JP3026354B2 - ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白 - Google Patents
ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白Info
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- JP3026354B2 JP3026354B2 JP02259698A JP25969890A JP3026354B2 JP 3026354 B2 JP3026354 B2 JP 3026354B2 JP 02259698 A JP02259698 A JP 02259698A JP 25969890 A JP25969890 A JP 25969890A JP 3026354 B2 JP3026354 B2 JP 3026354B2
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- Japan
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- amino acid
- hcnp
- cnp
- pcnp
- hgeco
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、ヒトCNP（human C−type natriuretic pep
tide;hCNP）の遺伝子及びこの遺伝子にコードされてい
るhCNP前駆体タンパク（preprohCNP）に関する。
tide;hCNP）の遺伝子及びこの遺伝子にコードされてい
るhCNP前駆体タンパク（preprohCNP）に関する。
［発明の背景］ 近年、各種動物の心房及び脳から、ナトリウム利尿ペ
プチド（matriuretic peptide;NP）と呼ばれる種々のペ
プチドが発見されてきた。現在これらNPは、アミノ酸一
次配列の類似性及びその前駆体構造から、３つのタイ
プ、すなわちＡ型NP（Ａ−type natriuretic peptide;A
NP）、Ｂ型NP（Ｂ−type natriuretic peptide;BNP）及
びＣ型NP（Ｃ−type natriuretic peptide;CNP）のいず
れかに分類することができる。このうち、ANP・BNPは最
初それぞれ心房、脳から単離・同定されたことから、AN
Pは心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriureti
c peptide）、BNPは脳ナトリウム利尿ペプチド（brain
natriuretic peptide）とも呼ばれている（Matsuo,H.an
d Nakazato,H.Endocrinol.Metab.Clin.North Am.,16,4
3,1987;Sudoh,T.et al.Nature,332,78,1988）。しか
し、現在ANPは心房のみならず脳にも存在しているこ
と、同様にBNPは脳のみならず心房にも存在しているこ
とが判ってきた。また、ANP・BNPはいずれも顕著なナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ANP
・BNPはいずれも心房から血中へ分泌されるホルモンと
してのみならず、脳内においては神経伝達物質としても
作用し、哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節してい
ることが明らかになってきた。
プチド（matriuretic peptide;NP）と呼ばれる種々のペ
プチドが発見されてきた。現在これらNPは、アミノ酸一
次配列の類似性及びその前駆体構造から、３つのタイ
プ、すなわちＡ型NP（Ａ−type natriuretic peptide;A
NP）、Ｂ型NP（Ｂ−type natriuretic peptide;BNP）及
びＣ型NP（Ｃ−type natriuretic peptide;CNP）のいず
れかに分類することができる。このうち、ANP・BNPは最
初それぞれ心房、脳から単離・同定されたことから、AN
Pは心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriureti
c peptide）、BNPは脳ナトリウム利尿ペプチド（brain
natriuretic peptide）とも呼ばれている（Matsuo,H.an
d Nakazato,H.Endocrinol.Metab.Clin.North Am.,16,4
3,1987;Sudoh,T.et al.Nature,332,78,1988）。しか
し、現在ANPは心房のみならず脳にも存在しているこ
と、同様にBNPは脳のみならず心房にも存在しているこ
とが判ってきた。また、ANP・BNPはいずれも顕著なナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ANP
・BNPはいずれも心房から血中へ分泌されるホルモンと
してのみならず、脳内においては神経伝達物質としても
作用し、哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節してい
ることが明らかになってきた。
一方、CNPはごく最近Sudohらにより、ANP・BNPのいず
れにも帰属されない第３のタイプに分類されるNPとして
ブタ脳から単離・同定された（Sudoh,T.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,168,863,1990）。すなわち、まず
最初に発見されたCNPは22アミノ酸残基より成り（な
お、本明細書においてこのペプチドを以下pCNP−22と略
す）、ANP・BNPと同様２個のシステイン残基を含んでお
り、これが分子内でジスルフィド結合を形成し、17アミ
ノ酸残基より構成された環状構造をもっている。しかも
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列にはANP
・BNPのそれらと高い相同性が見いだされた。しかしpCN
P−22はANP・BNPがいずれも上記環状構造のＣ−末端部
分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル構
造（tail構造）を持っているのに対し、このtail構造を
持っていない。すなわち、pCNP−22のＣ−末端はシステ
イン残基で終わっている。このことからpCNP−22の構造
はANP・BNPと似ているが、これらとは全く異なっている
ことが判った。さらに、pCNP−22はナトリウム利尿作用
及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用いた
弛緩活性でANP・BNPに比べ高い比活性を示すことが判っ
たことから、pCNP−22は新しいタイプに帰属されるNPで
あることが判り、このタイプに属するペプチドはCNPと
命名された。
れにも帰属されない第３のタイプに分類されるNPとして
ブタ脳から単離・同定された（Sudoh,T.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,168,863,1990）。すなわち、まず
最初に発見されたCNPは22アミノ酸残基より成り（な
お、本明細書においてこのペプチドを以下pCNP−22と略
す）、ANP・BNPと同様２個のシステイン残基を含んでお
り、これが分子内でジスルフィド結合を形成し、17アミ
ノ酸残基より構成された環状構造をもっている。しかも
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列にはANP
・BNPのそれらと高い相同性が見いだされた。しかしpCN
P−22はANP・BNPがいずれも上記環状構造のＣ−末端部
分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル構
造（tail構造）を持っているのに対し、このtail構造を
持っていない。すなわち、pCNP−22のＣ−末端はシステ
イン残基で終わっている。このことからpCNP−22の構造
はANP・BNPと似ているが、これらとは全く異なっている
ことが判った。さらに、pCNP−22はナトリウム利尿作用
及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用いた
弛緩活性でANP・BNPに比べ高い比活性を示すことが判っ
たことから、pCNP−22は新しいタイプに帰属されるNPで
あることが判り、このタイプに属するペプチドはCNPと
命名された。
また、pCNP−22に続き、本発明者らにより、CNPに帰
属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定され
た。このペプチドはpCNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基から成るペプチドであることが判った（以下、本
明細書においてこのペプチドをpCNP−53と略す）。言い
換えれば、pCNP−53はpCNP−22のＮ−末端にさらに31個
のアミノ酸残基が付加したペプチドであることが判っ
た。なお、興味あることにブタ脳ではpCNP−53がpCNP−
22より多く存在していることが明らかにされている（特
願平２−186582）。
属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定され
た。このペプチドはpCNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基から成るペプチドであることが判った（以下、本
明細書においてこのペプチドをpCNP−53と略す）。言い
換えれば、pCNP−53はpCNP−22のＮ−末端にさらに31個
のアミノ酸残基が付加したペプチドであることが判っ
た。なお、興味あることにブタ脳ではpCNP−53がpCNP−
22より多く存在していることが明らかにされている（特
願平２−186582）。
さらに、ごく最近の研究で、pCNP−22、pCNP−53の前
駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明らかにされ、
これらのペプチドの生合成機構についても明らかにされ
てきた（特願平２−186582）。すなわち、本発明者によ
り、pCNP−22、pCNP−53をコードするブタ染色体遺伝子
及びcDNAが単離・同定され、この解析から、ブタCNP前
駆体タンパク（preprop CNP）の構造が明らかにされる
と共に、pCNP−22、pCNP−53は最初126アミノ酸残基か
らなるprepropCNPとしてmRNAから翻訳され、次のこのＮ
−末端領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切
断されpropCNPに転換され、さらにpropCNPはプロセシン
グ酵素により特異的に切断されることによりpCNP−53と
pCNP−22に転換されることが判った。
駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明らかにされ、
これらのペプチドの生合成機構についても明らかにされ
てきた（特願平２−186582）。すなわち、本発明者によ
り、pCNP−22、pCNP−53をコードするブタ染色体遺伝子
及びcDNAが単離・同定され、この解析から、ブタCNP前
駆体タンパク（preprop CNP）の構造が明らかにされる
と共に、pCNP−22、pCNP−53は最初126アミノ酸残基か
らなるprepropCNPとしてmRNAから翻訳され、次のこのＮ
−末端領域に存在するシグナルペプチドが分泌過程で切
断されpropCNPに転換され、さらにpropCNPはプロセシン
グ酵素により特異的に切断されることによりpCNP−53と
pCNP−22に転換されることが判った。
以上のことから、pCNP−22及びpCNP−53についてもAN
P・BNP同様共通の前駆体タンパク（prepro pCNP）から
生合成される分泌ペプチドであることが判った。
P・BNP同様共通の前駆体タンパク（prepro pCNP）から
生合成される分泌ペプチドであることが判った。
しかしながら、現在までの研究でANP・BNPに帰属され
るペプチド類がいずれも心房から血中に分泌されるホル
モンとしてのみならず、脳内においては神経伝達物質と
して作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判っているのに対し、CNPの詳細な生体内分布及び
生理作用に関しては不明な点が多い。
るペプチド類がいずれも心房から血中に分泌されるホル
モンとしてのみならず、脳内においては神経伝達物質と
して作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判っているのに対し、CNPの詳細な生体内分布及び
生理作用に関しては不明な点が多い。
また、ANP・BNPに関しては、現在までにヒトの構造が
明らかにされ、医薬への応用が進められているが、CNP
に関しては、現在までのところ、ヒトにおける構造が明
らかにされていない。
明らかにされ、医薬への応用が進められているが、CNP
に関しては、現在までのところ、ヒトにおける構造が明
らかにされていない。
［本発明が解決すべき課題］ 従って本発明は、ヒトにおけるCNP（hCNP）構造、特
にpCNP−22、pCNP−53に対応するヒトCNP構造を明らか
にすると共に、この前駆体タンパク（ブタにおけるprep
ro pCNPに対応する）の構造をも明らかにすることを目
的とする。
にpCNP−22、pCNP−53に対応するヒトCNP構造を明らか
にすると共に、この前駆体タンパク（ブタにおけるprep
ro pCNPに対応する）の構造をも明らかにすることを目
的とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、まずANPのアミノ酸配列及びそれをコ
ードする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存され
ていることから、CNPの場合も同様の可能性が高いと考
えた。また、ブタ脳内におけるCNPの存在量はANP、BNP
のそれに比べきわめて少量であり、しかもこれらペプチ
ドの脳内における産生組織が特定されていないことか
ら、直接ヒト脳からCNPをペプチドとして単離、同定す
ること、及びcDNAを単離し、これを解析することにより
ヒトCNPを同定することは困難であると考えた。そこ
で、本発明者らは先に得たブタCNP遺伝子またはcCNPを
プローブとして用い、ヒトCNP遺伝子を単離し、これを
解析することにより、ヒトCNP前駆体タンパクの構造及
びpCNP−53、pCNP−22に対応するヒトCNPの構造を明ら
かにすることを計画した。
ードする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存され
ていることから、CNPの場合も同様の可能性が高いと考
えた。また、ブタ脳内におけるCNPの存在量はANP、BNP
のそれに比べきわめて少量であり、しかもこれらペプチ
ドの脳内における産生組織が特定されていないことか
ら、直接ヒト脳からCNPをペプチドとして単離、同定す
ること、及びcDNAを単離し、これを解析することにより
ヒトCNPを同定することは困難であると考えた。そこ
で、本発明者らは先に得たブタCNP遺伝子またはcCNPを
プローブとして用い、ヒトCNP遺伝子を単離し、これを
解析することにより、ヒトCNP前駆体タンパクの構造及
びpCNP−53、pCNP−22に対応するヒトCNPの構造を明ら
かにすることを計画した。
本発明では、まずpCNPcDNA（特願平２−186583）から
制限酵素Dde Iで切り出される約700塩基のDNA断片（pCc
DNA）をプローブとして用いる。このプローブは化学的
に合成することもできる。このプローブを用いヒト染色
体遺伝子ライブラリー（λファージにヒト染色体遺伝子
断片を組み込んだもの）をスクリーニングした。このヒ
ト染色体遺伝子ライブラリーは当業者が容易に調製で
き、また市販のライブラリー、例えばクローンテック
（Clonetech）社製のものを利用することもできる。そ
の結果、pCcDNAにhydridizeするクローン（λhCNP2）が
得られた。このクローンを解析したところ、λhCHP2は
約15Kbpのヒト染色体遺伝子を含んでおり、またこの15K
bpうち、約2KbpからなるEcoR I DNA断片（hgEco−２）
がpCcDNAプローブとhydridizeすることが判った。この
約2kBPからなるhgEco−２を解析した結果、このDNA断片
がhCNP遺伝子の一部を含むことが明らかとなった。（な
お、hgEco−２の制限酵素地図および塩基配列決定のス
トラテジーを第１図に示す。）次に本発明者らは、hCNP
前駆体タンパクの全構造を明らかにする目的で、hgEco
−２をプローブに用い、再度ヒト染色体遺伝子ライブラ
リーをスクリーニングした。この結果、hgEco−２プロ
ーブとhydridizeするクローン（λhCNP1）を得た。λhC
NP1を解析したところ、このクローンは15Kbp以上のヒト
染色体遺伝子を含んでおり、またこのうち、約4Kbpから
なるEcoR I断片（hgEco−１）がhgEco−２プローブとhy
dridizeすることが確認された。そこでこのhgEco−１断
片の制限酵素地図を作成し、すでに得ているhgEco−２
と比較したところ（第１図）hgEco−１はhgEco−２の
５′側にさらに約2Kbpのヒト染色体遺伝子を含むDNAで
あることが明らかとなった。そこで、このDNA断片の塩
基配列を決定した（なお、hgEco−１の塩基配列決定の
ストラテジーを第１図に示す）。この結果、第２図に示
すようにこのhgEco−１は、ヒトCNP前駆体タンパクの全
アミノ酸配列をコードする構造遺伝子（structuralgen
e）領域のみならず、ヒトCNP遺伝子のプロモーター領域
をも含んでいることが判った。すなわち、まずプロモー
ター領域に関しては第２図に示すDNA塩基配列番号で154
6番目から1551番目に真核生物遺伝子のプロモーター領
域に共通して存在するTATAボックス（TATA box）が存在
し、またこのTATA boxの上流には遺伝子発現の制御に関
与していると思われるGC boxが２個、Y boxが１個存在
していることが判った。これらのことからこの領域はCN
P前駆体遺伝子のプロモーター領域であると判断した。
制限酵素Dde Iで切り出される約700塩基のDNA断片（pCc
DNA）をプローブとして用いる。このプローブは化学的
に合成することもできる。このプローブを用いヒト染色
体遺伝子ライブラリー（λファージにヒト染色体遺伝子
断片を組み込んだもの）をスクリーニングした。このヒ
ト染色体遺伝子ライブラリーは当業者が容易に調製で
き、また市販のライブラリー、例えばクローンテック
（Clonetech）社製のものを利用することもできる。そ
の結果、pCcDNAにhydridizeするクローン（λhCNP2）が
得られた。このクローンを解析したところ、λhCHP2は
約15Kbpのヒト染色体遺伝子を含んでおり、またこの15K
bpうち、約2KbpからなるEcoR I DNA断片（hgEco−２）
がpCcDNAプローブとhydridizeすることが判った。この
約2kBPからなるhgEco−２を解析した結果、このDNA断片
がhCNP遺伝子の一部を含むことが明らかとなった。（な
お、hgEco−２の制限酵素地図および塩基配列決定のス
トラテジーを第１図に示す。）次に本発明者らは、hCNP
前駆体タンパクの全構造を明らかにする目的で、hgEco
−２をプローブに用い、再度ヒト染色体遺伝子ライブラ
リーをスクリーニングした。この結果、hgEco−２プロ
ーブとhydridizeするクローン（λhCNP1）を得た。λhC
NP1を解析したところ、このクローンは15Kbp以上のヒト
染色体遺伝子を含んでおり、またこのうち、約4Kbpから
なるEcoR I断片（hgEco−１）がhgEco−２プローブとhy
dridizeすることが確認された。そこでこのhgEco−１断
片の制限酵素地図を作成し、すでに得ているhgEco−２
と比較したところ（第１図）hgEco−１はhgEco−２の
５′側にさらに約2Kbpのヒト染色体遺伝子を含むDNAで
あることが明らかとなった。そこで、このDNA断片の塩
基配列を決定した（なお、hgEco−１の塩基配列決定の
ストラテジーを第１図に示す）。この結果、第２図に示
すようにこのhgEco−１は、ヒトCNP前駆体タンパクの全
アミノ酸配列をコードする構造遺伝子（structuralgen
e）領域のみならず、ヒトCNP遺伝子のプロモーター領域
をも含んでいることが判った。すなわち、まずプロモー
ター領域に関しては第２図に示すDNA塩基配列番号で154
6番目から1551番目に真核生物遺伝子のプロモーター領
域に共通して存在するTATAボックス（TATA box）が存在
し、またこのTATA boxの上流には遺伝子発現の制御に関
与していると思われるGC boxが２個、Y boxが１個存在
していることが判った。これらのことからこの領域はCN
P前駆体遺伝子のプロモーター領域であると判断した。
次に、構造遺伝子領域に関しては、まず、前記のTATA
boxの下流（３′側）塩基配列番号1722から1724にATG
が存在し、このATGはTATA boxの下流（３′側）で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
周りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.C
いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本発
明者はこのATGがヒトCNP前駆体の翻訳開始コドンである
と推定した。次にもしこのATGを翻訳開始コドンとする
と、すでに明らかとなっているブタCNP染色体遺伝子の
構造との比較から、塩基配列番号1809−1811番目に存在
しているリジン残基のコドン（AAG）までが第１エキソ
ンになる。また同様の比較から塩基配列番号2256−2258
番目に存在しているバリン残基のコドン（GTC）から第
２エキソンが始まることになる。なお、初めに解析した
hgEco−２は第２エキソン内の塩基配列番号2286以降を
コードするDNA断片となる。これらのことは、塩基配列
番号で1810付近にスプライシングドナーのコンセンサス
シークエンスとして知られているC/A AGGT A/G AGTと似
た塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番号2256
の５′側にはスプライシングアクセプターのコンセンサ
スシークエンスとして知られている（Py）n N C/T AGG
（Pyはピリジン塩基を示し、ＮはA.T.C.G.いずれかの塩
基を示す）に似た塩基配列が存在していることからも支
持される。これらのことから、本発明者らは塩基配列番
号1812から2255番目までのDNA領域はイントロン（intro
n）であり、このintronはhCNP前駆体タンパクをコード
する成熟（mature）mRNAができる際スプライシングによ
り除かれるのではないかと考えた。つまり、hCNP前駆体
タンパクは塩基配列番号1722から始まり、1811で終わる
第１エクソンと2256から始まる第２エクソンによりコー
ドされており、ブタ同様全体ではアミノ酸126残基から
なるポリペプチドであることが明らかとなった。
boxの下流（３′側）塩基配列番号1722から1724にATG
が存在し、このATGはTATA boxの下流（３′側）で最初
に現れるメチオニンコドンであり、しかもこのコドンの
周りの塩基配列は真核生物で知られている翻訳開始コド
ンのコンセンサスシークエンスA/G NNATG（ＮはA.T.G.C
いずれかの塩基を示す）と一致していることから、本発
明者はこのATGがヒトCNP前駆体の翻訳開始コドンである
と推定した。次にもしこのATGを翻訳開始コドンとする
と、すでに明らかとなっているブタCNP染色体遺伝子の
構造との比較から、塩基配列番号1809−1811番目に存在
しているリジン残基のコドン（AAG）までが第１エキソ
ンになる。また同様の比較から塩基配列番号2256−2258
番目に存在しているバリン残基のコドン（GTC）から第
２エキソンが始まることになる。なお、初めに解析した
hgEco−２は第２エキソン内の塩基配列番号2286以降を
コードするDNA断片となる。これらのことは、塩基配列
番号で1810付近にスプライシングドナーのコンセンサス
シークエンスとして知られているC/A AGGT A/G AGTと似
た塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番号2256
の５′側にはスプライシングアクセプターのコンセンサ
スシークエンスとして知られている（Py）n N C/T AGG
（Pyはピリジン塩基を示し、ＮはA.T.C.G.いずれかの塩
基を示す）に似た塩基配列が存在していることからも支
持される。これらのことから、本発明者らは塩基配列番
号1812から2255番目までのDNA領域はイントロン（intro
n）であり、このintronはhCNP前駆体タンパクをコード
する成熟（mature）mRNAができる際スプライシングによ
り除かれるのではないかと考えた。つまり、hCNP前駆体
タンパクは塩基配列番号1722から始まり、1811で終わる
第１エクソンと2256から始まる第２エクソンによりコー
ドされており、ブタ同様全体ではアミノ酸126残基から
なるポリペプチドであることが明らかとなった。
さらに、このようにして明らかにされたhCNP前駆体タ
ンパク（以降、本発明ではprepro hCNPと略す）のアミ
ノ酸一次配列をブタのそれと比較したところ、全体で５
カ所（第３図prepro hCNPのアミノ酸一次配列番号で37,
40,56,90および101番目）アミノ酸配列が異なっている
以外、同じであることが判った。特に、ブタCNPの生合
成機構で明らかにされている、CNP前駆体タンパクの分
泌に関与するpreproCNPのＮ−末端領域に存在するシグ
ナルペプチドのアミノ酸一次配列、及びpreproCNPからC
NP−22、CNP−53が生じる際プロセシング酵素により認
識、切断されるCNP−22、CNP−53のＮ−末端近傍のアミ
ノ酸配列はヒトとブタで全く同じであることが判った。
ンパク（以降、本発明ではprepro hCNPと略す）のアミ
ノ酸一次配列をブタのそれと比較したところ、全体で５
カ所（第３図prepro hCNPのアミノ酸一次配列番号で37,
40,56,90および101番目）アミノ酸配列が異なっている
以外、同じであることが判った。特に、ブタCNPの生合
成機構で明らかにされている、CNP前駆体タンパクの分
泌に関与するpreproCNPのＮ−末端領域に存在するシグ
ナルペプチドのアミノ酸一次配列、及びpreproCNPからC
NP−22、CNP−53が生じる際プロセシング酵素により認
識、切断されるCNP−22、CNP−53のＮ−末端近傍のアミ
ノ酸配列はヒトとブタで全く同じであることが判った。
以上のことを総合的に考えると、ヒトCNPの生合成経
路はブタ同様まず126アミノ酸残基からなるprepro hCNP
がmRNAから翻訳（transration）される。次に、このＮ
−末端領域に存在するシグナルペプチドは分泌過程で切
断されprohCNPに転換される。さらに、prohCNPはプロセ
シング酵素により特異的に（第３図アミノ酸一次配列番
号で73と74の間、104と105の間）切断されることによ
り、pCNP−53、pCNP−22に対応するヒトCNP−53（hCNP
−22;第３図アミノ酸一次配列番号74から126番目）、ヒ
トCNP−22（hCNP−22;第３図アミノ酸一次配列番号105
から126番目）に転換されることが予測される。ところ
で、hCNP−22に関しては、pCNP−22と全く同じアミノ酸
一次配列であることから、pCNP−22と同じ生理活性作用
（ナトリウム利尿作用、血圧降下作用など）を示すこと
は疑う余地がない。
路はブタ同様まず126アミノ酸残基からなるprepro hCNP
がmRNAから翻訳（transration）される。次に、このＮ
−末端領域に存在するシグナルペプチドは分泌過程で切
断されprohCNPに転換される。さらに、prohCNPはプロセ
シング酵素により特異的に（第３図アミノ酸一次配列番
号で73と74の間、104と105の間）切断されることによ
り、pCNP−53、pCNP−22に対応するヒトCNP−53（hCNP
−22;第３図アミノ酸一次配列番号74から126番目）、ヒ
トCNP−22（hCNP−22;第３図アミノ酸一次配列番号105
から126番目）に転換されることが予測される。ところ
で、hCNP−22に関しては、pCNP−22と全く同じアミノ酸
一次配列であることから、pCNP−22と同じ生理活性作用
（ナトリウム利尿作用、血圧降下作用など）を示すこと
は疑う余地がない。
一方、hCNP−53とPCNP−53では２カ所アミノ酸配列が
異なる（第３図アミノ酸一次配列番号で90番目と101番
目）ことから、hCNP−53は新規のペプチドであり、その
生理作用については不明である。そこで本発明者らは、
hCNP−53を化学合成し、この新規ペプチドの生理活性を
調べた。この結果hCNP−53はヒヨコ直腸弛緩作用を示す
と共に、ラットに投与すると明確なナトリウム利尿作用
及び血圧降下作用を示すことを見いだした。
異なる（第３図アミノ酸一次配列番号で90番目と101番
目）ことから、hCNP−53は新規のペプチドであり、その
生理作用については不明である。そこで本発明者らは、
hCNP−53を化学合成し、この新規ペプチドの生理活性を
調べた。この結果hCNP−53はヒヨコ直腸弛緩作用を示す
と共に、ラットに投与すると明確なナトリウム利尿作用
及び血圧降下作用を示すことを見いだした。
以上まとめると、本発明者らは、hCNP前駆体タンパク
をコードする染色体遺伝子を単離し、これを解析するこ
とにより、そのアミノ酸一次配列を明らかにすることに
成功した。またこの結果、pCNP−22、pCNP−53に対応す
るヒトCNP（hCNP−22、hCNP−53）の構造を明らかにす
ると共に、hCNP−53に関しては、これを化学合成し、そ
の生理活性を確認することにより本発明を完成させた。
をコードする染色体遺伝子を単離し、これを解析するこ
とにより、そのアミノ酸一次配列を明らかにすることに
成功した。またこの結果、pCNP−22、pCNP−53に対応す
るヒトCNP（hCNP−22、hCNP−53）の構造を明らかにす
ると共に、hCNP−53に関しては、これを化学合成し、そ
の生理活性を確認することにより本発明を完成させた。
なお、本発明で得られたhCNP染色体遺伝子をそのま
ま、あるいは適当なプロモーター（例えばSV40初期プロ
モーター）の下流に接続し、適当な哺乳動物細胞（例え
ばサル賢臓細胞由来のCOS細胞）に形質導入することに
よりhCNPcDNAが得られることは自明の事実である（特願
平２−186583）。
ま、あるいは適当なプロモーター（例えばSV40初期プロ
モーター）の下流に接続し、適当な哺乳動物細胞（例え
ばサル賢臓細胞由来のCOS細胞）に形質導入することに
よりhCNPcDNAが得られることは自明の事実である（特願
平２−186583）。
このようにして得られるhCNPcDNAの全塩基配列とこれ
にコードされるhCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列
を第３図に示した。
にコードされるhCNP前駆体タンパクのアミノ酸一次配列
を第３図に示した。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1.DNAプローブ（pCcDNA）の作製 ヒトCNP前駆体タンパクをコードする染色体遺伝子を
クローニングするために用いるDNAプローブ（pCcDNA）
の作製は、ブタCNPcDNA（特願平２−186583）を制限酵
素Dde Iで切断し約700bpのDNA断片を単離、このDNA断片
を［α−32P］dCTPを用い、ニックトランスレーション
で放射標識することにより作製した。
クローニングするために用いるDNAプローブ（pCcDNA）
の作製は、ブタCNPcDNA（特願平２−186583）を制限酵
素Dde Iで切断し約700bpのDNA断片を単離、このDNA断片
を［α−32P］dCTPを用い、ニックトランスレーション
で放射標識することにより作製した。
実施例2.ヒトCNP前駆体タンパクの一部分をコードする
染色体遺伝子の単離 ４℃に保存されたヒト染色体遺伝子ファージDNAライ
ブラリーを大腸菌K12株由来LE392に感染させ、LB培地
（10g Bactotryptone,5g Yeast extract,5g NaCl.1.
5％ Bactoagar全量1l）に拡げ、37℃で一夜培養した。
プレートを４℃で30分間冷却した後、ファージプラーク
上にニトロセルロースフィルター（Shleicher ＆ Schne
ll社製）を５分間放置した。次にこのフィルターをプレ
ートからはがし、風乾後アルカリ変性液（0.5M NaOH,1.
5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液（0.5M Tris−HCl
pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。その後、３×SSC溶
液（20×SSC NaCl 175.3g,クエン酸三ナトリウム88.2g
全量1l）でニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾
後、減圧下80℃120分間熱処理を行った。
染色体遺伝子の単離 ４℃に保存されたヒト染色体遺伝子ファージDNAライ
ブラリーを大腸菌K12株由来LE392に感染させ、LB培地
（10g Bactotryptone,5g Yeast extract,5g NaCl.1.
5％ Bactoagar全量1l）に拡げ、37℃で一夜培養した。
プレートを４℃で30分間冷却した後、ファージプラーク
上にニトロセルロースフィルター（Shleicher ＆ Schne
ll社製）を５分間放置した。次にこのフィルターをプレ
ートからはがし、風乾後アルカリ変性液（0.5M NaOH,1.
5M NaCl）に１分間浸し、次に中和液（0.5M Tris−HCl
pH7.0,1.5MNaCl）に１分間浸した。その後、３×SSC溶
液（20×SSC NaCl 175.3g,クエン酸三ナトリウム88.2g
全量1l）でニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾
後、減圧下80℃120分間熱処理を行った。
このようにして調整したニトロセルロースフィルター
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［３×SSC,1×デンハ
ート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコー
ル、各々0.2mg/ml）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SD
S］に加え、60℃にて３時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。次に２枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記pCcDNAプローブを100万cpm、及び前記プレハ
イブリダイゼーション溶液1mlを用い、60℃にて一夜ハ
イブリダイゼーションを行った。次にこのフィルターを
0.1％SDSを含む３×SSC溶液で60℃30分間、３回洗浄
後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜
行った。このようにして約20万クローンをスクリーニン
グすることによりpCcDNAプローブとハイルブリダイズす
るクローンが１個得られた。このクローンをλhCNP2と
命名し、以後の解析を行った。
を用い、以下に示す条件でプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルター
をプレハイブリダイゼーション液［３×SSC,1×デンハ
ート液（アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコー
ル、各々0.2mg/ml）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SD
S］に加え、60℃にて３時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。次に２枚のニトロセルロースフィルターあ
たり、前記pCcDNAプローブを100万cpm、及び前記プレハ
イブリダイゼーション溶液1mlを用い、60℃にて一夜ハ
イブリダイゼーションを行った。次にこのフィルターを
0.1％SDSを含む３×SSC溶液で60℃30分間、３回洗浄
後、風乾し、オートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜
行った。このようにして約20万クローンをスクリーニン
グすることによりpCcDNAプローブとハイルブリダイズす
るクローンが１個得られた。このクローンをλhCNP2と
命名し、以後の解析を行った。
実施例3.λhCNP2ファージDNAの解析及びDNA塩基配列の
決定 A.λhCNP2ファージDNAの解析 まず常法に従いλhCNP2ファージからDNAを調整した。
次に、このファージDNAを制限酵素EcoR Iを用い切断
し、切断されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
離・解析した。この結果、λhCNP2は約15Kbpのヒト染色
体遺伝子を含むファージであることが判った。また、pC
cDNAプローブを用い、サザンブロット解析を行った結
果、λhCNP2は約2KbpのEcoR I DNA断片（hgEco−２）が
pCcDNAプローブとハイブリダイズすることが判った。
決定 A.λhCNP2ファージDNAの解析 まず常法に従いλhCNP2ファージからDNAを調整した。
次に、このファージDNAを制限酵素EcoR Iを用い切断
し、切断されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
離・解析した。この結果、λhCNP2は約15Kbpのヒト染色
体遺伝子を含むファージであることが判った。また、pC
cDNAプローブを用い、サザンブロット解析を行った結
果、λhCNP2は約2KbpのEcoR I DNA断片（hgEco−２）が
pCcDNAプローブとハイブリダイズすることが判った。
B.hgEco−2DNA断片の塩基配列決定 まず、hgEco−2DNA断片の塩基配列を決定するため
に、一旦、hgEco−2DNA断片をプラスミドベクターpUC11
8（宝酒造）のEcoR Iサイトにサブクローニングし、pUC
hCNP2を作製した。次に、pUChCNP2を適当な制限酵素を
用いて切断し、得られたDNA断片をM13ファージにサブク
ローニングし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
に、一旦、hgEco−2DNA断片をプラスミドベクターpUC11
8（宝酒造）のEcoR Iサイトにサブクローニングし、pUC
hCNP2を作製した。次に、pUChCNP2を適当な制限酵素を
用いて切断し、得られたDNA断片をM13ファージにサブク
ローニングし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
その結果、このDNA断片がヒトCNP遺伝子の一部をコー
ドしていることが明らかとなった。
ドしていることが明らかとなった。
実施例4.ヒトCNP前駆体タンパク全領域をコードする染
色体遺伝子の単離 実施例２で示した方法により調整したニトロセルロー
スフィルターを用い、以下に示す条件でプラークハイブ
リダイゼーションを行った。プローブは前記λhCNP2由
来のhgEco−２約2Kbpにニックトランスレーション法で
［α−32P］dCTPを用いて放射標識したものを用いた。
以後このプローブをhgEco−2DNAと記す。
色体遺伝子の単離 実施例２で示した方法により調整したニトロセルロー
スフィルターを用い、以下に示す条件でプラークハイブ
リダイゼーションを行った。プローブは前記λhCNP2由
来のhgEco−２約2Kbpにニックトランスレーション法で
［α−32P］dCTPを用いて放射標識したものを用いた。
以後このプローブをhgEco−2DNAと記す。
まず、ニトロセルロースフィルターをプレハイブリゼ
ーション液［３×SSC、１×デンハート液（アルブミ
ン、ポリビニルピロリドン、フィコール、各々0.2mg/m
l）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SDS］に加え、65℃に
て３時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に２
枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記hgEco−2
DNAプローブを100万cpm、及び前記プレハイブリダイゼ
ーション溶液1mlを用い、65℃にて一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。次にこのフィルターを0.1％SDSを含
む３×SSC溶液で65℃30分間、３回洗浄後、風乾し、オ
ートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜行った。このよ
うにして約50万クローンをスクリーニングすることによ
りhgEco−2DNAプローブとハイブリダイズするクローン
が５個得られた。これらのクローンのうちの一つをλhC
NP1と命名し、以後の解析を行った。
ーション液［３×SSC、１×デンハート液（アルブミ
ン、ポリビニルピロリドン、フィコール、各々0.2mg/m
l）、サケ精子DNA50μg/ml、0.1％SDS］に加え、65℃に
て３時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に２
枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記hgEco−2
DNAプローブを100万cpm、及び前記プレハイブリダイゼ
ーション溶液1mlを用い、65℃にて一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。次にこのフィルターを0.1％SDSを含
む３×SSC溶液で65℃30分間、３回洗浄後、風乾し、オ
ートラジオグラフィーを−80℃で一昼夜行った。このよ
うにして約50万クローンをスクリーニングすることによ
りhgEco−2DNAプローブとハイブリダイズするクローン
が５個得られた。これらのクローンのうちの一つをλhC
NP1と命名し、以後の解析を行った。
実施例5.λhCNP1ファージDNAの解析及びDNA塩基配列の
決定 A.λhCNP1ファージDNAの解析 まず常法に従いλhCNP1ファージからDNAを調整した。
次に、このファージDNAを制限酵素EcoR Iを用い切断
し、切断されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
離・解析した。この結果、λhCNP1は約15Kbp以上のヒト
染色体遺伝子を含むファージであることが判った。ま
た、hgEco−2DNAプローブを用い、サザンブロット解析
を行った結果、約4KbpのEcoR I DNA断片（hgEco−１）
がhgEco−2DNAプローブとハイブリダイズすることが判
った。そこで、hgEco−2DNAプローブとハイブリダイズ
するDNA断片の塩基配列を、以下に示す方法で決定し
た。
決定 A.λhCNP1ファージDNAの解析 まず常法に従いλhCNP1ファージからDNAを調整した。
次に、このファージDNAを制限酵素EcoR Iを用い切断
し、切断されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で分
離・解析した。この結果、λhCNP1は約15Kbp以上のヒト
染色体遺伝子を含むファージであることが判った。ま
た、hgEco−2DNAプローブを用い、サザンブロット解析
を行った結果、約4KbpのEcoR I DNA断片（hgEco−１）
がhgEco−2DNAプローブとハイブリダイズすることが判
った。そこで、hgEco−2DNAプローブとハイブリダイズ
するDNA断片の塩基配列を、以下に示す方法で決定し
た。
B.hgEco−1DNA断片の塩基配列決定 まず、hgEco−1DNA断片の塩基配列を決定するため
に、一旦、hgEco−1DNA断片をプラスミドベクターpUC11
8（宝酒造）のEcoR Iサイトにサブクローニングし、pUC
CNP1を作成した。次に、pUCCNP1を適当な制限酵素を用
いて切断し、得られたDNA断片をM13ファージにサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。以上
述べた方法で決定した塩基配列の領域を第１図に実線の
矢印で示した。また、hgEco−1DNA断片hgEco−１のlowe
r strandの塩基配列を決定するために、一旦、hgEco−
１をファージベクターM13mp18のEcoR Iサイトにサブク
ローニングし、M13hCNP1を作製した。次に、これをtemp
lateにしてすでに決定された塩基配列を基に化学合成し
たオリゴヌクレオチドプライマー及びUniversalプライ
マーを用い、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。決定
した領域を第１図に点線の矢印で示した。以上の方法で
決定した塩基配列にhgEco−2DNA断片の塩基配列を合わ
せてhgEco−1DNA断片の全塩基配列を完成させた。この
塩基配列及びこの塩基配列から予想されるエクソン部位
にコードされるアミノ酸配列を第２図に示した。
に、一旦、hgEco−1DNA断片をプラスミドベクターpUC11
8（宝酒造）のEcoR Iサイトにサブクローニングし、pUC
CNP1を作成した。次に、pUCCNP1を適当な制限酵素を用
いて切断し、得られたDNA断片をM13ファージにサブクロ
ーニングし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。以上
述べた方法で決定した塩基配列の領域を第１図に実線の
矢印で示した。また、hgEco−1DNA断片hgEco−１のlowe
r strandの塩基配列を決定するために、一旦、hgEco−
１をファージベクターM13mp18のEcoR Iサイトにサブク
ローニングし、M13hCNP1を作製した。次に、これをtemp
lateにしてすでに決定された塩基配列を基に化学合成し
たオリゴヌクレオチドプライマー及びUniversalプライ
マーを用い、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。決定
した領域を第１図に点線の矢印で示した。以上の方法で
決定した塩基配列にhgEco−2DNA断片の塩基配列を合わ
せてhgEco−1DNA断片の全塩基配列を完成させた。この
塩基配列及びこの塩基配列から予想されるエクソン部位
にコードされるアミノ酸配列を第２図に示した。
実施例6.hCNP−53の化学合成 hCNP−53はアプライドバイオシンシステム社のペプチ
ド合成機を用い、固相法で合成し、フッ化水素で脱保護
し、分子内Ｓ−Ｓ結合を形成した後、精製した。
ド合成機を用い、固相法で合成し、フッ化水素で脱保護
し、分子内Ｓ−Ｓ結合を形成した後、精製した。
最終精製標品のアミノ酸シークエンシングの結果を第
１表に、また、アミノ酸分析値を第２表に示す。この結
果から、確かに化学合成したhCNP−53が目的とするhCNP
−53であることを確認した。
１表に、また、アミノ酸分析値を第２表に示す。この結
果から、確かに化学合成したhCNP−53が目的とするhCNP
−53であることを確認した。
第１表は、化学合成したhCNP−53のエドマン分析法に
より各サイクルごとに生じるPTH−アミノ酸の収率を示
す表である。なお各アミノ酸は一文字表記で表した。
より各サイクルごとに生じるPTH−アミノ酸の収率を示
す表である。なお各アミノ酸は一文字表記で表した。
第２表は、化学合成したhCNP−53のアミノ酸分析値を
示す表である。
示す表である。
実施例7.hCNP−53の生理活性の測定 A.hCNP−53のヒヨコ直腸弛緩活性 ヒヨコ直腸弛緩活性は、Currie等の方法（Currie et
al.Nature,221,1−13,1983）に従い測定した。この結
果、hCNP−53のEC50は0.87±0.1nMで、α−ANPの約３倍
高い活性を示した。
al.Nature,221,1−13,1983）に従い測定した。この結
果、hCNP−53のEC50は0.87±0.1nMで、α−ANPの約３倍
高い活性を示した。
B.hCNP−53のナトリウム利尿作用及び血圧降下作用測定 ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用の測定は、DeBo
ld等の方法（Life Sci.,28,89−94,1981）に従いラット
を用いて測定した。この結果、hCNE−53は100nmol/kg投
与で尿排出量を2.5倍高め、さらに血圧を10％低下させ
ることが判った。
ld等の方法（Life Sci.,28,89−94,1981）に従いラット
を用いて測定した。この結果、hCNE−53は100nmol/kg投
与で尿排出量を2.5倍高め、さらに血圧を10％低下させ
ることが判った。
［発明の効果］ 以上のように、本発明者らは、pCNPcDNAをプローブと
して、ヒト染色体遺伝子ライブラリーからhCNP遺伝子の
一部を単離し、さらにこれをプローブとして、hCNP前駆
体の全領域をコードする遺伝子を単離することに成功し
た。また、この遺伝子はhCNPのプロモーター領域をも含
むものであった。この結果、まずヒトにおいてもブタ同
様CNPをコードする遺伝子が存在することが明らかとな
り、さらにhCNP前駆体タンパクの全構造が決定された。
hCNP前駆体タンパクは、ブタ同様126個のアミノ酸残基
からなり、そのＣ−末端には、ブタ脳から単離されたpC
NP−53およびpCNP−22に対応するアミノ酸配列が存在し
た。これらのペプチドのプロセシング部位のアミノ酸配
列はブタとヒトで完全に一致することからヒトにおいて
も、本発明者らがすでに明らかにしているブタ同様の生
合成経路を経てこれらのペプチドが作られ、生体内の体
液量及び血圧の恒常性を調節するホルモンまたは神経伝
達物質として作用することが予想される。
して、ヒト染色体遺伝子ライブラリーからhCNP遺伝子の
一部を単離し、さらにこれをプローブとして、hCNP前駆
体の全領域をコードする遺伝子を単離することに成功し
た。また、この遺伝子はhCNPのプロモーター領域をも含
むものであった。この結果、まずヒトにおいてもブタ同
様CNPをコードする遺伝子が存在することが明らかとな
り、さらにhCNP前駆体タンパクの全構造が決定された。
hCNP前駆体タンパクは、ブタ同様126個のアミノ酸残基
からなり、そのＣ−末端には、ブタ脳から単離されたpC
NP−53およびpCNP−22に対応するアミノ酸配列が存在し
た。これらのペプチドのプロセシング部位のアミノ酸配
列はブタとヒトで完全に一致することからヒトにおいて
も、本発明者らがすでに明らかにしているブタ同様の生
合成経路を経てこれらのペプチドが作られ、生体内の体
液量及び血圧の恒常性を調節するホルモンまたは神経伝
達物質として作用することが予想される。
本発明で特に注目すべきことは、hCNP−53の構造をpC
NP−53と比較した場合、アミノ酸が２カ所異なることが
明らかとなった点にある。そこで、本発明者らは、hCNP
−53を化学合成し、その生理活性をヒヨコ直腸弛緩作
用、ナトリウム利尿及び血圧降圧作用で確認した。すな
わちhCNP−53が生理活性ペプチドであることを証明した
のである。このことはCNPファミリーに属するペプチド
を医薬品に応用する上で、非常に重要な意味をもつ。た
とえば、ヒトと構造の異なるpCNP−53を医薬品として使
用したならば、おそらく生体内では異物として認識さ
れ、抗体が産生される。その結果、pCNP−53の活性が中
和されたり、抗原抗体のコンプレックスによる賢毒性が
生じる可能性がある。また、ヒト細胞のCNPレセプター
に対する親和性がhCNP−53に比べ弱い可能性もあり、そ
の場合は作用自体が弱くなる。同様のことは、hCNP−53
に限らずhCNP前駆体タンパクから生合成される可能性の
あるペプチド［preprohCNPのアミノ酸一次配列番号で24
から102番目の間には、少なくとも９個のリジン残基（2
4,30,51,52,55,65,89,97および99番目）と８個のアルギ
ニン残基（33,68,70,73,76,82,87および96番目）が存在
し、prohCNPは生体内においてプロセシング酵素によ
り、これら塩基性アミノ酸残基のＣ−末端側が特異的に
切断される可能性があり、生体内においてhCNP−22およ
びhCNP−53のＮ−末端にさらにアミノ酸が付加したペプ
チドが存在している可能性が高い。］においても言える
ことである。
NP−53と比較した場合、アミノ酸が２カ所異なることが
明らかとなった点にある。そこで、本発明者らは、hCNP
−53を化学合成し、その生理活性をヒヨコ直腸弛緩作
用、ナトリウム利尿及び血圧降圧作用で確認した。すな
わちhCNP−53が生理活性ペプチドであることを証明した
のである。このことはCNPファミリーに属するペプチド
を医薬品に応用する上で、非常に重要な意味をもつ。た
とえば、ヒトと構造の異なるpCNP−53を医薬品として使
用したならば、おそらく生体内では異物として認識さ
れ、抗体が産生される。その結果、pCNP−53の活性が中
和されたり、抗原抗体のコンプレックスによる賢毒性が
生じる可能性がある。また、ヒト細胞のCNPレセプター
に対する親和性がhCNP−53に比べ弱い可能性もあり、そ
の場合は作用自体が弱くなる。同様のことは、hCNP−53
に限らずhCNP前駆体タンパクから生合成される可能性の
あるペプチド［preprohCNPのアミノ酸一次配列番号で24
から102番目の間には、少なくとも９個のリジン残基（2
4,30,51,52,55,65,89,97および99番目）と８個のアルギ
ニン残基（33,68,70,73,76,82,87および96番目）が存在
し、prohCNPは生体内においてプロセシング酵素によ
り、これら塩基性アミノ酸残基のＣ−末端側が特異的に
切断される可能性があり、生体内においてhCNP−22およ
びhCNP−53のＮ−末端にさらにアミノ酸が付加したペプ
チドが存在している可能性が高い。］においても言える
ことである。
さらに、第２図にしめすhCNP前駆体タンパクの遺伝子
は、このタンパクをコードする構造遺伝子領域のみなら
ず、この構造遺伝子を発現させるプロモーター領域をも
含んでいることが判った。このプロモーター領域の下流
に、例えばCAT（クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ）遺伝子をつなぎ、適当なヒト細胞に形質
導入することで、hCNPの発現調節機構を詳細に検討する
ことが可能になる。
は、このタンパクをコードする構造遺伝子領域のみなら
ず、この構造遺伝子を発現させるプロモーター領域をも
含んでいることが判った。このプロモーター領域の下流
に、例えばCAT（クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ）遺伝子をつなぎ、適当なヒト細胞に形質
導入することで、hCNPの発現調節機構を詳細に検討する
ことが可能になる。
以上述べたことから、本発明により明らかにされたhC
NP前駆体タンパクの染色体遺伝子およびアミノ酸一次配
列の情報は、今後、ヒトにおけるCNPの生合成、生理作
用のメカニズムを解明する上で、また、CNPファミリー
に属するペプチドを医薬品へと応用する上で大いに貢献
するものである。
NP前駆体タンパクの染色体遺伝子およびアミノ酸一次配
列の情報は、今後、ヒトにおけるCNPの生合成、生理作
用のメカニズムを解明する上で、また、CNPファミリー
に属するペプチドを医薬品へと応用する上で大いに貢献
するものである。
第１図はhgEco−２とhgEco−１の制限酵素地図及び塩基
配列決定のストラテジーを示す図である。 第２図は、hCNP前駆体タンパクをコードするhgEco−１
のDNA塩基配列と構造遺伝子領域のエクソンにコードさ
れているhCNP前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す図で
ある。 第３図は、hCNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされる
hCNP前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す図である。
配列決定のストラテジーを示す図である。 第２図は、hCNP前駆体タンパクをコードするhgEco−１
のDNA塩基配列と構造遺伝子領域のエクソンにコードさ
れているhCNP前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す図で
ある。 第３図は、hCNPcDNAの全塩基配列とこれにコードされる
hCNP前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 南野 直人 大阪府吹田市青山台３丁目50，Ｄ―10― 303 (72)発明者 田中 正治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (72)発明者 渕村 佳代子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社生物医学研究所 内 (72)発明者 俵木 保典 東京都千代田区麹町５―７―２ 第31森 ビル サントリー株式会社創薬推進部内 (56)参考文献 特開 平４−74199（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖ ｏｌ．168，Ｖｏｌ．２（Ａｐｒｉｌ 30，1990）ｐ．863−870 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖ ｏｌ．170，Ｖｏｌ．２（Ｊｕｌｙ 31, 1990）ｐ．973−979 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ
Claims (11)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチ
ド。 - 【請求項３】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端側の１位乃至101位のいずれか２個の隣接するアミ
ノ酸残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損してい
るポリペプチド。 - 【請求項４】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項５】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするDNA。 - 【請求項６】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするDNA。 - 【請求項７】下記の塩基配列を有する請求項５記載のDN
A。 - 【請求項８】下記の塩基配列を有する請求項６記載のDN
A。 - 【請求項９】請求項１記載のアミノ酸配列において、Ｎ
末端からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチド
をコードするDNA。 - 【請求項１０】請求項１記載のアミノ酸配列において、
Ｎ末端側の１位乃至101位のいずれか２個の隣接するア
ミノ酸残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損して
いるポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項１１】下記の塩基配列を有するDNA。
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