JP3160276B2 - 新規ｃＤＮＡフラグメント - Google Patents
新規ｃＤＮＡフラグメントInfo
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- JP3160276B2 JP3160276B2 JP04963689A JP4963689A JP3160276B2 JP 3160276 B2 JP3160276 B2 JP 3160276B2 JP 04963689 A JP04963689 A JP 04963689A JP 4963689 A JP4963689 A JP 4963689A JP 3160276 B2 JP3160276 B2 JP 3160276B2
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- JP
- Japan
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- cdna
- human
- bnp
- fragment
- cdna fragment
- Prior art date
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生理活性ペプチドの生産に有用な新規cDNAフ
ラグメント、更に詳しくはヒト脳性ナトリウム利尿活性
のあるペプチド（ヒトBNP）をコードする塩基配列を含
有するcDNAフラグメント、その製造法、及び該cDNAフラ
グメントを合成するためのmRNAに関する。
ラグメント、更に詳しくはヒト脳性ナトリウム利尿活性
のあるペプチド（ヒトBNP）をコードする塩基配列を含
有するcDNAフラグメント、その製造法、及び該cDNAフラ
グメントを合成するためのmRNAに関する。
1983〜1984年にラットおよびヒトの心房より分泌され
る新しいナトリウム利尿ペプチドの構造決定が次々に発
表された〔例えば、:Biochem.Biophys.Res.Commun.,11
7,859（1983）;Biochem.Biophys.Res.Commun.,118,131
〜139（1984）〕。これらのペプチドは心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（以下、ANPという）と命名され、強力
なナトリウム利尿作用、血管平滑筋弛緩作用を有し、新
しいタイプのペプチド系循環器用薬剤として注目されて
いる。
る新しいナトリウム利尿ペプチドの構造決定が次々に発
表された〔例えば、:Biochem.Biophys.Res.Commun.,11
7,859（1983）;Biochem.Biophys.Res.Commun.,118,131
〜139（1984）〕。これらのペプチドは心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（以下、ANPという）と命名され、強力
なナトリウム利尿作用、血管平滑筋弛緩作用を有し、新
しいタイプのペプチド系循環器用薬剤として注目されて
いる。
一方、1988年にはブタの脳より新しい利尿ペプチドが
単離精製され、構造決定もされ、ブタ脳性ナトリウム利
尿ペプチド（以下、ブタBNPという）と命名された〔Nat
ure,332,No.6159,78〜81（1988）;Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,155,726〜732（1988）〕。脳性ナトリウム利
尿ペプチド（BNP）の薬理作用はANPはほとんど同じであ
り、利尿作用、ナトリウム利尿作用、血圧降下作用、ヒ
ヨコ直腸弛緩作用等を有し、その比活性もANPとほぼ同
等である。ただし直腸弛緩活性はBNPの方がANPより３〜
４倍高い。このような性質よりBNPも新しいペプチド系
循環器用薬剤として期待されている。また、ブタBNPに
ついては、DNAレベルの研究も行なわれ、ブタBNPおよび
その前駆体をコードする塩基配列を有するcDNAのクロー
ニングが報告されている〔Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,157,410（1988）〕。
単離精製され、構造決定もされ、ブタ脳性ナトリウム利
尿ペプチド（以下、ブタBNPという）と命名された〔Nat
ure,332,No.6159,78〜81（1988）;Biochem.Biophys.Re
s.Commun.,155,726〜732（1988）〕。脳性ナトリウム利
尿ペプチド（BNP）の薬理作用はANPはほとんど同じであ
り、利尿作用、ナトリウム利尿作用、血圧降下作用、ヒ
ヨコ直腸弛緩作用等を有し、その比活性もANPとほぼ同
等である。ただし直腸弛緩活性はBNPの方がANPより３〜
４倍高い。このような性質よりBNPも新しいペプチド系
循環器用薬剤として期待されている。また、ブタBNPに
ついては、DNAレベルの研究も行なわれ、ブタBNPおよび
その前駆体をコードする塩基配列を有するcDNAのクロー
ニングが報告されている〔Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,157,410（1988）〕。
ところでBNPはヒトの疾患治療薬として用いるもので
あるため、抗原性等の問題よりヒト由来のBNPの開発が
要望されていた。しかし、ヒト由来のBNPについては蛋
白、ペプチドのレベルでも、DNAのレベルでもその存在
および構造が未だ証明されていない。
あるため、抗原性等の問題よりヒト由来のBNPの開発が
要望されていた。しかし、ヒト由来のBNPについては蛋
白、ペプチドのレベルでも、DNAのレベルでもその存在
および構造が未だ証明されていない。
かかる実情において、本発明者らはヒト由来のBNP
（ヒトBNP）を取得すべく種々検討してきたところ、ブ
タBNP前駆体をコードするcDNAフラグメントをプローブ
として用い、ヒト組織のcDNAライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、該ヒト組織中よりBNPをコードす
るcDNAをクローニングすることに成功し、本発明を完成
した。
（ヒトBNP）を取得すべく種々検討してきたところ、ブ
タBNP前駆体をコードするcDNAフラグメントをプローブ
として用い、ヒト組織のcDNAライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、該ヒト組織中よりBNPをコードす
るcDNAをクローニングすることに成功し、本発明を完成
した。
すなわち、本発明は次のアミノ酸配列を含有するヒト
脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードするcDNAフラグメ
ントを提供するものである。
脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードするcDNAフラグメ
ントを提供するものである。
本発明はまた該cDNAフラグメントの製造法を提供する
ものである。
ものである。
本発明はまた該cDNAフラグメントを合成するためのmR
NAを提供するものである。
NAを提供するものである。
本発明のcDNAフラグメントは例えば次のようにして調
製される。
製される。
まず、ヒトBNPが含有されていると考えられるヒト組
織より全RNAを分離し、これよりmRNAを精製し、常法に
よりcDNAライブラリーを構築する。次いでこのcDNAライ
ブラリーよりブタBNP前駆体をコードするcDNAフラグメ
ントをプローブとするハイブリダイゼーションによって
ヒトBNPクローンをスクリーニングすれば、本発明のcDN
Aフラグメントが得られる。以下に本発明cDNAフラグメ
ントの製法について説明する。
織より全RNAを分離し、これよりmRNAを精製し、常法に
よりcDNAライブラリーを構築する。次いでこのcDNAライ
ブラリーよりブタBNP前駆体をコードするcDNAフラグメ
ントをプローブとするハイブリダイゼーションによって
ヒトBNPクローンをスクリーニングすれば、本発明のcDN
Aフラグメントが得られる。以下に本発明cDNAフラグメ
ントの製法について説明する。
（１） cDNAライブラリーの構築 mRNAを調製するためのヒト組織としては、ヒト脳、ヒ
ト心房等が用いられる。RNAの分離は、例えばヒト心房
断片をグアニジルチオシアネートとともにホモジナイズ
し、トリフルオロ酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心によ
り行うことができる。mRNAの精製はオリゴ（dT）セルロ
ースカラムクロマトグラフィーにて常法により行われ
る。得られたmRNAよりcDNAを合成するには、例えばcDNA
合成キット（ファルマシア製）を用いる方法、岡山−ベ
ルグ（Berg）の方法、グラブラーとホフマンの方法やそ
の変法、他の市販のキットなどを用いて常法により行わ
れる。得られたcDNAに制限酵素EcoR Iアダプターを付加
後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ等で５′端をリン酸化
してベクター（例えばλgt10）とライゲーションし、さ
らにインビトロパッケージングをすることにより、cDNA
ライブラリーを構築する。
ト心房等が用いられる。RNAの分離は、例えばヒト心房
断片をグアニジルチオシアネートとともにホモジナイズ
し、トリフルオロ酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心によ
り行うことができる。mRNAの精製はオリゴ（dT）セルロ
ースカラムクロマトグラフィーにて常法により行われ
る。得られたmRNAよりcDNAを合成するには、例えばcDNA
合成キット（ファルマシア製）を用いる方法、岡山−ベ
ルグ（Berg）の方法、グラブラーとホフマンの方法やそ
の変法、他の市販のキットなどを用いて常法により行わ
れる。得られたcDNAに制限酵素EcoR Iアダプターを付加
後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ等で５′端をリン酸化
してベクター（例えばλgt10）とライゲーションし、さ
らにインビトロパッケージングをすることにより、cDNA
ライブラリーを構築する。
（２） ヒトBNPクローンのスクリーニング ヒトBNPクローンのスクリーニングは、ブタBNPのcDNA
断片のラベル体をプローブとして用いて行なわれる。こ
のcDNA断片はブタBNPのcDNAクローニング〔Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,157,410（1988）〕の過程で得られた
不完全長のクローンであるpBNP−82（320bp）を制限酵
素Xho IとRsa Iで消化して得られる120bp断片（ブタBNP
の活性部位であるブタBNP−26（アミノ酸26残基からな
る）とその上流30bpを含むDNA断片）であり、プローブ
はこのcDNA断片を32Pでラベルして調製される。該プロ
ーブと前述のcDNAライブラリーをハイブリダイズせし
め、陽性クローンを選択する。選択された陽性クローン
λhBNP−57を制限酵素で切断すれば本発明のcDNAフラグ
メントが得られる。
断片のラベル体をプローブとして用いて行なわれる。こ
のcDNA断片はブタBNPのcDNAクローニング〔Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,157,410（1988）〕の過程で得られた
不完全長のクローンであるpBNP−82（320bp）を制限酵
素Xho IとRsa Iで消化して得られる120bp断片（ブタBNP
の活性部位であるブタBNP−26（アミノ酸26残基からな
る）とその上流30bpを含むDNA断片）であり、プローブ
はこのcDNA断片を32Pでラベルして調製される。該プロ
ーブと前述のcDNAライブラリーをハイブリダイズせし
め、陽性クローンを選択する。選択された陽性クローン
λhBNP−57を制限酵素で切断すれば本発明のcDNAフラグ
メントが得られる。
得られたcDNAフラグメントの塩基配列の決定は、常法
例えばcDNAフラグメントをシークェンシング用ベクター
に組み込み、phBNP−57を作成し、ついでcDNA領域の制
限酵素地図を作成し、さらに適当な長さに切断する制限
酵素を用いて得られるDNA断片をそれぞれシークェンシ
ング用ベクターに組み込み直してサブクローニングし、
サンガーらの方法によって全塩基配列を決定することが
できる。
例えばcDNAフラグメントをシークェンシング用ベクター
に組み込み、phBNP−57を作成し、ついでcDNA領域の制
限酵素地図を作成し、さらに適当な長さに切断する制限
酵素を用いて得られるDNA断片をそれぞれシークェンシ
ング用ベクターに組み込み直してサブクローニングし、
サンガーらの方法によって全塩基配列を決定することが
できる。
かくして決定された本発明のcDNAフラグメントの塩基
配列およびヒトBNPを含有するアミノ酸配列は第２図に
示す通りである。第２図の塩基配列のうち、１〜402は
アミノ酸数134残基よりなるヒトBNPプレ前駆体ポリペプ
チドをコードし、このうち79〜402はアミノ酸数108残基
よりなるヒトBNP前駆体ポリペプチドをコードすると考
えられる。このことは前駆体の前にあるシグナルペプチ
ドの構造がブタとヒトとで非常によく似ており、またAr
g−Ser−His−Pro−Leu−Gly（塩基番号73−90に対応）
のアミノ酸配列がブタBNPにも同様にありこの中のSer−
Hisの結合が切れてブタBNP前駆体が生成している〔Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,157,410（1988）〕ことから
判断した。またこのうち307〜402はアミノ酸数32残基よ
りなるヒトBNP−32をコードすると考えられる。このこ
とはまだヒトBNPがペプチドとして単離されていないた
め断定はできないが前駆体からプロセッシングを受けた
ヒトBNPが生成すると考えられる。ブタの場合ブタBNP−
26（アミノ酸26残基よりなる）〔Nature,332,78〜81（1
988）〕ブタBNP−32（アミノ酸32残基よりなる）〔Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,155,726〜732（1988）〕が単
離され、ANPにおいてもヒトではヒトαANP（アミノ酸28
残基よりなる）〔Biochem.Biophys.Res.Commun,118,131
〜139（1984）〕ラットではラットαANP（アミノ酸28残
基よりなる）〔Biochem.Biop−hys.Res.Commun.,117,85
9−865（1983）〕が単離されている。これらはすべてそ
の前駆体に存在するArgおよびPro−Arg後で切断され生
成されている。ヒトBNPの場合活性に必要と思われるCys
（112番目）からHis（134番目）の23アミノ酸残基から
なるペプチドの前に存在するArgが102番目のArgでありP
roArgの構造をもっていることからこの後でプロセッシ
ングを受けてアミノ酸数32残基よりなるヒトBNP−32が
生成すると考えた。
配列およびヒトBNPを含有するアミノ酸配列は第２図に
示す通りである。第２図の塩基配列のうち、１〜402は
アミノ酸数134残基よりなるヒトBNPプレ前駆体ポリペプ
チドをコードし、このうち79〜402はアミノ酸数108残基
よりなるヒトBNP前駆体ポリペプチドをコードすると考
えられる。このことは前駆体の前にあるシグナルペプチ
ドの構造がブタとヒトとで非常によく似ており、またAr
g−Ser−His−Pro−Leu−Gly（塩基番号73−90に対応）
のアミノ酸配列がブタBNPにも同様にありこの中のSer−
Hisの結合が切れてブタBNP前駆体が生成している〔Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,157,410（1988）〕ことから
判断した。またこのうち307〜402はアミノ酸数32残基よ
りなるヒトBNP−32をコードすると考えられる。このこ
とはまだヒトBNPがペプチドとして単離されていないた
め断定はできないが前駆体からプロセッシングを受けた
ヒトBNPが生成すると考えられる。ブタの場合ブタBNP−
26（アミノ酸26残基よりなる）〔Nature,332,78〜81（1
988）〕ブタBNP−32（アミノ酸32残基よりなる）〔Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,155,726〜732（1988）〕が単
離され、ANPにおいてもヒトではヒトαANP（アミノ酸28
残基よりなる）〔Biochem.Biophys.Res.Commun,118,131
〜139（1984）〕ラットではラットαANP（アミノ酸28残
基よりなる）〔Biochem.Biop−hys.Res.Commun.,117,85
9−865（1983）〕が単離されている。これらはすべてそ
の前駆体に存在するArgおよびPro−Arg後で切断され生
成されている。ヒトBNPの場合活性に必要と思われるCys
（112番目）からHis（134番目）の23アミノ酸残基から
なるペプチドの前に存在するArgが102番目のArgでありP
roArgの構造をもっていることからこの後でプロセッシ
ングを受けてアミノ酸数32残基よりなるヒトBNP−32が
生成すると考えた。
またANPの場合前駆体にも生理活性があることが判っ
ておりヒトBNPの場合も同様と考えられ、医薬品として
考えた場合前駆体、ヒトBNP−32どちらも有用な物質で
ある。
ておりヒトBNPの場合も同様と考えられ、医薬品として
考えた場合前駆体、ヒトBNP−32どちらも有用な物質で
ある。
なお、全長cDNAフラグメント及びそれに対応するアミ
ノ酸の配列は図２に示した通りであるが、必ずしも全長
ペプチドのみがヒトBNP活性を示すものではない。すな
わち、この全長cDNAフラグメントで産生させる全長のペ
プチドのみが有用であるとは限らず、例えばＣ端が短縮
されたものを得ることもある。あるいは部分的にアミノ
酸をコードするコドンに入れ換えてヒトBNP活性を示す
ペプチドを産生させることもできる。さらに、それらの
アミノ酸配列をコードするcDNAフラグメント配列は一種
類に限らないことは常識であり、一旦全長cDNAフラグメ
ントを特定すれば種々の変種DNAを作りこれを用いてヒ
トBNP活性を有するペプチドを産生させることができ
る。従って本発明で意味するヒト由来の脳性ナトリウム
利尿ペプチド（ヒトBNP）とは全長ヒトBNPに限定されず
BNP活性を有しているペプチドのことであり、ヒト由来
の脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードする塩基配列と
はそれらをコードする塩基配列を意味する。
ノ酸の配列は図２に示した通りであるが、必ずしも全長
ペプチドのみがヒトBNP活性を示すものではない。すな
わち、この全長cDNAフラグメントで産生させる全長のペ
プチドのみが有用であるとは限らず、例えばＣ端が短縮
されたものを得ることもある。あるいは部分的にアミノ
酸をコードするコドンに入れ換えてヒトBNP活性を示す
ペプチドを産生させることもできる。さらに、それらの
アミノ酸配列をコードするcDNAフラグメント配列は一種
類に限らないことは常識であり、一旦全長cDNAフラグメ
ントを特定すれば種々の変種DNAを作りこれを用いてヒ
トBNP活性を有するペプチドを産生させることができ
る。従って本発明で意味するヒト由来の脳性ナトリウム
利尿ペプチド（ヒトBNP）とは全長ヒトBNPに限定されず
BNP活性を有しているペプチドのことであり、ヒト由来
の脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードする塩基配列と
はそれらをコードする塩基配列を意味する。
本発明cDNAフラグメントを用い、常法により発現ベク
ターを導入し、発現させることによりヒトBNP、ヒトBNP
前駆体、さらにはそれらと生物学的活性を同じくする各
種ペプチドを産生させることができる。得られるヒトBN
Pは優れた平滑筋弛緩作用、利尿及びナトリウム利尿作
用、血圧降下作用を有し、かつヒト由来であるため安全
性が高く、例えば心臓性浮腫、腎臓性浮腫、肝性浮腫、
肺浮腫、高血圧症、うつ血性心不全、急性及び慢性腎不
全等の治療薬として有用である。
ターを導入し、発現させることによりヒトBNP、ヒトBNP
前駆体、さらにはそれらと生物学的活性を同じくする各
種ペプチドを産生させることができる。得られるヒトBN
Pは優れた平滑筋弛緩作用、利尿及びナトリウム利尿作
用、血圧降下作用を有し、かつヒト由来であるため安全
性が高く、例えば心臓性浮腫、腎臓性浮腫、肝性浮腫、
肺浮腫、高血圧症、うつ血性心不全、急性及び慢性腎不
全等の治療薬として有用である。
また投与方法は、ペプチド系医薬の投与に使用されて
いる方法すなわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射によ
り、あるいは舌下投与、鼻内投与、直腸投与により投与
することが可能である。
いる方法すなわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射によ
り、あるいは舌下投与、鼻内投与、直腸投与により投与
することが可能である。
またこのペプチドは危険な又は有害な副作用を生じさ
せることなく投与できる量は、0.5μg/kg〜100mg/kgの
範囲が好ましい。
せることなく投与できる量は、0.5μg/kg〜100mg/kgの
範囲が好ましい。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （１） cDNAライブラリーの構築 ヒト心房断片3gを液体窒素で破砕した後、Chirgwinら
の方法〔Chirgwin,J.M.ら:Biochemistry,18,5294〜5299
（1979）〕に従い、グアニジウムチオシアネート水溶液
を添加しホモジナイズした。ついでトリフルオロ酢酸セ
シウム平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離した。
次いで常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラム
クロマトグラフィーで精製し、37μｇのポリ（Ａ）+RNA
（mRNA）を単離した。
の方法〔Chirgwin,J.M.ら:Biochemistry,18,5294〜5299
（1979）〕に従い、グアニジウムチオシアネート水溶液
を添加しホモジナイズした。ついでトリフルオロ酢酸セ
シウム平衡密度勾配超遠心によって全RNAを分離した。
次いで常法によりこれをオリゴ（dT）セルロースカラム
クロマトグラフィーで精製し、37μｇのポリ（Ａ）+RNA
（mRNA）を単離した。
続いてcDNA合成キット（ファルマシア製）を用いて３
μｇのmRNAからcDNAを合成し、EcoR Iアダプターを付加
後T4ポリヌクレオチドキナーゼで５′端をリン酸化して
ベクターλgt10とライゲーションした。ベクターとして
はEcoR Iによる切断と脱リン酸化したλgt10アームズを
用いた。このλgt10アームズ２μｇに対しライゲーショ
ンに用いたcDNAはcDNA合成に用いたRNAに換算して0.1μ
ｇ相当である。ライゲーション後パッケージングキット
（ギガパックゴールド：ストラタジーン製）を使ってパ
ッケージングしてcDNAライブラリーの構築を終了した。
μｇのmRNAからcDNAを合成し、EcoR Iアダプターを付加
後T4ポリヌクレオチドキナーゼで５′端をリン酸化して
ベクターλgt10とライゲーションした。ベクターとして
はEcoR Iによる切断と脱リン酸化したλgt10アームズを
用いた。このλgt10アームズ２μｇに対しライゲーショ
ンに用いたcDNAはcDNA合成に用いたRNAに換算して0.1μ
ｇ相当である。ライゲーション後パッケージングキット
（ギガパックゴールド：ストラタジーン製）を使ってパ
ッケージングしてcDNAライブラリーの構築を終了した。
cDNAライブラリーの構築成績を調べるため少量を大腸
菌c600およびc600hflに接種したところ、c600で出現し
たプラークのうち90％が透明で10％が濁っていた。この
ことにより組み換えファージはライブラリー中の90％を
占めていることがわかった。また、cDNAライブラリー全
体では約７×107のブラークを生じることがわかった。
菌c600およびc600hflに接種したところ、c600で出現し
たプラークのうち90％が透明で10％が濁っていた。この
ことにより組み換えファージはライブラリー中の90％を
占めていることがわかった。また、cDNAライブラリー全
体では約７×107のブラークを生じることがわかった。
（２） ヒトBNPクローンのスクリーニング スクリーニングはcDNAライブラリーの一部を大腸菌c6
00hflに接種し、出現した５×105プラークについて行っ
た。一方、スクリーニングのためのプローブはブタBNP
のcDNA断片を32Pでラベルしたものを用いた。このcDNA
断片はブタBNPのcDNAクローニング〔Biochem.Biophys.R
es.Commun.,157,410（1988）〕の過程で得られた不完全
長クローンであるpBNP−82（320bp）から制限酵素Xho I
とRsa Iで切り出される120bp断片（ブタBNPの活性部位
であるブタBNP−26（アミノ酸26残基からなる）とその
上流30bpを含むDNA断片）をアクリルアミドゲル電気泳
動で精製して調整した。まずプラークをナイロンフィル
ターにトランスファーし、アルカリ処理後中和して紫外
線照射でDNAを固定した。５×デーンハーツ（Denhardt
s）溶液、100μg/mlの変性サケ精子DNA及び0.1％SDSを
含む４×SSC溶液0.6M NaClと0.06Mクエン酸３ナトリウ
ムにフィルターを浸して60℃で３時間プレハイブリダイ
ゼーションした。引き続きRandom primed DNAラベリン
グキット（ベーリンガーマンハイム社製）によって32P
でラベルしたプローブを２×106cpm/mlになるようにハ
イブリダイゼーション液（プレハイブリダイゼーション
液と同一組成）に加え、その中でフィルターを60℃で一
昼夜インキュベートした。
00hflに接種し、出現した５×105プラークについて行っ
た。一方、スクリーニングのためのプローブはブタBNP
のcDNA断片を32Pでラベルしたものを用いた。このcDNA
断片はブタBNPのcDNAクローニング〔Biochem.Biophys.R
es.Commun.,157,410（1988）〕の過程で得られた不完全
長クローンであるpBNP−82（320bp）から制限酵素Xho I
とRsa Iで切り出される120bp断片（ブタBNPの活性部位
であるブタBNP−26（アミノ酸26残基からなる）とその
上流30bpを含むDNA断片）をアクリルアミドゲル電気泳
動で精製して調整した。まずプラークをナイロンフィル
ターにトランスファーし、アルカリ処理後中和して紫外
線照射でDNAを固定した。５×デーンハーツ（Denhardt
s）溶液、100μg/mlの変性サケ精子DNA及び0.1％SDSを
含む４×SSC溶液0.6M NaClと0.06Mクエン酸３ナトリウ
ムにフィルターを浸して60℃で３時間プレハイブリダイ
ゼーションした。引き続きRandom primed DNAラベリン
グキット（ベーリンガーマンハイム社製）によって32P
でラベルしたプローブを２×106cpm/mlになるようにハ
イブリダイゼーション液（プレハイブリダイゼーション
液と同一組成）に加え、その中でフィルターを60℃で一
昼夜インキュベートした。
次にフィルターを0.1％SDSを含む２×SCC溶液で洗浄
し、風乾後、オートラジオグラフィーに供した。
し、風乾後、オートラジオグラフィーに供した。
これにより55個のハイブリダイゼーションポジティブ
プラークを得た。この55個のポジティブプラークがヒト
ANPをコードするDNA（680bp）をプローブとしてハイブ
リダイズするか否か試みたところ、すべて陰性であっ
た。この結果、このcDNAは公知のヒトANPをコードするc
DNAとは異なることが明らかである。上記55個のポジテ
ィブプラークをモノクローン化し、ついで常法によりλ
ファージDNAを調製した。これを制限酵素BcoR Iで切断
して得られるDNA断片を調べたところ、λhBNP−57と命
名したクローンに最長約700bpのcDNAが挿入されてい
た。このインサートcDNAをシークエンス用ベクターであ
るブルースクリプト（Blue Script（KS（＋）），スト
ラタジーン製）に組み込みphBNP−57を作成した。この
プラスミドを含有する大腸菌はE.coli HB101/phBNP−57
と命名し、微工研に微工研条寄第2299号（FERMBP−229
9）として寄託した。ついでこのcDNA領域の制限酵素地
図を作成した。更に適当な長さに切断される制限酵素を
用いてcDNA断片を得、それぞれをブルースクリプトに組
み直してサブクローニングした。
プラークを得た。この55個のポジティブプラークがヒト
ANPをコードするDNA（680bp）をプローブとしてハイブ
リダイズするか否か試みたところ、すべて陰性であっ
た。この結果、このcDNAは公知のヒトANPをコードするc
DNAとは異なることが明らかである。上記55個のポジテ
ィブプラークをモノクローン化し、ついで常法によりλ
ファージDNAを調製した。これを制限酵素BcoR Iで切断
して得られるDNA断片を調べたところ、λhBNP−57と命
名したクローンに最長約700bpのcDNAが挿入されてい
た。このインサートcDNAをシークエンス用ベクターであ
るブルースクリプト（Blue Script（KS（＋）），スト
ラタジーン製）に組み込みphBNP−57を作成した。この
プラスミドを含有する大腸菌はE.coli HB101/phBNP−57
と命名し、微工研に微工研条寄第2299号（FERMBP−229
9）として寄託した。ついでこのcDNA領域の制限酵素地
図を作成した。更に適当な長さに切断される制限酵素を
用いてcDNA断片を得、それぞれをブルースクリプトに組
み直してサブクローニングした。
挿入cDNA領域の制限酵素切断部位と塩基配列決定のス
トラテジーを第１図に示す。塩基配列はサンガーらの方
法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463〜5467（1977））
を用いて決定した。
トラテジーを第１図に示す。塩基配列はサンガーらの方
法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463〜5467（1977））
を用いて決定した。
第２図にこのcDNAの塩基配列及びその塩基配列に対応
するアミノ酸配列を示す。
するアミノ酸配列を示す。
該挿入DNAの配列は翻訳開始コドンTAGからはじまり翻
訳終止コドンTAAで終る長い翻訳可能領域を有する。全
長692bpであるこのcDNAは塩基対番号−99〜−１までは
５′側非翻訳領域であり、１〜78まではシグナルペプチ
ドをコードし、79〜402はヒトBNP前駆体をコードしてい
ると考えられる。そのうち307〜402はヒトBNP−32（ア
ミノ酸32残基よりなる）をコードしていると考えられ
る。また403〜593は３′側非翻訳領域である。
訳終止コドンTAAで終る長い翻訳可能領域を有する。全
長692bpであるこのcDNAは塩基対番号−99〜−１までは
５′側非翻訳領域であり、１〜78まではシグナルペプチ
ドをコードし、79〜402はヒトBNP前駆体をコードしてい
ると考えられる。そのうち307〜402はヒトBNP−32（ア
ミノ酸32残基よりなる）をコードしていると考えられ
る。また403〜593は３′側非翻訳領域である。
この中で、ヒトBNP−32をコードしている307〜402の
塩基配列に対応するアミノ酸配列はそのうちのアミノ酸
17残基がシスティンのジスルフィド結合でつくる環状構
造をもちブタBNPと非常によく似た構造を有している。
塩基配列に対応するアミノ酸配列はそのうちのアミノ酸
17残基がシスティンのジスルフィド結合でつくる環状構
造をもちブタBNPと非常によく似た構造を有している。
実施例２ ポリペプチドの製造 λhBNP−57から制限酵素EcoR Iで切り出されたcDNA
を、プラスミドブルースクリプトに挿入することによっ
て構築された組み換えプラスミドであるクローンphBNP
−57を利用して、γ−BNPを生産するベクターを得るこ
とができる。
を、プラスミドブルースクリプトに挿入することによっ
て構築された組み換えプラスミドであるクローンphBNP
−57を利用して、γ−BNPを生産するベクターを得るこ
とができる。
すなわち、phBNP−57の挿入cDNAのγ−BNPコード領域
の直前に、位置指向性突然変異によって新たな制限酵素
認識部位と翻訳開始コドン（ATG）を導入し、この新し
い認識部位を利用してフラグメントを分離する。次に、
発現ベクター用プラスミドのプロモーターのすぐ上流に
上記フラグメントを挿入し、このプラスミドを大腸菌に
導入する。ポリペプチドを合成するに足る十分な栄養物
を与えて大腸菌を培養し、次いでγ−BNPを回収する。
また、phBNP−57の挿入cDNA上で、位置指向性突然変異
の位置および塩基配列を変えることによってBNP−32、
あるいはBNPを大腸菌で生産するためのフラグメントが
得られ、これらのフラグメントが挿入された発現ベクタ
ーを大腸菌に導入し、これを培養することによりBNP−3
2あるいはBNPを回収することができる。
の直前に、位置指向性突然変異によって新たな制限酵素
認識部位と翻訳開始コドン（ATG）を導入し、この新し
い認識部位を利用してフラグメントを分離する。次に、
発現ベクター用プラスミドのプロモーターのすぐ上流に
上記フラグメントを挿入し、このプラスミドを大腸菌に
導入する。ポリペプチドを合成するに足る十分な栄養物
を与えて大腸菌を培養し、次いでγ−BNPを回収する。
また、phBNP−57の挿入cDNA上で、位置指向性突然変異
の位置および塩基配列を変えることによってBNP−32、
あるいはBNPを大腸菌で生産するためのフラグメントが
得られ、これらのフラグメントが挿入された発現ベクタ
ーを大腸菌に導入し、これを培養することによりBNP−3
2あるいはBNPを回収することができる。
第１図はポジティブクローンλhBNP−57に挿入されたcD
NA断片の塩基配列決定のストラテジーおよび該cDNAフラ
グメントの制限酵素地図を示す。 第２図は第１図のストラテジーに従って決定されたcDNA
フラグメントの塩基配列およびこの塩基配列に対応する
アミノ酸配列を示す。
NA断片の塩基配列決定のストラテジーおよび該cDNAフラ
グメントの制限酵素地図を示す。 第２図は第１図のストラテジーに従って決定されたcDNA
フラグメントの塩基配列およびこの塩基配列に対応する
アミノ酸配列を示す。
フロントページの続き (72)発明者 南野 直人 宮崎県宮崎郡清武町大字木原5618番地 (72)発明者 寒川 賢治 宮崎県宮崎郡清武町大字加納甲字櫛間 1520―24 (72)発明者 松尾 壽之 宮崎県宮崎郡清武町大字木原6653番地 (56)参考文献 特表 平３−505280（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, （1988）Ｖｏｌ．155，ｐ．726−732 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, （1988）Ｖｏｌ．157，ｐ．410−416 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C07K 14/58 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (12)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列を含有するヒト脳性ナト
リウム利尿ペプチドをコードするcDNAフラグメント。 - 【請求項２】次の塩基配列からなる請求項１記載のcDNA
フラグメント。 - 【請求項３】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドを含有す
るヒト組織より精製したmRNAから得られるものである請
求項１または２記載のcDNAフラグメント。 - 【請求項４】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドを含有す
るヒト組織より精製したmRNAから構築したcDNAライブラ
リーから得られるものである請求項１〜３のいずれか１
項記載のcDNAフラグメント。 - 【請求項５】ヒト組織が脳または心房である請求項１〜
４のいずれか１項記載のcDNAフラグメント。 - 【請求項６】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドが次のア
ミノ酸配列からなるものである請求項１〜５のいずれか
１項記載のcDNAフラグメント。 - 【請求項７】次の塩基配列からなる請求項６記載のcDNA
フラグメント。 - 【請求項８】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドを含有す
るヒト組織より精製した、請求項１〜７のいずれか１項
記載のcDNAフラグメントを合成するためのmRNA。 - 【請求項９】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドを含有す
るヒト組織より分離した、全RNAから精製されるもので
ある請求項８記載のmRNA。 - 【請求項１０】ヒト組織が脳または心房である請求項８
または９記載のmRNA。 - 【請求項１１】請求項８〜10のいずれか１項記載のmRNA
を用いてcDNAライブラリーを構築し、次いで該cDNAライ
ブラリーについて、プローブを用いたハイブリダイゼー
ションによってヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドクロー
ンをスクリーニングすることを特徴とする請求項１〜７
のいずれか１項記載のcDNAフラグメントの製造法。 - 【請求項１２】プローブがブタBNP前駆体をコードするD
NAフラグメントである請求項11記載のcDNAフラグメント
の製造法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04963689A JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
| DK90104021T DK0385476T4 (da) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Fysiologisk aktivt polypeptid og DNA |
| EP90104021A EP0385476B2 (en) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| ES90104021T ES2076981T5 (es) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Polipeptido fisiologicamente activo y su adn. |
| AT90104021T ATE124994T1 (de) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologisch aktives polypeptid und dna. |
| DE69020755T DE69020755T3 (de) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologisch aktives Polypeptid und DNA. |
| US08/192,800 US7211380B1 (en) | 1989-03-01 | 1994-02-07 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| US09/902,161 US20020086843A1 (en) | 1989-03-01 | 2001-07-11 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| US10/335,847 US20030162710A1 (en) | 1989-03-01 | 2003-01-03 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| CL200401266A CL2004001266A1 (es) | 1989-03-01 | 2004-05-25 | Procedimiento para la preparacion de un fragmento de adn que codifica un polipeptido de cerebro humano y posee actividad natriuretica; procedimiento de preparacion del polipeptido; fragmento de adn; polipeptido. |
| US11/737,521 US20090105464A1 (en) | 1989-03-01 | 2007-04-19 | Physiologically active polypeptide and dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04963689A JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000369462A Division JP3346764B2 (ja) | 2000-12-05 | 2000-12-05 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231082A JPH02231082A (ja) | 1990-09-13 |
| JP3160276B2 true JP3160276B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=12836702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04963689A Expired - Lifetime JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3160276B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1339210C (en) * | 1988-05-31 | 1997-08-05 | John Lewicki | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
-
1989
- 1989-03-01 JP JP04963689A patent/JP3160276B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（１９８８）Ｖｏｌ．１５５，ｐ．７２６−７３２ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（１９８８）Ｖｏｌ．１５７，ｐ．４１０−４１６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02231082A (ja) | 1990-09-13 |
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