JP2511160B2 - 新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術 - Google Patents

新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の相互参照 これは,1988年５月31日に提出された米国特許出願第2
00,383号の一部継続出願である,1988年６月14日に提出
された米国特許出願第206,470号の一部継続出願である1
989年１月19日に提出された米国特許出願第299,880号の
一部継続出願である。
技術分野 本発明は，一般に，脳および心臓組織に見い出される
ナトリウム排出亢進性および／または血管拡張性ペプチ
ドに関する。更に，本発明は，ブタの組織から得られる
ナトリウム排出亢進性および／または血管拡張性ペプチ
ドをコードする遺伝子ならびに他の種におけるアミノ酸
配列によって関連づけられるペプチドをコードする遺伝
子に関する。更に，本発明は，ヒトの心房からのナトリ
ウム排出亢進性および／または血管拡張性ペプチドをコ
ードする遺伝子に関する。
背景技術 通常の細胞外液パラメータ，すなわち血管中の体液
（fluid）の容量および圧力，を維持するペプチドが心
房内に存在することは，よく知られている。心房性ナト
リウム排出亢進性ペプチド（心房性ナトリウム利尿ペプ
チド）と命名された，密接に関連した一連のペプチド
が，いくつかの種から単離され，同定され，これらのペ
プチドの類似体が調製されている。
ラット心房組織の粗抽出物のナトリウム排出亢進効果
は,7年以上前に示された。利尿性およびナトリウム排出
亢進性プロペプチドを有する多数のペプチドが，それ以
来，心房組織から単離され，配列決定された。Flynn,T.
G.,ら，Biochem Biophys Res Commun（1983）117:859-8
65;Currie.M.G.,ら，Science（1984）223:67-69;Kangaw
a,K.,ら，Biochem Biophys Res Commun（1984）118:131
-139;米国特許第4,496,544号；米国特許第4,508,712号;
Kangawa,K.,ら，Biochem Biophys Res Commun（1984）1
19:933-940;Garcia,R.,ら，Biochem Biophys Res Commu
n（1985）126:178-174;Katsube,N.,ら，Biochem Biophy
s Res Commun（1985）128:325-330;米国特許第4,607,02
3号；第4,577,864号；および第4,618,600号；同時係続
出願第616,488号；第766,030号；および第870,795号。
心房性ナトリウム排出亢進性ペプチド（ANP）と呼ばれ
るこれらのペプチドは，その環内に17のアミノ酸を含む
環式ジスルフィド（ジスルフィド結合を提供する２つの
システインを含む）である。それらをコードする遺伝子
は，より大きなタンパクをコードし，このタンパクは，
次いで,ANPのセットを構成する，より短いタンパクへと
プロセッシングされる。
単離された心房性ペプチドの様々な類似体はまた，同
時係属出願第921,360号；第138,893号；および第174,73
9号において説明されている。
これらのペプチドおよびその類似体は，体液容量およ
び血管の直径を制御することによって，血圧を制御する
のに有効であると理解されている。多数の病状は，うっ
血性の心臓疾患，肝硬変およびネフローゼ症候群を含む
異常な体液の滞留によって特徴づけられる。これらの疾
病は，循環系の静脈側に過剰な体液が蓄積されること，
および腎臓の灌流不足と関連し，これらは，糸球体の浸
透率（GFR）の低下につながる。更に，腎臓への灌流が
低下することにより，レニンの分泌，循環系においてア
ンギオテンシンの形成につながるタンパク分解酵素，お
よび小動脈の強力な収縮筋が刺激される。レニンはま
た，ナトリウム保持ホルモンであるアルドステロンの副
腎腺からの放出を刺激する。
高血圧は，それ自身，細胞外液容量の増加による，も
うひとつの重篤な結果であり，死に至る主要な原因であ
る。
ナトリウムおよび水分滞留に関連する疾病に関する治
療方法は，変化しており，様々な利尿性物質の投与を含
む。しかし，すべての個体を満足させるような治療剤は
存在せず，利用され得る材料の範囲を広げることが重要
である。本発明は，有用な治療薬の範囲の補足に加え
て，脳および心房において見い出され，中央および末端
機能に明るい光を投げかけ，それによって正常な個体が
適切な体液バランスを維持するという点で重要な物質を
更に提供する。更に，これらのペプチドおよびタンパク
のいくつかは，生理的活性を変化および改変した。
ブタの脳からのこれらの因子の１つは,Sudoh,P.,Natu
re（1988）332;78-81によって単離され，配列決定され
た。それは、ブタの脳および心房組織において合成され
る26個のアミノ酸のペプチドである。心房組織におい
て、ペプチドは、分析された心房性ナトリウム排出亢進
性ペプチド（ANP）活性の濃度の約1/100で存在する。し
かし、脳において、ペプチドは、ANPよりも豊富であり
得る。このブタの脳のナトリウム排出亢進性ペプチドま
たはpBNPの活性のスペクトルは、ブタANPのスペクトル
に類似する。ヒトANP（hANP）およびpBNPの部分のアミ
ノ酸配列の比較を以下に示す。対応するブタANPの関連
部分は，ヒトの配列と同一である。
相同でない９つの部分（星印）がある。ラットまたは
ヒトANP配列において見い出されるIleまたはMetのLeuへ
の保存された（conservative）置換は、既知の容認され
得る置換である。
宮崎医科大学の，これと同一のグループからの後続の
論文では，更にこれらのタンパクを特定決定している。
Sudoh,T.,ら、Biochem Biophys Res Comm（1988）155:7
26-732は、ブタの脳から、Ｃ末端に上記のブダBNPの26
のアミノ酸およびＮ末端に付加的な配列であるSer-Pro-
Lys-Thr-Met-Arg-という６個のアミノ酸でなる延長部分
を含む、32アミノ酸のナトリウム排出亢進性ペプチ
ド（"BNP-32"）を単離することについて報告している。
次ぎのページに続く論文において，組織における様々な
ナトリウム排出亢進性ペプチドのレベルが報告されてい
る。Ueda,S.,ら，（同書）,pp.733-739は，脳および脊
髄におけるブタBNPおよびブタBNP-32のレベルを局在化
し，測定するために放射性免疫アッセイを使用した。そ
の結果により,BNPおよびBNP-32はブタの脳における免疫
反応性BNPの主要な形であり，髄質橋（medulla-pon
s），尾状核（striatum）および脊髄において最も高い
濃度が見い出されることが示された。心房性のナトリウ
ム排出亢進性ペプチドのブタの形（pANP）もまた，ブタ
の脳においてBNPの特徴よりも約13倍低いレベルで発見
された。Minamino,N.,ら（同書）,pp.740-746は，末端
組織におけるブタBNPおよびANPの放射性免疫アッセイの
結果を報告している。BNPの濃度は，アッセイされた組
織の心臓心房において最も高かった。このタンパクの免
疫反応性形態は，主として12kdの高分子量形態として特
徴づけられ，心房組織内の免疫反応性BNPの全体の15％
未満は，低分子量形態のpBNPまたはpBNP-32である。
この出版の後続編において,Minamino,N.,ら，Biochem
Biophys Res Comm（1988）157:402-409は，この高分子
量形態のBNPをブタの心臓から単離し，特性決定するこ
とを報告した。このタンパクの完全なアミノ酸配列を
得，そのカルボキシ末端に26のアミノ酸pBNP（および32
のアミノ酸PBNP-32）を含むことを示した。全長のタン
パクは,106のアミノ酸を含む。最後に,Maekawa,K.,ら
（同書）,PP.410-416は，ブタBNPの前駆体タンパクをコ
ードするcDNAのクローン化およびその配列分析について
報告している。cDNAライブラリーをブタの心臓心房から
得，関連するBNPでコードされた遺伝子を単離し，配列
決定した。この遺伝子は,N末端に,25の残基推定シグナ
ルペプチドを含むことが発見され，これに，報告された
タンパクの106のアミノ酸に対応するコドンが後続して
いる。
これらの結果は，一般により長い前駆体とも関連のあ
る，心房由来のナトリウム排出亢進性ペプチドの研究か
ら得られる情報と一致する。本出願の親出願において，
ブタBNPをコードする遺伝子が提供されており，これに
よって，これらの前駆体タンパクの上流部分の推定アミ
ノ酸配列が推定された。この親出願において得られたcD
NAが，不完全にプロセッシングされ，イントロンを含ん
でいる一方，以下に記載の標準技術を使用してこの配列
を更に処理することによって，イントロンの位置が確立
された。この親出願は，他の種からナトリウム排出亢進
性関連ペプチド（NRP）を同定するのに適用され得る直
接的な手法を開示した。概説された直接的な手法は，ヒ
トNRPをクローニングしなかった。更に，以下に説明さ
れるように，プローブとして，ブタBNPのみを使用して
ヒトNRPを得ることは可能ではなかった。ヒトNRPを得る
ためには，中間クローンである，イヌBNPを使用する必
要があった。従って，本発明は，様々な脊椎動物源から
ナトリウム排出亢進性ペプチド（NP）およびナトリウム
排出亢進性関連ペプチド（NRP）のグループを提供す
る。
発明の開示 本発明は,pBNPの完全な遺伝子配列、そのプレプロ
形、およびこの遺伝子およびその変性形によってコード
されたタンパクを大量に合成する能力を提供する。本発
明はまた、ナトリウム排出亢進活性を有する同様の蛋白
をコードする遺伝子配列を他の脊椎動物種から回収する
ことを可能にすると共に、それらを合成する能力を提供
する。ブタBNP、その前駆体およびより短い関連脳タン
パクをコードするcDNAを第１図に示す。Sudoh（前出）
によって説明された26のアミノ酸pBNPをコードする「プ
ロセッシングされていない」cDNAの断片には、アンダー
ラインを引いている。
従って、１つの局面では、本発明は、ブタの脳の26ア
ミノ酸のナトリウム排出亢進性ペプチドをコードする配
列を含む組換え体cDNAプローブに向けられており、該組
み換え体cDNAプローブは、第１図のDNAまたはその有効
部分を含む。本発明はまた、このプローブまたはこのプ
ローブから得られたプローブを使用して回収された組換
え体DNA配列に向けられており、従って、あるいは、第
３図および第５図に示されるイヌおよびヒト源からのペ
プチドのコード配列の有効部分を含む有効なプローブを
含む。
もう１つの局面では、本発明は、ナトリウム排出亢進
活性を有し、次式を有するペプチドに向けられており、 ここでR1は、下記の群から選択され、 または、第８図にブタ、イヌまたはヒトBNPの天然の上
流配列として示された、10番目から109番目のアミノ酸
配列、またはその複合体であり； R2は（OH），NH2，またはNR′Ｒ″であり、ここで
Ｒ′およびＲ″は、それぞれ独立して低級アルキル（1-
4C）であり、もしくは、 または、それらのアミド（NH2またはNR′Ｒ″）であ
る； 但し、式（１）が R1‐Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Le
u-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2 であり、R1がAsp-Ser-Glyである場合には、R2はAsn-Val
-Leu-Arg-Arg-Tyrとはなり得ない。
他の局面では，本発明は，上記のペプチドをコードす
る組換え体DNA配列，および適切に形質転換された宿主
中においてこれらのペプチドの生産を行うことが可能な
組換え体発現系に関する。本発明はまた，形質転換され
た細胞を培養し，細胞培養物から所望のペプチドを回収
することによって組換え体手段を使用して本発明のペプ
チドを生成する方法に関する。
本発明はまた,1ケ所または２ケ所が，保存されたアミ
ノ酸置換を含む，このクラスのペプチドの変性形に向け
られている。
本発明はまた，本発明のペプチドを使用する薬学的組
成物および処理方法に関する。
図面の簡単な説明 第１図は，イントロンの位置が確立された，ブタBNP
をコードする，プロセッシングされていない形の回収さ
れたcDNAの完全な配列を示す。26アミノ酸pBNPペプチド
をコードする配列の部分にはアンダーラインが引かれて
おり，ヌクレオチド残基660-723および1276-1289から構
成される。
第２図は,pBNPでコードされるcDNAのプローブとして
合成されたオリゴヌクレオチドを示す。
第３図は，ナトリウム排出亢進活性を有するイヌタン
パクをコードする遺伝子のコード部分についての,DNAお
よび推定タンパク配列を示す。
第４図は，ヒトANP（左側のパネル）およびイヌNRP
（右側のパネル）でプローブされたヒトゲノムDNAのサ
ザンブロットを示す。
第５図は，ヒトNRPをコードするヒトゲノムクローン
のDNAおよび推定アミノ酸配列を示す。
第６図は，本発明のブタ，イヌおよびヒトタンパクの
プレプロの形のアミノ酸配列の比較を示す。
発明の実施するための形態 A.定義 本願で使用されるように，「脳ナトリウム排出亢進性
ペプチド（BNP）は，定められた厳密な条件の下で，第
１図に示されるDNAの有効部分にハイブリダイズする能
力を有するDNAによってコードされ，ナトリウム排出亢
進活性を有するアミノ酸配列を示す。すべての脊椎動物
の脳は,pBNPとして本願に開示されているものに類似す
るペプチドを包含する，この活性を有するペプチドの小
集団と，このアミノ酸配列を含むより長い前駆体タンパ
クと，その活性断片とを含むと考えられる 本願で使用されるように，「ブタ脳ナトリウム排出亢
進性ペプチド（pBNP）」は,Sudohらによって単離され，
上記に提示された26アミノ酸配列を示す。「pBNPをコー
ドするcDNA」は，残基660〜723および1276〜1289を含
む，本願の第１図に示されるヌクレオチド配列を示す。
cDNAにおけるpBNPコドンの分離は，この特殊なクローン
のテンプレートを形成したmRNAの不完全なプロセッシン
グによるためであると思われる。このクローンは,1988
年６月10日に，アメリカン タイプカルチャー コレク
ション,Rockville,MD,に寄託されており，その受託番号
は,ATCC 40465である。
第１図に示されるpBNPをコードするcDNAは，下記に説
明するように，前駆体タンパクをコードする付加的な配
列を含んでいるため,pBNPをコードする部分自身を分離
する配列によって表現されるイントロン以外の付加的な
イントロンに対応するヌクレオチドを含んでいると思わ
れ，他のいくつかの脊椎動物種において対応し，関連す
る脳ナトリウム排出亢進性ペプチドをコードするゲノム
またはcDNA配列を得るための有効なプローブとして使用
され得る。本出願に使用されるように，「前駆体脳ナト
リウム排出亢進性ペプチド」は，遺伝子配列によってコ
ードされたナトリウム排出亢進活性を有するペプチドを
示し，その遺伝子配列から，例えば,pBNPタンパクが得
られるが，異なる長さのペプチドを得るためにプロセッ
シングされる。同様のプロセッシングの相違は，他の脊
椎動物にも存在すると思われる。このようなナトリウム
排出亢進性ペプチドの全クラスは，本発明のDNAプロー
ブによって回収される。例えば,pBNPをコードするDNAの
リーディングフレームの検査は,N−末端に延長したペプ
チドが仮定され得るように,N−末端の延長を示す。ANP
前駆体である「プロANP」は，異なるANPペプチドにつな
がる心房および脳組織において異なる方法でプロセッシ
ングされる。心房において発見されるペプチドから類推
することによって,BNPの重要な末端の形は，トリペプチ
ドであるThr-Met-ArgがＮ−末端から延長するpBNPの29
残基ペプチドであると思われる。付加的な上流残基であ
るSer-Pro-LysおよびGly-Ile-Arg-Ser-Pro-Lysが更にＮ
−末端から延長するペプチドもまた予想される。従っ
て,pBNPを含むリーディングフレームを調べることによ
って,N−末端配列が更に延長するであろう付加的な上流
プロセッシング部位の仮定が可能となる。
その他の延長した前駆体ペプチドは，第１図の配列情
報を使用して，標準の技術によって発見され得る。心房
ナトリウム排出亢進性ペプチド前駆体から類推すること
によって，シグナル配列を含んでいると思われる最も長
い前駆体の起点が，ヌクレオチド61および120を連結す
るラインにおける最上部のリーディングフレームに示さ
れるメチオニンコドンまたは密接に配置された下流ATG
に存在することは明白である。従って，リーディングフ
レームは，この翻訳の起点からpBNPをコードする領域ま
で維持されないことは明白である。このことは，回収さ
れるcDNAクローンに転写される少なくとももう１つのイ
ントロンが存在することを示す。このイントロンの位置
および最長の形の前駆体ペプチドの全配列の推定につい
ては，以下に更に詳細に説明する。いずれにせよ,pBNP
に関連する前駆体BNPペプチドは，この描写された遺伝
子によってコードされた他のナトリウム排出亢進性ペプ
チドを含み，ペプチドの類似群は，集合的に指定された
ナトリウム排出亢進性ペプチド（NP）であり，他の種に
おいて「ナトリウム排出亢進性関連ペプチド」（NRP）
を含む。
その他の有用な用語は，用語「プレプロ」NRPであ
り，これは，ナトリウム排出亢進活性を有する様々な形
態のペプチドの分泌に影響する天然の関連シグナル配列
と，この活性に絶対必要な環式部分の上流で融合される
分泌ペプチドのアミノ酸配列とを有するコードされたペ
プチドを示す。上流配列を有する「プロ」形態は，ペプ
チドの環式形態を表現し得る。第１図，第３図および第
５図に，ブタ，イヌおよびヒトのタンパクをそれぞれ詳
細に示す，本発明に包含される３つの特異的な実施態様
に関して，「プレ」配列を表現する推定シグナル配列の
位置は，「プロ」形態を示す前駆体形態であると思われ
る，全長成熟タンパクと共に各図面に示されている。様
々なプロセッシング部位が得られるため，これらの図面
および第６図に示される複合配列において，上向き矢印
によって示されるように，「プロ」NPおよび「NP」の明
確な区別は，無意味なことであると思われる。本発明に
よって定義されたペプチドは，上記式（１）において提
示されており,Sudohのブタ「BNP」に対応する同定され
た26アミノ酸領域に先行するか，あるいはその環式部分
に連結するＮ−末端の形の長さにかかわらず，ナトリウ
ム排出亢進および／または血管拡張活性を有する。
「発現系」は，適合する宿主おけるその発現に影響を
与え得る適切な制御配列に作動可能なように連結された
コード領域を含むDNAを示す。発現系は，常にプロモー
タを含むが，目的の宿主に応じて，リボソーム結合部位
またはCAP部位などの重要な付加的DNAと，終結配列と，
必要に応じてプロモータの上流または他の作動可能な位
置にあるエンハンサ配列を含み得る。本発明の組換え体
発現系は,BNPをコードする本発明のDNA,例えば，脊椎動
物源から得られ，発現に影響を与え得る付加的なDNA配
列に作動可能なように連結されたBNPを含む。発現系
は，宿主細胞の染色体とは独立して自己複製するプラス
ミドまたはウィルスベクターのような転移ベクター上に
存在するか，または宿主細胞に挿入されると，染色体に
取入れられ得るように構築され得る。
B.他の関連ブダBNPおよび脊椎動物NRP遺伝子の回収 ある局面では，本発明は，第１図に示されるcDNA中に
コードされたブタBNPタンパクの群のすべての要素およ
びその保存された形物に関する。最長の前駆体タンパク
をコードするアミノ酸配列の推定およびプロセッシング
された形態の推定は，ここに提供されたプロセッシング
されていないcDNAを使用して成し遂げられる。この標準
的なアプローチにおいて，潜在的なイントロン，即ち残
基100から約660の間のイントロンを連結するcDNAの短い
部分を表現するオリゴヌクレオチド配列は，合成され，
標識され，およびBNPを産生する細胞から単離されたmRN
Aのノザンブロットをプローブするために使用される。
大半のmRNAは，プロセッシング形態である。従って，適
切な長さの伝令にうまくハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドは,cDNAのコード領域を表現する。容易にハイ
ブリダイズしないオリゴヌクレオチドは，イントロン領
域を表現する。重なる合成cDNAを使用することによっ
て，イントロンの位置は，正確に同定され得る。このこ
とにより，最大の前駆体タンパクをコードする完全な配
列の推定が可能になり，関連するBNPタンパクが形成さ
れる配列を限定する。
このアプローチの変形においては，部分的cDNA画分
が，ブタの心房から単離されたmRNAからの増幅された形
態で生成した。増幅のためのcDNAを，この組織から単離
されたポリA+RNAをオリゴヌクレオチド3895でハイブリ
ダイゼーションさせることによって得た。オリゴヌクレ
オチドプライマーは，第１図に示すように，塩基100〜1
23（同定鎖）および652〜685（相補償）に対応してい
た。ポリメラーゼ鎖反応を使用して，増幅を行った。た
だし，増幅された生成物を，調製したアガロースゲル上
で分析すると,2つのバンドが得られる。相対発生量が低
い，大きい方のバンドは，スプライスされていない前駆
体から得られる小さい方のDNAを示し，発生量の高いバ
ンドは，更に十分にプロセッシングされたcDNAであると
思われる。このバンドをゲルから溶離し，配列決定した
ところ，第１図の塩基223〜468に対応する延長部分は存
在せず，回収されたDNAは，第３図に示される配列を有
していた。
従って，標準的な技術を使用して,Greenbergら，Natu
re（1984）312:656-658によって説明されるように，心
房ナトリウム排出亢進性ペプチド前駆体に見い出される
イントロンに対応する推定上流イントロンの位置が，容
易に得られた。第１図に示すように,131アミノ酸のリー
ディングフレームが得られる。シグナル配列は，アミノ
酸１〜25によって表現され，プレプロ形態のブタBNPを
プロ形態に転換する開裂部位は，プレプロ配列の部位26
におけるSer25とHisとの間にあると考えられる。Sudoh
によって報告され,26個のアミノ酸を有するブタBNPの配
列は，アミノ酸残基81〜106（106〜131）によって表現
される。
回収されたcDNA上にコードされたブタBNPsのクラスへ
の接近を提供することに加えて，第１図のcDNAは，様々
な脊椎動物種からの関連NRPタンパクのクラスをコード
する対応の前駆体遺伝子への接近を提供する。
第１図に示されるpBNPをコードするcDNAまたはその有
効部分は，当該技術分野で一般に知られている多数の手
法によって，他の脊椎動物宿主から得られた遺伝子ライ
ブラリーにおいて，プローブとして使用され得る。ブダ
BNPは，適切な条件の下でヒトNRPにハイブリダイズする
ことが可能であると考えられるあらゆる理由が存在し
た。しかし,pBNPがヒトライブラリーにハイブリダイズ
する条件は決定され得なかった。進化という観点から，
ブタBNPが対応するイヌタンパクよりも対応するヒトタ
ンパクに関連しているようであることは驚きであった。
従って，ブタBNPがヒトNRPを同定することができず，イ
ヌ遺伝子が中間体として作用する必要のあったことは予
想されなかった。
所望の遺伝子の源は，脊椎動物種に適切なゲノムライ
ブラリーまたはペプチドを合成する細胞からのcDNAライ
ブラリーであり得る。以下に説明するように，これらの
ペプチドは脳で合成されるが，通常生成されたANPより
も低いレベルで心房組織においても発生することが知ら
れている。従って，更に容易に接近し得る心房組織はま
た，脳組織よりもむしろ，プローブされるべきcDNAライ
ブラリーを調製するのに使用され得る。この場合，高い
厳密性および＋／−ハイブリダイゼーションが，より優
勢なANPをコードするDNAを区別するのに使用され得る。
ゲノムおよびcDNAライブラリーの両方を調製することは
当該技術分野でよく知られている。事実，いくつかのゲ
ノムライブラリーは，市販されている。cDNAライブラリ
ーを調製するための好ましい技術は,Hyunh,V.T.,ら，DN
A Cloning Techniques--A Practical Approach（IRL Pr
ess,Oxford,1984）ならびにOkayamaおよびBerg,Mol Cel
l Biol（1983）3:280−289によって開示されている。好
ましくは，例えば，以下に例示される手法に従う。
次いで，ハイブリダイズする配列を得るために，ゲノ
ムまたはcDNAライブラリーは厳密ではない条件の下でプ
ローブされる。次いで，回収された配列は分析され，標
準的な手法に従って，配列決定され得る。
第１図のpBNPをコードするDNA全体は，プローブとし
て使用されるか，あるいは有効部分が使用され得る。有
効部分を構成するものは，プローブされるライブラリー
の特性に依存し，実験的に決定され得る。一般に，ゲノ
ムライブラリーが所望の遺伝子の回収のための源である
場合には，残基601〜1300あたりから延長するpBNPをコ
ードするcDNAのセグメントが好適である。このセグメン
トは,pBNPタンパクのコード配列に干渉するイントロン
を結合する。配列の上流部分もまた，使用し得た。無
論，クローン全体を使用するのに特別な欠点は存在しな
い。他方,cDNAライブラリーが調べられる場合には，通
常の通りにスプライシングされたコード領域を表現する
cDNAの部分のみを使用することが所望される。従って，
例えば，好適なプローブは,pBNPコドン（部分660〜723
および1276〜1289）を示す隣接DNAまたは幾分か小さな
その断片であり得る。
無論，実際のプローブは示されている配列，または好
ましくはそれらの相補体であり得る。
事実，第１図のブタDNAは，他の種からゲノムライブ
ラリーにおいて関連するタンパクをコードする遺伝子を
回収することが可能であるが，ヒトNRPを直接回収する
ことはできない。ブタ，ラット，イヌ，ネコおよびウサ
ギからのゲノムライブラリーは，以下の条件の内の少な
くとも１つで，第１図のプローブにハイブリダイズする
能力を示した。
（１）50％のホルムアミド,6 x SSC,5 x デンハート,10
mMのリン酸ナトリウム,42℃における10μg/mlの剪断DNA
および （２）20％のホルムアオド,6 x SSC,5 x デンハート,10
mMのリン酸ナトリウム,37℃における10μg/mlの剪断DN
A。
両方のハイブリダイゼーション条件下で，洗浄は,1xS
Sc,0.1％のSDSで,50〜60℃において,1時間であった。
ヒトゲノムDNAは，これらの条件の下で第１図のDNA配
列にハイブリダイズしなかったが，ヒトNRPを得るため
に，イヌNRPを使用することは可能であった。ヒトNRP遺
伝子配列を得るためにイヌNRP配列を使用する必要性
は，無論，予想され得なかった。
ブタのプローブを使用してイヌDNAを得ることによっ
て，第３図に示される配列を有する挿入物が得られ,pdB
NP-1と指定され,1988年12月14日にアメリカン タイプ
カルチャーコレクションに，受託番号ATCC-67862とし
て寄託された。この配列をプローブとして使用し,EcoRI
で消化されたヒトゲノムDNAから得られ，ナトリウム排
出亢進活性を有する同様のタンパクをコードするクロー
ンが見い出された。このヒトDNAは，第５図に示される
ような配列を有し,phBNP-1と指定され,1988年12月14日
にアメリカン タイプ カルチャーコレクションに，受
託番号ATCC-67863として寄託された。
ブタ，イヌおよびヒト種からのナトリウム排出亢進活
性を有する推定プレプロ形態のペプチドをコードするア
ミノ酸配列は，第６図に示されている。ブタおよびイヌ
種は，ヒト配列よりもナトリウム排出亢進活性を推定的
に司る領域において，より相同的であると思われる。第
６図における情報を使用して，ナトリウム排出亢進活性
を有するペプチドのクラスが，特定され得る。このクラ
スは，以下の式で示される。
ここでR1は，下記の群から選択され， または，第６図にブタ，イヌまたはヒトBNPの天然の上
流配列として示された,10番目から109番目のアミノ酸配
列，またはその複合体であり； R2は（OH），NH2，またはNR′Ｒ″であり，ここで
Ｒ′およびＲ″は，それぞれ独立して低級アルキル（1-
4C）であるか，もしくは， または，それらのアミド（NH2またはNR′Ｒ″）であ
る； 但し，式（１）が R1−Cys−Phe−Gly−Arg−Arg−Leu−Asp−Arg−Ile−G
ly−Ser−Leu−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−R2 であり，R1がAsp-Ser-Glyである場合には，R2はAsn−Va
l−Leu−Arg−Arg−Tyrとはなり得ない。
上記に使用されているように，第６図において，ブ
タ，イヌまたはヒトのBNPまたはNRPの天然上流配列とし
て示されている配列の「複合体」は，そこに示されてい
るような，上流配列を示し，ここで各部分は,3つのすべ
て種に示される代替的なアミノ酸を交換可能に含む。こ
れらの配列の複合体は，式（１）と上記のR1およびR2の
定義とに特定的に示されている配列に関する複合体のよ
うに構築される。
更に，これらのペプチド配列は，特定部分の代わり
に,L形態よりもむしろＤ形態を使用する置換を含む,1つ
または２つの保存されたアミノ酸置換を用いることによ
って変性され得る。標準固相技術を使用して，これらの
ペプチドが合成され得るため，例えば，保存された置換
を，遺伝子によってコードされるアミノ酸に限定する必
要はない。
特定の脊椎動物種のBNPグループをコードする前駆体
遺伝子を回収すると，その種に関連するBNPペプチドの
推定は，決定された配列の翻訳と，プロセッシング部位
の同定との問題である。心房ナトリウム排出亢進性ペプ
チド対応部に関するパターンによって，指針が提供され
る。心房ペプチドから類推すると,BNPタンパクは，上記
に示されるpBNPの配列の位置４および20におけるシステ
イン残基の酸化によって形成される環式ジスルフィドで
あると考えられる。特定種のコードされたBNPペプチド
のクラスは，配列中に１つまたは２つの保存されたアミ
ノ酸置換を含む，このジスルフィド結合した環の外側に
ある切形の形態と，示されているpBNPの延長形態とを含
むと考えられる。
推定（または生成された）ペプチド配列は,20％のホ
ルムアミド,5 x デンハート,6 x SSC,100mg/mlのRNA,お
よび42℃におけるけ0.05％のピロリン酸ナトリウムを含
む緩衝液中でハイブリダイゼーションし，次いで1 x SS
C,0.1％のSSDで60℃で，または上記の条件（１）または
（２）で洗浄することによって，示されている厳密性に
対応する条件の下で，このペプチド配列をコードするDN
Aが，第１図のpBNPをコードするcDNAに直接または間接
にハイブリダイズする場合には，本発明の特定のナトリ
ウム排出亢進性タンパクの範囲に属する。更に，このDN
Aによってコードされたペプチドは，以下に説明するよ
うにアッセイされたナトリウム排出亢進活性を示すに違
いない。
「直接のハイブリダイゼーション」は，ナトリウム排
出亢進性ペプチドをコードするDNAが，第１図に示され
るDNAまたはその有効部分自体にハイブリダイズするこ
とを意味する。「間接のハイブリダイゼーション」は,D
NAが第１図のブタBNPにハイブリダイズする能力を有す
るDNAにハイブリダイズすることを意味する。従って，
第５図に示されるヒト配列は，第３図のイヌ配列を介し
てブタBNPに間接的にハイブリダイズする。しかし，ブ
タBNPは，ヒトNRPに直接的にハイブリダイズしなかっ
た。
本発明はまた，第１図のcDNAによってコードされたBN
Pタンパクの変性形態に関する。これらのBNPの１つまた
は２つの部分は，活性が保持される限りにおいて改変さ
れ得る。保存されたアミノ酸置換は好ましい。即ち，例
えば，酸性アミノ酸としてアスパラギン酸／グルタミン
酸，塩基性アミノ酸としてリジン／アルギニン／ヒスチ
ジン，疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン／
メチオニン／バリン，親水性アミノ酸としてセリン／グ
リシン／アラニン／スレオニンである。しかし，ペプチ
ドは，組換え方法によって，または遺伝子から調製され
る必要がないため，置換は,D−またはβアミノ形態のよ
うなコードされないアミノ酸を含む。
B.BNPとNRPの作製 本発明のBNPとNRPは，種々の方法で作製され得，それ
らの方法には，組換え法の使用が包含される。
BNPペプチドとNRPペプチドをコードする，回収された
遺伝子は，次いで操作され，種々の組換え系を用いて発
現される。回収された遺伝子のいずれかのサブセグメン
トによってコードされる配列を有するペプチドは，翻訳
されたタンパクをプロセッシングしない宿主系で発現系
を適切に設計することによって得られ得る。例えば，発
現系は，いずれかの隣接配列を適切に修飾し，所望のＮ
末端の直前にATG開始コドンを，所望のＣ末端の後に停
止コドンを配置することによって構築される。次いで，
所望のコード配列は，必要に応じて，原核生物宿主また
は真核生物宿主で機能する制御系に，作動可能な結合で
連結される。数多くの制御系が当該技術分野で公知であ
る。
ナトリウム排出亢進性ペプチド前駆体は，特定の真核
生物系で明らかにプロセッシングされるので，組換え宿
主の選択には注意を払う必要がある。あるいは，タンパ
ク分解酵素によって開裂されやすいと考えられている位
置で代わりのアミノ酸をコードするように遺伝子配列を
修飾することによってプロセッシングを防止することが
できる。例えば,pBNPの１位のアスパラギン酸の直前の
アルギニンをトレオニン残基で置き換えることができ，
その結果，得られたペプチドはその部位でのトリプシン
開裂に対して感受性がなくなる。あるいは，これらのペ
プチドをプロセッシングし得る酵素が欠如した宿主で発
現させることができる。
種々の脊椎動物種のナトリウム排出亢進性に関連する
ペプチドの類をコードする遺伝子は,pBNPをコードするD
NAから構築されたプローブが入手しやすいので，得られ
やすくなる。したがって，これらの遺伝子は，部位特異
的変位によってコドンを１つ以上のアミノ酸で置き換え
ることにより操作され得，ナトリウム排出亢進活性を維
持しているこれらのペプチドの類似体をコードする配列
を得ることができる。
発現ベクターの構築および適切なDNA配列由来の組換
え体の作製は，それ自体当該技術分野で公知の方法によ
って実施される。
発現は，原核生物系または真核生物系で実施され得
る。原核生物は，E.coli.の種々の株によって最も頻繁
に説明される。しかしながら，バチルス属（例えば，Ba
cillus subtilis），Pseudomonasの種々の種，または他
のバクテリアの株のような，他の微生物株も用いられ得
る。そのような原核生物系では，複製部位と，宿主に適
合する種由来の制御配列とを含むプラスミドベクターが
用いられる。例えば，E.coli.は，典型的には,Boliver
ら（Gene（1977）2:95）による，E.coli.種由来のプラ
スミドである,pBR322の誘導体を用いて形質転換され
る。原核生物制御配列が一般に用いられ，この制御配列
は，ここでは，転写開始のためのプロモータ，必要に応
じてオペレータ，およびリボソーム結合部位配列を含む
と定義される。それには，β‐ラクタマーゼ（ペニシリ
ナーゼ）およびラクトース（lac）プロモータ系（Chan
ら，Nature（1977）198,1056），トリプトファン（tr
p）プロモータ系（Goeddelら，Nucleic Acids Res（198
0）8:4057），およびλ由来のPLプロモータおよびＮ遺
伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら，Nature（198
1）292:128）のような一般的に用いられるプロモータが
包含される。原核生物と適合する，いずれの利用可能な
プロモータ系も用いられ得る。
真核生物宿主で有用な発現系は，適切な真核生物遺伝
子由来のプロモータを包含する。酵母で有用なプロモー
タのクラスには，例えば，糖分解酵素を合成するための
プロモータが包含される。それには,3-ホスホグリセレ
ートキナーゼのためのプロモータ（Hitzemanら，J Biol
Chem（1980）255:2073）が含まれる。他のプロモータ
には，エノラーゼ遺伝子由来のもの（Holland,M.J.ら，
J Biol Chem（1981）256:1385）またはYEp13から得られ
たLeu2遺伝子由来のもの（Broach,J.ら，Gene（1978）
8:121）が包含される。
適切な哺乳類プロモータには，メタロチオネイン,SV4
0由来の初期または後期プロモータ（Fiersら，Nature
（1978）273:113），または，ポリオーマ，アデノウイ
ルスII,ウシ乳頭腫ウイルスまたはトリ肉腫ウイルス由
来のプロモータのような他のウイルスプロモータが包含
される。適切なウイルスエンハンサおよび哺乳類エンハ
ンサは上記に引用されている。植物細胞が発現系として
用いられる場合には，ノパリン合成プロモータが適切で
ある（Depicker,A.ら，J Mol Appl Gen（1982）1:56
1）。
発現系は，標準法によりBNP配列に作用可能に結合さ
れた前述の制御配列から，当該技術分野でよく理解され
ている標準結合法と制限法を用いて構築される。単離さ
れたプラスミド,DNA配列，または合成されたオリゴヌク
レオチドは，開裂され，整えられ，所望の形態に再結合
される。
部位特異的なDNAの開裂は，一般的に当該技術分野で
理解されている条件下で適切な制限酵素（または複数の
制限酵素）で処理することによって実施される。上記の
条件の特定のものはこれらの市販されている制限酵素の
製造者によって指定されている。例えば,New England B
iolabs,Product Catalogを参照のこと。一般に，プラス
ミドまたはDNA配列約１μｇは，約20μｌの緩衝液溶液
中１単位の酵素で開裂される；ここでの実施例では，典
型的には,DNA基質が確実に完全消化されるように過剰の
制限酵素が用いられる。変更も可能であるが，約37℃で
１時間から２時間のインキュベーション時間が採用され
る。各インキュベーションの後，フェノール／クロロホ
ルムで抽出することによって，タンパクを除去し，続い
てエーテル抽出を行ってもよい。そして，水溶性の画分
からエタノールで沈澱させることによって核酸を回収
し，続いてセファデックスＧ−50スピンカラムにかけ
る。必要に応じて，標準法を用いたポリアクリルアミド
ゲルまたはアガロースゲル電気泳動により，開裂された
断片のサイズによる分離を行ってもよい。サイズによる
分離の一般的な記述は，Methods in Enzymology（198
0）65:499-560に見られる。
制限開裂断片は,4種のデオキシヌクレオチド三リン酸
（dNTP）の存在下,50mMトリス（pH7.6）,50mM NaCl,6mM
MgCl2,6mM DTTおよび５〜10μM dNTP中,20〜25℃で15
〜25分間のインキュベーション時間を用いて，E.coli.D
NAポリメラーゼＩの大きな断片（クレノウ）で処理する
ことによって平滑末端化され得る。クレノウ断片は,5′
側の粘着末端を埋めるが，たとえ４種のdNTPが存在して
も、突出する３′側の１本鎖をけずる。必要に応じて，
粘着末端の特性が指示する制限内でただ１種のdNTP,す
なわち選択されたdNTPを供給することによって選択的な
修復が実施できる。クレノウ断片で処理した後，混合物
をフェノール／クロロホルムで抽出し，エタノールで沈
澱させ，続いてセファデックスＧ−50スピンカラムにか
ける。適切な条件下でS1ヌクレアーゼで処理することに
よって，いずれの１本鎖部分も加水分解される。
合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オリゴヌクレオ
チド合成装置を用いて調製される。アニーリングの前
の，あるいは標識のための１本鎖のキナーゼ処理は,5mM
トリス（pH7.6）,10mM MgCl2,5mMジチオスレイトール,1
〜2mM ATP,1.7pmole 32P‐ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mM
スペルミジン，および0.1mM EDTAの存在下で,0.1nmole
の基質に対して過剰（例えば，約10単位）のポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて実施される。
結合は，以下の標準条件と温度下で15〜30μｌの容量
で実施される。すなわち,20mMトリスHCl（pH7.5）,10mM
MgCl2,10mM DTT,33μg/ml BSA,10mM〜50mM NaCl,そし
て,40μM ATP,0.01〜0.02（Weiss）単位のT4 DNAリガー
ゼを０℃で（「粘着末端」結合に対して），あるいは,1
mM ATP,0.3〜0.6（Weiss）単位のT4 DNAリガーゼを14℃
で（「平滑末端」結合に対して）のいずれかである。分
子間「粘着末端」結合は，通常33〜100μg/mlの全DNA濃
度（５〜100nMの全末端濃度）で実施される。分子間の
平滑末端結合（通常10〜30倍モル過剰のリンカーを用い
る）は,1μＭの最終濃度で実施される。
「ベクター断片」を用いたベクターの構築では,5′側
のリン酸を除去し，ベクターの結合を防ぐために，通
常，ベクター断片を細菌のアルカリホスファターゼ（BA
P）で処理する。BAP消化は，Na+とMg+2との存在下，ベ
クター１μｇ当りBAP約１単位を用いて，約150mMトリス
中pH8,60℃で約１時間実施される。核酸断片を回収する
ために，調製物は，フェノール／クロロホルムで抽出さ
れ，エタノールで沈澱され，セファデックスＧ−50スピ
ンカラムにかけることによって脱塩される。あるいは,2
回消化されたベクターの必要でない断片をさらに制限酵
素で消化することによって再結合を防止することができ
る。
配列の修飾が必要な,cDNAまたはゲノムDNA由来のベク
ター部分に対して，プライマーの部位特異的変異が用い
られる。これは，差異されるべき１本鎖のファージDNA
に，限定された不一致を除いては相補的なプライマー合
成オリゴヌクレオチドを用いて実施され，これにより所
望の変異が現れる。簡単に言えば，合成オリゴヌクレオ
チドは，ファージに相補的なストランドを合成するため
のプライマーとして用いられ，得られた２本鎖DNAはフ
ァージを維持する宿主バクテリアに形質転換される。形
質転換されたバクテリアの培養物は，寒天上にプレート
され，ファージを有する単一の細胞からプラークを形成
させる。
理論的には，新しいプラークの50％が１本鎖として変
異された形態を持つファージを含み,50％が元の配列を
有する。得られたプラークを，確実に一致するもののハ
イブリダイゼーションはおこるが，元のストランドと不
一致のものはハイブリダイゼーションが十分に防止され
る温度で，キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリ
ダイズさせる。プローブとハイブリダイズしたプラーク
を取り出し，培養して,DNAを回収する。部位特異的変異
法の詳細は，以下の特定の実施例に記載されている。
プラスミド構築のための正しい結合は，まず，E.col
i.遺伝子貯蔵センター（E.coli.Genetic Stock Cente
r）から得た，E.coli.株MM294,CGSC＃6135,または他の
適切な宿主を連結混合物で形質転換することによって確
認され得る。成功裏に得られた形質転換体は，当該技術
分野で理解されているように，アンピシリン，テトラサ
イクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって選択
される。この形質転換体由来のプラスミドは，次いで,C
lewell,D.B.ら，Proc Natl Acad Sci USA（1969）62:11
59の方法にしたがって調製され，続いて必要に応じてク
ロラムフェニコール増幅（Clewell,D.B.,J Bacteriol
（1972）110:667）される。単離されたDNAは，制限法，
および／または,Sanger,F.ら，Proc Natl Acad Sci USA
（1977）74:5463,さらにMessingら，Nucleic Acids Res
（1981）9:309に記載のジデオキシ法による配列決定に
より，あるいは,Maxamら，Methods in Enzymology（198
0）65:499の方法により分析される。
構築されたベクターは，次いで，適切な宿主に形質転
換される。
用いられる宿主細胞によって，そのような細胞に適し
た標準法を用いて形質転換が行われる。Cohen,S.N.,Pro
c Natl Acad Sci USA（1972）69:2110に記載されている
ような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理，または
Maniatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual
（1982）,Cold Spring Harbor Press,p.254に記載のRbC
l法が，原核生物細胞や，実質的な細胞壁の障壁を有す
る他の細胞に用いられる。Agrobacterium tumefaciens
を用いる感染（Shaw,C.H.ら，Gene（1983）23:315）
は，ある種の植物細胞に用いられる。そのような細胞壁
を持たない哺乳類細胞には,Grahamとvan der Eb,Virolo
gy（1978）52:546のリン酸カルシウム沈澱法が好まし
い。酵母への形質転換は,Van Solingen,P.ら，J Bacter
（1977）130:946,および,Hsiao,C.L.ら，Proc Natl Aca
d Sci USA（1979）76:3829の方法にしたがって実施され
る。
次いで，形質転換された細胞は,BNP配列の発現に好ま
しい条件下で培養され，そして，組換えによって産生さ
れたタンパクが培養物から回収される。
組換えによる産生に加えて，演繹された配列が直接ペ
プチド合成を実施できるほど十分に短いペプチドは，標
準的な固相法を用いて調製され得る。
したがって，本発明の範囲内の化合物は，当該技術分
野で周知の方法，例えば，固相ペプチド合成法などによ
って化学的に合成され得る。この合成は，αアミノ基が
保護されたアミノ酸を用いてペプチドのカルボキシ末端
から開始される。他の保護基が適切であるとしても，全
てのアミノ基に対してt-ブチルオキシカルボニル（Bo
c）保護基が用いられ得る。例えば,Boc-Val-OH,Boc-Leu
-OH,Boc-Arg-OH,またはBoc-Tyr-OH（すなわち，選択さ
れたBNP類似体のカルボキシ末端アミノ酸）が，クロロ
メチル化ポリスチレン樹脂支持体にエステル化され得
る。ポリスチレン樹脂支持体は，架橋剤として,0.5〜２
％のジビニルベンゼンを用いた，スチレンの共重合体が
好ましい。架橋剤は，ポリスチレンポリマーを所定の有
機溶媒に完全に不溶性にする。Stewartら，Solid-Phase
Peptide Synthesis（1969）,W.H.freeman社，サンフラ
ンシスコ，およびMerrifield,J Am Chem Soc（1963）8
5:2149-2154を参照のこと。これらの方法およびペプチ
ド合成の他の方法は，米国特許第3,862,925号；第3,84
2,067号；第3,972,859号；および第4,105,602号にも例
示されている。
合成は，マニュアル法を用いても，例えば，アプライ
ドバイオシステム430Aペプチド合成装置（フオースター
シティー，カルフォルニア州）またはバイオサーチSAM
II自動ペプチド合成装置（Biosearch社，サンラファエ
ル，カルフォルニア州）を用いて製造者から提供される
操作説明書にある指示に従って自動で行ってもよい。
もちろん，自動化された合成法も配列を制御すること
ができるので，この合成法を用いて，上記のようにして
遺伝子を修飾することによって得られたアミノ酸配列に
上記の修飾が利用できる。さらに，置換されたアミノ酸
が遺伝子によってコードされる必要はない。したがっ
て,D体またはβアミノ酸によって，天然に存在するアミ
ノ酸が置き換えられ得る。
本発明のBNPを合成する前述の方法は，これに制限さ
れる意図はなく，本発明のBNPは従来のいずれの方法で
も調製され得る。BNPは，上記で特定された厳密な条件
下で第１図のcDNAにハイブリダイズする遺伝子によって
コードされること，および，以下で述べるレセプターア
ッセイでナトリウム排出亢進活性を示すことのみが要求
される。
C.アッセイ系 種々の脊椎動物種および由来の本発明のナトリウム排
出亢進性ペプチド（NP）およびその修飾物のメンバー
は，ナトリウム排出亢進活性を分析する標準的な方法を
用いて所望のナトリウム排出亢進活性を有することを確
認され得る。インビトロおよびインビボの両方で数多く
の系が利用可能である。インビトロでの試験の最も簡単
な形態は，腎臓および，内因性のナトリウム排出亢進性
化合物のクリアランスに影響を持つ他の部位において，
レセプターに対するペプチドの親和性を試験する，結合
アッセイである。したがって，心房由来のナトリウム排
出亢進性ペプチドに対するアッセイ法に類似の方法で
は，一般的なナトリウム排出亢進活性は，培養されたウ
シ大動脈平滑筋（BASM）細胞およびウシ大動脈内皮（BA
E）細胞由来のレセプターへの結合に対して，候補とな
るペプチドが，例えばヨウ素化によって標識されたpBNP
と競合する能力によって分析され得る。競合は関連する
クリアランスレセプターへの結合に特徴的である。さら
に，サイクリックGMPのレベルは，これらの同じ細胞で
測定され得る。そして，それはインビボで観察される生
物学的活性の原因である，関連する生物学的レセプター
への，ペプチドの結合に対して，特徴的である。
ここで請求の範囲に示された組成物の範囲内に入るた
めには，候補となるペプチドは，ここで記述された厳密
な条件下でpBNPをコードするDNAに直接または間接的に
ハイブリダイズし得る遺伝子配列によってコードされる
か，あるいは，式（１）で定義されるか，または上述の
その修飾形でなければならない。さらに，候補ペプチド
は，インビトロのレセプター結合アッセイで競合アッセ
イによって示されるクリアランスレセプターへの結合，
またはサイクリックGMPレベルの変化によって示される
エフェクターレセプターへの結合のいずれか，あるいは
その両方の活性を示さなければならない。ペプチドが，
ナトリウム排出亢進活性および利尿活性に対するインビ
ボの試験に関連する方法でクリアランスレセプターの結
合を阻害する場合，ペプチドは，サイクリックGMP活性
のようなpBNPに関連する直接的な生物学的活性を持って
いてもよいし，持たなくてもよい。ペプチドは，血管拡
張剤でもあり得る。
レセプター結合アッセイ 特定のANPレセプター部位は，腎臓，副腎，血管およ
び培養細胞のような標的組織で同定されてきた。Mapie
r,M.A.ら，Proc Nat Acad Sci USA（1984）81:5946-594
0:DeLean,A.ら，Endocrinology（1984）115:1636-1638;
Schenk,D.B.ら，Biochem Biophys Res Comm（1985）12
7:433-442。そのような組織は,BNP結合のレセプターを
有する。そのレセプターは,ANPに対するレセプターと同
じであってもよいし，同じでなくてもよい。ANPまたはA
NP類似体がこれらの特異的レセプター部位に結合するこ
とが生物学的活性の必要条件であると仮定されるので,B
NP関連ペプチド，またはそれらの修飾形のこれらのレセ
プターへの結合は，生物学的活性を予想すると考えられ
る。
アッセイは，一般に,Schenk（前述）およびScarborou
gh,R.M.ら，J Biol Chem（1986）261:12960-12964の開
示にしたがって発展してきた。Scarborough,R.M.の開示
においては，培養されたBASM細胞およびBAE細胞への結
合について,ANP類似体が標識された天然のANPと競合す
る能力を評価している。標識されたpBNPを用いる，同じ
ようなアッセイが，候補となるBNP族ペプチドの評価に
用いられ得る。pBNP（上記）は，カルボキシ末端のＹ残
基がヨウ素化され，（125I）‐pBNPと表される。類似の
「競合置換」レセプター結合アッセイは，当該技術分野
では，特定のリガンドーレセプター相互作用を試験する
ための一般的な事例と考えられる。
このアッセイでは,0.5nMの（125I）‐pBNPまたは（
125I）‐ヒトNRPを，異なる量の標識されていない,pBN
P,hNRP,dNRPまたは候補ペプチド（pBNPをコードするcDN
Aにハイブリダイズする遺伝子によってコードされる）
が存在する,BASM細胞の個々の試料中でインキュベート
する。
pBNPの濃度の増加，あるいは，成功裏に得られた候補
ペプチドによって，（125I）‐pBNPのBASM細胞関連レセ
プターへの結合が効果的に防止される。（125I）‐pBNP
結合の最大量の50％を示す未標識ペプチドの濃度をKi
（app）と呼び，レセプター結合の親和性を反映する。
したがって,Ki（app）＝100nMのペプチドは,Ki（app）
＝10nMのペプチドより実質的に弱い，レセプターとの相
互作用を示す。これらのBNP類似体が,1つ以上のレセプ
ター部位で機能すると仮定すると，増加したレセプター
の親和性は，生物学的有効性の増加を反映するべきであ
る。
上記の競合アッセイに適したナトリウム排出亢進性ペ
プチドが，試験された本発明のペプチドに関連して選択
されるべきである。例えば,ANPとBNPによって用いられ
たレセプターは，同じであっても異なっていてもよい。
いずれかの別の種の形態も，式（１）の候補ペプチドに
対する適切なアッセイ反応で競合剤として用いられ得
る。
全身を用いた哺乳類バイオアッセイ 本発明のNP配列（上記のレセプターアッセイで活性を
示したもの）の生物学的活性は，麻酔をかけたラットと
イヌで確認され得る。レセプターの結合親和性とインビ
ボでの効果のと相関関係は，生物学的活性に対するレセ
プターアッセイの予測値を示す。
1.麻酔されたラットでの利尿性とナトリウム排出亢進性 １つの方法では，カニューレを，麻酔をかけたラット
の左右の尿管と大腿部静脈に配置し，尿を尿管から回収
する。NP組成物を大腿部静脈を通して投与する。NPの注
入の前に，生理食塩水を30分間注入し，尿を５分間のベ
ースライン期間６回にわたって回収し，尿の容積を重量
測定によって決定する。
これらのベースライン回収期間の後，種々のNPを30分
または60分間注入し，注入の間と注入後60分間（その間
ラットは，生理食塩水に戻す）にわたって,5分間の期間
で尿の容積を測定する。データは，注入の直前の６回の
５分間ベースライン対象期間で平均した尿の流速によっ
て評価され,NPの投与中および投与後の値を「ベースラ
イン」の対照値と比較する。そして,NPの応答が，算出
され，ベースライン対照応答に対する百分率としてプロ
ットされる。このようにして，実質的にベースライン±
SDを上回るペプチドに対する応答が，統計的に重要な増
加であると解釈され得る。
2.麻酔されたイヌでの利尿性とナトリウム排出亢進性 本発明のNPの生物学的活性は，ペントバルビタールで
麻酔されたイヌでも確認され得る。この実施例では，カ
ニューレを，麻酔されたイヌの左右の尿管または膀胱
と，大腿部静脈に配置し，尿を回収する。NPを，大腿部
静脈を通して投与する。NPの注入の前に，生理食塩水を
30分間注入し，そして,10分間回収期間で３回尿を回収
する。尿の容積を重量測定によって決定し，尿ナトリウ
ムの量を分光学的に決定する。
これらの３回のベースライン回収期間の後，選択され
たNPを60分間注入し，尿の速度と尿ナトリウム排泄物を
注入後さらに60分間測定する。注入（60分）と回収（60
分）の間,10分間の採収期間が得られる。生理食塩水の
みを投与される対照動物を並行して試験する。
種々のNP部分を注入されたイヌの尿の流速とナトリウ
ムの排泄速度を，生理食塩水を注入された対照の動物に
対して比較することによってデータを評価する。
単離された組織のバイオアッセイ インビボでのNPの効果は，レセプターの妨害（内部NP
の結合と除去を含む）により，内部NPの効果を強化する
能力によって単独で達成され得る。これが特定のNPに対
しての場合である範囲では,NPの利尿効果とナトリウム
排出亢進効果は,NPが特に供給されない限り存在しない
ような単離された組織では，減少するか，または消失す
ると予想される。
したがって，単離された組織のバイオアッセイにおい
てNPの活性が低い（しかしながら，これらアッセイでも
活性は存在する）としても,NP組成物は，本発明の範囲
内である。
D.用途と投与 簡潔に言えば，本発明のナトリウム排出亢進性ペプチ
ドは，細胞外液のレベルが高いことに関連する，高血圧
のような疾患の治療に有用である。この化合物は，Remi
ngton's Phermaceutical Siences,Mack Publishing社,E
ston,Pa（最新版）に記載されているような従来のペプ
チドの処方物で投与される。好ましくは，ペプチドは，
注射によって投与され，好ましくは，静脈注射によっ
て，この投与経路に適した処方物を用いて投与される。
投与量のレベルは，被検体の約0.01〜100μg/kgであ
る。
これらの化合物およびそれらを含有する組成物は，効
率の悪い腎臓の灌流や腎糸球体の濾過速度の低下に起因
する高血圧および腎疾患に加えて，種々の浮腫状態の治
療の治療薬としての用途が見いだされ得る。このような
浮腫状態には，例えば，うっ血性心不全，ネフローゼ症
候群および肝硬変などがある。本発明のナトリウム排出
亢進性ペプチドは，特にうっ血性心不全に効果的であ
る。
したがって，本発明は本発明の化合物を効果的な量で
含有する組成物をも提供する。その化合物は，それらの
毒性のない付加塩，アミド，エステルを包含し，単独で
上記の治療学的な利点を提供する。そのような組成物
も，生理学的に許容できる液体，ゲルまたは固体の希釈
剤，アジュバント，および賦形剤とともに提供され得
る。
これらの化合物および組成物は，家畜の様な獣医学的
用途，および，ヒトの臨床学的用途において，他の治療
薬と同様の方法で哺乳類に投与され得る。一般に，治療
学的効果に必要な投与量は，ホストの体重に対して約0.
001〜100μg/kg,より一般的には,0.01〜100μg/kgの範
囲内であろう。あるいは，この範囲内の投与量で，所望
の治療効果が得られるまで，長時間（通常24時間を超え
る）にたって定常的に注入して投与してもよい。
典型的には，そのような組成物は，液体状の溶液また
は懸濁液のいずれかの注射可能なものとして調製され
る；注射の前に液体中に溶解または懸濁されるのに適し
た個体形態も調製され得る。調製物は乳化されてもよ
い。活性成分は，しばしば，生理学的に許容され，そし
て活性成分と相溶性の，希釈剤または賦形剤と混合され
る。適切な希釈剤および賦形剤は，例えば，水，生理食
塩水，ブドウ糖，グリセロールなどとそれらの組合せで
ある。さらに，必要に応じて，組成物は，少量の補助物
質を含有してもよい。補助物質としては，湿潤剤または
乳化剤，安定化剤またはpH緩衝剤などがある。
組成物は，従来，例えば皮下注射または静脈注射によ
って，非経口的に投与されている。他の投与形態に適し
た別の処方には，坐剤，鼻腔内エアロゾル，および場合
によっては経口処方物がある。坐剤の伝統的なバインダ
ーと賦形剤には，例えば，ポリアルキレングリコールま
たはトリグリセライドが包含される；そのような坐剤
は,0.5〜10％，好ましくは,1〜２％の範囲内の活性成分
を含有する混合物から形成され得る。経口処方物は，例
えば薬理学的等級のマンニトール，ラクトース，デンプ
ン，ステアリン酸マグネシウム，サッカリンナトリウ
ム，セルロース，炭酸マグネシウムなどのような，通常
用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は，溶
液，懸濁液，錠剤，丸剤，カプセル，徐放性処方物，ま
たは粉末の形態であり,10〜95％，好ましくは25〜70％
の活性成分を含有する。
ペプチド化合物は，中性の形態でまたは塩の形態で組
成物中に処方され得る。薬理学的に許容される毒性のな
い塩には，酸付加塩（遊離のアミノ基により形成され
る）と，例えば塩酸またはリン酸のような無機酸，また
は例えば塩酸またはリン酸のような有機酸，あるいは酢
酸，シュウ酸，酒石酸，マンデル酸などのような有機酸
とで形成される塩が，包含される。遊離のカルボキシル
基とで形成される塩は，例えば，ナトリウム，カリウ
ム，アンモニウム，カルシウムまたは水酸化第２鉄のよ
うな無機塩基，およびイソプロピルアミン，トリメチル
アミン,2-エチルアミノエタノール，ヒスチジン，プロ
カインなどの有機塩基から誘導され得る。
ナトリウム排出亢進活性，利尿活性，または血管弛緩
活性を示す，本発明の化合物に加えて，本発明の化合物
は，そのような有用な化合物の合成において中間体とし
ても用いられ得る。あるいは，適切に選択することによ
って，活性レベルが減少しているか，または完全に消失
している，本発明の化合物は，他の利尿性，ナトリウム
排出亢進性または血管弛緩性の化合物（本発明の範囲外
の化合物も包含される）の活性を調製するために機能し
得る。活性の調整は，例えば，クリアランスレセプター
に結合し，レセプターのターンオーバー（turnover）を
刺激し，分解酵素またはレセプター活性に別の基質を提
供して，それらの酵素またはレセプターを阻害すること
によっておこなわれる。この方法を用いる場合，そのよ
うな化合物は他の活性化合物との混合物として送達され
るか，あるいは，例えばそれ自身のキャリア中で別々に
送達され得る。
本発明の化合物は，標識試薬（通常，抗体）を用いる
イムノアッセイに用いる抗血清を調製するためにも用い
られ得る。ポリペプチドは，必要であれば，ジアルデヒ
ド，カルボジイミド，または市販のリンカーを用いて，
抗原性を与えるキャリアに結合され得ることが好都合で
ある。これらの化合物と免疫学的試薬は，発色基，蛍光
体（例えば，フルオレセインまたはローダミン），放射
性同位体（例えば，125I,35S,14C，または3H）または磁
化粒子のような種々の標識によって当該技術分野で周知
の方法により標識されてもよい。
これらの標識された化合物および試薬，あるいは，そ
れらを認識し，それらに特異的に結合し得る標識試薬
は，例えば，診断用試薬としての用途が見いだされ得
る。生物学的試料由来のサンプルは，本発明の化合物を
用いて，通常の抗原決定基を有する物質の存在またはそ
の量について分析され得る。さらに，当該技術分野で公
知の方法によってモノクローナル抗体を調製することが
でき，その抗体は，例えば，免疫学的に関連する化合物
のインビボでの過剰生産を中和するための治療上の用途
が見いだされ得る。
適切な対象物には，水またはナトリウムイオンを高度
に蓄積する症状を有する動物が含まれる。獣医学的用途
およびヒトの治療用の用途の両方が適している。
以下の実施例は，例示を意図するものであり，本発明
を限定する意図はない。
実施例１ ブタのBNPをコードするDNAの回収 液体窒素中で凍結させたブタの心臓の組織を得て，そ
れを心房部と心室部に大別した。凍結した心房部の組織
（5g）を，まず，乳鉢と乳棒で粉砕し，次に，組織粉砕
器で粉末にし,50mMのトリス（pH7.5）と,5mMのEDTAと,5
％のβ−メルカプトエタノールとを含む多量（25ml）の
5Mグアニジンチオシアネートに溶解した。そして，サル
コシルを２％まで加え，その試料を65℃で２分間インキ
ュベートした。その後,7000 x gで10分間，遠心分離し
て不溶性の物質を取り除いた。そして,2.5gのCsClを加
え,5.8MのCsClの10mlのクッション上に重層し，再び,2
5,000rpmで12時間，遠心分離することにより，全RNAを
この上清から単離した。続いて，この上清を吸引し，ペ
レットがトリス（50mM）と,EDTA（5mM）と，β−メルカ
プトエタノール（２％）とを含む緩衝液に溶解した。そ
れから，一旦,RNA溶液をフェノール抽出し，エタノール
で沈澱させた。ポリA+RNAをオリゴdtセルロースクロマ
トグラフィーで単離した。
ブタの心房のmRNA（５μｇ）に相補的な２本鎖DNAを,
RNAse H法で合成した。そして，このcDNAを標準的な方
法でメチル化し,EcoRIリンカーを連結し，そして消化し
た。次に，全cDNAを，すでに調製されたλファージアー
ムに連結し，標準的な方法でパッケージングした。この
パッケージング反応物をプレーティングすることによっ
て，ほとんど全て（＞95％）が１〜5kbの範囲内の挿入
物をを有することを示すこのライブラリーから無作為に
単離された約1.75 x 105のファージを含むライブラリー
が得られた。
pBNP cDNAを検出するためにプローブを設計した。第
２図に示されるように，ヒトANP cDNAに関する保存性は
オリゴ3351が構築する際に推定された。こうして，図に
示されたヒトANPをコードする配列を,pBNPをコードする
配列を得るのに必要な程度にだけ修飾した。第２のオリ
ゴ3352は,AとＣよりもＧとＴを好む哺乳動物のコドンの
選択性にしたがって設計された別の60-merであった。さ
らに,60-mer3376は，偽陽性を取り除くために，ヒトANP
配列に適合するように合成された。
上記のライブラリーから，およそ300,000のファージ
をプレートし，ニトロセルロースフィルタで重複しては
がした。シリーズＡ（15枚のニトロセルロースフィル
タ）を変性し，中和し,2時間焼いた。そして，ハイブリ
ダイゼーション緩衝液（20％ホルムアミド,5 x Denhard
tの溶液,6 x SSC,0.05％ ピロリン酸,100μg/ml サケ
の精子DNA）中で２時間プレハイブリダイズさせた。次
に，標識オリゴヌクレオチドプローブ（3351 1.5 x 107
cpm）を加えて，これらのフィルタを42℃で一晩インキ
ュベートした。続いて，フィルタを40分間,20℃で,6 SS
C,0.1％ SDS中で，それから,10分間,65℃で,1 x SSD中
で２回洗浄した。シリーズＢを，オリゴ3352を使わない
こと以外は同様にして処理した。この場合，最後の洗浄
は60℃で行った。両方の場合とも，フィルタを乾燥させ
て，オートラジオグラフィーを行った。オリゴ3351でプ
ローブすると，約450の陽性（プレートされた全クロー
ンの0.2％）が得られた。これらのほとんどは，このオ
リゴを用いた先のスクリーニングに基づくと，ブタのAN
Pであると考えられる。シリーズＢでは,4つのクローン
がオリゴ3352にハイブリダイズした。これらのハイブリ
ッドは,60℃では安定だが,65℃では安定でない。これら
４つのうち，クローン14のみがオリゴ3351ともハイブリ
ダイズした。そして，これを取り出して，もう一度精製
した。それから，この精製されたファージを，増殖させ
た。そして,DNAをCsClステップグラディエントで36,000
rpmで遠心分離して単離し，フェノール抽出し，透析
し，そしてエタノールで沈澱させた。ファージDNAは,Ec
oRIで制限酵素分析すると,1.5kbのDNA挿入物を含んでい
た。次に，この挿入物を,M13配列決定ベクターにサブク
ローン化して，配列を決定した。このBNP mRNAの量は，
このライブラリーのANPより約400倍少なく，すなわち,
0.0005％だった。
クローン14からの挿入物のDNA配列を第１図に示す。B
NPのコード領域は，このクローン中に存在する。しかし
ながら，それは,26アミノ酸BNPのVal22残基において，
イントロンと思われるものによって中断されている。し
たがって，このクローンは,1または２以上のイントロン
が存在するプロセッシングされていないmRNAを含んでい
るようである。
実施例２ 上流に存在するイントロンの同定 上で述べたように，表１のDNA配列は，リーディング
フレームにおいて変化を示す。さらに，このDNA配列は,
Greenbergら（前出）によって記載されているような,AN
Pをコードする遺伝子から類推すると，上流にイントロ
ンを含み得る。このイントロンの位置を決定するため
に，その想定上の位置を取り巻く配列を増幅法のプライ
マーとして使用し，イントロンを含まないスプライシン
グされたDNAを得た。
ポリA+RNAを,Chirgwin,J.M.,Biochemistry（1979）1
8:5294-5299のグアニジンイソチオシアネート法で，次
に，オリゴ‐dTセルロースクロマトグラフィーを用い
て，ブタの心房組織から単離した。そして，約２μｇの
ブタの心房のmRNAを,400ngのオリゴヌクレオチド3895
（前出）をプライマーとして,0.5mMのDNTPと,50mMのTri
s-HCl,pH8.3と,10mMの塩化マグネシウムと,10単位のRNa
sinと,50単位の逆転写酵素とを含む20μｌの反応液中で
培養した。続いて，得られたDNAを,Saiki,R.K.,Science
（1988）239:487-491に記載されているように，増幅さ
せた。37℃で１時間培養してから，反応液の半分を,67m
MのTris-HCl,pH8.8と,6.7mMの塩化マグネシウムと,16.6
mMの硫酸アンモニウムと,10mMのメルカプトエタノール
と,6.7μＭのEDTAと,1mMのdNTPと,10％のDMSOと,400ng
の各プライマーオリゴヌクレオチドとの中に,100μｌま
で希釈した。このオリゴヌクレオチドプライマーは，第
１図に示されたpBNPクローンの塩基100〜123（同一鎖）
と652〜685（相補鎖）とに対応したものである。
反応混合物を５分間沸騰させて変性させ，続いて,42
℃でインキュベートしてプライマーアニーリングを行っ
た。Thermus aquaticusのポリメラーゼ（３単位）を加
えて，その試料を72℃で３分間，さらに，インキュベー
トした。この一連の作業（98℃,1min;43℃,1分間;72℃,
3分間）を，それ以上ポリメラーゼを加えずに,30回繰り
返した。100μｌの鉱油層のもとで，さらに反応を起こ
させ,10μｌのアリクオットを取り出し，標準的なアガ
ローズゲル電気泳動法によって分析した。得られたDNA
の断片を，エチジウムブロマイドで染色して可視化し，
調製アガロースゲルを用いた電気泳動法で精製した。そ
して，増幅されたDNA断片を，キナーゼ処理し,M13に連
結し，そして配列決定した。
この反応から得られた２つのDNA配列は，以下の通り
である。すなわち，約650bpの方は，低い相対量であ
り，おそらくスプライスされていないものであると推定
された。他方，より多量の約350bpの方のバンドは，十
分にプロセッシングされたDNAであると考えられた。実
際，第１図に示されているこの配列は位置100〜684逆向
きの矢印の間に見られる。
実施例３ NRPをコードする遺伝子の回収 第１図の全1504塩基配列，すなわち，塩基601〜1300
を構成する，より短いセグメントは，他の脊椎動物種の
類似NRPペプチドコードする遺伝子を得るために，プロ
ーブとして使用される。（しかし，以下の実施例５で述
べるように，ヒトNRPをこの直接的な方法で得ることは
できなかった。）この方法では，ゲノムDNAのブロット
は，基質として使用されている。適当な種の肝臓に由来
する約10μｇのゲノムDNAを,BamHIあるいはPstIで一晩
消化する。そして，その消化されたDNAをエタノールで
沈澱し,0.8％のアガロースゲルで電気泳動させた。そし
て，そのゲルを，一晩ニトロセルロースフィルタ上にブ
ロットさせる。次に，フィルタを変性させ，焼き，そし
て42℃で，プレハイブリダイゼーション緩衝液（20％の
ホルムアミド,5 x Denhardtの6 x SSC,100mg/ml RNA,0.
05％ピロリン酸ナトリウム）中で，プレハイブリダイズ
させた。
cDNAをニックートランスレーションにより標識し，同
様のゲルより２枚のパネルに42℃で，一晩，プレハイブ
リダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズさせた。そ
して，これらのフィルタを,60℃と65℃で,1 x SSC,0.1
％ SDS中で洗浄して，オートラジオグラフ用フィルムに
感光させた。
次に，特定種の類似NRPをコードする遺伝子を増幅さ
せ，標準的な方法で配列決定した。こうして推定された
配列を操作して，発現系への挿入のために適した制限部
位を供与することができ，かつ，部位特異的変異処理に
よって所望の停止コドンおよび開始コドンを供与するこ
とができる。
ブタと，ラットと，イヌと，ネコと，ウサギと，ヒト
との生体のゲノムDNAを，下記の２つの異なったハイブ
リダイゼーション条件下で，第１図に示されたcDNAを使
用したサザンブロット法でプローブした： （１）50％ ホルムアミド,6 x SSC,5 x Denhardt,10mM
硫酸ナトリウム,10μg/mlの剪断DNA,42℃にて；および （２）20％ ホルムアミド,6 x SSC,5 x Denhardt,10mM
硫酸ナトリウム,10μg/mlの剪断DNA,37℃にて。
いずれの場合にも，清浄は,1 x SSC,0.1％ SDS中で,5
0〜60℃にて１時間，行った。
ハイブリダイゼーションは,pBNPとヒトDNAとの間では
起こらなかった。
実施例４ イヌNRPの回収 Clontech Inc.より得たイヌのゲノムライブラリーか
ら，上記の実施例３の条件（１）のもとで２個のクロー
ンが得られた。そして，これらの同定されたクローンの
DNAを,HaeIIIあるいはAluIで消化し,M13にサブクローン
下した。得られたプラークを，ブタのプローブへのハイ
ブリダイゼーションのためにスクリーニングし，陽性ク
ローンの配列を決定した。第１図のBNPをコードする配
列を検出することにより，クローンの同定が確認され
た。そして，全遺伝子を含む2.9kb HindIIIの断片をpBR
322にサブクローン化し,pdBNP-1と名づけた。BNP遺伝子
をコードするこのクローンの一部分のDNA配列を，第３
図に示す。pdBNP-1プラスミドは,1988年12月14日に，ア
メリカンタイプカルチャーコレクションに，受託番号AT
CC-67862で寄託された。
実施例５ ヒトNRPの回収 ヒトゲノムライブラリーは，実施例３に記載のよう
に，第１図のブタDNAを使ったプローブとのハイブリダ
イゼーションに対応するシグナルを得ることができなか
った。上記実施例３の条件（１）のもとでプローブとし
てpdBNP-1を使用すると，第４図に示すように，消化さ
れたヒトゲノムDNAのブロット中に可視化することので
きた顕著な数個のバンドが生じた。調製アガロースゲル
を使用して,6〜7kbのサイズ範囲内にEcoRIで消化された
ヒトゲノムDNAを単離した。そして，単離されたDNAを，
λ‐ZAP2（Strategene Inc.）にクローン化し，パッケ
ージした。得られたミニライブラリーを上記実施例の条
件（１）のハイブリダイゼーション条件を用いて，スク
リーニングした。７個の陽性シグナルを精製して，挿入
物をpBLUSCRIPTベクターにサブクローン化した。ハイブ
リダイゼーション陽性のHaeIIIおよびAluIで消化したプ
ラスミドDNAのM13サブクローンの配列を決定した。プラ
スミドphBNP-1のコード領域の配列は，第５図に示され
ている。そして，そのプラズミドは,1988年12月14日
に，アメリカンタイプカルチャーコレクションに，受託
番号ATCC-67863で寄託された。
Mount,S.,Mucleic Acids Res（1982）10:459-472に記
載されたイントロンスプライス連結コンセンサス配列を
使うと，ヒトcDNA配列の最初のエクソンは，ブタの配列
に比べてBNP前駆体領域中に,2つの余分のアミノ酸を含
んでいるようである。これは，ヒトの心房RNAのPCR増幅
によって確認され得る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＵ Ｃ１２Ｒ 1:19） ＡＢＲ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７８６２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７８６３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０４６５ (72)発明者 スカーボロー，ロバート エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94544 ヘイワード，ナンバー ２，ク リアブルック サークル 29831 (72)発明者 ポーター，ジェイ．ゴードン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94560 ニューアーク，ドゥマス プレ イス 7261 (56)参考文献 特開 昭63−107997（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．332，Ｐ．78 −81（1988)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ナトリウム排出亢進活性を有し、次式で示
    されるペプチド： R1‐Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Se
    r-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2 ここでR1は、下記から選択され、 ここでR3は、次式で示される102アミノ酸配列： またはそのＣ端末部分であり； R2は、（OH）、NH2、NHR′またはNR′Ｒ″であり、ここ
    でＲ′およびＲ″はそれぞれ独立して低級アルキル（1-
    4C）であるか、もしくはR2は、 Lys; Lys-Val; Lys-Val-Leu; Lys-Val-Leu-Arg; Lys-Val-Leu-Arg-Arg; Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His; またはそれらのアミド（NH2、NHR′またはNR′Ｒ″）で
    ある。
  2. 【請求項２】R1がSer-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gl
    y-であり、およびR2がLys-Val-Leu-Arg-Arg-Hisまたは
    そのアミドである、請求項１に記載のペプチド。
  3. 【請求項３】被検体にナトリウム排出、利尿および／ま
    たは血管拡張を誘導するための薬剤組成物であって、請
    求項２に記載のペプチドを有効量で、適切な薬学的賦形
    剤とともに含有する、組成物。
  4. 【請求項４】組換え宿主細胞に含有されたときに、請求
    項１に記載のペプチドをコードするDNAを発現させる能
    力を有する、組換え発現系。
  5. 【請求項５】請求項４に記載の発現系を有するように操
    作された、組換え宿主細胞または細胞培養物。
  6. 【請求項６】ナトリウム排出亢進活性を有するペプチド
    を製造する方法であって、 該ペプチドをコードするDNAの発現がなされ得る条件下
    で、請求項５に記載の細胞を培養すること；および 培養物から該ペプチドを回収すること； を包含する方法。
  7. 【請求項７】請求項１に記載のペプチドをコードするDN
    Aで実質的になる、単離され精製された形の組換えDNA。
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