JP3026351B2 - ブタｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白 - Google Patents
ブタｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白Info
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- JP3026351B2 JP3026351B2 JP2186583A JP18658390A JP3026351B2 JP 3026351 B2 JP3026351 B2 JP 3026351B2 JP 2186583 A JP2186583 A JP 2186583A JP 18658390 A JP18658390 A JP 18658390A JP 3026351 B2 JP3026351 B2 JP 3026351B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、ブタ由来CNP（Ｃ−type natriuretic pept
ide）の遺伝子、そのcDNA及びブタ由来CNPの前駆体蛋白
に関する。
ide）の遺伝子、そのcDNA及びブタ由来CNPの前駆体蛋白
に関する。
［発明の背景］ 近年、生体内の体液及び血圧の恒常性を調節するホル
モンまたは神経伝達物質として、心房性ナトリウム利尿
ペプチド（ANP）、及び脳ナトリウム利尿ペプチド（BN
P）と呼ばれる２種類の異なったペプチドファミリーに
帰属されるペプチド類が発見され、それらの構造及び生
合成機構が明らかにされると共に、これらの生理作用に
ついても明らかにされてきた。
モンまたは神経伝達物質として、心房性ナトリウム利尿
ペプチド（ANP）、及び脳ナトリウム利尿ペプチド（BN
P）と呼ばれる２種類の異なったペプチドファミリーに
帰属されるペプチド類が発見され、それらの構造及び生
合成機構が明らかにされると共に、これらの生理作用に
ついても明らかにされてきた。
一方、ごく最近本発明者らにより、ブタ脳からＣ−タ
イプナトリウム利尿ペプチド（Ｃ−type natriuretic p
eptide:CNP）と名付けられたナトリウム利尿ペプチドの
第３のファミリーに属する新規ペプチドが発見されてき
た。
イプナトリウム利尿ペプチド（Ｃ−type natriuretic p
eptide:CNP）と名付けられたナトリウム利尿ペプチドの
第３のファミリーに属する新規ペプチドが発見されてき
た。
ANP発見への最初の手がかりは、1981年de Boldらによ
り報告された。すなわち、彼らはラット心房粗抽出液を
他のラットに静注すると著しい利尿を生ずることを見い
だし、心房中にナトリウム利尿を促進する因子が存在し
ていることを報告した（de Bold A.J.et al,Life Sci.,
28 89,1981）。その後、この因子は寒川らによりヒト心
房より単離、その構造が明らかにされ、心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（ANP）と命名され（Kangawa,K.et al,B
iochem.Biophys.Res.Commun.118 131,1984;Kangawa,K.e
t al,Nature,313 397,1985:特公昭63−19520号、特開昭
60−184098号、特開昭60−260596号）。ヒトANP（hAN
P）は心房において分子量の異なる３種類、すなわちα
型、β型、およびγ型が存在しており、α型hANP（α−
hANP）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した28個のアミ
ノ酸からなる一本鎖ペプチドであること、β型hANP（β
−hANP）はα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成した逆
平行２量体であること、γ型hANP（γ−hANP）は126個
のアミノ酸からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部分
にα−hANPを含んでいることが明らかにされた。さら
に、hANPに対するcDNAが単離され、この解析からα−、
β−、γ−hANPの生合成経路が判り、これらはいずれも
共通の前駆体タンパクから生合成されることが判った
（Oikawa,S.et al,Nature,309 724,1984）。
り報告された。すなわち、彼らはラット心房粗抽出液を
他のラットに静注すると著しい利尿を生ずることを見い
だし、心房中にナトリウム利尿を促進する因子が存在し
ていることを報告した（de Bold A.J.et al,Life Sci.,
28 89,1981）。その後、この因子は寒川らによりヒト心
房より単離、その構造が明らかにされ、心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（ANP）と命名され（Kangawa,K.et al,B
iochem.Biophys.Res.Commun.118 131,1984;Kangawa,K.e
t al,Nature,313 397,1985:特公昭63−19520号、特開昭
60−184098号、特開昭60−260596号）。ヒトANP（hAN
P）は心房において分子量の異なる３種類、すなわちα
型、β型、およびγ型が存在しており、α型hANP（α−
hANP）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した28個のアミ
ノ酸からなる一本鎖ペプチドであること、β型hANP（β
−hANP）はα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成した逆
平行２量体であること、γ型hANP（γ−hANP）は126個
のアミノ酸からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部分
にα−hANPを含んでいることが明らかにされた。さら
に、hANPに対するcDNAが単離され、この解析からα−、
β−、γ−hANPの生合成経路が判り、これらはいずれも
共通の前駆体タンパクから生合成されることが判った
（Oikawa,S.et al,Nature,309 724,1984）。
なお、これらhANPのうちα−hANPが主に血中に分泌さ
れていることが判っている。
れていることが判っている。
hANPの構造が明らかにされて以来、現在までに他の哺
乳類のANP構造も明らかにされてきている（特開昭60−1
84097号、特開昭61−7298号）。この結果、ANPのアミノ
酸配列は、げっ歯類からヒトまで哺乳類動物において広
い範囲で類似しており、特にα型ANP（α−ANP）はヒト
・イヌ・ブタを含む高等哺乳類においては同一のアミノ
酸配列を持つこと、また、ラット及びウサギではα−hA
NPの12位メチオニン残基がイソロイシン残基に一箇所置
換している以外全く同一のアミノ酸配列を有しているこ
とが判ってきている（Oikawa,S.et al,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,132 892,1985;Forssmann,W.G.et al,Ana
t.Embryol.,168 307,1983）。
乳類のANP構造も明らかにされてきている（特開昭60−1
84097号、特開昭61−7298号）。この結果、ANPのアミノ
酸配列は、げっ歯類からヒトまで哺乳類動物において広
い範囲で類似しており、特にα型ANP（α−ANP）はヒト
・イヌ・ブタを含む高等哺乳類においては同一のアミノ
酸配列を持つこと、また、ラット及びウサギではα−hA
NPの12位メチオニン残基がイソロイシン残基に一箇所置
換している以外全く同一のアミノ酸配列を有しているこ
とが判ってきている（Oikawa,S.et al,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,132 892,1985;Forssmann,W.G.et al,Ana
t.Embryol.,168 307,1983）。
最初ANPは心房より単離されたが、ANPに対する抗体を
作製し、生体内における分布を調べたところ、ANPは心
房以外にも脳にも存在していることが判った。ただし、
脳ではα−ANPのＮ−末端がさらに切断され短縮された
α−ANP［４−28］、α−ANP［５−28］が存在している
（Ueda,S.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,149 105
5,1987）。脳では視床下部、橋被蓋（pontinetegmentu
m）にANP含有ニューロンの存在が報告されていることか
ら（Cantin,M.et al,Histo−chemistry,80 113,1984;Sa
per,C.B.et al,Science,227 1047,1985）、ANPは現在脳
において心血管系の調節にかかわる神経伝達物質として
も作用しているのではないかと考えられている。ANPの
生理作用は前にも述べたが、顕著なナトリウム利尿作用
を示すのみならず、血圧降下作用さらには副腎皮質のア
ルドステロン産生を抑制することが判ってきた。従っ
て、現在ANPは心房から血中に分泌され、体液及び血圧
の恒常性を調節するホルモンとして作用するのみなら
ず、脳では神経系の神経伝達物質として作用し、体液及
び血圧の恒常性を調節していることが判ってきた。一
方、BNPは1988年Sudohらによりブタ脳から単離・同定さ
れたペプチドである（Sudoh,T.et al,Nature,332 78,19
88）。
作製し、生体内における分布を調べたところ、ANPは心
房以外にも脳にも存在していることが判った。ただし、
脳ではα−ANPのＮ−末端がさらに切断され短縮された
α−ANP［４−28］、α−ANP［５−28］が存在している
（Ueda,S.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,149 105
5,1987）。脳では視床下部、橋被蓋（pontinetegmentu
m）にANP含有ニューロンの存在が報告されていることか
ら（Cantin,M.et al,Histo−chemistry,80 113,1984;Sa
per,C.B.et al,Science,227 1047,1985）、ANPは現在脳
において心血管系の調節にかかわる神経伝達物質として
も作用しているのではないかと考えられている。ANPの
生理作用は前にも述べたが、顕著なナトリウム利尿作用
を示すのみならず、血圧降下作用さらには副腎皮質のア
ルドステロン産生を抑制することが判ってきた。従っ
て、現在ANPは心房から血中に分泌され、体液及び血圧
の恒常性を調節するホルモンとして作用するのみなら
ず、脳では神経系の神経伝達物質として作用し、体液及
び血圧の恒常性を調節していることが判ってきた。一
方、BNPは1988年Sudohらによりブタ脳から単離・同定さ
れたペプチドである（Sudoh,T.et al,Nature,332 78,19
88）。
Sudohらにより最初にブタ脳から単離されたBNP（pBNP
−26）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を持つアミノ酸26残
基より成るペプチドで、その構造、すなわちアミノ酸一
次配列、及びＳ−Ｓ結合様式（アミノ酸17残基で構成さ
れる環状構造）はANPと似ているが、ANPとは明らかに区
別されるペプチドである。さらにこのペプチドはANPと
同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すこと
が確認されたことから、このペプチドは脳ナトリウム利
尿ペプチド（BNP）と命名された。その後、ブタ脳からp
BNP−26のＮ−末端に６個のアミノ酸が付加した32アミ
ノ酸残基よりなるpBNP−32も単離され（Sudoh,T.et al,
Biochem.Biophys.Res.Commun.,155 726,1988）、またブ
タ心房からはγ−BNPと命名されたアミノ酸106個からな
るペプチドも単離・同定されている（Minamino,N.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,157 402,1988）。
−26）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を持つアミノ酸26残
基より成るペプチドで、その構造、すなわちアミノ酸一
次配列、及びＳ−Ｓ結合様式（アミノ酸17残基で構成さ
れる環状構造）はANPと似ているが、ANPとは明らかに区
別されるペプチドである。さらにこのペプチドはANPと
同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すこと
が確認されたことから、このペプチドは脳ナトリウム利
尿ペプチド（BNP）と命名された。その後、ブタ脳からp
BNP−26のＮ−末端に６個のアミノ酸が付加した32アミ
ノ酸残基よりなるpBNP−32も単離され（Sudoh,T.et al,
Biochem.Biophys.Res.Commun.,155 726,1988）、またブ
タ心房からはγ−BNPと命名されたアミノ酸106個からな
るペプチドも単離・同定されている（Minamino,N.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,157 402,1988）。
さらに、現在までにヒト及びラットBNPのcDNAが単離
され、これらのBNPの前駆体構造も明らかになっている
（Sudoh,T.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,159 14
27,1989;Kojima,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,159 1420,1989）。
され、これらのBNPの前駆体構造も明らかになっている
（Sudoh,T.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,159 14
27,1989;Kojima,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,159 1420,1989）。
これらの結果、これらBNPファミリーに属するペプチ
ド類はANPとは全く異なった前駆体から生合成されるこ
とが判った。
ド類はANPとは全く異なった前駆体から生合成されるこ
とが判った。
前述したように、BNPは最初脳より単離されたが、ブ
タ脳においてBNPはANPに比べ10倍量存在していること、
さらにはANPと同様心房にも存在し（ただし、心房でのB
NPの存在量はANPの２〜３％）、心房から血中へ分泌さ
れていることが判った（Minamino,N.et al,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,155 740,1988;Aburaya,M.et al,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,165 872,1989）。これらの事
実から、BNPはANPと同様、脳においては神経伝達物質と
して、また心房から血中へ分泌されるホルモンとして作
用し、体液及び血圧の恒常性を調節していることが判っ
た。ところで、ナトリウム利尿ペプチドのように、生体
におけるある生理的作用（例えば、体液及び血圧の恒常
性）の調節に単一ペプチドではなく、複数のペプチドが
関与している例として、現在までにオピオイドペプチド
（Opoid peptide）、タヒキニン（tachykinin）さらに
はエンドセリン（endothelin）などが知られている。こ
れらの例では、いずれも３種の異なるペプチドファミリ
ーが存在していることが知られている（Hollt,V.,Trend
Neuro Sci.,6 24,1983;Nakanishi,S.Physiol.Review,6
7 1117,1987;Inoue,A.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,86 2863,1989）。このことから、ナトリウム利尿作
用を示すペプチドも現在までに判っているANP・BNPファ
ミリーに帰属されるペプチド類以外に、第３のファミリ
ーに帰属されるペプチド類が存在している可能性が高ま
った。この点に関し、ごく最近本発明者らはブタ脳か
ら、ANP・BNPファミリーのいずれにも属さない、すなわ
ち、ナトリウム利尿ペプチドの第３のファミリーに属す
る新規ペプチドを２種見いだすことに成功し、これらの
ペプチドをCNP（Ｃ−type natriuretic peptide）と命
名した。
タ脳においてBNPはANPに比べ10倍量存在していること、
さらにはANPと同様心房にも存在し（ただし、心房でのB
NPの存在量はANPの２〜３％）、心房から血中へ分泌さ
れていることが判った（Minamino,N.et al,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,155 740,1988;Aburaya,M.et al,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,165 872,1989）。これらの事
実から、BNPはANPと同様、脳においては神経伝達物質と
して、また心房から血中へ分泌されるホルモンとして作
用し、体液及び血圧の恒常性を調節していることが判っ
た。ところで、ナトリウム利尿ペプチドのように、生体
におけるある生理的作用（例えば、体液及び血圧の恒常
性）の調節に単一ペプチドではなく、複数のペプチドが
関与している例として、現在までにオピオイドペプチド
（Opoid peptide）、タヒキニン（tachykinin）さらに
はエンドセリン（endothelin）などが知られている。こ
れらの例では、いずれも３種の異なるペプチドファミリ
ーが存在していることが知られている（Hollt,V.,Trend
Neuro Sci.,6 24,1983;Nakanishi,S.Physiol.Review,6
7 1117,1987;Inoue,A.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,86 2863,1989）。このことから、ナトリウム利尿作
用を示すペプチドも現在までに判っているANP・BNPファ
ミリーに帰属されるペプチド類以外に、第３のファミリ
ーに帰属されるペプチド類が存在している可能性が高ま
った。この点に関し、ごく最近本発明者らはブタ脳か
ら、ANP・BNPファミリーのいずれにも属さない、すなわ
ち、ナトリウム利尿ペプチドの第３のファミリーに属す
る新規ペプチドを２種見いだすことに成功し、これらの
ペプチドをCNP（Ｃ−type natriuretic peptide）と命
名した。
最初に発見されたCNPはアミノ酸残基22個からなるペ
プチドで（以後、本発明ではこのペプチドをCNP−22と
略す）、その構造はANP・BNPと似ているが、これらとは
明らかに異なっている。すなわち、CNP−22はANP・BNP
と同様分子内Ｓ−Ｓ結合に基づく17アミノ酸残基で構成
される環状構造を持ち、しかもこの環状構造を形成して
いるアミノ酸一次配列にはCNP−22、α−ANP、BNP−32
の間で高い相同性がある。実際17アミノ酸残基のうち、
12アミノ酸残基は同じであった。
プチドで（以後、本発明ではこのペプチドをCNP−22と
略す）、その構造はANP・BNPと似ているが、これらとは
明らかに異なっている。すなわち、CNP−22はANP・BNP
と同様分子内Ｓ−Ｓ結合に基づく17アミノ酸残基で構成
される環状構造を持ち、しかもこの環状構造を形成して
いるアミノ酸一次配列にはCNP−22、α−ANP、BNP−32
の間で高い相同性がある。実際17アミノ酸残基のうち、
12アミノ酸残基は同じであった。
しかしながら、CNP−22の構造は、この環状構造部分
を除くと、Ｎ−及びＣ−末端部分でα−ANP、BNP−32と
全く異なっている。特に特徴的なことは、Ｃ−末端部分
の構造で、α−ANP、BNP−32には、環状構造を形成して
いるシステイン残基のＣ−末端側にはα−ANPで５個、B
NP−32で６個のアミノ酸残基が存在しており、いわゆる
tail構造が存在しているのに対し、CNP−22のＣ−末端
はシステイン残基であることから、CNP−22にはこのtai
l構造が存在していない。
を除くと、Ｎ−及びＣ−末端部分でα−ANP、BNP−32と
全く異なっている。特に特徴的なことは、Ｃ−末端部分
の構造で、α−ANP、BNP−32には、環状構造を形成して
いるシステイン残基のＣ−末端側にはα−ANPで５個、B
NP−32で６個のアミノ酸残基が存在しており、いわゆる
tail構造が存在しているのに対し、CNP−22のＣ−末端
はシステイン残基であることから、CNP−22にはこのtai
l構造が存在していない。
以上述べたように、CNP−22はα−ANP、BNP−32と構
造が明らかに異なることに加え、CNP−22をラットに投
与すると、明らかなナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことが確認されたことから、CNP−22は生体内
におけるナトリウム利尿ペプチドの第３のファミリーに
属する新規ペプチドであることが判った（特願平２−10
5047号）。さらにその後、本発明者らは、CNP−22に対
する抗体を作製し、この抗体に免疫活性を示すペプチド
をブタ脳から精製した。この結果、CNP−53と名付けた
ペプチドを単離することに成功し、このペプチドの構造
を解析した結果、CNP−53はCNP−22をＣ−末端に含む53
アミノ酸残基からなるペプチド、言い換えれば、CNP−5
3はCNP−22のＮ−末端にさらに31個のアミノ酸残基が付
加したペプチドであることが判った（本発明者等の同日
付け特許出願）。
造が明らかに異なることに加え、CNP−22をラットに投
与すると、明らかなナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことが確認されたことから、CNP−22は生体内
におけるナトリウム利尿ペプチドの第３のファミリーに
属する新規ペプチドであることが判った（特願平２−10
5047号）。さらにその後、本発明者らは、CNP−22に対
する抗体を作製し、この抗体に免疫活性を示すペプチド
をブタ脳から精製した。この結果、CNP−53と名付けた
ペプチドを単離することに成功し、このペプチドの構造
を解析した結果、CNP−53はCNP−22をＣ−末端に含む53
アミノ酸残基からなるペプチド、言い換えれば、CNP−5
3はCNP−22のＮ−末端にさらに31個のアミノ酸残基が付
加したペプチドであることが判った（本発明者等の同日
付け特許出願）。
以上をまとめると、現在までに、哺乳動物においては
少なくともタイプの明らかに異なる３種類（ANPファミ
リー、BNPファミリー、CNPファミリー）のナトリウム利
尿ペプチド類が存在し、このうち、ANPファミリー、BNP
ファミリーに属するペプチドはいずれも心房から血中に
分泌され、体液及び血圧の恒常性を調節するホルモンと
して作用しているのみならず、これらは脳でも生合成さ
れ、脳内においては神経系の神経伝達物質として作用
し、体液及び血圧の恒常性を調節していることが判って
きた。しかしながら、最近発見されたCNPファミリーに
属するペプチド（CNP−22,CNP−53）に関しては、脳内
における存在量がANPやBNPに比べきわめて少ないことか
ら、現在までのところCNPの詳細な生合成機構、生体内
分布及び生理作用に関しては判っていない。
少なくともタイプの明らかに異なる３種類（ANPファミ
リー、BNPファミリー、CNPファミリー）のナトリウム利
尿ペプチド類が存在し、このうち、ANPファミリー、BNP
ファミリーに属するペプチドはいずれも心房から血中に
分泌され、体液及び血圧の恒常性を調節するホルモンと
して作用しているのみならず、これらは脳でも生合成さ
れ、脳内においては神経系の神経伝達物質として作用
し、体液及び血圧の恒常性を調節していることが判って
きた。しかしながら、最近発見されたCNPファミリーに
属するペプチド（CNP−22,CNP−53）に関しては、脳内
における存在量がANPやBNPに比べきわめて少ないことか
ら、現在までのところCNPの詳細な生合成機構、生体内
分布及び生理作用に関しては判っていない。
［本発明が解決すべき課題］ 本発明はブタCNP（CNP−22,CNP−53）及びその前駆体
の遺伝子及びcDNAを単離し、これを解析することによ
り、ブタCNPの前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を明
らかにすると共に、この遺伝子にコードされている全タ
ンパクまたはその一部分を遺伝子工学的に生産する方法
を提供することを目的とする。
の遺伝子及びcDNAを単離し、これを解析することによ
り、ブタCNPの前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を明
らかにすると共に、この遺伝子にコードされている全タ
ンパクまたはその一部分を遺伝子工学的に生産する方法
を提供することを目的とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、先に単離したCNP−22、CNP−53のブタ
脳内における存在量がANP,BNPのそれに比べきわめて少
量であり、しかもこれらペプチドの脳内における産生組
織が特定されていないことから、直接CNPに対応するcDN
Aを単離し、この解析からCNP前駆体タンパクの構造を明
らかにすることは困難であると考えた。そこで、本発明
者らはCNP遺伝子をブタ染色体から単離し、これを解析
することによりブタCNP前駆体タンパクの構造を明らか
にすることを計画した。
脳内における存在量がANP,BNPのそれに比べきわめて少
量であり、しかもこれらペプチドの脳内における産生組
織が特定されていないことから、直接CNPに対応するcDN
Aを単離し、この解析からCNP前駆体タンパクの構造を明
らかにすることは困難であると考えた。そこで、本発明
者らはCNP遺伝子をブタ染色体から単離し、これを解析
することによりブタCNP前駆体タンパクの構造を明らか
にすることを計画した。
本発明では、まずCNP遺伝子を単離するために用いるD
NAプローブの作製を以下に示す方法で行った。すなわ
ち、第１図に示すように、まずCNP−53のＮ−及びＣ−
末端部分のアミノ酸一次配列に対応するDNAプライマー
（KF225,KF226）を作製した。次に、このプライマーを
用い、Saikiらの方法（Saiki,R.K.et al,Science 239 4
87,1988）に従って、ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（PCR）を行うことにより、ブタ染色体遺伝子の
中でCNP−53のアミノ酸一次配列をコードしているDNA領
域だけを特異的に増幅させた。さらに、ここで増幅した
DNAは一旦プラスミドベクターに導入し、目的とするDNA
が組み込まれたクローン（DH1/pCNP5）を単離した。
NAプローブの作製を以下に示す方法で行った。すなわ
ち、第１図に示すように、まずCNP−53のＮ−及びＣ−
末端部分のアミノ酸一次配列に対応するDNAプライマー
（KF225,KF226）を作製した。次に、このプライマーを
用い、Saikiらの方法（Saiki,R.K.et al,Science 239 4
87,1988）に従って、ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（PCR）を行うことにより、ブタ染色体遺伝子の
中でCNP−53のアミノ酸一次配列をコードしているDNA領
域だけを特異的に増幅させた。さらに、ここで増幅した
DNAは一旦プラスミドベクターに導入し、目的とするDNA
が組み込まれたクローン（DH1/pCNP5）を単離した。
なお、この様にして得たDH1/pCNP5からプラスミドpCN
P5を回収し解析したところ、pCNP5はPCRにより増幅され
た147塩基対（bp）からなるDNA断片（以下このDNA断片
をDC−53と略す）を含み、DC−53はCNP−53のアミノ酸
一次配列をコードしているDNAであることを確認した。
また、この結果からCNP−53のアミノ酸一次配列をコー
ドしている遺伝子領域には少なくともイントロン（intr
on）が含まれていないことが判った。
P5を回収し解析したところ、pCNP5はPCRにより増幅され
た147塩基対（bp）からなるDNA断片（以下このDNA断片
をDC−53と略す）を含み、DC−53はCNP−53のアミノ酸
一次配列をコードしているDNAであることを確認した。
また、この結果からCNP−53のアミノ酸一次配列をコー
ドしている遺伝子領域には少なくともイントロン（intr
on）が含まれていないことが判った。
次に、この様にして作製したDNAプローブ（DC−53）
を用い、ブタ染色体遺伝子ライブラリー（λファージに
ブタ染色体遺伝子断片を組み込んだもの）をスクリーニ
ングしたところ、DC−53にハイブリダイズ（hybridiz
e）するクローン（λ CNP6）が得られた。このクローン
を解析したところ、λCNP6は約14Kbpのブタ染色体遺伝
子を含んでおり、またこの14Kbpうち、約2KbpからなるB
amHI DNA断片がDC−53 DNAプローブとhybridizeするこ
とが判った。そこでこの約2KbpからなるBamHI DNA断片
の全塩基配列を第２図に示す方法を用い決定した。この
結果、第３図に示すようにこのBamHI DNA断片は、ブタC
NP前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコードする構造遺
伝子（structural gene）領域のみならず、ブタCNP遺伝
子のプロモーター領域をも含んでいることが判った。す
なわち、まずプロモーター領域に関しては、第３図に示
すDNA塩基配列番号で133番目から138番目には真核生物
遺伝子のプロモーター領域に共通して存在するTATAボッ
クス（TATA box）が存在し、また、このTATA boxの上流
には遺伝子発現の制御に関与していると思われるGC box
が２個、Y boxが１個存在していることが判った。これ
らのことから、この領域はCNP前駆体遺伝子のプロモー
ター領域であることが判った。
を用い、ブタ染色体遺伝子ライブラリー（λファージに
ブタ染色体遺伝子断片を組み込んだもの）をスクリーニ
ングしたところ、DC−53にハイブリダイズ（hybridiz
e）するクローン（λ CNP6）が得られた。このクローン
を解析したところ、λCNP6は約14Kbpのブタ染色体遺伝
子を含んでおり、またこの14Kbpうち、約2KbpからなるB
amHI DNA断片がDC−53 DNAプローブとhybridizeするこ
とが判った。そこでこの約2KbpからなるBamHI DNA断片
の全塩基配列を第２図に示す方法を用い決定した。この
結果、第３図に示すようにこのBamHI DNA断片は、ブタC
NP前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコードする構造遺
伝子（structural gene）領域のみならず、ブタCNP遺伝
子のプロモーター領域をも含んでいることが判った。す
なわち、まずプロモーター領域に関しては、第３図に示
すDNA塩基配列番号で133番目から138番目には真核生物
遺伝子のプロモーター領域に共通して存在するTATAボッ
クス（TATA box）が存在し、また、このTATA boxの上流
には遺伝子発現の制御に関与していると思われるGC box
が２個、Y boxが１個存在していることが判った。これ
らのことから、この領域はCNP前駆体遺伝子のプロモー
ター領域であることが判った。
次に、構造遺伝子領域に関しては、まず、前記したTA
TA boxの下流（３′側）塩基配列番号310から312にATG
が存在し、このATGはTATA boxの下流（３′側）で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
回りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.C
いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本発
明者はこのATGがブタCNP前駆体の翻訳開始コドンである
と推定した。次に、もしこのATGを翻訳開始コドンとす
ると、この下流塩基配列番号430−432番目に存在してい
る翻訳終止コドン（TGA）まで40アミノ酸残基をコード
するオープンリーディングフレームが存在する。しか
し、このオープンリーディデングフレームから予測され
るペプチドのアミノ酸一次配列にはCNP−22、CNP−53に
対応するアミノ酸配列は出現しない。一方、このBamHI
DNA断片には塩基配列番号725から1126番目まで134アミ
ノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームが
存在しており、このオープンリーディングフレームから
予測されるペプチドのアミノ酸一次配列の中にはCNP−2
2及びCNP−53に対応するアミノ酸一次配列が出現するこ
とが判った。これらの解析から、ブタCNPの構造遺伝子
は少なくとも１個のイントロン（intron）が存在してい
ること、言い換えればブタCNP前駆体タンパクは遺伝子
上では少なくとも２個のエクソン（exon）に分かれてコ
ードされていることが判った。このことは、塩基配列番
号で400付近にスプライシングドナーのコンセンサスシ
ークエンスとして知られているC/A AGGT A/G AGTと似た
塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番号840の
５′側にはスプライシングアクセプターのコンセンサス
シークエンスとして知られている（Py）n N C/T AGG（P
yはピリミジン塩基を示し、ＮはA.T.C.Gいずれかの塩基
を示す）に似た塩基配列が存在していることからも支持
される。これらのことから、本発明者らは塩基配列番号
399から838番目までのDNA領域はintronであり、このint
ronはCNP前駆体タンパクをコードする成熟（mature）mR
NAができる際スプライシングにより除かれるのではない
かと考えた。つまり、CNP前駆体タンパクは塩基配列番
号310から始まり、399で終わる第１エクソンと、838か
ら始まる第２エクソンによりコードされており、全体で
はアミノ酸126残基からなるポリペプチドであることが
推定された。そこで、この推定を確かめるために、本発
明者らは以下に述べる方法を用い、CNP前駆体遺伝子の
構造遺伝子領域を動物細胞で発現させ、この構造遺伝子
から転写（transcription）されるmRNAの構造、さらに
このmRNAから翻訳されるタンパクを解析することにし
た。すなわち、本発明者らは第４図に示すように、CNP
前駆体遺伝子の構造遺伝子領域をSV40の初期プロモータ
ーに結合させたプラスミドpSV2CNPを作製し、このプラ
スミドをCOS−１細胞に導入することにより（この細胞
を以後COS−1/pSV2CNPと略す）この構造遺伝子をSV40プ
ロモーター支配下、動物細胞内で発現させた。
TA boxの下流（３′側）塩基配列番号310から312にATG
が存在し、このATGはTATA boxの下流（３′側）で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
回りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.C
いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本発
明者はこのATGがブタCNP前駆体の翻訳開始コドンである
と推定した。次に、もしこのATGを翻訳開始コドンとす
ると、この下流塩基配列番号430−432番目に存在してい
る翻訳終止コドン（TGA）まで40アミノ酸残基をコード
するオープンリーディングフレームが存在する。しか
し、このオープンリーディデングフレームから予測され
るペプチドのアミノ酸一次配列にはCNP−22、CNP−53に
対応するアミノ酸配列は出現しない。一方、このBamHI
DNA断片には塩基配列番号725から1126番目まで134アミ
ノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームが
存在しており、このオープンリーディングフレームから
予測されるペプチドのアミノ酸一次配列の中にはCNP−2
2及びCNP−53に対応するアミノ酸一次配列が出現するこ
とが判った。これらの解析から、ブタCNPの構造遺伝子
は少なくとも１個のイントロン（intron）が存在してい
ること、言い換えればブタCNP前駆体タンパクは遺伝子
上では少なくとも２個のエクソン（exon）に分かれてコ
ードされていることが判った。このことは、塩基配列番
号で400付近にスプライシングドナーのコンセンサスシ
ークエンスとして知られているC/A AGGT A/G AGTと似た
塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番号840の
５′側にはスプライシングアクセプターのコンセンサス
シークエンスとして知られている（Py）n N C/T AGG（P
yはピリミジン塩基を示し、ＮはA.T.C.Gいずれかの塩基
を示す）に似た塩基配列が存在していることからも支持
される。これらのことから、本発明者らは塩基配列番号
399から838番目までのDNA領域はintronであり、このint
ronはCNP前駆体タンパクをコードする成熟（mature）mR
NAができる際スプライシングにより除かれるのではない
かと考えた。つまり、CNP前駆体タンパクは塩基配列番
号310から始まり、399で終わる第１エクソンと、838か
ら始まる第２エクソンによりコードされており、全体で
はアミノ酸126残基からなるポリペプチドであることが
推定された。そこで、この推定を確かめるために、本発
明者らは以下に述べる方法を用い、CNP前駆体遺伝子の
構造遺伝子領域を動物細胞で発現させ、この構造遺伝子
から転写（transcription）されるmRNAの構造、さらに
このmRNAから翻訳されるタンパクを解析することにし
た。すなわち、本発明者らは第４図に示すように、CNP
前駆体遺伝子の構造遺伝子領域をSV40の初期プロモータ
ーに結合させたプラスミドpSV2CNPを作製し、このプラ
スミドをCOS−１細胞に導入することにより（この細胞
を以後COS−1/pSV2CNPと略す）この構造遺伝子をSV40プ
ロモーター支配下、動物細胞内で発現させた。
まず、mRNAの解析に関しては、COS−1/pSV2CNPから全
RNAを抽出し、続いてオリゴdTセルロースカラムを用いp
olyA＋RNAを調製し、これを用いてcDNAライブラリーを
作製した。次に、このcDNAライブラリーをDC−53 DNAを
用いスクリーニングすることにより、このDNAプローブ
にhybridizeするクローンDH1/pCNPcDNA1を単離した。さ
らに、このクローンからプラスミドpCNPcDNA1を単離
し、cDNA領域の全塩基配列を決定した。この結果、第５
図に示すように、CNP遺伝子の構造遺伝子由来のmature
mRNA（cDNA）には本発明者が予測したintronに対応する
領域が存在しないことが判った。つまり、第３図の塩基
配列番号400から838番目までのDNA領域はintronであ
り、このintronはCNP前駆体タンパクをコードするmatur
e mRNAができる際、スプライシングにより除かれること
が判った。このことにより、本発明者らは、最終的にCN
P遺伝子の構造遺伝子領域におけるエクソン、イントロ
ンの位置を確定することに成功し、さらに、CNP前駆体
タンパクは第５図に示すアミノ酸一次配列を持つ126ア
ミノ酸残基からなるポリペプチドであることを明らかに
することに成功した。なお、このようにして明らかにさ
れたブタCNP前駆体タンパク（以後、本発明ではprepro
CNPと略す）のアミノ酸一次配列において、CNP−22、CN
P−53はPreProCNPのＣ−末端領域に存在し、また、PreP
roCNPのＮ−末端領域には疎水性アミノ酸残基に富む領
域（第５図アミノ酸一次配列番号10から16番目）が存在
していることから、PreProCNPのＮ−末端領域には分泌
（secretion）に必要なシグナルペプチドが存在してい
る可能性が高い。
RNAを抽出し、続いてオリゴdTセルロースカラムを用いp
olyA＋RNAを調製し、これを用いてcDNAライブラリーを
作製した。次に、このcDNAライブラリーをDC−53 DNAを
用いスクリーニングすることにより、このDNAプローブ
にhybridizeするクローンDH1/pCNPcDNA1を単離した。さ
らに、このクローンからプラスミドpCNPcDNA1を単離
し、cDNA領域の全塩基配列を決定した。この結果、第５
図に示すように、CNP遺伝子の構造遺伝子由来のmature
mRNA（cDNA）には本発明者が予測したintronに対応する
領域が存在しないことが判った。つまり、第３図の塩基
配列番号400から838番目までのDNA領域はintronであ
り、このintronはCNP前駆体タンパクをコードするmatur
e mRNAができる際、スプライシングにより除かれること
が判った。このことにより、本発明者らは、最終的にCN
P遺伝子の構造遺伝子領域におけるエクソン、イントロ
ンの位置を確定することに成功し、さらに、CNP前駆体
タンパクは第５図に示すアミノ酸一次配列を持つ126ア
ミノ酸残基からなるポリペプチドであることを明らかに
することに成功した。なお、このようにして明らかにさ
れたブタCNP前駆体タンパク（以後、本発明ではprepro
CNPと略す）のアミノ酸一次配列において、CNP−22、CN
P−53はPreProCNPのＣ−末端領域に存在し、また、PreP
roCNPのＮ−末端領域には疎水性アミノ酸残基に富む領
域（第５図アミノ酸一次配列番号10から16番目）が存在
していることから、PreProCNPのＮ−末端領域には分泌
（secretion）に必要なシグナルペプチドが存在してい
る可能性が高い。
以上のことを総合的に考えると、CNP−22、CNP−53は
以下に述べる経路で生合成されることが推定される。す
なわち、まず126アミノ酸残基からなるPreProCNPがmRNA
から翻訳（translation）される。次に、このＮ−末端
領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切断され
ProCNPに転換される。さらに、ProCNPはプロセッシング
酵素により特異的に切断され（第５図アミノ酸一次配列
番号で73と74の間、104と105の間）、CNP−53とCNP−22
に転換される。
以下に述べる経路で生合成されることが推定される。す
なわち、まず126アミノ酸残基からなるPreProCNPがmRNA
から翻訳（translation）される。次に、このＮ−末端
領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切断され
ProCNPに転換される。さらに、ProCNPはプロセッシング
酵素により特異的に切断され（第５図アミノ酸一次配列
番号で73と74の間、104と105の間）、CNP−53とCNP−22
に転換される。
このことを確かめるために、本発明者らは次にCOS−1
/pSV2CNP培養上清のタンパクを解析した。すなわち、ま
ずCOS−1/pSV2CNP培養上清液を集め、これを濃縮した。
次に、この濃縮液中に含まれるタンパク・ペプチドをセ
ファデックスＧ−75を用い、分子量別に分画した。続い
て各溶出画分の一部を抗CNP−22抗血清を用いたラジオ
イムノアッセイ（RIA）に供し、各画分に存在する抗CNP
−22抗体に免疫活性を示すペプチド及びタンパクを定量
した。この結果、第６図に示すように、分子量約16Kの
溶出画分と分子量約３〜10Kの溶出画分に、抗CNP−22抗
血清に対し免疫活性を示すタンパク及びペプチドが存在
していることが判った。この結果から、COS−1/pSV2CNP
細胞においてProCNPは分泌発現されることが判り、ま
た、分子量約３〜7K付近に抗CNP−22抗血清に対し免疫
活性を示すペプチドが存在していることから、COS−１
細胞でProCNPの一部分は、さらに低分子ペプチド類（た
だし、これらペプチド類はすべてそのＣ−末端領域にCN
P−22構造を持っている）に転換されることが判った。
/pSV2CNP培養上清のタンパクを解析した。すなわち、ま
ずCOS−1/pSV2CNP培養上清液を集め、これを濃縮した。
次に、この濃縮液中に含まれるタンパク・ペプチドをセ
ファデックスＧ−75を用い、分子量別に分画した。続い
て各溶出画分の一部を抗CNP−22抗血清を用いたラジオ
イムノアッセイ（RIA）に供し、各画分に存在する抗CNP
−22抗体に免疫活性を示すペプチド及びタンパクを定量
した。この結果、第６図に示すように、分子量約16Kの
溶出画分と分子量約３〜10Kの溶出画分に、抗CNP−22抗
血清に対し免疫活性を示すタンパク及びペプチドが存在
していることが判った。この結果から、COS−1/pSV2CNP
細胞においてProCNPは分泌発現されることが判り、ま
た、分子量約３〜7K付近に抗CNP−22抗血清に対し免疫
活性を示すペプチドが存在していることから、COS−１
細胞でProCNPの一部分は、さらに低分子ペプチド類（た
だし、これらペプチド類はすべてそのＣ−末端領域にCN
P−22構造を持っている）に転換されることが判った。
以上まとめると、本発明者らはブタCNP（CNP−22,CNP
−53）前駆体タンパクをコードする染色体遺伝子及びcD
NAを単離し、これらを解析することにより、ブタCNP前
駆体タンパクのアミノ酸一次配列を明らかにすると共
に、この遺伝子またはcDNAにコードされているタンパク
及びその一部分を遺伝子工学的方法を用い生産させるこ
とに成功し、本発明を完成させた。
−53）前駆体タンパクをコードする染色体遺伝子及びcD
NAを単離し、これらを解析することにより、ブタCNP前
駆体タンパクのアミノ酸一次配列を明らかにすると共
に、この遺伝子またはcDNAにコードされているタンパク
及びその一部分を遺伝子工学的方法を用い生産させるこ
とに成功し、本発明を完成させた。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1.DNAプローブ（DC−53）の作製 A.PCRによる遺伝子増幅 CNP−53のアミノ酸一次配列をコードしている染色体
遺伝子領域を、以下に示す方法を用いin vitroで増幅し
た。まず、第１図に示すCNP−53のＮ−及びＣ−末端領
域のアミノ酸一次配列に対応するDNAプライマーを２種
（KF225,KF226）化学合成した。ただし、KF225、KF226
の５′末端領域には、遺伝子増幅した後この遺伝子を容
易にサブクローニングできるように、制限酵素PstI認識
部位を人工的に導入した（第１図アルファベット小文字
で示した塩基が人工的に変換した塩基である）。次に、
このDNAプライマーを用いSaikiらの方法（Saiki,R.K.et
al,Science,239 487,1988）に従いポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（PCR）を行った。すなわち、KF22
5、KF226をそれぞれ1.25μｇ、ブタ染色体DNA 1μｇを
反応液［10mM Tris−HCl（pH8.5）,2.5mM MgCl2,50mM K
Cl,0.2mM NTPs,0.02％ gelatin］100μｌに加え、さら
にこの溶液にThermus aquaticus DNAポリメラーゼ（New
England BioLabs）5 unitsを加えPCRを行った。なお、
反応は90℃で1.5分、65℃で２分、70℃で1.5分を１サイ
クルとし、このサイクルを30回繰り返すことにより行っ
た。ただし、10サイクルめに反応液には前記DNAポリメ
ラーゼをさらに5 units加えた。このようにして増幅さ
せた遺伝子はエタノール沈澱により回収した。
遺伝子領域を、以下に示す方法を用いin vitroで増幅し
た。まず、第１図に示すCNP−53のＮ−及びＣ−末端領
域のアミノ酸一次配列に対応するDNAプライマーを２種
（KF225,KF226）化学合成した。ただし、KF225、KF226
の５′末端領域には、遺伝子増幅した後この遺伝子を容
易にサブクローニングできるように、制限酵素PstI認識
部位を人工的に導入した（第１図アルファベット小文字
で示した塩基が人工的に変換した塩基である）。次に、
このDNAプライマーを用いSaikiらの方法（Saiki,R.K.et
al,Science,239 487,1988）に従いポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（PCR）を行った。すなわち、KF22
5、KF226をそれぞれ1.25μｇ、ブタ染色体DNA 1μｇを
反応液［10mM Tris−HCl（pH8.5）,2.5mM MgCl2,50mM K
Cl,0.2mM NTPs,0.02％ gelatin］100μｌに加え、さら
にこの溶液にThermus aquaticus DNAポリメラーゼ（New
England BioLabs）5 unitsを加えPCRを行った。なお、
反応は90℃で1.5分、65℃で２分、70℃で1.5分を１サイ
クルとし、このサイクルを30回繰り返すことにより行っ
た。ただし、10サイクルめに反応液には前記DNAポリメ
ラーゼをさらに5 units加えた。このようにして増幅さ
せた遺伝子はエタノール沈澱により回収した。
B.DC−53のサブクローニング及び解析 前記方法を用い増幅させた遺伝子の中から、目的とす
るCNP−53のアミノ酸一次配列をコードするDNA断片を得
るために、まず、前記方法で増幅させたDNA断片を一旦
プラスミドベクターpUC118へサブクローニングした。す
なわち、前記方法を用い増幅させた遺伝子を制限酵素Ps
tIで処理し、この遺伝子断片をpUC118（宝酒造）のPstI
サイトに導入し、これを用いて大腸菌K12株由来DH1を形
質転換させることにより、遺伝子ライブラリーを作製し
た。次に、この遺伝子ライブラリーを化学合成した混合
DNAプローブKF206（第１図CNP−53のアミノ酸一次配列
で16番目のロイシン（Leu）から21番目のアスパラギン
（Asn）に対応するオリゴヌクレオチド混合DNAプロー
ブ、14mer,32混合物）を用い、Woodらの方法（Wood,W.
I.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82 1585,1985）に
従いスクリーニングすることにより、KF206にハイブリ
ダイゼーションするクローンDH1/pCNP5を得た。続い
て、このクローンから常法に従い、プラスミド（pCNP
5）を分離・精製し、このプラスミドを制限酵素PstIで
切断し解析したところ、pCNP5は約150塩基対からなるPs
tI DNA断片を含んでいることが判った。そこで、このPs
tI DNA断片が、最終的に目的とするCNP−53のアミノ酸
一次配列をコードする遺伝子断片であることを確かめる
ために、PstI DNA断片をM13ファージにクローニング
し、SEQUENASE（United states Biochemical Corporati
on）を用いてジデオキシ法（Sanger,F.et al,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.,74 5463,1977）でこのDNA塩基配列
を決定した。この結果、PstI DNA断片は全体で147塩基
対（bp）からなり、このDNA塩基配列がCNP−53をコード
する遺伝子であることが判った。
るCNP−53のアミノ酸一次配列をコードするDNA断片を得
るために、まず、前記方法で増幅させたDNA断片を一旦
プラスミドベクターpUC118へサブクローニングした。す
なわち、前記方法を用い増幅させた遺伝子を制限酵素Ps
tIで処理し、この遺伝子断片をpUC118（宝酒造）のPstI
サイトに導入し、これを用いて大腸菌K12株由来DH1を形
質転換させることにより、遺伝子ライブラリーを作製し
た。次に、この遺伝子ライブラリーを化学合成した混合
DNAプローブKF206（第１図CNP−53のアミノ酸一次配列
で16番目のロイシン（Leu）から21番目のアスパラギン
（Asn）に対応するオリゴヌクレオチド混合DNAプロー
ブ、14mer,32混合物）を用い、Woodらの方法（Wood,W.
I.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82 1585,1985）に
従いスクリーニングすることにより、KF206にハイブリ
ダイゼーションするクローンDH1/pCNP5を得た。続い
て、このクローンから常法に従い、プラスミド（pCNP
5）を分離・精製し、このプラスミドを制限酵素PstIで
切断し解析したところ、pCNP5は約150塩基対からなるPs
tI DNA断片を含んでいることが判った。そこで、このPs
tI DNA断片が、最終的に目的とするCNP−53のアミノ酸
一次配列をコードする遺伝子断片であることを確かめる
ために、PstI DNA断片をM13ファージにクローニング
し、SEQUENASE（United states Biochemical Corporati
on）を用いてジデオキシ法（Sanger,F.et al,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.,74 5463,1977）でこのDNA塩基配列
を決定した。この結果、PstI DNA断片は全体で147塩基
対（bp）からなり、このDNA塩基配列がCNP−53をコード
する遺伝子であることが判った。
C.DC−53の作製 ブタCNP前駆体タンパクをコードする遺伝子をクロー
ニングするために用いるDNAプローブ（DC−53）の作製
は、前記したプラスミドpCNP5を制限酵素PstIで切断
し、147bpDNA断片を単離し、このDNA断片を［α−32P］
dCTPを用い、ニックトランスレーションで放射標識する
ことにより作製した。
ニングするために用いるDNAプローブ（DC−53）の作製
は、前記したプラスミドpCNP5を制限酵素PstIで切断
し、147bpDNA断片を単離し、このDNA断片を［α−32P］
dCTPを用い、ニックトランスレーションで放射標識する
ことにより作製した。
実施例2.ブタCNP前駆体タンパクをコードする染色体遺
伝子の単離 ４℃に保存されたブタ染色体遺伝子ファージDNAライ
ブラリー（Clonetech社製）を大腸菌K12株由来LE392に
感染させ、LB培地（10g Bactotryptone,5g Yeast extra
ct,5g NaCl,1.5％Bactoagar全量１）に拡げ、37℃で
一夜培養した。プレートを４℃で30分間冷却した後、フ
ァージプラーク上にニトロセルロースフィルター（Shle
icher ＆ Schnell社製）を５分間放置した。次にこのフ
ィルターをプレートからはがし、風乾後アルカリ変性液
（0.5M NaOH,1.5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液
（0.5M Tris−HCl pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。
その後、3xSSC溶液（20xSSC NaCl 175.3g,クエン酸三ナ
トリウム88.2g全量１）でニトロセルロースフィルタ
ーをすすぎ、風乾後、減圧下80℃120分間熱処理を行っ
た。
伝子の単離 ４℃に保存されたブタ染色体遺伝子ファージDNAライ
ブラリー（Clonetech社製）を大腸菌K12株由来LE392に
感染させ、LB培地（10g Bactotryptone,5g Yeast extra
ct,5g NaCl,1.5％Bactoagar全量１）に拡げ、37℃で
一夜培養した。プレートを４℃で30分間冷却した後、フ
ァージプラーク上にニトロセルロースフィルター（Shle
icher ＆ Schnell社製）を５分間放置した。次にこのフ
ィルターをプレートからはがし、風乾後アルカリ変性液
（0.5M NaOH,1.5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液
（0.5M Tris−HCl pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。
その後、3xSSC溶液（20xSSC NaCl 175.3g,クエン酸三ナ
トリウム88.2g全量１）でニトロセルロースフィルタ
ーをすすぎ、風乾後、減圧下80℃120分間熱処理を行っ
た。
このようにして調製したニトロセルロースフィルター
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［3xSSC、1xデンハー
ト液（アルブミン，ポリビニルピロリドン，フィコー
ル，各々0.2mg/ml）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SD
S］に加え、65℃にて３時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。次に２枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記DC−53DNAプローブを100万cpm、及び前記プ
レハイブリダイゼーション溶液1mlを用い、65℃にて一
夜ハイブリダイゼーションを行った。次にこのフィルタ
ーを0.1％SDSを含む3xSSC溶液で65℃30分間、３回洗浄
後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜
行った。このようにして約200万クローンをスクリーニ
ングすることによりDC−53DNAプローブとハイブリダイ
ズするクローンが５個得られた。これらのクローンのう
ちの一つをλCNP6と命名し、以後の解析を行った。
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［3xSSC、1xデンハー
ト液（アルブミン，ポリビニルピロリドン，フィコー
ル，各々0.2mg/ml）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SD
S］に加え、65℃にて３時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。次に２枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記DC−53DNAプローブを100万cpm、及び前記プ
レハイブリダイゼーション溶液1mlを用い、65℃にて一
夜ハイブリダイゼーションを行った。次にこのフィルタ
ーを0.1％SDSを含む3xSSC溶液で65℃30分間、３回洗浄
後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜
行った。このようにして約200万クローンをスクリーニ
ングすることによりDC−53DNAプローブとハイブリダイ
ズするクローンが５個得られた。これらのクローンのう
ちの一つをλCNP6と命名し、以後の解析を行った。
実施例3.λCNP6ファージの解析及び塩基配列の決定 A.λCNP6ファージDNAの解析 まず常法に従いλCNP6ファージからDNAを調製した。
次に、このファージDNAを制限酵素BamHI、HindIII及びP
stIを用い切断し、切断されたDNA断片をアガロースゲル
電気泳動で分離・解析した。この結果、λCNP6は約14Kb
pのブタ染色体遺伝子を含むファージであることが判っ
た。また、DC−53DNAプローブを用い、サザンブロット
解析を行った結果、約2KbpのBamHI DNA断片、約3KbpのH
indIII DNA断片、約5KbpのPstI DNA断片がDC−53DNAプ
ローブとハイブリダイズすることが判った。そこで、DC
−53DNAプローブとハイブリダイズする最も小さいBamHI
（2Kbp）DNA断片の全塩基配列を、以下に示す方法でupp
er strand、lower strand別々に決定した。
次に、このファージDNAを制限酵素BamHI、HindIII及びP
stIを用い切断し、切断されたDNA断片をアガロースゲル
電気泳動で分離・解析した。この結果、λCNP6は約14Kb
pのブタ染色体遺伝子を含むファージであることが判っ
た。また、DC−53DNAプローブを用い、サザンブロット
解析を行った結果、約2KbpのBamHI DNA断片、約3KbpのH
indIII DNA断片、約5KbpのPstI DNA断片がDC−53DNAプ
ローブとハイブリダイズすることが判った。そこで、DC
−53DNAプローブとハイブリダイズする最も小さいBamHI
（2Kbp）DNA断片の全塩基配列を、以下に示す方法でupp
er strand、lower strand別々に決定した。
B.BamHI DNA断片の塩基配列決定 まず、BamHI DNA断片upper strandの塩基配列を決定
するために、一旦、BamHI DNA断片をプラスミドベクタ
ーpUC118（宝酒造）のBamHIサイトにサブクローニング
し、pUCCNP6を作製した。次に、pUCCNP6を制限酵素XbaI
及びSphIを用いて切断し、TAKARAキロシークエンス用デ
レーションキット（宝酒造）を用いることにより、第２
図（ａ）に示したBamHI DNAの左片DNA末端を種々の長さ
にデレーションさせたプラスミド（デレーションプラス
ミド）を作製した。続いてアガロースゲル電気泳動でデ
レーションの長さを解析し、適当な長さにデレーション
されたクローンを９個選んだ。最終的には、これらのク
ローンにヘルパーファージM13K07を感染させ、一本鎖DN
A（lower strand）を回収し、このDNAをtemplateにして
Universalプライマーを用い、ジデオキシ法［SEQUENASE
（United States Biochemical Corporation）］でBamHI
DNA断片upper strandのDNA塩基配列を決定した。な
お、この方法で適当な長さのデレーションミュータント
クローンが得られず塩基配列が決定できなかった領域に
ついては、すでに決定した塩基配列を基に化学合成した
オリゴヌクレオチドKF248,KF249,KF250［第２図（ｃ）
参照］をプライマーに用い、DNA塩基配列を決定した。
するために、一旦、BamHI DNA断片をプラスミドベクタ
ーpUC118（宝酒造）のBamHIサイトにサブクローニング
し、pUCCNP6を作製した。次に、pUCCNP6を制限酵素XbaI
及びSphIを用いて切断し、TAKARAキロシークエンス用デ
レーションキット（宝酒造）を用いることにより、第２
図（ａ）に示したBamHI DNAの左片DNA末端を種々の長さ
にデレーションさせたプラスミド（デレーションプラス
ミド）を作製した。続いてアガロースゲル電気泳動でデ
レーションの長さを解析し、適当な長さにデレーション
されたクローンを９個選んだ。最終的には、これらのク
ローンにヘルパーファージM13K07を感染させ、一本鎖DN
A（lower strand）を回収し、このDNAをtemplateにして
Universalプライマーを用い、ジデオキシ法［SEQUENASE
（United States Biochemical Corporation）］でBamHI
DNA断片upper strandのDNA塩基配列を決定した。な
お、この方法で適当な長さのデレーションミュータント
クローンが得られず塩基配列が決定できなかった領域に
ついては、すでに決定した塩基配列を基に化学合成した
オリゴヌクレオチドKF248,KF249,KF250［第２図（ｃ）
参照］をプライマーに用い、DNA塩基配列を決定した。
次に、lower strandの塩基配列は2KbpのBamHI DNA断
片のupper strandをM13ファージにサブクローニング
し、これをtemplateにして、前記の方法で決定したuppe
r strandの塩基配列を基に化学合成したオリゴヌクレオ
チドプライマーKF239,KF243,KF244,KF245,KF246,KF247,
KF252,KF254［第２図（ｃ）参照］及びUniversalプライ
マーを用い、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。な
お、以上述べたDNA塩基配列決定において、Universalプ
ライマーを用い塩基配列を決定した領域を、第２図
（ｂ）に実線の矢印で示し、化学合成したオリゴヌクレ
オチドプライマーを用い塩基配列を決定した領域を、第
２図（ｂ）に破線の矢印で示した。
片のupper strandをM13ファージにサブクローニング
し、これをtemplateにして、前記の方法で決定したuppe
r strandの塩基配列を基に化学合成したオリゴヌクレオ
チドプライマーKF239,KF243,KF244,KF245,KF246,KF247,
KF252,KF254［第２図（ｃ）参照］及びUniversalプライ
マーを用い、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。な
お、以上述べたDNA塩基配列決定において、Universalプ
ライマーを用い塩基配列を決定した領域を、第２図
（ｂ）に実線の矢印で示し、化学合成したオリゴヌクレ
オチドプライマーを用い塩基配列を決定した領域を、第
２図（ｂ）に破線の矢印で示した。
以上の方法で決定したBamHI DNA断片のupperstrand塩
基配列及びこの塩基配列から予想されるエクソン部位に
コードされるアミノ酸配列を第３図に示した。
基配列及びこの塩基配列から予想されるエクソン部位に
コードされるアミノ酸配列を第３図に示した。
実施例4.ブタCNP遺伝子の発現 実施例３で単離・解析したブタCNP前駆体遺伝子（Bam
HI DNA断片）を用い、以下に述べる方法で、ブタCNP前
駆体遺伝子の構造遺伝子領域を動物細胞で発現させ、こ
の構造遺伝子から転写（transcription）されるmRNAの
構造解析、さらにこのmRNAから翻訳（translation）さ
れるタンパクの解析を行った。
HI DNA断片）を用い、以下に述べる方法で、ブタCNP前
駆体遺伝子の構造遺伝子領域を動物細胞で発現させ、こ
の構造遺伝子から転写（transcription）されるmRNAの
構造解析、さらにこのmRNAから翻訳（translation）さ
れるタンパクの解析を行った。
A.ブタCNP構造遺伝子発現ベクターpSV2CNPの作製 第４図に示すように、まずプラスミドベクターpSV2dh
fr（Bethesda Reserch Laboratories Inc.製）を制限酵
素Bgl IIで切断し、続いてDNAポリメラーゼ（Klenow fr
agment）を用いてBgl II切断部位を平滑末端とした後、
制限酵素HindIIIで処理することにより、pSV2dhfrから
マウスデヒドロ葉酸還元酵素（mouse dhfr）のcDNA領域
を除いた。
fr（Bethesda Reserch Laboratories Inc.製）を制限酵
素Bgl IIで切断し、続いてDNAポリメラーゼ（Klenow fr
agment）を用いてBgl II切断部位を平滑末端とした後、
制限酵素HindIIIで処理することにより、pSV2dhfrから
マウスデヒドロ葉酸還元酵素（mouse dhfr）のcDNA領域
を除いた。
次に、プラスミドpUCCNPdel（このプラスミドは実施
例３において、BamHI DNAフラグメントのupper strand
DNA塩基配列を決定する際に作製したデレーションプラ
スミドの中の一つで、第３図に示したBamHI DNA断片の
５′−末端から166bpがデレーションしている。尚、本
プラスミドにより形質転換された宿主細胞は、Escheric
hia coli SMB318と命名され、工業技術院微生物工業技
術研究所に1990年７月10日付けで微工研条寄第2997号
（FERM BP−2997）として寄託されている。）を制限酵
素HindIIIとRsalを用い切断し、989bpからなるDNAフラ
グメントを得た。このDNAフラグメントを前記した方法
で作製したpSV2dhfrのHindIII−Bgl II DNAフラグメン
トとライゲートさせることにより、ブタCNP構造遺伝子
発現ベクターpSV2CNPを作製した。
例３において、BamHI DNAフラグメントのupper strand
DNA塩基配列を決定する際に作製したデレーションプラ
スミドの中の一つで、第３図に示したBamHI DNA断片の
５′−末端から166bpがデレーションしている。尚、本
プラスミドにより形質転換された宿主細胞は、Escheric
hia coli SMB318と命名され、工業技術院微生物工業技
術研究所に1990年７月10日付けで微工研条寄第2997号
（FERM BP−2997）として寄託されている。）を制限酵
素HindIIIとRsalを用い切断し、989bpからなるDNAフラ
グメントを得た。このDNAフラグメントを前記した方法
で作製したpSV2dhfrのHindIII−Bgl II DNAフラグメン
トとライゲートさせることにより、ブタCNP構造遺伝子
発現ベクターpSV2CNPを作製した。
B.pSV2CNPから転写されるmRNAの解析 ブタCNP構造遺伝子から転写（transcription）される
mRNAの構造解析は以下に述べる方法で行った。
mRNAの構造解析は以下に述べる方法で行った。
まず、プラスミドpSV2CNP（10μｇ）をサル腎臓由来C
OS−１細胞（7.5x105cell）にCellphect Transfection
Kit（ファルマシア社）を用い導入した。次に、この細
胞（COS−1/pSV2CNP）を10％FCS（Fetal Carf Serum,GI
BCO社）を含む、DMEM（Darbeco′s Modified Eager′s
Medium,GIBCO社）培地8mlで37℃、５％CO2存在下72時間
培養した後、培養上清と細胞を分離した。なお、このよ
うにして得た培養上清は−70℃に保持し、後述するタン
パクの解析に用い、また、細胞は以後述べるmRNAの解析
に用いた。
OS−１細胞（7.5x105cell）にCellphect Transfection
Kit（ファルマシア社）を用い導入した。次に、この細
胞（COS−1/pSV2CNP）を10％FCS（Fetal Carf Serum,GI
BCO社）を含む、DMEM（Darbeco′s Modified Eager′s
Medium,GIBCO社）培地8mlで37℃、５％CO2存在下72時間
培養した後、培養上清と細胞を分離した。なお、このよ
うにして得た培養上清は−70℃に保持し、後述するタン
パクの解析に用い、また、細胞は以後述べるmRNAの解析
に用いた。
まず、前記した細胞（COS−1/pSV2CNP）約107個か
ら、グアニジン−チオシアネート法を用い、全RNA（tot
al RNA）800μｇを抽出した。次に、このtotal RNA 800
μｇを抽出した。次に、このtotal RNA 800μｇからオ
リゴ（dT）セルロースカラムを用い、poly（Ａ）＋RNA
を約150μｇ調製した。続いて、10μｇのpoly（Ａ）＋R
NAを用いて、Okayama−Bergの方法（Molec.Cell Biol.2
161−170,1982）により、cDNAライブラリーを作製し、
約2x105個のindependentクローンを得た。このcDNAライ
ブラリー約4x103個を、実施例１で作製したDC−53 DNA
プローブを用い、常法に従いスクリーニングした結果、
DC−53 DNAプローブとハイブリダイズするクローンを
得、このクローンをDH1/pCNPcDNA1と命名した。
ら、グアニジン−チオシアネート法を用い、全RNA（tot
al RNA）800μｇを抽出した。次に、このtotal RNA 800
μｇを抽出した。次に、このtotal RNA 800μｇからオ
リゴ（dT）セルロースカラムを用い、poly（Ａ）＋RNA
を約150μｇ調製した。続いて、10μｇのpoly（Ａ）＋R
NAを用いて、Okayama−Bergの方法（Molec.Cell Biol.2
161−170,1982）により、cDNAライブラリーを作製し、
約2x105個のindependentクローンを得た。このcDNAライ
ブラリー約4x103個を、実施例１で作製したDC−53 DNA
プローブを用い、常法に従いスクリーニングした結果、
DC−53 DNAプローブとハイブリダイズするクローンを
得、このクローンをDH1/pCNPcDNA1と命名した。
続いて、常法に従いこのクローンからプラスミド（pC
NPcDNA1）を分離・精製し、種々の制限酵素で切断し解
析した。この結果、pCNPcDNA1は約1.4KbのcDNAを含んで
いることが判った。最終的なmRNAの解析は、この1.4Kb
のcDNAを一旦M13ファージにサブクローニングし、SEQUE
NASE（United States Biochemical Corporation）を用
い、ジデオキシ法で、このDNA塩基配列を決定すること
により行った。第５図にこのようにして決定したcDNAの
DNA塩基配列と、このDNA塩基配列から予想されるアミノ
酸一次配列を示した。
NPcDNA1）を分離・精製し、種々の制限酵素で切断し解
析した。この結果、pCNPcDNA1は約1.4KbのcDNAを含んで
いることが判った。最終的なmRNAの解析は、この1.4Kb
のcDNAを一旦M13ファージにサブクローニングし、SEQUE
NASE（United States Biochemical Corporation）を用
い、ジデオキシ法で、このDNA塩基配列を決定すること
により行った。第５図にこのようにして決定したcDNAの
DNA塩基配列と、このDNA塩基配列から予想されるアミノ
酸一次配列を示した。
C.CNPmRNAから翻訳されるタンパクの解析 CNPmRNAから翻訳されるタンパクの解析は、まず、実
施例４−Ｂで調製したCOS−1/pSV2CNP上清液（75ml）を
溶解し、Seppakを用いて濃縮・脱塩した。次に、このサ
ンプルを凍結乾燥した後、1M酢酸溶液5mlに溶解した。
続いて、この溶解液に含まれるタンパク・ペプチドをSe
phadexG−75カラム（1.8x137cm,ファルマシア社）を用
い、分子量別に分画した（流速:7.7ml/hr、画分サイズ:
5ml）。最終的には、各溶出画分の一部（40μｇ）を抗C
NP−22抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）系
に供し［このRIA系に関しては、本発明者らによるブタ
新規生理活性ペプチド（CNP−53）の特許に詳細に記載
されている］、各画分に存在する抗CNP−22抗体に免疫
活性を示すペプチド及びタンパク（ir−CNP−22）を定
量した。この結果、第６図に示すように、分子量約16K
の溶出画分（画分番号36〜44）と分子量３〜10Kの溶出
画分（画分番号45〜66）に、抗CNP−22抗血清に対し免
疫活性を示すタンパク及びペプチドが存在していること
が判った。なお、前記RIAの結果、COS−1/pSV2CNPの培
養上清75ml中に抗CNP−22抗血清に対し免疫活性を示す
タンパク及びペプチドがCNP−22換算で150ng存在してい
ることが判った。
施例４−Ｂで調製したCOS−1/pSV2CNP上清液（75ml）を
溶解し、Seppakを用いて濃縮・脱塩した。次に、このサ
ンプルを凍結乾燥した後、1M酢酸溶液5mlに溶解した。
続いて、この溶解液に含まれるタンパク・ペプチドをSe
phadexG−75カラム（1.8x137cm,ファルマシア社）を用
い、分子量別に分画した（流速:7.7ml/hr、画分サイズ:
5ml）。最終的には、各溶出画分の一部（40μｇ）を抗C
NP−22抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）系
に供し［このRIA系に関しては、本発明者らによるブタ
新規生理活性ペプチド（CNP−53）の特許に詳細に記載
されている］、各画分に存在する抗CNP−22抗体に免疫
活性を示すペプチド及びタンパク（ir−CNP−22）を定
量した。この結果、第６図に示すように、分子量約16K
の溶出画分（画分番号36〜44）と分子量３〜10Kの溶出
画分（画分番号45〜66）に、抗CNP−22抗血清に対し免
疫活性を示すタンパク及びペプチドが存在していること
が判った。なお、前記RIAの結果、COS−1/pSV2CNPの培
養上清75ml中に抗CNP−22抗血清に対し免疫活性を示す
タンパク及びペプチドがCNP−22換算で150ng存在してい
ることが判った。
［発明の効果］ 本発明では、まずブタ染色体遺伝子の中からCNP−53
をコードしているDNA領域をPCRを用い特異的に増幅さ
せ、DNAプローブ（DC−53）を作製した。続いて、DC−5
3を用い、ブタCNP（CNP−22,CNP−53）前駆体タンパク
をコードする染色体遺伝子を単離し、その構造を明らか
にした。この結果、第３図に示すように、本発明で単離
したBamHI DNA断片は、ブタCNP前駆体タンパクの全アミ
ノ酸配列をコードする構造遺伝子（structural gene）
領域（ただし、ブタCNP前駆体タンパクは、この構造遺
伝子領域で２つのエクソンに分かれてコードされてい
る）のみならず、ブタCNP遺伝子のプロモーター領域を
も含んでいることが判った。
をコードしているDNA領域をPCRを用い特異的に増幅さ
せ、DNAプローブ（DC−53）を作製した。続いて、DC−5
3を用い、ブタCNP（CNP−22,CNP−53）前駆体タンパク
をコードする染色体遺伝子を単離し、その構造を明らか
にした。この結果、第３図に示すように、本発明で単離
したBamHI DNA断片は、ブタCNP前駆体タンパクの全アミ
ノ酸配列をコードする構造遺伝子（structural gene）
領域（ただし、ブタCNP前駆体タンパクは、この構造遺
伝子領域で２つのエクソンに分かれてコードされてい
る）のみならず、ブタCNP遺伝子のプロモーター領域を
も含んでいることが判った。
次に、この染色体遺伝子の構造遺伝子領域をサル腎臓
由来COS−１細胞で発現させ、この構造遺伝子から転写
されたmRNAの構造（cDNAの構造）、さらには、このmRNA
から翻訳されたタンパクの解析を行った。これらの結
果、まずブタCNP前駆体タンパクは、第５図に示すアミ
ノ酸一次配列を持つ全体で126アミノ酸残基からなるポ
リペプチドであることを見いだした。次に、この前駆体
タンパク（pre pro CNP）のＮ−末端領域にはシグナル
ペプチドが存在し、生体内においてCNP−22,CNP−53は
いずれも細胞外へ分泌されるペプチドであることが判っ
た。さらに、ブタCNP構造遺伝子を動物細胞で発現させ
ることにより、抗CNP−22抗体に対し免疫活性を示すペ
プチド及びタンパクを生産させることができることを見
いだした。
由来COS−１細胞で発現させ、この構造遺伝子から転写
されたmRNAの構造（cDNAの構造）、さらには、このmRNA
から翻訳されたタンパクの解析を行った。これらの結
果、まずブタCNP前駆体タンパクは、第５図に示すアミ
ノ酸一次配列を持つ全体で126アミノ酸残基からなるポ
リペプチドであることを見いだした。次に、この前駆体
タンパク（pre pro CNP）のＮ−末端領域にはシグナル
ペプチドが存在し、生体内においてCNP−22,CNP−53は
いずれも細胞外へ分泌されるペプチドであることが判っ
た。さらに、ブタCNP構造遺伝子を動物細胞で発現させ
ることにより、抗CNP−22抗体に対し免疫活性を示すペ
プチド及びタンパクを生産させることができることを見
いだした。
本発明により、ブタCNP前駆体の遺伝子及びcDNAが単
離・同定されたことから、今後これらをDNAプローブと
して用いれば、ブタ以外の動物細胞由来CNP遺伝子また
はcDNAが単離でき、これらを解析することにより、ブタ
を除く他の動物のCNPを同定することができる。また、
本発明実施例４−Ｃも含め、ブタCNP前駆体をコードす
る遺伝子またはcDNAを動物細胞で発現させ、細胞外へ分
泌されるタンパクあるいはペプチドを単離・同定すれ
ば、ブタCNP生合成機構をさらに詳しく解明することが
できる。特に、今まで生体内から単離・同定されていな
いPrePro CNPからシグナルペプチドが除去されたPro CN
Pの構造、さらにはCNP−53のＮ−末端にさらにアミノ酸
が付加した種々のペプチド類［Pre Pro CNPのアミノ酸
一次配列番号で24から73番目の間には、少なくとも５個
のリジン（Lys）残基（30,51,52,55及び65番目）と３個
のアルギニン（Arg）残基（33,68及び70番目）が存在
し、Pro CNPは生体内においてプロセッシング酵素によ
り、これら塩基性アミノ酸残基のＣ−末端側が特異的に
切断される可能性があり、生体内において今まで同定さ
れているCNP−22,CNP−53以外にCNP−53のＮ−末端にア
ミノ酸がさらに付加したペプチドが存在している可能性
が高い。］を単離・同定することができ、これらの生理
活性を調べることができる。
離・同定されたことから、今後これらをDNAプローブと
して用いれば、ブタ以外の動物細胞由来CNP遺伝子また
はcDNAが単離でき、これらを解析することにより、ブタ
を除く他の動物のCNPを同定することができる。また、
本発明実施例４−Ｃも含め、ブタCNP前駆体をコードす
る遺伝子またはcDNAを動物細胞で発現させ、細胞外へ分
泌されるタンパクあるいはペプチドを単離・同定すれ
ば、ブタCNP生合成機構をさらに詳しく解明することが
できる。特に、今まで生体内から単離・同定されていな
いPrePro CNPからシグナルペプチドが除去されたPro CN
Pの構造、さらにはCNP−53のＮ−末端にさらにアミノ酸
が付加した種々のペプチド類［Pre Pro CNPのアミノ酸
一次配列番号で24から73番目の間には、少なくとも５個
のリジン（Lys）残基（30,51,52,55及び65番目）と３個
のアルギニン（Arg）残基（33,68及び70番目）が存在
し、Pro CNPは生体内においてプロセッシング酵素によ
り、これら塩基性アミノ酸残基のＣ−末端側が特異的に
切断される可能性があり、生体内において今まで同定さ
れているCNP−22,CNP−53以外にCNP−53のＮ−末端にア
ミノ酸がさらに付加したペプチドが存在している可能性
が高い。］を単離・同定することができ、これらの生理
活性を調べることができる。
さらに、第３図に示すブタCNP前駆体タンパクの遺伝
子は、ブタCNP前駆体タンパクをコードする構造遺伝子
領域のみならず、この構造遺伝子を発現させる（transc
ription）プロモーター領域をも含んでいることが判っ
た。CNP−22及びCNP−53が脳から単離されたことを考え
ると、このプロモーターは脳で特異的に作用している可
能性が高い。従って、このプロモーターの下流に適当な
蛋白質をコードする遺伝子をつなぎ、これを用いトラン
スジェニックマウスを作製すれば、該蛋白質をトランス
ジェニックマウスの脳内で特異的に発現させることがで
き、該蛋白質の生理作用を個体レベルで解析することが
可能となる。
子は、ブタCNP前駆体タンパクをコードする構造遺伝子
領域のみならず、この構造遺伝子を発現させる（transc
ription）プロモーター領域をも含んでいることが判っ
た。CNP−22及びCNP−53が脳から単離されたことを考え
ると、このプロモーターは脳で特異的に作用している可
能性が高い。従って、このプロモーターの下流に適当な
蛋白質をコードする遺伝子をつなぎ、これを用いトラン
スジェニックマウスを作製すれば、該蛋白質をトランス
ジェニックマウスの脳内で特異的に発現させることがで
き、該蛋白質の生理作用を個体レベルで解析することが
可能となる。
以上述べたことから、本発明により明らかにされたブ
タCNP前駆体タンパクの染色体遺伝子、cDNA及びアミノ
酸一次配列の情報は、今後哺乳類におけるCNPの生合
成、生理作用のメカニズムを解明する上で、また、CNP
ファミリーに属するペプチドを医薬品へと応用する上
で、大いに貢献するものである。
タCNP前駆体タンパクの染色体遺伝子、cDNA及びアミノ
酸一次配列の情報は、今後哺乳類におけるCNPの生合
成、生理作用のメカニズムを解明する上で、また、CNP
ファミリーに属するペプチドを医薬品へと応用する上
で、大いに貢献するものである。
第１図は、ブタ染色体遺伝子からPCRを用いCNP−53をコ
ードする遺伝子領域を特異的に増幅するために用いた合
成DNAプライマー（KF225,KF226）及び、この遺伝子を単
離するために用いたDNA混合プローブ（KF206）の塩基配
列をCNP−53のアミノ酸一次配列と共に示す図である。
なお、図１においてKF206の塩基配列中ＮはＡ、Ｔ、Ｃ
又はＧのいずれかを示す。 第２図は、ブタCNP前駆体タンパクの染色体遺伝子（Bam
HI DNA断片）の制限酵素地図（ａ）、この遺伝子のDNA
塩基配列決定のストラテジー（ｂ）及び塩基配列決定に
用いた合成DNAプライマーの塩基配列をそれぞれ示す図
である。 第３図は、ブタCNP前駆体タンパクをコードする染色体
遺伝子（BamHI DNA断片）のDNA塩基配列と構造遺伝子領
域のエクソンにコードされているブタCNP前駆体タンパ
クのアミノ酸一次配列を示す図である。 第４図は、動物細胞発現ベクターpSV2CNPの作製法を示
す説明図である。 第５図は、CNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされる
ブタCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図で
ある。 第６図は、COS−1/pSV2CNP1細胞の培養上清に含まれる
タンパク及びペプチドをセファッデクスＧ−75ゲル濾過
カラムで分離した時の溶出パターンと各溶出画分の抗CN
P−22抗血清に対する免疫活性を示すチャートである。 なお、このカラムにおけるγ−rANP（１）とα−rANP
（２）の溶出位置を矢印で示す。
ードする遺伝子領域を特異的に増幅するために用いた合
成DNAプライマー（KF225,KF226）及び、この遺伝子を単
離するために用いたDNA混合プローブ（KF206）の塩基配
列をCNP−53のアミノ酸一次配列と共に示す図である。
なお、図１においてKF206の塩基配列中ＮはＡ、Ｔ、Ｃ
又はＧのいずれかを示す。 第２図は、ブタCNP前駆体タンパクの染色体遺伝子（Bam
HI DNA断片）の制限酵素地図（ａ）、この遺伝子のDNA
塩基配列決定のストラテジー（ｂ）及び塩基配列決定に
用いた合成DNAプライマーの塩基配列をそれぞれ示す図
である。 第３図は、ブタCNP前駆体タンパクをコードする染色体
遺伝子（BamHI DNA断片）のDNA塩基配列と構造遺伝子領
域のエクソンにコードされているブタCNP前駆体タンパ
クのアミノ酸一次配列を示す図である。 第４図は、動物細胞発現ベクターpSV2CNPの作製法を示
す説明図である。 第５図は、CNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされる
ブタCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列を示す図で
ある。 第６図は、COS−1/pSV2CNP1細胞の培養上清に含まれる
タンパク及びペプチドをセファッデクスＧ−75ゲル濾過
カラムで分離した時の溶出パターンと各溶出画分の抗CN
P−22抗血清に対する免疫活性を示すチャートである。 なお、このカラムにおけるγ−rANP（１）とα−rANP
（２）の溶出位置を矢印で示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 南野 直人 大阪府吹田市青山台３丁目50，Ｄ―10― 303 (72)発明者 田中 正治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (72)発明者 渕村 佳代子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (72)発明者 俵木 保典 東京都千代田区麹町５―７―２ 第31森 ビル サントリー株式会社創薬推進部内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 1/00 - 41/00 C07K 14/00 - 14/825 C12N 1/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (13)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチ
ド。 - 【請求項３】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端側の１位乃至73位のいずれか２個の隣接するアミノ
酸残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損している
ポリペプチド。 - 【請求項４】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（CNP−22）をコードするDNA。 - 【請求項５】前記のDNAが下記に示される塩基配列であ
る請求項４記載のDNA。 - 【請求項６】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（CNP−53）をコードするDNA。 - 【請求項７】前記のDNAが下記に示される塩基配列であ
る請求項６記載のDNA。 - 【請求項８】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするDNA。 - 【請求項９】前記のDNAの下記の塩基配列を有する請求
項８記載のDNA。 - 【請求項１０】下記のアミノ酸配列において、Ｎ末端か
らシグナルペプチドが欠損しているポリペプチドをコー
ドするDNA。 - 【請求項１１】下記のアミノ酸配列においてＮ末端側の
１位乃至73位のいずれか２個の隣接するアミノ酸残基間
が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損しているポリペプ
チドをコードするDNA。 - 【請求項１２】下記の塩基配列を有するDNA。
- 【請求項１３】下記の塩基配列を有するDNA。
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| DE69133591T DE69133591T2 (de) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | CNP-Gen und Vorläuferprotein aus Schwein |
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| PL3404102T3 (pl) | 2004-04-21 | 2021-12-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Koniugaty do dostarczania do kości i sposób ich wykorzystania do nakierowywania białek na kość |
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| MX2011012277A (es) * | 2009-05-20 | 2011-12-12 | Biomarin Pharm Inc | Variantes de peptidos natriureticos de tipo c. |
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| CA2852874A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Alexion Pharma Holding | Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof |
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-
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- 1991-07-12 DE DE69128664T patent/DE69128664T2/de not_active Expired - Lifetime
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