JPH0474199A - ブタｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、ブタ由来ＣＮ　Ｐ　（Ｃ−ｔｙｐｅ　ｎ５ｌ
ｒｉ　−ｕｒｅｔｉｅ　ｐｅｐｔｉｄｓ）の遺伝子、そ
のｃＤＮＡ及びブタ由来ＧＮＰの前駆体蛋白に関する。

［発明の背景〕 近年、生体内の体液及び血圧の恒常性を調節するホルモ
ンまｔ；は神経伝達物質として、心房性ナトリウム利尿
ペプチド（ＡＮＰ）、及び脳ナトリウム利尿ペプチド（
Ｂ　Ｎ　Ｐ）と呼ばれる２種類の異なったペプチドファ
ミリーに帰属されるペプチド類が発見され、それらの構
造及び生合成機構が明らかにされると共に、これらの生
理作用についても明らかにされてきた。

一方、ごく最近本発明者らにより、ブタ脳からＣ−タイ
プナトリウム利尿ペプチド（Ｃ−ｔｙｐｅｎａｔｒｉｃ
ｒｅｋｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ：　ＣＮＰ）と名付けられ
たナトリウム利尿ペプチドの第３のファミリーに属する
新規ペプチドが発見されてきた。

ＡＮＰ発見への最初の手がかりは、１９８１年ｄｅ　Ｂ
ｏｌｄらにより報告された。すなわち、彼らはラット心
房粗抽出液を他のラットに静注すると著しい利尿を生ず
ることを見いだし、心房中にナトリウム利尿を促進する
因子が存在していることを報告した（ｄｅ　Ｂｏｌｄ　
Ａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、Ｌｉ１ｅ　Ｓｃｉ、、　Ｈ８９゜
１９Ｎ）。　その後、この因子は寒用らによりヒト心房
より単離、その構造が明らかにされ、心房性ナトリウム
利尿ペプチド（ＡＮＰ）と命名され（ＫｘＢ＊ｖｔ、に
、ｔｌ　　ｉｔ、　　Ｂｉａｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ｒｅｓ、ＣｏｍｍｕｎＩＮ　　Ｈｌ、１９ｇ４；　　
Ｋｔ＋＋ｇｘｖｉ、に、ｅｌ　　ｘｌ、Ｎａ１ｕｒｔ、
３１３　３９７１Ｈ５：　　特公昭６３−１９５２０号
、特開昭６０−１８４０９８号、特開昭６０−２６０５
９６号）。ヒトＡＮＰ　（ｈＡＮＰ）は心房において分
子量の異なる３種類、すなわちα型、β型、およびγ型
が存在しており、σ型ｈＡＮＰ（σ−ｈＡＮＰ）は分子
内に１個のＳ−８結合を有した２８個のアミノ酸からな
る一重鎖ペプチドであること、β型ｈＡＮＰ　（β−ｈ
ＡＮＰ）はα−ｈＡＮＰが分子間でＳ−５結合を形成し
た逆平行２量体であること、γ型ｈＡＮＰ　（γ−ｈＡ
ＮＰ）は１２６個のアミノ酸からなる高分子蛋白質で、
そのＣ−末端部分にσ−ｈＡＮＰを含んでいることが明
らかにされた。

さらに、ｈＡＮＰに対するｃＤＮＡが単離され、この解
参からａ−１β−１γ−ｈＡＮＰの生合成経路が判り、
これらはいずれも共通の前駆体タンパクから生合成され
ることが判った（Ｏｉｋｓｖｓ、Ｓ。

ｅｌ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０９７２４．１９０
）。

なお、これらｈＡＮＰのうちａ−ｈＡＮＰが主に血中に
分泌されていることが判っている。

ｈＡＮＰの構造が明らかにされて以来、現在までに他の
哺乳類のＡＮＰ構造も明らかにされてきている（特開昭
６０−１８４０９７号、特開昭６１−７２９８号）。こ
の結果、ＡＮＰのアミノ酸配列は、げつ歯頚からヒトま
で哺乳類動物において広い範囲で類似しており、特にα
型ＡＮＰ　（αＡＮＰ）はヒト・イヌ・ブタを含む高等
哺乳類においては同一のアミノ酸配列を持つこと、また
、ラット及びウサギではσ−ｈＡＮＰの１２位メチオニ
ン残基がインロインン残基に一筺所置換している以外全
く同一のアミノ酸配列を有していることが判ってきてい
る（ＯｉｋｘｖＪ、Ｓ、！ｔ　＊ｌ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ
、Ｅｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｓｓ、Ｃｏｍｍｕ＋＋、、　Ｈ
２ｇ９２．１９８５；　ＦｏｒｓｓｍｘｎｎＷ、Ｇ、ｅ
ｔ　＊ｌ、Ａｎｘｆ、Ｅ＋ｂｒｙｏ１．，１６８３０７
．１９８３）　。

最初ＡＮＰは心房より単離されたが、ＡＮＰに対する抗
体を作製し、生体内における分布を調べたところ、ＡＮ
Ｐは心房以外にも脳にも存在していることが判った。た
だし、脳ではσ−ＡＮＰのＮ−末端がさらに切断され短
縮されたσ−ＡＮＰ［４−１１、α−ＡＮＰ　［５−Ｈ
ｌが存在している（［Ｉｅｄｉ、Ｓ、ｓｊ　　ｘｉ、　
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
ｕｏ、。

１１９１ｏｓ５，１９８７）。脳では視床下部、橋被蓋
（ｐａｎＬｉｏｔｔｅｇｍｃｎｔｕｍ）にＡＮＰ含有ニ
ューロンの存在が報告されていることから（ＣｉｎＩｉ
ｎ、Ｍ、ｔｔ　＊Ｉ。

ｌｉｉｓｆｏ−ｅｈｅｍｉｓｔ「ｙ、　８０１１３，１
９８４；　　５ａｐｅｒ、Ｃ，Ｂ、ｔＩａｔ、　５ｃｉ
ｓｎｃｅ、　０７１０４７．１９８５）、　ＡＮＰは現
在脳において心血管系の調節にかかわる神経伝達物質と
しても作用しているのではないかと考えられている。　
ＡＮＰの生理作用は前にも述べたが、顕著なナトリウム
利尿作用を示すのみならず、血圧降下作用さらには副腎
皮質のアルドステロン産生を抑制することが判ってきた
。従って、現在ＡＮＰは心房から血中に分泌され、体液
及び血圧の恒常性を調節するホルモンとして作用するの
みならず、脳では神経系の神経伝達物質として作用し、
体液及び血圧の恒常性を調節していることが判ってきた
。　一方、ＢＮＰは１９８８年５ａｄｏｈらによりブタ
脳から単離・同定されｔ；ペプチドである（Ｓｕｄｏｈ
、Ｔ、ｓｔ　＊ｌ、　Ｎ１ｔｕｒｃ、　３１２　Ｎ、＋
９８１）。

５ｕｄｏｈらにより最初にブタ脳から単離されたＢＮＰ
　（＋）ＢＮＰ−２６）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を
持つアミノ酸２６残基より成るペプチドで、その構造、
すなわちアミノ酸−次配列、及びＳ−８結合様式（アミ
ノ酸１７残基で構成される環状構造）はＡＮＰと似てい
るが、ＡＮＰとは明らかに区別されるペプチドである。

さらにこのペプチドはＡＮＰと同様、ナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことが確認されたことから、
このペプチドは脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）と
命名されプニ。その後、ブタ脳からｐＢＮＰ−２６のＮ
−末端に６個のアミノ酸が付加した３２アミノ酸残基よ
りなるｐＢＮＰ−３２も単離され（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ。

ｅｔ　　！１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１５５　０６゜１９０）
　、またブタ心房からはγ−ＢＮＦと命名されたアミノ
酸１０６個からなるペプチドも単離・同定されている（
Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、ｓＬ　！Ｉ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋
ａ、８ｉ。

ｐｈｙｓ、Ｒｔｓ、ｃｏｍｍｕｔｒ、、　１５７４０２
．１９０）　。

さらに、現在までにヒト及びラットＢＮＰのｃＤＮＡが
単離され、これらのＢＮＰの前駆体構造も明らかになっ
ている（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ、ｅｌ　ａｔ、　Ｂｉａｃｂｅ
ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｏ、、　　１５９
　１４２７．　１９Ｎ；　　Ｋｏｊｉｍａ。

Ｍ、　　ｅｔ　　！１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｏ、、　　１５９１４２０．１
９８９）　　。

これらの結果、これらＢＮＰ７７ミリーに属するペプチ
ド類はＡＮＰとは全く異なった前駆体から生合成される
ことが判った。

前述したように、ＢＮＰは最初脳より単離されたが、ブ
タ脳においてＢＮＰはＡＮＰに比べ１０倍量存在してい
ること、さらにはＡＮＰと同様心房にも存在しくただし
、心房でのＢＮＰの存在量はＡＮＰの２〜３％）、心房
から血中へ分泌されていることが判った（Ｍｉｎｓｍｉ
ｎｏ、Ｎ、ｅｔ　１１．　Ｂｉｏｃｂｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ＋＋、、　　１５
５　７４０．１９０；　　Ａｂ＋＋ｒｓｙ３Ｍ、　　ｅ
ｔ　　＊ｌ、　　Ｂｉｏｃｂｓｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１６５ｇ７２．　＋！＄９
）。これらの事笑から、ＢＮＰはＡＮＰと同様、脳にお
いては神経伝達物質として、また心房から血中へ分泌さ
れるホルモンとして作用し、体液及び血圧の恒常性を調
節していることが判った。　ところで、ナトリウム利尿
ペプチドのように、生体におけるある生理的作用（例え
ば、体液及び血圧の恒常性）の調節に単一ペプチドでは
なく、複数のペプチドが関与している例として、現在ま
でにオピオイドペプチド（Ｏｐａｉｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ
）、タヒキニン（ｔｉｃｈｙｋｉｎｉａ）さらにはエン
ドセリン（！ａｄｏＬｈｅｌｉｎ）などが知られている
。これらの例では、いずれも３種の異なるペプチドファ
ミリーが存在していることが知られている（ｌｆａｌｌ
ｔ。

Ｖ、、　　Ｔｒｅｎｄ　　Ｎｅｕｒｏ　　Ｓｃｉ、、　
　６　　Ｎ、１９ｇ３；　　Ｎｘｋｃｏｉｓｂｉ。

Ｓ、　Ｆｈｙｓｉｏｌ、Ｒｓｖｉｅｖ、　６７１１１７
．１９１７；　ＩｎｏＩＩｅ、Ａ、ｅ（＊ｌ、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎｘｊ１．Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、人、、　８
６２８６３．１９８９）このことから、ナトリウム利尿
作用を示すペプチドも現在までに判っているＡＮＰ−Ｂ
ＮＰファミリーに帰属されるペプチド類以外に、第３の
ファミリーに帰属されるペプチド類が存在している可能
性が高まった。この点に関し、ごく最近本発明者らはブ
タ脳から、ＡＮＰ−ＢＮＰファミリーのいずれにも属さ
ない、すなわち、ナトリウム利尿ペプチドの第３の７７
ミリーに属する新規ペプチドを２種見いだすことに成功
し、これらのペプチドをＧ　Ｎ　Ｐ　（Ｃ−ｔｙｐｅ　
ｎａｔｒｉｕｒｔｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ）と命名した
。

最初に発見されたＧＮＰはアミノ酸残基２２個からなる
ペプチドで（以後、本発明ではこのペプチドをＧＮＰ−
２２と略す）、その構造はＡＮＰ−ＢＮＰと似ているが
、これらとは明らかに異なっている。すなわち、ＧＮＰ
−２２はＡＮＰ−ＢＮＰと同様分子内Ｓ−８結合に基づ
く１７アミノ酸残基で構成される環状構造を持ち、しか
もこの環状構造を形成しているアミノ酸−次配列にはＧ
ＮＰ−２２、ａ−ＡＮＰ、ＢＮＰ　　３２の間で高い相
同性がある。実際１７アミノ酸残基のうち、１２アミノ
酸残基は同じであった。

しかしながら、ＧＮＰ−２２の構造は、この環状構造部
分を除くと、Ｎ−及びＣ−末端部分でα−ＡＮＰ、ＢＮ
Ｐ−３２と全く異なっている。特に特徴的なことは、Ｃ
−末端部分の構造で、α−ＡＮＰ、ＢＮＰ−３２には、
環状構造を形成しているシスティン残基のＣ−末端側に
はα−ＡＮＰで５個、ＢＮＰ−３２で６個のアミノ酸残
基が存在しており、いわゆるＬａ１ｌ構造が存在してい
るのに対し、ＧＮＰ−２２のＣ−末端はシスティン残基
であることから、ＧＮＰ−２２にはこの【１１１構造が
存在していない。

以上述べたように、ＧＮＰ−２２はσ−ＡＮＰ。

ＢＮＰ−３２と構造が明らかに異なることに加え、ＧＮ
Ｐ−２２をラットに投与すると、明らかなナトリウム利
尿作用及び血圧降下作用を示すことが確認されたことか
ら、ＧＮＰ−２２は生体内におけるナトリウム利尿ペプ
チドの第３のファミリーに属する新規ペプチドであるこ
とが判った（特願平２−１０５０４７号）。さらにその
後、本発明者らは、ＧＮＰ−２２に対する抗体を作製し
、この抗体に免疫活性を示すペプチドをブタ脳から精製
した。この結果、ＧＮＰ−５３と名付けたペプチドを単
離することに成功し、このペプチドの構造を解析しｔ；
結果、ＧＮＰ−５３はＧＮＰ−２２をＣ−末端に含む５
３アミノ酸残基からなるペプチド、言い換えれば、ＧＮ
Ｐ−５３はＧＮＰ−２２のＮ−末端にさらに３１個のア
ミノ酸残基が付加したペプチドであることが判った（本
発明者等の同日付は特許出願）。

以上をまとめると、現在までに、哺乳動物においては少
なくともタイプの明らかに異なる３種類（ＡＮＰ７アミ
リー、ＢＮＰ７アミリー、ＧＮＰファミリー）のナトリ
ウム利尿ペプチド類が存在し、このうち、ＡＮＰファミ
リー、ＢＮＰファミリーに属するペプチドはいずれも心
房から血中に分泌され、体液及び血圧の恒常性を調節す
るホルモンとして作用しているのみならず、これらは脳
でも生合成され、脳内においては神経系の神経伝達物質
として作用し、体液及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判ってきた。しかしながら、最近発見されたＧＮＰ
ファミリーに属するペプチド（ＧＮＰ−２２，ＧＮＰ−
５３）に関しては、脳内における存在量がＡＮＰやＢＮ
Ｐに比べきわめて少ないことから、現在までのところＧ
ＮＰの詳細な生合成機構、生体内分布及び生理作用に関
しては判っていない。

［本発明が解決すべき課題］ 本発明はブタＧＮＰ　（ＧＮＰ−２２，ＧＮＰ−５３）
及びその前駆体の遺伝子及びｃＤＮＡを単離し、これを
解析することにより、ブタＧＮＰの前駆体タンパクのア
ミノ酸−次配列を明らかにすると共に、この遺伝子にコ
ードされている全タンパクまたはその一部分を遺伝子工
学的に生産する方法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、先に単離したＧＮＰ−２２、ＣＮＰ−５
３のブタ脳内における存在量がＡＮＰ。

ＢＮＰのそれに比べきわめて少量であり、しかもこれら
ペプチドの脳内における産生組織が特定されていないこ
とから、直接ＣＮＰに対応するｃＤＮＡを単離し、この
解析からＧＮＰ前駆体タンパクの構造を明らかにするこ
とは困難であると考えた。そこで、本発明者らはＧＮＰ
遺伝子をブタ染色体から単離し、これを解析することに
よりブタＧＮＰ前駆体タンパクの構造を明らかにするこ
とを計画した。

本発明では、まずＧＮＰ遺伝子を単離するために用いる
ＤＮＡプローブの作製を以下に示す方法で行った。すな
わち、第１図に示すように、まずＧＮＰ−５３のＮ−及
びＣ−末端部分のアミノ酸沈配列に対応するＤＮＡプラ
イマー（ＫＦ２２Ｓ、ＫＦ２２６）を作製した。次に、
このプライマーを用い、５ａｉｋｉらの方法（Ｓａｉｋ
ｉ、Ｒ，に、ｔｔ　ｉｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９４
８７．１９８りに従って、ポリメラーゼ・チエイン・リ
アクション（ＰＣＲ）を行うことにより、ブタ染色体遺
伝子の中でＧＮＰ−５３のアミノ酸−次配列をフードし
ているＤＮＡ領域だけを特異的に増幅させた。さらに、
ここで増幅したＤＮＡは一旦プラスミドベクターに導入
し、目的とするＤＮＡが組み込まれたクローン（ＤＨＩ
／ｐｃＮＰ５）を単離した。

なお、この様にして得たＤＨＩ／ｐＣＮＰ５からプラス
ミドｐｃＮＰ５を回収し解析したところ、ｐＣＮＰ５は
ＰＣＲにより増幅された１４７塩基対（ｂｐ）からなる
ＤＮＡ断片（以下このＤＮＡ断片をＤＣ−５３と略す）
を含み、ＤＣ−５３はＧＮＰ−５３のアミノ酸−次配列
をコードしているＤＮＡであることを確認した。また、
この結果からＧＮＰ−５３のアミノ酸−次配列をコード
してＧする遺伝子領域には少なくともイントロン（１ｎ
ｔｒｏｎ）が含まれていないことが判った。

次に、この様にして作製したＤＮＡプローブ（ＤＣ−５
３）を用い、ブタ染色体遺伝子ライブラリー（λファー
ジにブタ染色体遺伝子断片を組み込んだもの）をスクリ
ーニングしたところ、ＤＣ５３にハイブリダイズ（ｂｙ
ｂｒｉｄｉｚｅ）するクローン（λＣＮＰ６）が得られ
た。このクローンを解析したところ、λＣＮＰ６は約＋
４Ｋｂｐのブタ染色体遺伝子を含んでおり、またこの＋
４Ｋｂｐうち、約２Ｋｂｐからなる　Ｂ！ＩＩＨＩ　Ｄ
　Ｎ　Ａ断片がＤＣ−５３ＤＮＡプローブとｈｙｂｒｉ
ｄｉｚｅすることが判った。そこでこの約２Ｋｂｐから
なるＢａｍ１ｌｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の全塩基配列を第
２図に示す方法を用い決定しｔ：。この結果、第３図に
示すようにこのＢａｍ［ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片は、ブタ
ＧＮＰ前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコードする構
造遺伝子（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ）領域のみ
ならず、ブタ染色体遺伝子のプロモーター領域をも含ん
でいることが判っｔ；。すなわち、まずプロモーター領
域に関しては、第３図に示すＤＮＡ塩基配列番号で１３
３番目からＮ８番目には真核生物遺伝子のプロモーター
領域に共通して存在するＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡ　
ｂｏｘ）が存在し、また、このＴＡＴＡ　ｂｏｘの上流
には遺伝子発現の制御に関与していると思われるＧＣｂ
ｏｘが２個、Ｙ　ｂｏｘが１個存在していることが判っ
た。これらのことから、この領域はＧＮＰ前駆体遺伝子
のプロモーター領域であることが判った。

次に、構造遺伝子領域に関しては、まず、前記したＴＡ
ＴＡ　ｂｏｘの下流（３′側）塩基配列番号３１１１か
ら３１２にムＴＧが存在し、このＡＴＧはＴＡＴＡ　ｂ
＋＋ｘの下流（３′側）で最初に現れるメチオニンコド
ンであり、しかもこのコドンの回りの塩基配列は真核生
物で知られている翻訳開始コドンのフンセンサスシーフ
ェンスＡ／Ｇ　ＮＮＡＴＧ　（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃいず
れかの塩基を示す）と一致していることから、本発明者
はこのＡＴＧがブタＣＮＰ前駆体の翻訳開始コドンであ
ると推定した。次に、もしこのムＴＧを翻訳開始コドン
とすると、この下流塩基配列番号４３０４３２番目Ｉ：
存在している翻訳終止コドン（ＴＧＡ）まで４０アミノ
酸残基をコードするオープンリーディングフレームが存
在する。しかし、このオープンリーディングフレームか
ら予測されるペプチドのアミノ酸−次配列にはＧＮＰ−
２２、ＧＮＰ−５３に対応するアミノ酸配列は出現しな
い。一方、このＢａｍ１ｌｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片には塩
基配列番号７２５から１１２６番目までＨ４アミノ酸残
基をコードするオゾンリーディングフレームが存在して
おり、このオープンリーディングフレームから予測され
るペプチドのアミノ酸−次配列の中にはＧＮＰ−２２及
びＧＮＰ−５３に対応するアミノ酸−次配列が出現する
ことが判った。これらの解析から、ブタＧＮＰの構造遺
伝子は少なくとも１個のイントロン（１ｎｔｒｏｎ）が
存在していること、言い換えればブタＧＮＰ前駆体タン
パクは遺伝子上では少なくとも２個のエクソン（ｅｘｏ
ｎ）に分かれてコードされていることが判った。このこ
とは、塩基配列番号で４００付近にスズライジングドナ
ーのコンセンサスシーフェンスとして知られているＣ／
Ａ　ＡＧＧＴＡ／Ｇ　ＡＴＧと似た塩基配列が存在する
こと、さらに、塩基配列番号８４０の５′側にはスプラ
イシングアクセプターのコンセンサスシーフェンスとし
て知られている（Ｐｙ）ｎ　Ｎ　Ｃ／Ｔ　ＡＧＧ　（Ｐ
Ｙはピリジン塩基を示し、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ，Ｇいずれか
の塩基を示す）に似た塩基配列が存在していることから
も支持される。これらのことから、本発明者らは塩基配
列番号３９９から８３８番目までのＤＮＡ領域は１０ｔ
ｒｏｎであり、この１ｎＬｒｏｎはＣＮＰ前駆体タンパ
クをコードする成熟（ｍｉｔｕｒｅ）　ｍ　ＲＮ　Ａが
できる際スプライシングにより除かれるのではないかと
考えた。つまり、ＧＮＰ前駆体タンパクは塩基配列番号
３１０から始まり、３９９で終わる第１エクソンと、８
３８から始まる第２エクソンによりコードされており、
全体ではアミノ酸Ｈ６残基からなるポリペプチドである
ことが推定された。　そこで、この推定を確かめるため
に、本発明者らは以下に述べる方法を用い、ＧＮＰ前駆
体遺伝子の構造遺伝子領域を動物細胞で発現させ、この
構造遺伝子から転写（１ｒｒｏｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）さ
れるｍ　ＲＮ　Ａの構造、さらにこのｍ　ＲＮ　Ａから
翻訳されるタンパクを解析することにした。すなわち、
本発明者らは第４図に示すように、ＧＮＰ前駆体遺伝子
の構造遺伝子領域をＳＶ４０の初期プロモーターに結合
させたプラスミドｐＳＶ２ＧＮＰを作製し、このプラス
ミドをＣＯ５−１細胞に導入することにより（この細胞
を以後ＣＯ５−１／ｐＳＶ２ＧＮＰと略す）この構造遺
伝子をＳＶ４０プロモーター支配下、動物細胞内で発現
させた。

まず、ｍＲＮＡの解析に関しては、ＣＯ３−１／ｐＳＶ
２ＣＮＰから全ＲＮＡを抽出し、続いてオリゴｄＴセル
ロースカラムを用いｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製し、これ
を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製しｔ；。次に、こ
のｃＤＮＡライブラリーをＤＣ−５３ＤＮＡを用いスク
リーニングすることにより、このＤＮＡプローブにｈｙ
ｂｒｉｄｉ！ｅするクローンＤＨＩ／ｐｃＮＰｃＤＮＡ
ｌを単離した。さらに、このクローンからプラスミドｐ
ＣＮＰｃＤＮＡ１を単離し、ｃＤＮＡ領域の全塩基配列
を決定した。この結果、第５図に示すように、ＧＮＰ遺
伝子の構造遺伝子出来のｍ５ｔｕｒｅ　ｍ　ＲＮＡ　（
ｃＤＮＡ）には本発明者が予測した１ｎＬｒｏｎに対応
する領域が存在しないことが判った。つまり、第３図の
塩基配列番号４００から８３８番目までのＤＮＡ領域は
１ｎＬｒｏｎであり、このｉｎｔｒｏｍはＧＮＰ前駆体
タンパクをコードするｍｘｔｕｒｅ　ｍ　ＲＮ　Ａがで
きる際、スプライシングにより除かれることが判った。

　このことにより、本発明者らは、最終的にＧＮＰ遺伝
子の構造遺伝子領域におけるエクソン、イントロンの位
置を確定することに成功し、さらに、ＧＮＰ前駆体タン
パクは第５図に示すアミノ酸−次配列を持つＩＮアミノ
酸残基からなるポリペプチドであることを明らかにする
ことに成功した。　なお、このようにして明らかにされ
たブタＧＮＰ前駆体タンパク（以後、本発明ではｐｒｅ
ｐｒ。

ＣＮＰと略す）のアミノ酸−次配列において、ＣＮＰ−
２２、ＧＮＰ−５３はＰｒｅＰｒｏＣＮＰのＣ−末端領
域に存在し、また、ＰｒｅＰｒｏＣＮＰのＮ−末端領域
には疎水性アミノ酸残基に富む領域（第５図アミノ酸−
次配列番号１０かも１６番目）が存在していることから
、ＰｒｅＰｒｏＣＮＰのＮ−末端領域には分泌（５ｅｃ
ｒｃｊｉｏｎ）に必要なシグナルペプチドが存在してい
る可能性が高い。

以上のことを総合的に考えると、ＧＮＰ−２２、ＧＮＰ
−５３は以下に述べる経路で生合成されることが推定さ
れる。すなわち、まず１２６アミノ酸残基からなるＰｒ
ｅＰｒｏＣＮＰがｍＲＮＡから翻訳（ｔｒｓｎｓｌｘｔ
ｉｏｎ）される。次に、このＮ−末端領域に存在するシ
グナルペプチドが分泌過程で切断されＰ　ｒ　ｏ　ＧＮ
Ｐに転換される。さらに、ＰｒｏＧＮＰはプロセッシン
グ酵素により特異的に切断され（第５図アミノ酸−次配
列番号で７３と７４の間、＋０４と１０５の間）、ＧＮ
Ｐ−５３とＧＮＰ−２２に転換される。

このことを確かめるために、本発明者らは次にＣＯ５−
１／ｐＳＶ２ＧＮＰ培養上清のタンパクを解析した。す
なわち、まずＣＯＳ　−１／　ｐ　Ｓ　Ｖ２ＧＮＰ培養
上溝液を集め、これを濃縮した。次に、この濃縮液中に
含まれるタンパク・ペプチドをセファデックスＧ−７５
を用い、分子量刑に分丙した。続いて各溶出画分の一部
を抗ＣＮＰ−２２抗血清を用いたラジオイムノアッセイ
（ＲＩ　Ａ）に供し、各両分に存在する抗ＣＮＰ−２２
抗体に免疫活性を示すペプチド及びタンパクを定量した
。

この結果、第６図に示すように、分子量約１６にの溶出
画分と分子量約３〜ＩＯＫの溶出画分に、抗ＣＮＰ−２
２抗血清に対し免疫活性を示すタンパク及びペプチドが
存在していることが判った。この結果から、ＣＯ３−１
／ｐＳＶ２ＧＮＰ細胞ニオいてＰｒｏＧＮＰは分泌発現
されることが判り、また、分子量約３〜７に付近に抗Ｃ
ＮＰ−２２抗血清に対し免疫活性を示すペプチドが存在
していることから、ＣＯ５−１細胞でＰ　ｒ　ｏ　ＧＮ
Ｐの一部分は、さらに低分子ペプチドｉｔ（ただし、こ
れらペプチド類はすべてそのＣ−末端領域にＧＮＰ−２
２構造を持っている）に転換されることが判った。

以上まとめると、本発明者らはブタＧＮＰ　（ＧＮＰ−
２２，ＧＮＰ−５３）前駆体タンパクをコードする染色
体遺伝子及びｃＤＮＡを単離し、これらを解析すること
により、ブタＧＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸−次配列
を明らかにすると共に、この遺伝子またはｃＤＮＡにコ
ードされているタンパク及びその一部分を遺伝子工学的
方法を用い生産させることに成功し、本発明を完成させ
た。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

ＧＮＰ−５３のアミノ酸−次配列をコードしている染色
体遺伝子領域を、以下に示す方法を用いｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏで増幅した。まず、第１図に示すＣＮＰ５３のＮ−及
びＣ−末端領域のアミノ酸−次配列に対応するＤＮＡプ
ライマーを２種（Ｉ［Ｆ２ｘｓ４Ｆ２２６）化学合成し
た。ただし、ＫＦ２２５、ＫＦ２２６の５′末端領域に
は、遺伝子増幅した後この遺伝子を容易にサブクローニ
ングできるように、制限酵素Ｐｓ口認識部位を人工的に
導入した（第１図アルファベット小文字で示した塩基が
人工的に変換した塩基である）。次に、このＤＮＡプラ
イマーを用いＳ！ｉｋｉらの方法（Ｓｉｉｋｉ、Ｒ，に
、ｔｔ　ｔｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９４０．１９８８）に従いポリ
メラーゼ・チエイン・リアクション（ＰＣＲ）を行った
。すなわち、ＫＦ２２５、ＫＦ２２６をそれぞれ１．２
５ＩＮ、ブタ染色体ＤＮＡ　　１７１ｇ　　を反応液　
［１０＋＊ＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ１，ｓ）、　２
．５＋ｍＭ　Ｍｊｃｌ、、　Ｓｏｄ　ＫＣＩ、　０．２
ｍＭ　ＮＴＰｓ、　０．０２％Ｈｅｌ＆ｔｉｎ］１００
μｍに加え、さらにこの溶液にＴｈｅｒｍｕｓ　ｓｑａ
＊ｔｉｃｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（？ｌｅｖ　Ｅ
ｕ１ｘｎｄ　ＢｉｏＬ＊ｂｓ）　５　　ｌ１ｍ１ｔｓを
加えＰＣＲを行った。なお、反応は９０℃で１．５分、
６５℃で２分、７０℃で　１．５分を１サイクルとし、
このサイクルを３０回繰り返すことにより行った。ただ
し、１０サイクルめに反応液には前記ＤＮＡポリメラー
ゼをさらに５　　■ｉｔｓ加えた。このようにして増幅
させた遺伝子はエタノール沈澱により回収した。

Ｂ、　　ＤＣ−５３のサブクローニング及び解析前記方
法を用い増幅させた遺伝子の中から、目的とするＧＮＰ
−５３のアミノ酸−次配列をコードするＤＮＡ断片を得
るために、まず、前記方法で増幅させたＤＮＡ断片を−
ＨプラスミドベクターｐＵＣ１１８へサブクローニング
した。すなわち、前記方法を用い増幅させた遺伝子を制
限酵素Ｐｓｊ　１で処理し、この遺伝子断片をｐＵｃ１
１８（宝酒造）のＰｓｋ　Ｉサイトに導入し、これを用
いて大腸菌Ｋ１２株由来ＤＨＩを形質転換させることに
より、遺伝子ライブラリーを作製した。次に、この遺伝
子ライブラリーを化学合成した混合ＤＮＡグローブＫＦ
２０６（第１図ＧＮＰ−５３のアミノ酸−次配列で１６
番目のロイシン（Ｌｅａ）から２１番目のアスパラギン
（Ａｓｎ）に対応するオリゴヌクレオチド混合ＤＮＡグ
ローブ、Ｎｍｅｒ、３２混金物）を用い、Ｗｏｏｄらの
方法（Ｗｏｏｄ、Ｗ、１．ｅＬ　ｔｌ、　Ｐｒｏｅ。

Ｎｘｔｌ、Ａｅ！ｄ、Ｓｃｉ、［１，Ｓ、Ａ、、　Ｈ１
５Ｎ、１９１５）に従いスクリーニングすることにより
、ＫＦ２０６にハイブリダイゼーションするクローンＤ
ＨＩ／ｐＣＮＰ５を得た。統いて、このクローンから常
法に従い、プラスミド（ｐＣＮＰ５）を分離・精製し、
このプラスミドを制限酵素Ｐｓｔｌで切断し解析したと
ころ、ｐｃＮＰ５は約１５０塩基対からなるＰｓｔｌ　
Ｄ　Ｎ　Ａ断片を含んでいることが判った。そこで、こ
のＰｓｊｌＤＮＡ断片が、最終的に目的とするＧＮＰ−
５３のアミノ酸−次配列をコードする遺伝子断片である
ことを確かめるために、ＰＨＩＤＮＡ断片をＭ１３ファ
ージにクローニングし、５ＥＱＵＥＮＡＳＥ　（［Ｉｎ
口ｔｄ　５ｔａｔｅｓ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｃｔｌ　
Ｃｏｒｐｏｒｉｊｉｏｎ）を用いてジデオキシ法（５ｘ
ｎ（ｅｒ、Ｆ、ｅｊ　＊ｌ、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７４５４６３、１
９７７）でこのＤＮＡ塩基配列を決定した。

この結果、Ｐｓｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片は全体で目７塩基
対（ｂｐ）からなり、このＤＮＡ塩基配列がＧＮＰ−５
３をコードする遺伝子であることが判った。

Ｃ，ＤＣ−５３の作製 ブタＧＮＰ前駆体タンパクをコードする遺伝子をクロー
ニングするために用いるＤＮＡプローブ（ＤＣ−５３）
の作製は、前記したプラスミドｐｃＮＰ５を制限酵素Ｐ
ｓｉで切断し、＋４７ｂｐＤ　ＮＡＡ断片単離し、この
ＤＮＡ断片を［σ−３２Ｐ］ｄｃＴＰを用い、ニックト
ランスレーションで放射標識することにより作製した。

実施例２６ブタＧＮＰ前駆体タンパクをコードする染色
体遺伝子の単離 ４°Ｃに保存されたブタ染色体遺伝子ファージＤＮＡラ
イブラリー（Ｃｌｏｏｅｆｓｃｈ社製）を大腸菌に１２
株由来ＬＥ３９２に感染させ、ＬＢ培地（＋０　！　Ｂ
ｘｃｌｏｔｒｙｐｔｏｎｔ、　Ｓ　（Ｙｅａｓｔ　ｅｘ
Ｉｒａｃｋ、　Ｓ　（ＮＩＣＩ、　１．ｓ％Ｂｔｃｔｏ
ｉｆｉｒ全量ｌ１１）に拡げ、３７℃で一夜培養した。

プレートを４℃で３０分間冷却した後、ファーシフシー
ク上にニトロセルロースフィルター（Ｓｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ　＆　Ｓｅｂ＋ｅｌ１社製）を５分間放置した。次に
このフィルターをプレートからはがし、風乾後アルカリ
変性液（０，５Ｍ　）ｌ＊ｏ［ｌ、１．ｓＭ　ＮｉＣ１
）に１分間浸し、次に中和液（０，ＳＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　ｐ［１７，０，１，ＳＭＮ息Ｃ１）に１分間浸し
た。その後、３ＩＳＳＣ溶液　（２０ｘＳＳＣＮ５ＣＩ
　１７５．３　ｇ、クエン酸三ナトリウム　ＳＣ２、全
量１１）でニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾
後、減圧下８０℃Ｎ。

分間熱処理を行った。

このようにして調製したニトロセルロースフィルターを
用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシヨ
ンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルターを
プレハイブリダイゼーション液［３！ＳＳＣ，ｌｘデン
ハート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコ
ール、各々０．２ｍ（／＋ａｌ）、サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ
　５０　ｆｉＥ／　ｍ１％０．１％５ＤＳＩに加え、６
５０Ｃにて３時間プレハイブリダイゼーションを行った
。次に２枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記
ＤＣ−５３ＤＮＡプローブを１００万Ｃｐ！ｌ。

及び前記プレハイブリダイゼーション溶液１１を用い、
６５℃にて一夜ハイブリダイゼーションを行った。次に
このフィルターを０．１％ＳＤＳを含む３ＸＳＳＣ溶液
で６５℃３０分間、３回洗浄後、風乾し、オートラジオ
グラフィーを一８０℃で一昼夜行った。このようにして
約２００万クローンをスクリーニングすることによりＤ
Ｃ−５３ＤＮＡプローブとハイブリダイズするクローン
が５個得られた。これらのクローンのうちの一つをλＣ
ＮＰ６と命名し、以後の解析を行った。

実施例３６λＣＮＰ６フアージの解析及び塩基配まず常
法に従いλＣＮＰ６ＣＮ−ジからＤＮＡを調製した。次
に、このファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ及びＰｓｉを用い切断し、切断されたＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で分離・解析した。この結
果、λＣＮＰ６は約１４Ｋｔｐのブタ染色体遺伝子を含
むファージであることが判った。また、ＤＣ−５３ＤＮ
Ａプローブを用い、サザンプロット解析を行った結果、
約２　ＫｂｐのＢＩＩＩＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片、約３　
ＫｂｐのＨｉｎｄ［ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片、約５　Ｋｂ
ｐのＰｓＬＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片がＤＣ−５３ＤＮＡグロ
ーブとハイブリダイズすることが判った。そこで、ＤＣ
−５３ＤＮＡグローブとハイブリダイズする最も小さい
Ｂ１鳳Ｈ１（２Ｋｂｐ）　ＤＮＡ断片の全塩基配列を、
以下に示す方法でＩｐｐｅｒ　Ｓｉｒｓｍｄ、　Ｌｏｖ
ｓｒ　　５ｔｒｉａｄ別々に決定した。

Ｂ、　　Ｂｓ諷１１１ＤＮＡ断片の塩　配列決定まず、
Ｂ＊ｍ１ｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片ｕｐｐｅｒ　５ｔｒａａ
ｄの塩基配列を決定するために、−旦、Ｂ１■ＨＩＤＮ
Ａ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１Ｂ（宝酒造）の
Ｂ１鳳ＩＩＩサイトにサブクローニングし、ｐＵＣＣＮ
Ｐ６を作製した。次に、ｐＵｃｃＮＰ６を制限酵素Ｉｂ
ｘ　Ｉ及び５ｐｈｌを用イテ切断し、ＴＡＫＡＲＡキロ
シークエンス用デレージョンキット（宝酒造）を用いる
ことにより、第２ｒｇＪ（ａ）に示したＢＪｍｌｌｌ　
Ｄ　Ｎ　Ａの左岸ＤＮＡ末端を種々の長さにデレージョ
ンさせたプラスミド（デレージョンプラスミド）を作製
した。続いてアガロースゲル電気泳動でデレージョンの
長さを解析し、適当な長さにデレージョンされたクロー
ンを９個選んだ。最終的には、これらのクローンにヘル
パーファージＭ１３ＫＯ７を感染させ、−末鎖ＤＮＡ　
（ｌｏｖｔｒｓｔｒａｎｄ）を回収し、このＤＮＡをｌ
ＣｍｐｌｉＬｃにしてＤ＋＋１ｖｅｒｓｘ＋プライマー
を用い、ジデオキシ法［ＳＥ　Ｑ　Ｕ　Ｅ　Ｎ　Ａ　Ｓ
　　Ｅ　　（ＴＩｎｉＬｅｄ　　５ｔａｔＣｓ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃｘｌＣａｒｐｏｒａ口ａｎ）　］　でＢ
ｓｍ旧ＤＮＡ断片ｕｐｐｅｒＳｔｒｌｌｄのＤＮＡ塩基
配列を決定した。なお、この方法で適当な長さのデレー
ションミュータントクローンが得られず塩基配列が決定
できなかった領域については、すでに決定した塩基配列
を基に化学合成したオリゴヌクレオチドＩ［Ｆ２４ａ、
ＫＦ２４９．ＫＦ２５Ｇ［第２図（ｃ）参照］をプライ
マーに用い、ＤＮＡ塩基配列を決定した。

次に、１ｏｖｅｒ　５ｌｒｘｎｄの塩基配列は２　Ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩＤＮＡ断片の１ｌｐｐｅｒ　５ＩｘＹを
Ｍ１３ファージにサブクローニングし、これをｌｅｍｐ
ｌａｔｅにして、前記の方法で決定したｕｐｐｅｒ　５
ｉｒｓ＋＋ｄの塩基配列を基に化学合成したオリゴヌク
レオチドプライマーＫＦ２３９　、ＫＦ２４３　、ＫＦ
２４４　、ＫＦ２４５　、ＫＦ２４６　、ＫＦ２４７　
、ＫＦ２Ｓｌ、ＫＦ２５４［第２図（ｃ）参照Ｊ及び■
ｎ１ｖｅｒｓｉｌプライマを用い、ジデオキシ法で塩基
配列を決定した。なお、以上述べたＤＮＡ塩基配列決定
において、Ｕｎｉｖｅｒｓｚｌプライマーを用い塩基配
列を決定した領域を、第２図（ｂ）に実線の矢印で示し
、化学合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用い塩
基配列を決定した領域を、第２図（ｂ）に破線の矢印で
示した。

以上の方法で決定したＢａｍ１ｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片の
ｕｐｐｅｒｓｔｒｅｎｄ塩基配列及びこの塩基配列から
予想されるエクソン部位にコードされるアミノ酸配列を
第３図に示した。

実施例４．ブタＧＮＰ選伝子の発現 実施例３で単離・解析したブタＧＮＰ前駆体遺伝子ＣＢ
ｒｄＴ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片）を用い、以下に述べる方法で
、ブタＧＮＰ前駆体遺伝子の構造遺伝子領域を動物細胞
で発現させ、この構造遺伝子から転写（ｔｒｓ＋＋５ｃ
ｒｉｐｌｉｏｎ）されるｍ　ＲＮ　Ａの構造解析、さら
にこのｍＲＮＡから翻訳（ｔｒｓｎｓｌｓｔｉｏｎ）さ
れるタンパクの解析を行った。

Ａ、　ブタＧＮＰ構造遺伝子発現ベクターｐｓＶ２ｃＮ
Ｐｌ）作製 第４図に示すように、まずプラスミドベクターｐ　Ｓ　
Ｖ　２　ｄ　ｈ　ｆ　ｒ　（Ｂｓｔｈ＊ｓｄａ　Ｒｅ５
ｅｒｃｈＬ＊ｂｏｒｓｔｅｒｉ！ｓ　ｌｉｅ、製）を制
限酵素Ｂｇｌ　１１で切断し、統いてＤＮＡポリメラー
ゼ　（Ｋｌｅ＋ｏｖ　ｆｒｏｍｓ＠ｔ）を用いてｌ１ｇ
１　ＩＩ　　切断部位を平滑末端とした後、制限酵素旧
ｍｄｌｒｌで処理することにより、１）ＳＶ２ｄｈｆｒ
からマウスデヒドロ葉酸還元酵素（ｓｏａｓｓ　Ｕｆｒ
）のｃＤＮＡ領域を除いた。

次に、プラスミドｐＵｃｃＮＰｄｅｌ（このプラスミド
は実施例３において、ＩｌｓｍＨＩ　ＤＮＡフラグメン
トのｕｐｐｅｒ　５ｔｒｓｒｒｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列
を決定する際に作製したデレージョンプラスミドの中の
一つで、第３図に示したＢｘｍ［ｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片
の５′−末端から１６６ｂｐがデレージョンしている。

尚、本プラスミドにより形質転換された宿主細胞は、Ｅ
ｓｃｈｔｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　５ＭＢ５＋８と命名
され、工業技術院微生物工業技術研究所に１９９０年７
月１０日付けで微工研条寄第２９９７号（ＦＥＲＭＨＰ
−２９９７）として寄託されている。）を制限酵素Ｂｉ
ｎｄ！ＩＩとＲ５！＋を用い切断し、９ｇ９ｂｐからな
るＤＮＡ７ラグメントを得た。

このＤＮＡフラグメントを前記しｔ；方法で作製したｐ
ＳＶ２ｄｈｆｒの　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｄ
　Ｎ　Ａ７ラグメントとライゲートさせることにより、
ブタＧＮＰ構造遺伝子発現ベクターｐｓＶ２ＧＮＰを作
製した。

Ｂ、　　ｐｓＶ２ｃＮＰから転写されるｍ　ＲＮ　Ａの
解析 ブタＣＮＰ構造遺伝子から転写（ｔｒｓｎｓ−ｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ）されるｍ　ＲＮ　Ａの構造解析は以下に述べ
る方法で行った。

まず、プラスミドｐＳＶ２ＧＮＰ　（１０ｐｇ）をすル
腎臓由来ＣＯ５−１細胞（７，５ｘｌＯ’ｃｓｌｌ）に
Ｃｔｌｌｐｈｃｃｔ　Ｔｒａｎｓｌｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉ
＋　（ファルマンア社）を用い導入した。次に、この細
胞（ＣＯ３−１／ｐＳＶ２ＧＮＰ）を１０％Ｆ　ＣＳ　
（Ｆｅｔａｌ　ＣａｒｆＳｅｒｕｍ、ＧＩＢＣＯ社）を
含む、ＤＭＥＭ（Ｄａｒｂｅｃｏ’５Ｌｄｉｆｉｅｄ　
Ｅｓｇｅｒ″ｓ　Ｍｅｄｉｏｍ、　ＧＩＢＣＯ社）培地
８ｍｌで３７°Ｃ，Ｓ％ＣＯ２存在下７２時間培養した
後、培養上清と細胞を分離した。なお、このようにして
得た培養上清は−７０’Ｏに保存し、後述するタンパク
の解析に用い、また、細胞は以後述べるｍ　ＲＮ　Ａの
解析に用いた。

まず、前記シタ細胞（ＣＯ３−１／１）ＳＶ２ＧＮＰ）
約１０’個から、グアニジン−チオシアネート法を用い
、全ＲＮＡ　（ｔａｌｘｌ　ＲＮＡ）　８００　ｐ　ｇ
を抽出した。次に、この　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｇｏｏ
　ｐ　ｇ　からオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用い
、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを約１５０μｇ調製した。続
いて、１０μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮ　Ａを用いて、
０ｋａｙｓａａ−Ｂｅｒｌの方法（Ｍｏｌｅｅ、Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　＋６１−１７０，１９０）により
、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、約２ｘｌＧ’個の１
ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｌクローンを得ｆ二。このｃＤＮＡ
ライブラリー約４ｘｌＯ３個を、実施例１で作製したＤ
Ｃ５３ＤＮＡプローブを用い、常法に従いスクリーニン
グした結果、ＤＣ−５３ＤＮＡプローブとハイブリダイ
ズするクローンを得、このクロンをＤ　Ｈｌ　／　ｐＣ
Ｎ　Ｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１と命名した。

続いて、常法に従いこのクローンからプラスミド（ｐｃ
ＮＰｃＤＮＡｌ）を分離・精製し、種々の制限酵素で切
断し解析した。この結果、ｐＣＮｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　
１は約１．４ＫｂのｃＤＮＡを含んでいることが判った
。最終的なｍ　ＲＮ　Ａの解析は、この１．４　Ｋｂの
ｃＤＮＡを一旦Ｍ１３ファージにサブクローニングし、
Ｓ　ＥＱ　Ｕ　Ｅ　Ｎ　Ａ　Ｓ　Ｅ　（ｌｉｍｉｔｅｄ
　５ｔｓｌＣｓ　Ｂｉｏｃｂｓｍｉｃｓｌ　Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ）を用い、ジデオキシ法で、このＤＮＡ塩
基配列を決定することにより行った。第５図にこのよう
にして決定したＣＤＮＡのＤＮＡ塩基配列と、このＤＮ
Ａ塩基配列から予想されるアミノ酸−次配列を示した。

Ｃ，ＣＮＰｍＲＮＡから翻訳される Ｃ　Ｎ　Ｐ　ｍ　ＲＮ　Ａから翻訳されるタンパクの解
析は、まず、実施例４−Ｂで調製したＣＯ５−１／ｐｓ
Ｖ２ｃＮＰ上清液（７５ｍｌ）を溶解し、５ｅｐｐａｋ
を用いて濃縮・脱塩した。次に、このサンプルを凍結乾
燥した後、１Ｍ酢酸溶液５１に溶解した。続いて、この
溶解液に含まれるタンパク・ペプチドを５ｅｐｂａａｅ
ｘＧ　−７５カラム（１，８ｘＨ７ｃｍ。

ファルマシア社〕を用い、分子量ヌｒ１に分画した（流
速ニア、７鱈／ｋｒｓ画分サイズ：　５　ｍｌ）　。最
終的には、各溶出画分の一部（４０Ｐｇ）を抗ＣＮＰ−
２２抗血清を用いたラジオイムノアンセイ（ＲＩＡ）系
に供し［このＲＩＡ系に関しては、本発明者らによるブ
タ新規生理活性ペプチド（ＧＮＰ−５３）の特許に詳細
に記載されている］、各両分に存在する抗ＣＮＰ−２２
抗体に免疫活性を示すペプチド及びタンパク（ｉｒ−Ｃ
ＮＰＪυを定量した。

この結果、第６図に示すように、分子量的１５にの溶出
画分（画分番号３６〜４４）と分子量３〜ＩＯＫの溶出
画分（画分番号４５〜６６）に、抗ＣＮＰ−２２抗血清
に対し免疫活性を示すタンパク及びペプチドが存在して
いることが判った。なお、前記ＲＩＡの結果、ＣＯ５−
１／Ｉ）ＳＶ２ＧＮＰの培養上清７５１中に抗ＣＮＰ−
２２抗血清に対し免疫活性を示すタンパク及びペプチド
がＧＮＰ−２２換算で１５０　Ｂ存在していることが判
った。

［発明の効果］ 本発明では、まずブタ染色体遺伝子の中からＣＮＰ−５
３をコードしているＤＮＡ領域をＰＣＲを用い特異的に
増幅させ、ＤＮＡプローブ（ＤＣ−５３）を作製した。

続いて、ＤＣ−５３を用い、ブタＧＮＰ　（ＧＮＰ−２
２，ＧＮＰ−５３）前駆体タンパクをコードする染色体
遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。この結果、
第３図に示すように、本発明で単離したＢａｍ［ｌＩ　
Ｄ　Ｎ　Ａ断片は、ブタＧＮＰ前駆体タンパクの全アミ
ノ酸配列をコードする構造遺伝子（ｓｔｒ＋＋ｃｔ＋＋
ｒ＊ｌ　Ｈｅｍｅ）領域（ただし、ブタＧＮＰ前駆体タ
ンパクは、この構造遺伝子領域で２つのエクソンに分か
れてコードされている）のみならず、ブタ染色体遺伝子
のプロモーター領域をも含んでいることが判った。

次に、この染色体遺伝子の構造遺伝子領域をサル腎臓由
来ＣＯ３−１細胞で発現させ、この構造遺伝子から転写
されたｍＲＮＡの構造（ｃＤＮＡの構造）、さらには、
このｍ　ＲＮ　Ａから翻訳されＩ；タンパクの解析を行
った。これらの結果、まずブタＣＮＰ前駆体タンパクは
、８５図に示すアミノ酸−次配列を持つ全体でＨ６アミ
ノ酸残基からなるポリペプチドであることを見いだした
。次に、この前駆体タンパク（ｐｒｅ　ｐｒｏ　ＣＮＰ
）のＮ−末端領域にはシグナルペプチドが存在し、生体
内においてＧＮＰ−２２，ＣＮＰ−５３はいずれも細胞
外へ分泌されるペプチドであることが判った。

さらに、ブタＧＮＰ構造遺伝子を動物ｍ胞で発現させる
ことにより、抗ＣＮＰ−２２抗体に対し免疫活性を示す
ペプチド及びタンパクを生産させることができることを
見いだした。

本発明により、ブタＧＮＰ前駆体の遺伝子及びｃＤＮＡ
が単離・同定されたことから、今後これらをＤＮＡプロ
ーブとして用いれば、ブタ以外の動物細胞由来ＧＮＰ遺
伝子またはｃＤＮＡが単離でき、これらを解析すること
により、ブタを除く他の動物のＧＮＰを同定することが
できる。また、本発明実施例４−Ｃも含め、ブタＧＮＰ
前駆体をコードする遺伝子またはｃＤＮＡを動物細胞で
発現させ、細胞外へ分泌されるタンパクあるいはペプチ
ドを単離・同定すれば、ブタＧＮＰ生合成機構をさらに
詳しく解明することができる。特に、今まで生体内から
単離・同定されていないＰｒｅＰｒｏ　　ＣＮＰからシ
グナルペプチドが除去されたＰｒｏ　　ＧＮＰの構造、
さらにはＧＮＰ−５３のＮ−末端にさらにアミノ酸が付
加した種々のペプチド類［Ｐｒｅ　Ｐｒｏ　ＧＮＰのア
ミノ酸−次配列番号で２４から７３番目の間には、少な
くとも５個のリジン（Ｌｙｓ）残基（３０，５＋、５２
．５５及び６５番目）と３個のアルギニン（Ａｒｇ）残
基（３３，６４及び７０番目）が存在し、ｐｒｏ　ＣＮ
Ｐは生体内においてプロセッンング酵素により、これら
塩基性アミノ酸残基のＣ末端側が特異的に切断される可
能性があり、生体内において今まで同定されているＣＮ
Ｐ−２２ＣＮＰ−５３以外にＧＮＰ−５３のＮ−末端に
アミノ酸がさらに付加したペプチドが存在している可能
性が高い。］を単離・同定することができ、これらの生
理活性を調べることができる。

さらに、第３図に示すブタＧＮＰ前駆体タンパクの遺伝
子は、ブタＧＮＰ前駆体タンパクをコードする構造遺伝
子領域のみならず、この構造遺伝子を発現させる（　ｔ
ｒｘｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）プロモーター領域をも含ん
でいることが判った。ＧＮＰ−２２及びＧＮＰ−５３が
脳から単離されたことを考えると、このプロモーターは
脳で特異的に作用している可能性が高い。従って、この
プロモーターの下流に適当な蛋白質をコードする遺伝子
をつなぎ、これを用いトランスジェニックマウスを作製
すれば、該蛋白質をトランスジェニックマウスの脳内で
特異的に発現させることができ、該蛋白質の生理作用を
個体レベルで解析することが可能となる。

以上述べたことから、本発明により明らかにされたブタ
ＣＮＰ前駆体タンパクの染色体遺伝子、ｃＤＮＡ及びア
ミノ酸−次配列の情報は、今後哺乳類におけるＧＮＰの
生合成、生理作用のメカニズムを解明する上で、また、
ＧＮＰファミリーに属するペプチドを医薬品へと応用す
る上で、大いに貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブタ染色体遺伝子からＰＣＲを用いＣＮＰ−
５３をコードする遺伝子領域を特異的に増幅するために
用いた合成りＮＡプライマー（ＫＦ２２５、ＫＦ２２６
）及び、この遺伝子を単離するために用いたＤＮＡ混合
プローブ（ＫＦ２０６）の塩基配列をＧＮＰ−５３のア
ミノ酸−次配列と共に示す図である。なお、図１におい
てＫＦ２０６の塩基配列中ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧのいず
れかを示す。 第２図は、ブタＧＮＰ前駆体タンパクの染色体遺伝子（
ＢＩＩＩＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片）の制限酵素地図（ａ）
、この遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定のスト２テジー（ｂ
）及び塩基配列決定に用いた合成りＮＡプライマーの塩
基配列をそれぞれ示す図である。 第３図は、ブタＧＮＰ前駆体タンパクをコードする染色
体遺伝子（Ｂｓｍ［ｌＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片）のＤＮＡ塩
基配列と構造遺伝子領域のエクソンにコードされている
ブタＧＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸沈配列を示す図で
ある。 第４図は、動物細胞発現ベクターｐｓＶ２ＧＮＰの作製
法を示す説明図である。 第５図は、ＣＮＰｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコード
されるブタＧＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸−欠配列を
示す図である。 第６図は、ＣＯ３−１／ｐｓＶ２ｃＮＰ１細胞の培養上
溝に含まれるタンパク及びペプチドをセファッデクスＧ
−７５ゲル濾過カラムで分離した時の溶出パターンと各
溶出画分の抗ＣＮＰ−２２抗血清に対する免疫活性を示
すチャートである。 なお、このカラムにおけるγ−ｒＡＮＰ　（１）とび−
ｒＡＮＰ　（２）の溶出位置を矢印で示す。 （外令名） ―コニム“ 手 続 補 正 ｆ坊式） ％式％ 事件の表示 平成２年特許願第１８６５８３号 ２゜ 発明の名称 ブタＧＮＰ遺伝子及び前駆体蛋白 ３゜ 補正をする者 事件との関係 住所 □１氏名　松 尾

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ２、前記のアミノ酸配列においてＮ−末端からシグナル
   ペプチドが欠損している請求項第１項記載のポリペプチ
   ド。 ３、前記のアミノ酸配列においてＮ−末端側の１位ない
   し７３位のいずれか２個の隣接するアミノ酸残基間が切
   断され、Ｎ−末端のペプチドが欠損している請求項第１
   項記載のポリペプチド。 ４、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＮＰ
   −２２）をコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ５、前記のＤＮＡが下記に示される塩基配列である請求
   項第４項記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ６、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＮＰ
   −５３）をコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ７、前記のＤＮＡが下記に示される塩基配列である請求
   項第６項記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 ８、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ９、前記ＤＮＡが下記の塩基配列を有する請求項第８項
   記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 １０、下記のアミノ酸配列においてＮ−末端からシグナ
   ルペプチドが欠損しているポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ。 【遺伝子配列があります】 １１、下記のアミノ酸配列においてＮ−末端側の１位な
   いし７３位のいずれか２個の隣接するアミノ酸残基間が
   切断され、Ｎ−末端のペプチドが欠損しているポリペプ
   チドをコードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 １２、下記の塩基配列を有するＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 １３、第３図に記載された塩基配列を有するＤＮＡ。