JPH04281790A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト血管収縮ペプチドた
るヒト・エンドセリン−２をコードするｃＤＮＡを含有
するＤＮＡ、ヒト・エンドセリン−２の前駆体蛋白質お
よびエンドセリン−２の製造方法に関する。本明細書に
おいて、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチドのアミノ酸配
列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末端側、または
その両方に該ペプチドＤＮＡによってコードされるアミ
ノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質をさす。
るヒト・エンドセリン−２をコードするｃＤＮＡを含有
するＤＮＡ、ヒト・エンドセリン−２の前駆体蛋白質お
よびエンドセリン−２の製造方法に関する。本明細書に
おいて、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチドのアミノ酸配
列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末端側、または
その両方に該ペプチドＤＮＡによってコードされるアミ
ノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質をさす。
【０００２】
【従来の技術】内皮依存性の血管拡張反応とならんで、
種々の刺激に対する内皮依存性の血管収縮反応が報告さ
れている。血管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷
による収縮、トロンビンによる収縮、血中酸素の減少に
よる収縮、さらにはニューロペプチドＹ〔プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），
７９，５４８５（１９８２）；同， ８１，４５７７（
１９８４）〕によるノルアドレナリン収縮の増強などが
その例である。アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジ
オロジー（Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．），２
４８，ｃ５５０（１９８５）およびジャーナル・オブ・
セル・フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
．）１３２，２６３（１９８７）には内皮細胞由来の冠
血管収縮因子（分子量はそれぞれ８，５００； ３，０
００）が記載されているが構造は不明である。また、ジ
ャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペ
リメンタル・セラビューティクス（Ｊ． Ｐｈａｒｍａ
ｃｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．）２３６，３３９（１９
８５）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されて
いるが、これも構造は不明である。一方、血管収縮作用
を有するペプチドとしてバソプレッシン（Ｖａｓｏｐｒ
ｅｓｓｉｎ）が知られていて、そのアミノ酸配列も明確
にされているが、バソプレッシンが哺乳類または鳥類の
血管内皮細胞をオリジンとして得られたという報告はな
い。また、血管収縮作用を有するアンジオテンシン（Ａ
ｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）がウシ大動脈の内皮細胞から得
られるという報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），６０，４
２２（１９８７）〕があるが、アンジオテンシンは分子
量約１，０００のペプチドである。
種々の刺激に対する内皮依存性の血管収縮反応が報告さ
れている。血管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷
による収縮、トロンビンによる収縮、血中酸素の減少に
よる収縮、さらにはニューロペプチドＹ〔プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），
７９，５４８５（１９８２）；同， ８１，４５７７（
１９８４）〕によるノルアドレナリン収縮の増強などが
その例である。アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジ
オロジー（Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．），２
４８，ｃ５５０（１９８５）およびジャーナル・オブ・
セル・フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ
．）１３２，２６３（１９８７）には内皮細胞由来の冠
血管収縮因子（分子量はそれぞれ８，５００； ３，０
００）が記載されているが構造は不明である。また、ジ
ャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペ
リメンタル・セラビューティクス（Ｊ． Ｐｈａｒｍａ
ｃｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．）２３６，３３９（１９
８５）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されて
いるが、これも構造は不明である。一方、血管収縮作用
を有するペプチドとしてバソプレッシン（Ｖａｓｏｐｒ
ｅｓｓｉｎ）が知られていて、そのアミノ酸配列も明確
にされているが、バソプレッシンが哺乳類または鳥類の
血管内皮細胞をオリジンとして得られたという報告はな
い。また、血管収縮作用を有するアンジオテンシン（Ａ
ｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）がウシ大動脈の内皮細胞から得
られるという報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），６０，４
２２（１９８７）〕があるが、アンジオテンシンは分子
量約１，０００のペプチドである。
【０００３】また本発明者等の一部は同様の血管収縮作
用を有するペプチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よ
りブタ・エンドセリンを単離することに成功し（特願昭
６２−２５５３８１号）、また本発明者等の一部はヒト
・エンドセリンの単離、ブタ・エンドセリンおよびヒト
・エンドセリンの相補ＤＮＡのクローニングにも成功し
ている（特願昭６２−２７５６１３号、同６２−３１３
１５５号及び同６３−１４８１５８号）。 このブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン−１と呼
ぶ。更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、
相補ＤＮＡのクローニングについても出願を行っており
（特願昭６３−１７４９３５号、および特願昭６３−１
８８０８３号）、これをエンドセリン−３と呼ぶ。また
本出願人はヒト・エンドセリン−３のクローニングにつ
いても出願している（特願平１−２７８４９７号）。更
に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補ＤＮＡ
のクローニングについても出願を行っており（特願昭６
３−２２３３８９号）、これをエンドセリンＢと呼ぶ。 また本出願人はヒトゲノムＤＮＡライブラリーからエン
ドセリン−１とは異なるアミノ酸配列をもつエンドセリ
ンをコードするＤＮＡをクローニングし、エンドセリン
−２と名付けエンドセリン−２蛋白質およびそのＤＮＡ
を出願している（特願平１−２７４９９０号）。これら
エンドセリン−１，Ｂ，−３，−２のアミノ酸配列につ
いては、図１にそれらを比較して示す。
用を有するペプチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よ
りブタ・エンドセリンを単離することに成功し（特願昭
６２−２５５３８１号）、また本発明者等の一部はヒト
・エンドセリンの単離、ブタ・エンドセリンおよびヒト
・エンドセリンの相補ＤＮＡのクローニングにも成功し
ている（特願昭６２−２７５６１３号、同６２−３１３
１５５号及び同６３−１４８１５８号）。 このブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン−１と呼
ぶ。更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、
相補ＤＮＡのクローニングについても出願を行っており
（特願昭６３−１７４９３５号、および特願昭６３−１
８８０８３号）、これをエンドセリン−３と呼ぶ。また
本出願人はヒト・エンドセリン−３のクローニングにつ
いても出願している（特願平１−２７８４９７号）。更
に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補ＤＮＡ
のクローニングについても出願を行っており（特願昭６
３−２２３３８９号）、これをエンドセリンＢと呼ぶ。 また本出願人はヒトゲノムＤＮＡライブラリーからエン
ドセリン−１とは異なるアミノ酸配列をもつエンドセリ
ンをコードするＤＮＡをクローニングし、エンドセリン
−２と名付けエンドセリン−２蛋白質およびそのＤＮＡ
を出願している（特願平１−２７４９９０号）。これら
エンドセリン−１，Ｂ，−３，−２のアミノ酸配列につ
いては、図１にそれらを比較して示す。
【０００４】なお、ここでエンドセリンは総称して、分
子量 ２５００ ± ３００ で、アミノ酸 ２１個か
らなるペプチドであり、そのアミノ酸配列のＮ末端から
数えで第１番目、第３番目、第１１番目、第１５番目に
位置する４個のＣｙｓ が２組のＳ−Ｓ結合を形成して
いる構造を有するものである。このジスルフィド結合の
組合せとしては、１−１５、３−１１の組合せ、および
１−１１、３−１５の組合せがあるが、前者の組合せの
ものの方が生成の割合が高く、また活性も高い。
子量 ２５００ ± ３００ で、アミノ酸 ２１個か
らなるペプチドであり、そのアミノ酸配列のＮ末端から
数えで第１番目、第３番目、第１１番目、第１５番目に
位置する４個のＣｙｓ が２組のＳ−Ｓ結合を形成して
いる構造を有するものである。このジスルフィド結合の
組合せとしては、１−１５、３−１１の組合せ、および
１−１１、３−１５の組合せがあるが、前者の組合せの
ものの方が生成の割合が高く、また活性も高い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、各種動
物より相同型のエンドセリンが見出されているが同一動
物種からの新規な相同型遺伝子は見出されていない。そ
こで更に新規な相同型エンドセリンを検索し、それらエ
ンドセリンの構造、及び活性等の研究を深め、それらの
有用性について検討すること、及び該新規ペプチドを遺
伝子組み換え技術によりクローニングし、大量生産の道
を拓くことが現在の課題である。
物より相同型のエンドセリンが見出されているが同一動
物種からの新規な相同型遺伝子は見出されていない。そ
こで更に新規な相同型エンドセリンを検索し、それらエ
ンドセリンの構造、及び活性等の研究を深め、それらの
有用性について検討すること、及び該新規ペプチドを遺
伝子組み換え技術によりクローニングし、大量生産の道
を拓くことが現在の課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記血管収
縮作用を有するエンドセリンの新規相同型遺伝子を採取
し、しかもそれを遺伝子組み換え技術によつて製造する
ことができれば、今後の研究、治療に多大な効果を奏す
ることができると考え、研究を重ねた結果、次のような
知見を得、本発明に到達したものである。即ち、本発明
者らは先に出願したヒト・エンドセリンのゲノミック（
ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡの一部をコードする合成ＤＮＡ
およびエンドセリン−２のゲノミックＤＮＡの約９９ｂ
ｐからなるＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトｃＤ
ＮＡ（相補ＤＮＡ）ライブラリーから、先のエンドセリ
ン−１，−３〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ）
，エンドセリン−３〕とは異なるアミノ酸配列をもつエ
ンドセリンをコードする相補ＤＮＡをクローニングする
ことに成功した。その結果、これらを遺伝子組み換え技
術によって大量に生産する道を拓くことに成功したもの
である。本発明者等は更に新規なアミノ酸配列のヒト・
エンドセリン−２前駆体を提供するものである。
縮作用を有するエンドセリンの新規相同型遺伝子を採取
し、しかもそれを遺伝子組み換え技術によつて製造する
ことができれば、今後の研究、治療に多大な効果を奏す
ることができると考え、研究を重ねた結果、次のような
知見を得、本発明に到達したものである。即ち、本発明
者らは先に出願したヒト・エンドセリンのゲノミック（
ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡの一部をコードする合成ＤＮＡ
およびエンドセリン−２のゲノミックＤＮＡの約９９ｂ
ｐからなるＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトｃＤ
ＮＡ（相補ＤＮＡ）ライブラリーから、先のエンドセリ
ン−１，−３〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ）
，エンドセリン−３〕とは異なるアミノ酸配列をもつエ
ンドセリンをコードする相補ＤＮＡをクローニングする
ことに成功した。その結果、これらを遺伝子組み換え技
術によって大量に生産する道を拓くことに成功したもの
である。本発明者等は更に新規なアミノ酸配列のヒト・
エンドセリン−２前駆体を提供するものである。
【０００７】本発明は（１）ヒト・エンドセリン−２を
コードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ヒト・エ
ンドセリン−２前駆体、（３）ヒト・エンドセリン−２
をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質
転換体、および（４）上記（３）の形質転換体の培養、
培養物中への蛋白質の生産蓄積、採取を包含する成熟エ
ンドセリン−２の製造方法に関するものである。
コードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ヒト・エ
ンドセリン−２前駆体、（３）ヒト・エンドセリン−２
をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質
転換体、および（４）上記（３）の形質転換体の培養、
培養物中への蛋白質の生産蓄積、採取を包含する成熟エ
ンドセリン−２の製造方法に関するものである。
【０００８】本発明の、ヒト・エンドセリン−２をコー
ドするｃＤＮＡは〔式１〕の塩基配列（配列番号：１）
を含有するものであるか或いはその一部であり、これは
公知のものとは異なる新規なものである。 〔式１〕 １ Ａ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＡ
Ａ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＣＴ ＧＣＴ
２８ ２９ ＣＣＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ
ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ
５８ ５９ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＣＣ
ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ８８ １ Ｍ Ｖ
Ｓ Ｖ Ｐ Ｔ Ｔ Ｗ Ｃ
Ｓ １０ ８９ ＧＴＴ ＧＣ
Ｇ ＣＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＣＣ
ＣＴＧ ＣＡＴ １１８ １１ Ｖ
Ａ Ｌ Ａ Ｌ Ｌ Ｖ
Ａ Ｌ Ｈ ２０ １１９
ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ １４８ ２１
Ｅ Ｇ Ｋ Ｇ Ｑ Ａ
Ａ Ａ Ｔ Ｌ ３０
１４９ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＣ
ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ １
７８ ３１ Ｅ Ｑ Ｐ Ａ
Ｓ Ｓ Ｓ Ｈ Ａ Ｑ
４０ １７９ ＧＧＣ ＡＣＣ ＣＡＣ Ｃ
ＴＴ ＣＧＧ ＣＴＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＣ
Ｃ ２０８ ４１ Ｇ Ｔ Ｈ
Ｌ Ｒ Ｌ Ｒ Ｒ Ｃ
Ｓ ５０ ２０９ ＴＧＣ ＡＧＣ
ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ
ＴＧＣ ＧＴＣ ２３８ ５１ Ｃ
Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ Ｋ
Ｅ Ｃ Ｖ ６０ ２３９ Ｔ
ＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴ
Ｃ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ２６８ ６１
Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ Ｄ
Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ ７０ ２
６９ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＡＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＣ ２９
８ ７１ Ｎ Ｔ Ｐ Ｅ
Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ
８０ ２９９ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＣＣ
Ｇ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ
３２８ ８１ Ｌ Ｇ Ｎ
Ｐ Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ｒ
Ｒ ９０ ３２９ ＴＣＣ ＣＴＧ
ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ＡＧＴ ３５８ ９１ Ｓ
Ｌ Ｐ Ｒ Ｒ Ｃ Ｑ Ｃ
Ｓ Ｓ １００ ３５９ ＧＣ
Ｃ ＡＧＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ
ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ３８８ １０１
Ａ Ｒ Ｄ Ｐ Ａ Ｃ
Ａ Ｔ Ｆ Ｃ １１０ ３８
９ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ａ
ＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ４１８
１１１ Ｌ Ｒ Ｒ Ｐ Ｗ
Ｔ Ｅ Ａ Ｇ Ａ
１２０ ４１９ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＧＧ
ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＧＴＧ
４４８ １２１ Ｖ Ｐ Ｓ
Ｒ Ｋ Ｓ Ｐ Ａ Ｄ
Ｖ １３０ ４４９ ＴＴＣ ＣＡＧ Ａ
ＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＣ
Ｔ ＡＣＡ ４７８ １３１ Ｆ Ｑ
Ｔ Ｇ Ｋ Ｔ Ｇ Ａ
Ｔ Ｔ １４０ ４７９ ＧＧＡ
ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ５０８ １４１
Ｇ Ｅ Ｌ Ｌ Ｑ Ｒ
Ｌ Ｒ Ｄ Ｉ １５０ ５０９
ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴ
Ｃ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＧＡ ５３８
１５１ Ｓ Ｔ Ｖ Ｋ Ｓ
Ｌ Ｆ Ａ Ｋ Ｒ １
６０ ５３９ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ
ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＧＧ ＴＣＣ
５６８ １６１ Ｑ Ｑ Ｅ
Ａ Ｍ Ｒ Ｅ Ｐ Ｒ Ｓ
１７０ ５６９ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＣ
Ｃ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＧ
ＴＧＴ ５９８ １７１ Ｔ Ｈ
Ｓ Ｒ Ｗ Ｒ Ｋ Ｒ
＊ １７９ ５９９ ＣＧＴ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＧＧ Ｇ
ＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ６２８ ６２９ Ｃ
ＣＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧ
Ａ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣＣ ６５８ ６５９
ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＴＣＴ
ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ６８８ ６
８９ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＧＴ
ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ７１
８ ７１９ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＧＧ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ
７４８ ７４９ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＣＣ
Ｔ ＣＧＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ
７７８ ７７９ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＣＡ
ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＴＣ
ＧＧＣ ８０８ ８０９ ＣＴＣ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ Ｇ
ＴＧ ＣＴＧ ８３８ ８３９ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧ
Ｇ ＡＡＧ ＡＡＣ ８６８ ８６９ ＴＧ
Ｃ ＡＴＧ ＧＧＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＴＣ
ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ８９８ ８９９
ＣＧＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ９２８ ９２
９ ＡＣＡ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＡ Ｃ
ＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＧＡＡ ９５８
９５９ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＧ
Ｃ ＣＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＧ
９８８ ９８９ ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＴ
１０１８１０１９ ＧＧＣ ＴＧＴ ＧＴＣ
ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＣＣ Ｃ
ＣＡ １０４８１０４９ ＧＡＧ ＴＴＣ Ｔ
ＴＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＧ
Ｇ ＡＣＣ １０７８１０７９ ＣＴＣ ＣＣ
Ａ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＣＴ
ＧＣＴ ＴＴＴ １１０８１１０９ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＡＴＴ
ＴＧＣ ＣＣＴ ＡＡＧ １１３８１１３９
ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＣＣ ＡＡＴ Ｔ
ＡＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＡ １１６８１１６９
ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＡＣＣ ＣＴ
Ｃ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＣＴ ＧＣＧ １１９８１
１９９ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ
ＴＡＡ ＡＴ １２
１８ また本発明のヒト・エンドセリン−２前駆体は〔式
２〕のアミノ酸配列（配列番号：２）を含有するもので
ある。 〔式２〕 １０ ２０
３０ ４０
５０ ６０Ｎ−ＭＶＳＶＰＴＴＷＣＳＶ
ＡＬＡＬＬＶＡＬＨＥＧＫＧＱＡＡＡＴＬＥＱＰＡＳＳ
ＳＨＡＱＧＴＨＬＲＬＲＲＣＳＣＳＳＷＬＤＫＥＣＶ
７０ ８０
９０ １００ １１
０ １２０ ＹＦＣＨＬＤＩＩＷＶＮＴ
ＰＥＱＴＡＰＹＧＬＧＮＰＰＲＲＲＲＲＳＬＰＲＲＣＱ
ＣＳＳＡＲＤＰＡＣＡＴＦＣＬＲＲＰＷＴＥＡＧＡ
１３０ １４０
１５０ １６０ １７０
ＶＰＳＲＫＳＰＡＤＶＦＱＴＧＫＴＧＡＴＴＧＥＬ
ＬＱＲＬＲＤＩＳＴＶＫＳＬＦＡＫＲＱＱＥＡＭＲＥＰ
ＲＳＴＨＳＲＷＲＫＲ＊ −Ｃ また〔式２〕の４９〜８５番のアミノ酸配列に相当
する Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ
Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ Ｇ
Ｎ Ｐ Ｐ （配列番号：３）で表わされるも
のもヒト・エンドセリン−２前駆体の一種であり、この
ものはビッグ・エンドセリン−２（１−３７）と呼ぶ。
ドするｃＤＮＡは〔式１〕の塩基配列（配列番号：１）
を含有するものであるか或いはその一部であり、これは
公知のものとは異なる新規なものである。 〔式１〕 １ Ａ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＡ
Ａ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＣＴ ＧＣＴ
２８ ２９ ＣＣＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ
ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ
５８ ５９ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＣＣ
ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ８８ １ Ｍ Ｖ
Ｓ Ｖ Ｐ Ｔ Ｔ Ｗ Ｃ
Ｓ １０ ８９ ＧＴＴ ＧＣ
Ｇ ＣＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＣＣ
ＣＴＧ ＣＡＴ １１８ １１ Ｖ
Ａ Ｌ Ａ Ｌ Ｌ Ｖ
Ａ Ｌ Ｈ ２０ １１９
ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ １４８ ２１
Ｅ Ｇ Ｋ Ｇ Ｑ Ａ
Ａ Ａ Ｔ Ｌ ３０
１４９ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＣ
ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ １
７８ ３１ Ｅ Ｑ Ｐ Ａ
Ｓ Ｓ Ｓ Ｈ Ａ Ｑ
４０ １７９ ＧＧＣ ＡＣＣ ＣＡＣ Ｃ
ＴＴ ＣＧＧ ＣＴＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＣ
Ｃ ２０８ ４１ Ｇ Ｔ Ｈ
Ｌ Ｒ Ｌ Ｒ Ｒ Ｃ
Ｓ ５０ ２０９ ＴＧＣ ＡＧＣ
ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ
ＴＧＣ ＧＴＣ ２３８ ５１ Ｃ
Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ Ｋ
Ｅ Ｃ Ｖ ６０ ２３９ Ｔ
ＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴ
Ｃ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ２６８ ６１
Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ Ｄ
Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ ７０ ２
６９ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＡＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＣ ２９
８ ７１ Ｎ Ｔ Ｐ Ｅ
Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ
８０ ２９９ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＣＣ
Ｇ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ
３２８ ８１ Ｌ Ｇ Ｎ
Ｐ Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ｒ
Ｒ ９０ ３２９ ＴＣＣ ＣＴＧ
ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ＡＧＴ ３５８ ９１ Ｓ
Ｌ Ｐ Ｒ Ｒ Ｃ Ｑ Ｃ
Ｓ Ｓ １００ ３５９ ＧＣ
Ｃ ＡＧＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ
ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ３８８ １０１
Ａ Ｒ Ｄ Ｐ Ａ Ｃ
Ａ Ｔ Ｆ Ｃ １１０ ３８
９ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ａ
ＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ４１８
１１１ Ｌ Ｒ Ｒ Ｐ Ｗ
Ｔ Ｅ Ａ Ｇ Ａ
１２０ ４１９ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＧＧ
ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＧＴＧ
４４８ １２１ Ｖ Ｐ Ｓ
Ｒ Ｋ Ｓ Ｐ Ａ Ｄ
Ｖ １３０ ４４９ ＴＴＣ ＣＡＧ Ａ
ＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＣ
Ｔ ＡＣＡ ４７８ １３１ Ｆ Ｑ
Ｔ Ｇ Ｋ Ｔ Ｇ Ａ
Ｔ Ｔ １４０ ４７９ ＧＧＡ
ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ５０８ １４１
Ｇ Ｅ Ｌ Ｌ Ｑ Ｒ
Ｌ Ｒ Ｄ Ｉ １５０ ５０９
ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴ
Ｃ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＧＡ ５３８
１５１ Ｓ Ｔ Ｖ Ｋ Ｓ
Ｌ Ｆ Ａ Ｋ Ｒ １
６０ ５３９ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ
ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＧＧ ＴＣＣ
５６８ １６１ Ｑ Ｑ Ｅ
Ａ Ｍ Ｒ Ｅ Ｐ Ｒ Ｓ
１７０ ５６９ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＣ
Ｃ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＧ
ＴＧＴ ５９８ １７１ Ｔ Ｈ
Ｓ Ｒ Ｗ Ｒ Ｋ Ｒ
＊ １７９ ５９９ ＣＧＴ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＧＧ Ｇ
ＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ６２８ ６２９ Ｃ
ＣＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧ
Ａ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣＣ ６５８ ６５９
ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＴＣＴ
ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ６８８ ６
８９ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＧＴ
ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ７１
８ ７１９ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＧＧ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ
７４８ ７４９ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＣＣ
Ｔ ＣＧＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ
７７８ ７７９ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＣＡ
ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＴＣ
ＧＧＣ ８０８ ８０９ ＣＴＣ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ Ｇ
ＴＧ ＣＴＧ ８３８ ８３９ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧ
Ｇ ＡＡＧ ＡＡＣ ８６８ ８６９ ＴＧ
Ｃ ＡＴＧ ＧＧＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＴＣ
ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ８９８ ８９９
ＣＧＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ９２８ ９２
９ ＡＣＡ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＡ Ｃ
ＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＧＡＡ ９５８
９５９ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＧ
Ｃ ＣＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＧ
９８８ ９８９ ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＴ
１０１８１０１９ ＧＧＣ ＴＧＴ ＧＴＣ
ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＣＣ Ｃ
ＣＡ １０４８１０４９ ＧＡＧ ＴＴＣ Ｔ
ＴＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＧ
Ｇ ＡＣＣ １０７８１０７９ ＣＴＣ ＣＣ
Ａ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＣＴ
ＧＣＴ ＴＴＴ １１０８１１０９ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＡＴＴ
ＴＧＣ ＣＣＴ ＡＡＧ １１３８１１３９
ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＣＣ ＡＡＴ Ｔ
ＡＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＡ １１６８１１６９
ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＡＣＣ ＣＴ
Ｃ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＣＴ ＧＣＧ １１９８１
１９９ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ
ＴＡＡ ＡＴ １２
１８ また本発明のヒト・エンドセリン−２前駆体は〔式
２〕のアミノ酸配列（配列番号：２）を含有するもので
ある。 〔式２〕 １０ ２０
３０ ４０
５０ ６０Ｎ−ＭＶＳＶＰＴＴＷＣＳＶ
ＡＬＡＬＬＶＡＬＨＥＧＫＧＱＡＡＡＴＬＥＱＰＡＳＳ
ＳＨＡＱＧＴＨＬＲＬＲＲＣＳＣＳＳＷＬＤＫＥＣＶ
７０ ８０
９０ １００ １１
０ １２０ ＹＦＣＨＬＤＩＩＷＶＮＴ
ＰＥＱＴＡＰＹＧＬＧＮＰＰＲＲＲＲＲＳＬＰＲＲＣＱ
ＣＳＳＡＲＤＰＡＣＡＴＦＣＬＲＲＰＷＴＥＡＧＡ
１３０ １４０
１５０ １６０ １７０
ＶＰＳＲＫＳＰＡＤＶＦＱＴＧＫＴＧＡＴＴＧＥＬ
ＬＱＲＬＲＤＩＳＴＶＫＳＬＦＡＫＲＱＱＥＡＭＲＥＰ
ＲＳＴＨＳＲＷＲＫＲ＊ −Ｃ また〔式２〕の４９〜８５番のアミノ酸配列に相当
する Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ
Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ Ｇ
Ｎ Ｐ Ｐ （配列番号：３）で表わされるも
のもヒト・エンドセリン−２前駆体の一種であり、この
ものはビッグ・エンドセリン−２（１−３７）と呼ぶ。
【０００９】更に〔式２〕の４９〜８６番のアミノ酸配
列に相当する Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ
Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ Ｇ
Ｎ Ｐ Ｐ Ｒ（配列番号：４）で表わされ
るものもヒト・エンドセリン−２前駆体の一種であり、
このものはビッグ・エンドセリン−２（１−３８）と呼
ぶ。
列に相当する Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ
Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ Ｇ
Ｎ Ｐ Ｐ Ｒ（配列番号：４）で表わされ
るものもヒト・エンドセリン−２前駆体の一種であり、
このものはビッグ・エンドセリン−２（１−３８）と呼
ぶ。
【００１０】〔式１〕の塩基配列は本発明で得られたヒ
ト・エンドセリン−２ｃＤＮＡ配列であり、〔式２〕の
成熟エンドセリン−２アミノ酸（アンダーラインを施し
た部分の Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ
Ｄ Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ
Ｈ Ｌ Ｄ Ｉ Ｉ Ｗの配列）をコードす
る塩基配列の一例としては〔式１〕の Ｎｏ．２０３〜
２６５で表わされるものが挙げられる。
ト・エンドセリン−２ｃＤＮＡ配列であり、〔式２〕の
成熟エンドセリン−２アミノ酸（アンダーラインを施し
た部分の Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ
Ｄ Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ
Ｈ Ｌ Ｄ Ｉ Ｉ Ｗの配列）をコードす
る塩基配列の一例としては〔式１〕の Ｎｏ．２０３〜
２６５で表わされるものが挙げられる。
【００１１】本発明方法におけるヒト・エンドセリン−
２の成熟エンドセリン−２をコードする塩基配列を有す
るＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）
ヒト・エンドセリン−２産生細胞からメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ｉｉ）該ｍＲＮＡ から
単鎖の相補 ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮ
Ａを合成し、（ｉｉｉ）該相補ＤＮＡをファージまたは
プラスミドに組み込み、（ｉｖ）得られた組み換えファ
ージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
例えばヒト・エンドセリン−２の一部をコードするＤＮ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションにより、あるい
は抗エンドセリン−２抗体を用いたイムノアッセイ法に
より目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラ
スミドを単離し、（ｖｉ）その組み換えＤＮＡから目的
とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（ｖｉｉ）該クロ
ーン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。
２の成熟エンドセリン−２をコードする塩基配列を有す
るＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）
ヒト・エンドセリン−２産生細胞からメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ｉｉ）該ｍＲＮＡ から
単鎖の相補 ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮ
Ａを合成し、（ｉｉｉ）該相補ＤＮＡをファージまたは
プラスミドに組み込み、（ｉｖ）得られた組み換えファ
ージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
例えばヒト・エンドセリン−２の一部をコードするＤＮ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションにより、あるい
は抗エンドセリン−２抗体を用いたイムノアッセイ法に
より目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラ
スミドを単離し、（ｖｉ）その組み換えＤＮＡから目的
とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（ｖｉｉ）該クロ
ーン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。
【００１２】ヒト・エンドセリン−２をコードするｍＲ
ＮＡは、種々のエンドセリン産生細胞、例えばヒト腎臓
癌細胞のＡＣＨＮ細胞などから得る事ができる。ヒト・
エンドセリン−２産生細胞からＲＮＡを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム
・チルグウィン（Ｊ．Ｍ．．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１８
，５２９４（１９７９）〕などが挙げられる。
ＮＡは、種々のエンドセリン産生細胞、例えばヒト腎臓
癌細胞のＡＣＨＮ細胞などから得る事ができる。ヒト・
エンドセリン−２産生細胞からＲＮＡを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム
・チルグウィン（Ｊ．Ｍ．．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１８
，５２９４（１９７９）〕などが挙げられる。
【００１３】このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素を用いて、例えば岡山（Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａ）らの方法〔モレキュラ−・アンド・セルラ−・バ
イオロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２，１６１（１９８２）およ
び同誌 ３， ２８０（１９８３）〕に従いｃＤＮＡを
合成し、得られた ｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。 ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来の ｐＢＲ３２２〔ジ−ン（ｇｅｎｅ），２，９
５（１９７７）〕，ｐＢＲ３２５〔ジーン，４，１２１
（１９７８）〕，ｐＵＣ１２〔ジーン，１９，，２５９
（１９８２）〕，ｐＵＣ１３〔ジーン，１９，２５９（
１９８２）〕、ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，枯草菌由
来の ｐＵＢ１１０〔バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーョン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１１２，６７８
（１９８３）〕などが挙げられるが、その他のものであ
っても、宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれ
をも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファ
ージベクターとしては、たとえばλｇｔ１１〔ヤング及
びデーヴィス（Ｙｏｕｎｇ， Ｒ．， ａｎｄＤａｖｉ
ｓ， Ｒ．，）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー
・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），８０，１１９４（１９８３）
〕などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内
で増殖できるものであれば用いることができる。プラス
ミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー・マニ
アティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａ
ｔｏｒｙ），第２３９頁（１９８２）に記載の方法など
が挙げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組み
込む方法としては、たとえばヒューン（Ｈｙｕｎｈ，Ｔ
．Ｖ．）らの方法〔ディー・エヌ・エークローニング
ア プラクティカル アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）
１，４９（１９８５）〕などが挙げられる。
し、逆転写酵素を用いて、例えば岡山（Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａ）らの方法〔モレキュラ−・アンド・セルラ−・バ
イオロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２，１６１（１９８２）およ
び同誌 ３， ２８０（１９８３）〕に従いｃＤＮＡを
合成し、得られた ｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。 ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来の ｐＢＲ３２２〔ジ−ン（ｇｅｎｅ），２，９
５（１９７７）〕，ｐＢＲ３２５〔ジーン，４，１２１
（１９７８）〕，ｐＵＣ１２〔ジーン，１９，，２５９
（１９８２）〕，ｐＵＣ１３〔ジーン，１９，２５９（
１９８２）〕、ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，枯草菌由
来の ｐＵＢ１１０〔バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーョン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１１２，６７８
（１９８３）〕などが挙げられるが、その他のものであ
っても、宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれ
をも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファ
ージベクターとしては、たとえばλｇｔ１１〔ヤング及
びデーヴィス（Ｙｏｕｎｇ， Ｒ．， ａｎｄＤａｖｉ
ｓ， Ｒ．，）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー
・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），８０，１１９４（１９８３）
〕などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内
で増殖できるものであれば用いることができる。プラス
ミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー・マニ
アティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａ
ｔｏｒｙ），第２３９頁（１９８２）に記載の方法など
が挙げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組み
込む方法としては、たとえばヒューン（Ｈｙｕｎｈ，Ｔ
．Ｖ．）らの方法〔ディー・エヌ・エークローニング
ア プラクティカル アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）
１，４９（１９８５）〕などが挙げられる。
【００１４】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属菌，バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導
入する。上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリ
キア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１
２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０，１６０
（１９６８）〕，Ｍ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ），９，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）〕，１２０，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー４１，４
５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）〕などが
挙げられる。上記バチルス属菌としては、たとえばバチ
ルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＭＩ１１４（ジーン，２４，２５５（１９８３），
２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
９５，８７（１９８４）〕などが挙げられる。
当な宿主たとえばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）属菌，バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導
入する。上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリ
キア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１
２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０，１６０
（１９６８）〕，Ｍ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ），９，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）〕，１２０，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー４１，４
５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）〕などが
挙げられる。上記バチルス属菌としては、たとえばバチ
ルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＭＩ１１４（ジーン，２４，２５５（１９８３），
２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
９５，８７（１９８４）〕などが挙げられる。
【００１５】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、たとえばティー・マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら，モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），第２４９頁（１
９８２）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカル
シウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げ
られる。またファージ・ベクターを用いる場合には、た
とえば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法
を用いて導入することができる。ヒト・エンドセリン−
２ ｃＤＮＡを含有するヒト・ｃＤＮＡライブラリーは
上記の方法などで得ることが出来る。
ては、たとえばティー・マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら，モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），第２４９頁（１
９８２）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカル
シウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げ
られる。またファージ・ベクターを用いる場合には、た
とえば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法
を用いて導入することができる。ヒト・エンドセリン−
２ ｃＤＮＡを含有するヒト・ｃＤＮＡライブラリーは
上記の方法などで得ることが出来る。
【００１６】ヒトｃＤＮＡライブラリーからヒト・エン
ドセリン−２ ｃＤＮＡをクローニングする方法として
は、例えばファージベクターλｃｈａｒｏｎ４Ａとヒト
・エンドセリン−２のアミノ酸配列に基づいて化学合成
したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたプラー
クハイブリダイゼーション法〔ティー・マニアティス（
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）
，（１９８２）〕などが挙げられる。このようにしてク
ローン化されたヒト・エンドセリン−２ｃＤＮＡは必要
があればプラスミド、例えばｐＢＲ３２２， ｐＵＣ１
２， ｐＵＣ１３， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９， ｐ
ＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９などにサブクローニングして
ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮＡを得ることができる
。
ドセリン−２ ｃＤＮＡをクローニングする方法として
は、例えばファージベクターλｃｈａｒｏｎ４Ａとヒト
・エンドセリン−２のアミノ酸配列に基づいて化学合成
したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたプラー
クハイブリダイゼーション法〔ティー・マニアティス（
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）
，（１９８２）〕などが挙げられる。このようにしてク
ローン化されたヒト・エンドセリン−２ｃＤＮＡは必要
があればプラスミド、例えばｐＢＲ３２２， ｐＵＣ１
２， ｐＵＣ１３， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９， ｐ
ＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９などにサブクローニングして
ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮＡを得ることができる
。
【００１７】このようにして得られたＤＮＡの塩基配列
を、たとえばマキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）法〔Ｍａｘａｍ， Ａ． Ｍ． ａｎｄ
Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｗ．，プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５６０（
１９７７）〕あるいはジデオキシ法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ． ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９，３０
９（１９８１）〕によって決定し、既知のアミノ酸配列
との比較からヒト・エンドセリン−２ＤＮＡの存在を確
認する。以上のようにして、ヒト・エンドセリン−２を
コードするｃＤＮＡ（ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮ
Ａ）〔式１〕が得られる。
を、たとえばマキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）法〔Ｍａｘａｍ， Ａ． Ｍ． ａｎｄ
Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｗ．，プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５６０（
１９７７）〕あるいはジデオキシ法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ． ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９，３０
９（１９８１）〕によって決定し、既知のアミノ酸配列
との比較からヒト・エンドセリン−２ＤＮＡの存在を確
認する。以上のようにして、ヒト・エンドセリン−２を
コードするｃＤＮＡ（ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮ
Ａ）〔式１〕が得られる。
【００１８】後述の実施例２で得られたヒト・エンドセ
リン−２をコードするｃＤＮＡの制限酵素断片地図を図
２に示す。またジデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配
列、およびその塩基配列から判明したアミノ酸配列を図
３に示す。図４にヒト・エンドセリン−２の前駆体のア
ミノ酸配列を示す。
リン−２をコードするｃＤＮＡの制限酵素断片地図を図
２に示す。またジデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配
列、およびその塩基配列から判明したアミノ酸配列を図
３に示す。図４にヒト・エンドセリン−２の前駆体のア
ミノ酸配列を示す。
【００１９】上記のようにしてクローン化されたヒト・
エンドセリン−２をコードするｃＤＮＡは目的によりそ
のまま、または所望により制限酵素で消化して使用する
ことが出来る。クローン化されたｃＤＮＡから発現させ
たい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベクター
）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを
得ることができる。該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終
止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流に
プロモーターを接続する。
エンドセリン−２をコードするｃＤＮＡは目的によりそ
のまま、または所望により制限酵素で消化して使用する
ことが出来る。クローン化されたｃＤＮＡから発現させ
たい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベクター
）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを
得ることができる。該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終
止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流に
プロモーターを接続する。
【００２０】ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ
１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４），酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５），あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワク
シニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。形質転換する際の宿主がエシェ
リキア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター，ｌａｃ
プロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモー
ター，ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌
である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモ
ーター，ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である
場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，
ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなどが好まし
い。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモーターが
ｔｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモーターであるこ
とが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４
０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター
、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロ
モーターなどがそれぞれ利用できる。なお、発現にエン
ハンサーの利用も効果的である。
ラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ
１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４），酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５），あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワク
シニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。形質転換する際の宿主がエシェ
リキア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター，ｌａｃ
プロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモー
ター，ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌
である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモ
ーター，ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である
場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，
ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなどが好まし
い。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモーターが
ｔｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモーターであるこ
とが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４
０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター
、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロ
モーターなどがそれぞれ利用できる。なお、発現にエン
ハンサーの利用も効果的である。
【００２１】このようにして構築されたヒト・エンドセ
リン−２の成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母
、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属菌、
バチルス属菌の具体例としては、前記したものと同様の
ものが挙げられる。上記酵母としては、たとえばサッカ
ロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ￣，ＮＡ
８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。動物細
胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒ
トＦＬ細胞などが挙げられる。
リン−２の成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母
、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属菌、
バチルス属菌の具体例としては、前記したものと同様の
ものが挙げられる。上記酵母としては、たとえばサッカ
ロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ￣，ＮＡ
８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。動物細
胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒ
トＦＬ細胞などが挙げられる。
【００２２】上記エシェリキア属菌を形質転換するには
、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９，２１１０（１９７２
）やジーン，１７，１０７（１９８２）などに記載の方
法に従って行なわれる。
、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９，２１１０（１９７２
）やジーン，１７，１０７（１９８２）などに記載の方
法に従って行なわれる。
【００２３】バチルス属菌を形質転換するには、たとえ
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ），１６８，１１１（１９７９）などに記載の
方法に従って行なわれる。
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅ
ｔｉｃｓ），１６８，１１１（１９７９）などに記載の
方法に従って行なわれる。
【００２４】酵母を形質転換するには、たとえばプロシ
ージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法に
従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たと
えばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（
１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。このよう
にして、ヒト・エンドセリン−２成熟ペプチドをコード
するｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された
形質転換体が得られる。
ージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法に
従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たと
えばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（
１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。このよう
にして、ヒト・エンドセリン−２成熟ペプチドをコード
するｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された
形質転換体が得られる。
【００２５】宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては
、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチー
プ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、
バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物と
してはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、
ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。 培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリキア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・
ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イン
ドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる
。宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜
４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培
養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要
により通気や攪拌を加えることもできる。宿主が酵母で
ある形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば
バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔
Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、「プロシージング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
７７，４５０５（１９８０）〕が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通
気や攪拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換
体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％
の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ））１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培
地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（
１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オ
ブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（
Ｔｈｅ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ） １９
９，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージン
グ・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジ
カル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３， １（１９５０）〕
などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい
。 培養は通常約３０〜４０℃で約 １５〜６０ 時間行い
、必要に応じて通気や撹拌を加える。
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては
、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチー
プ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、
バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物と
してはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、
ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。 培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリキア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・
ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イン
ドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる
。宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜
４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培
養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要
により通気や攪拌を加えることもできる。宿主が酵母で
ある形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば
バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔
Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、「プロシージング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
７７，４５０５（１９８０）〕が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通
気や攪拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換
体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％
の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ））１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培
地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（
１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オ
ブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（
Ｔｈｅ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ） １９
９，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージン
グ・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジ
カル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３， １（１９５０）〕
などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい
。 培養は通常約３０〜４０℃で約 １５〜６０ 時間行い
、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２６】上記培養物からヒト・エンドセリン−２の
成熟ペプチド（エンドセリン−２）を分離精製するには
、例えば下記の方法により行なうことができる。ヒト・
エンドセリン−２の成熟ペプチドを培養菌体あるいは細
胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体
あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超
音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって
菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によ
りヒト・エンドセリン−２の成熟ペプチドの粗抽出液を
得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸
グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトン Ｘ−１
００等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に
ヒト・エンドセリン−２前駆体たんぱくや成熟ペプチド
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める
。 このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるヒト・エンドセリン−２前駆体たんぱくや成熟
ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法
としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などが挙げられる。
成熟ペプチド（エンドセリン−２）を分離精製するには
、例えば下記の方法により行なうことができる。ヒト・
エンドセリン−２の成熟ペプチドを培養菌体あるいは細
胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体
あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超
音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって
菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によ
りヒト・エンドセリン−２の成熟ペプチドの粗抽出液を
得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸
グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトン Ｘ−１
００等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に
ヒト・エンドセリン−２前駆体たんぱくや成熟ペプチド
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める
。 このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるヒト・エンドセリン−２前駆体たんぱくや成熟
ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わ
せて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法
としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
などの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ
トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す
る方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する
方法などが挙げられる。
【００２７】かくして生成するヒト・エンドセリン−２
前駆体たんぱくや成熟ペプチドは特異抗体を用いたエン
ザイムイムノアッセイなどにより測定することができる
。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該活性を指
標にして測定することもできる。
前駆体たんぱくや成熟ペプチドは特異抗体を用いたエン
ザイムイムノアッセイなどにより測定することができる
。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該活性を指
標にして測定することもできる。
【００２８】
【作用】本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換し
た菌体や細胞では、大量のエンドセリン−２成熟ペプチ
ドを産生せしめることができ、これらのペプチド生産を
有利に導くことができる。ここに製造されるエンドセリ
ン−２またはその前駆体は他のエンドセリン同様、低血
圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用することができ
るのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解析
や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与
えるものである。また同様にこのエンドセリンは、血管
収縮剤として種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止
するような効果を有する。またこのものは種々のショッ
ク症状を回復させる効果をも有する。このペプチドは経
口的、局所的、静注もしくは非経口的に投与することが
できるが、局所もしくは静注投与が好ましい。投与量は
０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０
１μｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、体重に応じた投与量を
１〜１０ｍｌの生理的食塩水中に溶解して用いる。
た菌体や細胞では、大量のエンドセリン−２成熟ペプチ
ドを産生せしめることができ、これらのペプチド生産を
有利に導くことができる。ここに製造されるエンドセリ
ン−２またはその前駆体は他のエンドセリン同様、低血
圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用することができ
るのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解析
や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与
えるものである。また同様にこのエンドセリンは、血管
収縮剤として種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止
するような効果を有する。またこのものは種々のショッ
ク症状を回復させる効果をも有する。このペプチドは経
口的、局所的、静注もしくは非経口的に投与することが
できるが、局所もしくは静注投与が好ましい。投与量は
０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０
１μｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、体重に応じた投与量を
１〜１０ｍｌの生理的食塩水中に溶解して用いる。
【００２９】本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成
分を含む乳剤、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤、カ
プセル剤、丸剤などの種々の形態に製剤化したものとし
て使用できる。副成分としては、薬理的に許容され得る
賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充
填剤、担体などが用いられる。これらの副成分の例とし
ては、賦形剤としては乳糖、ぶどう糖、白糖などが、崩
壊剤としては澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、カ
ルボキシメチルセルローズカルシウムなどが、滑沢剤と
してはステアリン酸マグネシウム、タルク、流動パラフ
ィンなどが、結合剤としては単シロップ、ゼラチン溶液
、エタノール、ポリビニルアルコールなどが、分散剤と
してはメチルセルロース、エチルセルロース、セラック
などが、可塑剤としてはグリセリン、澱粉などが挙げら
れる。
分を含む乳剤、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤、カ
プセル剤、丸剤などの種々の形態に製剤化したものとし
て使用できる。副成分としては、薬理的に許容され得る
賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充
填剤、担体などが用いられる。これらの副成分の例とし
ては、賦形剤としては乳糖、ぶどう糖、白糖などが、崩
壊剤としては澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、カ
ルボキシメチルセルローズカルシウムなどが、滑沢剤と
してはステアリン酸マグネシウム、タルク、流動パラフ
ィンなどが、結合剤としては単シロップ、ゼラチン溶液
、エタノール、ポリビニルアルコールなどが、分散剤と
してはメチルセルロース、エチルセルロース、セラック
などが、可塑剤としてはグリセリン、澱粉などが挙げら
れる。
【００３０】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたは
Ｙ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお、本発明のヒト・エンドセリン−２においては、そ
のアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他のア
ミノ酸への置換など）されていてもよい。
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたは
Ｙ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお、本発明のヒト・エンドセリン−２においては、そ
のアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他のア
ミノ酸への置換など）されていてもよい。
【００３１】
【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお、実施例３で得られた形質転換体 Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４／ｐＨ
ＥＴ−２（Ｋ）は、平成２年７月１０日から財団法人発
酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５０６４とし
て、また平成２年７月１２日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３００８として寄託され保管されている。また
、実施例５で得られた形質転換体 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／Ｐ３／ｐＴＳ６１２は
、平成２年１２月２４日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １５１２２として、また平成２
年１２月２０日から通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２
１１として寄託され保管されている。
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお、実施例３で得られた形質転換体 Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４／ｐＨ
ＥＴ−２（Ｋ）は、平成２年７月１０日から財団法人発
酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５０６４とし
て、また平成２年７月１２日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３００８として寄託され保管されている。また
、実施例５で得られた形質転換体 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１／Ｐ３／ｐＴＳ６１２は
、平成２年１２月２４日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １５１２２として、また平成２
年１２月２０日から通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２
１１として寄託され保管されている。
【００３２】参考例
（１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を注射針に
よる擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（
０．５×２０ ｍｍ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５
：９５、Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲ
ル液（３ｍｌ）中に懸垂する。 刺激前張力（ｂａｓａ
ｌ ｔｅｎｓｉｏｎ）を２ｇに設定したのち、張力トラ
ンスデューサーで等尺性張力を測定する。 （２）強心作用のアッセイ法 前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心脈
数を測定する。
よる擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（
０．５×２０ ｍｍ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５
：９５、Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲ
ル液（３ｍｌ）中に懸垂する。 刺激前張力（ｂａｓａ
ｌ ｔｅｎｓｉｏｎ）を２ｇに設定したのち、張力トラ
ンスデューサーで等尺性張力を測定する。 （２）強心作用のアッセイ法 前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心脈
数を測定する。
【００３３】実施例１ ｇｅｎｏｍｉｃヒト・エンド
セリン−２のＤＮＡの一部をコードするＤＮＡプローブ
の作製 ヒト・ｇｅｎｏｍｉｃ・エンドセリン−２の配列の一部
のＤＮＡプローブ ５’ ＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ
ＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣ
ＣＴＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣ
ＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧ
ＴＧ ３’（配列番号：５）を化学合成し、ＡＣＨＮ細
胞由来のｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。
セリン−２のＤＮＡの一部をコードするＤＮＡプローブ
の作製 ヒト・ｇｅｎｏｍｉｃ・エンドセリン−２の配列の一部
のＤＮＡプローブ ５’ ＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣ
ＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣ
ＣＴＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣ
ＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧ
ＴＧ ３’（配列番号：５）を化学合成し、ＡＣＨＮ細
胞由来のｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。
【００３４】実施例２ ｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡラ
イブラリーの作製 ■ＡＣＨＮ細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出ヒト腎臓
癌細胞、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １６１１）を１
０％子牛血清を含むダルベッコ 最少必須培地（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ， Ｄ−ＭＥＭ）で５％ＣＯ２、９５％
Ａｉｒ、３７℃の条件で〔１５０ｃｍ２のフラスコ（フ
ァルコン社）で１０本分〕培養し、３〜４日後、培養液
を除き、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で洗浄し
た。次いで、フラスコ１本に付き１００ｍｌのグアニジ
ン・イソチオシアネート液（５Ｍ グアニジン・チオシ
アネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５％メルカプトエタノール）を加え、細胞を溶
解した後、１５０ｍｌのガラス製ホモゲナイザーに集め
、よく磨砕した。２０％のザルコシン酸ソーダ液（２０
％ Ｎ−ラウロイル ザルコシン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５％メルカプトエタノール）を最終濃度が５％と
なるように加えた後、さらによく磨砕した。 固形のセシウムクロライドを、０．２ｇｒａｍ／ｍｌと
なるように加え、さらによく溶かしながら磨砕した。次
いで、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
に溶解した５．２Ｍのセシウムクロライド溶液をベック
マン社のＳＷ２８ローター用のチューブに５ｍｌ入れ、
この上層に上記の細胞溶解液を３０ｍｌ重層し、２２℃
、２８，０００回転で４８時間、ＳＷ２８ローターで遠
心した。ＲＮＡをチューブのペレットに集め、上層の液
を吸収して除いた後（Ｋａｐｌａｉｎの方法、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｊ． １８３， １８１−１８４，（１９７
９）、ＲＮＡを０．４％のザルコシン溶液に溶解した後
、食塩を最終濃度０．２５Ｍとなるように加え、冷エタ
ノールを２．５容加えて−２０℃に貯蔵した。
イブラリーの作製 ■ＡＣＨＮ細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出ヒト腎臓
癌細胞、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １６１１）を１
０％子牛血清を含むダルベッコ 最少必須培地（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ， Ｄ−ＭＥＭ）で５％ＣＯ２、９５％
Ａｉｒ、３７℃の条件で〔１５０ｃｍ２のフラスコ（フ
ァルコン社）で１０本分〕培養し、３〜４日後、培養液
を除き、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で洗浄し
た。次いで、フラスコ１本に付き１００ｍｌのグアニジ
ン・イソチオシアネート液（５Ｍ グアニジン・チオシ
アネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５％メルカプトエタノール）を加え、細胞を溶
解した後、１５０ｍｌのガラス製ホモゲナイザーに集め
、よく磨砕した。２０％のザルコシン酸ソーダ液（２０
％ Ｎ−ラウロイル ザルコシン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、５％メルカプトエタノール）を最終濃度が５％と
なるように加えた後、さらによく磨砕した。 固形のセシウムクロライドを、０．２ｇｒａｍ／ｍｌと
なるように加え、さらによく溶かしながら磨砕した。次
いで、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
に溶解した５．２Ｍのセシウムクロライド溶液をベック
マン社のＳＷ２８ローター用のチューブに５ｍｌ入れ、
この上層に上記の細胞溶解液を３０ｍｌ重層し、２２℃
、２８，０００回転で４８時間、ＳＷ２８ローターで遠
心した。ＲＮＡをチューブのペレットに集め、上層の液
を吸収して除いた後（Ｋａｐｌａｉｎの方法、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｊ． １８３， １８１−１８４，（１９７
９）、ＲＮＡを０．４％のザルコシン溶液に溶解した後
、食塩を最終濃度０．２５Ｍとなるように加え、冷エタ
ノールを２．５容加えて−２０℃に貯蔵した。
【００３５】■ポリＡ＋ＲＮＡの分離
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを遠心（２５，０００回転で２０分
間）して集め、ファルマシア製のｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ
精製法マニュアルに従ってオリゴｄＴカラムクロマト法
でｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡを部分精製した。Ｔｏｔａｌ
ＲＮＡ含有の約５％をｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡとして回収
した。
間）して集め、ファルマシア製のｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ
精製法マニュアルに従ってオリゴｄＴカラムクロマト法
でｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡを部分精製した。Ｔｏｔａｌ
ＲＮＡ含有の約５％をｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡとして回収
した。
【００３６】■ｃＤＮＡの合成とファージλｇｔ１１を
用いたｃＤＮＡライブラリーの作製上記■で得られたｐ
ｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ ５μｇをＡｍｅｒｓｈａｍ社のｃ
ＤＮＡ合成キットを使用し、マニュアルに従って、３２
Ｐ−ｄＣＴＰをｃＤＮＡ合成のマーカーとして用いて、
ｃＤＮＡの合成を行った。使用したｐｏｌｙＡ＋ ＲＮ
Ａ ５μｇの約１０％を二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−
ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ， ｄｓ ＤＮＡ）として得
た。同じく、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のｃＤＮＡクローニン
グキットを使用して、このｄｓＤＮＡに制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩのアダプターをｌｉｇａｔｉｏｎ 反応により結合
し、ＥｃｏＲＩで処理してｄｓ ＤＮＡの５’，３’端
にＥｃｏＲＩアダプターが結合したｄｓＤＮＡを得た。 このＥｃｏＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡをファー
ジλｇｔ１１ＤＮＡのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、フ
ァージ粒子に再構築し、ファージλｇｔ１１のｃＤＮＡ
ライブラリーとして得た。得られたファージλｇｔ１１
のｃＤＮＡライブラリーの感染価は約２×１０６プラー
ク形成単位／ｍｌであった。
用いたｃＤＮＡライブラリーの作製上記■で得られたｐ
ｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ ５μｇをＡｍｅｒｓｈａｍ社のｃ
ＤＮＡ合成キットを使用し、マニュアルに従って、３２
Ｐ−ｄＣＴＰをｃＤＮＡ合成のマーカーとして用いて、
ｃＤＮＡの合成を行った。使用したｐｏｌｙＡ＋ ＲＮ
Ａ ５μｇの約１０％を二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−
ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ， ｄｓ ＤＮＡ）として得
た。同じく、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のｃＤＮＡクローニン
グキットを使用して、このｄｓＤＮＡに制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩのアダプターをｌｉｇａｔｉｏｎ 反応により結合
し、ＥｃｏＲＩで処理してｄｓ ＤＮＡの５’，３’端
にＥｃｏＲＩアダプターが結合したｄｓＤＮＡを得た。 このＥｃｏＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡをファー
ジλｇｔ１１ＤＮＡのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、フ
ァージ粒子に再構築し、ファージλｇｔ１１のｃＤＮＡ
ライブラリーとして得た。得られたファージλｇｔ１１
のｃＤＮＡライブラリーの感染価は約２×１０６プラー
ク形成単位／ｍｌであった。
【００３７】実施例３ ヒト・エンドセリン−２ ｃ
ＤＮＡのクローニング ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮＡを持つファージクロ
ーンの単離 実施例２の（３）で得られた組み換えファージ（λｇｔ
１１）をペントンおよびデービス（Ｐｅｎｔｏｎｅ ａ
ｎｄ Ｄａｖｉｓ） の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ），１９６，１８０−１８２（１９７７）〕により
１シャーレ当り１，５００プラークの条件で大腸菌Ｙ１
０９０に感染させた後、ニトロセルロースにファージを
移しとり、常法どおりフィルターを処理した。 ヒト
・ゲノムＤＮＡのエンドセリン−２をコードする核酸配
列〔Ｉｎｏｕｅ ら、プロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）８
６， ２８６３〜２８６７（１９８９）〕の部分ＤＮＡ
断片５’ ＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴ
ＴＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣ
ＴＣＣＴＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴ
ＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧ
ＧＧＴＧ ３’をＤＮＡ合成機（ＡＢ１モデル）で合成
し、α−３２Ｐ・ｄＣＴＰを用いてランダムプライム法
によって３２Ｐ−標識プローブを作成した。ニトロセル
ロースに移した組み換えファージＤＮＡとこの３２Ｐ−
標識エンドセリン−２プローブとをペントンとデービス
の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９６，１８
０−１８２（１９７７）〕によりハイブリダイゼーショ
ンを行ない、ハイブリッドを形成したファージクローン
をスクリーニングして、陽性のプラークを数個得た。単
一化したファージを大腸菌Ｙ１０９０に感染させ（３７
℃、ＬＢブロス、５〜６時間）、遠心して大腸菌を除い
た後、培養液１ｍｌに２０％ポリエチレングリコール・
０．１５Ｍ食塩溶液を２００μｌ添加して、４℃、２〜
３時間静置してファージ粒子を１５，０００回転で２０
分間遠心して沈殿させた。１００μｌの蒸留水を加えて
ファージ粒子を懸濁し、９５℃で１０分間加熱した。こ
の組み換えファージＤＮＡはλｇｔ１１であるので、ｃ
ＤＮＡの組み換え部位であるＥｃｏＲＩサイトの近くの
５’ＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣ
Ｇと５’ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡ
ＡＴＧのＤＮＡ断片をλｇｔ１１のプライマーとして用
いて、ポリマーチェインリアクション（ＰＣＲ）法〔Ｍ
ｉｃｈａｅｌ Ｉ．Ａ． Ｉｕｎｉｓ， ＰＣＲプロト
コールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９０）〕で、このｃＤＮＡ
部分を増巾合成した。
ＤＮＡのクローニング ヒト・エンドセリン−２ ｃＤＮＡを持つファージクロ
ーンの単離 実施例２の（３）で得られた組み換えファージ（λｇｔ
１１）をペントンおよびデービス（Ｐｅｎｔｏｎｅ ａ
ｎｄ Ｄａｖｉｓ） の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ），１９６，１８０−１８２（１９７７）〕により
１シャーレ当り１，５００プラークの条件で大腸菌Ｙ１
０９０に感染させた後、ニトロセルロースにファージを
移しとり、常法どおりフィルターを処理した。 ヒト
・ゲノムＤＮＡのエンドセリン−２をコードする核酸配
列〔Ｉｎｏｕｅ ら、プロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）８
６， ２８６３〜２８６７（１９８９）〕の部分ＤＮＡ
断片５’ ＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴ
ＴＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣ
ＴＣＣＴＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴ
ＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧ
ＧＧＴＧ ３’をＤＮＡ合成機（ＡＢ１モデル）で合成
し、α−３２Ｐ・ｄＣＴＰを用いてランダムプライム法
によって３２Ｐ−標識プローブを作成した。ニトロセル
ロースに移した組み換えファージＤＮＡとこの３２Ｐ−
標識エンドセリン−２プローブとをペントンとデービス
の方法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９６，１８
０−１８２（１９７７）〕によりハイブリダイゼーショ
ンを行ない、ハイブリッドを形成したファージクローン
をスクリーニングして、陽性のプラークを数個得た。単
一化したファージを大腸菌Ｙ１０９０に感染させ（３７
℃、ＬＢブロス、５〜６時間）、遠心して大腸菌を除い
た後、培養液１ｍｌに２０％ポリエチレングリコール・
０．１５Ｍ食塩溶液を２００μｌ添加して、４℃、２〜
３時間静置してファージ粒子を１５，０００回転で２０
分間遠心して沈殿させた。１００μｌの蒸留水を加えて
ファージ粒子を懸濁し、９５℃で１０分間加熱した。こ
の組み換えファージＤＮＡはλｇｔ１１であるので、ｃ
ＤＮＡの組み換え部位であるＥｃｏＲＩサイトの近くの
５’ＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣ
Ｇと５’ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡ
ＡＴＧのＤＮＡ断片をλｇｔ１１のプライマーとして用
いて、ポリマーチェインリアクション（ＰＣＲ）法〔Ｍ
ｉｃｈａｅｌ Ｉ．Ａ． Ｉｕｎｉｓ， ＰＣＲプロト
コールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９０）〕で、このｃＤＮＡ
部分を増巾合成した。
【００３８】ＰＣＲ法で増巾合成したＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉで処理した後、プラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ
部位にｌｉｇａｔｉｏｎ により結合し、大腸菌ＤＨ５
αを形質転換して５個のクローン ｐＨＥＴ−２（５２）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐ
ＨＥＴ−２（３１）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨ
ＥＴ−２（２７）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨＥ
Ｔ−２（２６）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨＥＴ
−２（３５）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４この中のｐ
ＨＥＴ−２（５２）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４をｐ
ＨＥＴ−２（Ｋ）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４とする
。
Ｉで処理した後、プラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ
部位にｌｉｇａｔｉｏｎ により結合し、大腸菌ＤＨ５
αを形質転換して５個のクローン ｐＨＥＴ−２（５２）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐ
ＨＥＴ−２（３１）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨ
ＥＴ−２（２７）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨＥ
Ｔ−２（２６）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４ｐＨＥＴ
−２（３５）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４この中のｐ
ＨＥＴ−２（５２）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４をｐ
ＨＥＴ−２（Ｋ）／Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４とする
。
【００３９】実施例４ クローン化したＤＮＡの塩基
配列の決定 上記実施例３で得られたプラスミドＤＮＡを精製し、ジ
デオキシ鎖ターミネーション法によりＤＮＡの塩基配列
を決定した〔サンガー、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７４， ５４６３〜５４６７（１９７７）〕。図３に
その決定方向と全塩基配列を示した。ヒト・エンドセリ
ン−２の前駆体をコードするｃＤＮＡはｐＨＥＴ−２（
５２）で１２１８塩基からなり、５３４塩基のオープン
・フレームが採れて１７８個のアミノ酸をコードしてい
る。枠で囲った部分がヒト・エンドセリン−２の部分で
、先にゲノムＤＮＡの配列から示された配列に一致する
。 実施例５ ヒト・エンドセリン−２の発現ヒト・エン
ドセリン−２の前駆体をコードするｃＤＮＡを持つプラ
スミド、ｐＨＥＴ−２（Ｋ）を制限酵素のＥｃｏ−ＲＩ
で切り出し、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ ＩのＥｃｏ−
ＲＩ部位に組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ １
０６１／Ｐ３）を形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ
１０６１／Ｐ３／ｐＴＳ６１２を得た（図５）。このプ
ラスミドを精製し、常法通りにＣＨＯ−Ｋ１細胞に、プ
ラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと共に取り込ませ、薬剤Ｇ４１
８耐性の細胞を選択した。この細胞をクローン化し、そ
の株細胞をＣＨＯ−１２−５−１２と命名した。該細胞
を、１０％ｃａｌｆ−ｓｅｒｕｍを含むＤＭＥＭで培養
し、培養液の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ
） ＥＴを測定した結果、図６に示した通り、細胞の増
殖（白ぬきの三角は全細胞数を示す）と共に、ｉｍｍｕ
ｎｏｒｅａｃｔｉｖｅなエンドセリン（黒ぬりの四角）
とｂｉｇ−エンドセリン（白ぬきの四角）の分泌が認め
られた。 実施例６ ヒト・エンドセリン、エンドセリン前駆体のＣＨＯ細胞
形質転換体での発現とその構造決定 ヒトＥＴ−２のｃＤＮＡを組込んだ発現プラスミドｐＴ
Ｓ６１２で形質転換したＣＨＯ細施であるＣＨＯ−１２
−５−１２細胞の培養上清１５００ｍｌを３つに分け、
各５００ｍｌづつを以下の通り処理した。■０．２２μ
ｍのフィルターでろ過、■ＡｗＥＴＮ４０−アフィニテ
ィカラムクロマトグラフィ（作り方は後出）にかけ、■
吸着物をＲＰ−ＨＰＬＣで分離（図７）、■各フラクシ
ョンを真空乾燥、■ヒトｂｉｇ−ＥＴ−２（１−３７）
のエンザイム・イムノ・アッセイにかけ、■ヒトｂｉｇ
−ＥＴ−２（１−３７）合成品よりも２分前に溶出され
る分画を分取（図７の２４ピーク）、そして■アミノ酸
配列の決定を行なった。
配列の決定 上記実施例３で得られたプラスミドＤＮＡを精製し、ジ
デオキシ鎖ターミネーション法によりＤＮＡの塩基配列
を決定した〔サンガー、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７４， ５４６３〜５４６７（１９７７）〕。図３に
その決定方向と全塩基配列を示した。ヒト・エンドセリ
ン−２の前駆体をコードするｃＤＮＡはｐＨＥＴ−２（
５２）で１２１８塩基からなり、５３４塩基のオープン
・フレームが採れて１７８個のアミノ酸をコードしてい
る。枠で囲った部分がヒト・エンドセリン−２の部分で
、先にゲノムＤＮＡの配列から示された配列に一致する
。 実施例５ ヒト・エンドセリン−２の発現ヒト・エン
ドセリン−２の前駆体をコードするｃＤＮＡを持つプラ
スミド、ｐＨＥＴ−２（Ｋ）を制限酵素のＥｃｏ−ＲＩ
で切り出し、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ ＩのＥｃｏ−
ＲＩ部位に組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ １
０６１／Ｐ３）を形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ
１０６１／Ｐ３／ｐＴＳ６１２を得た（図５）。このプ
ラスミドを精製し、常法通りにＣＨＯ−Ｋ１細胞に、プ
ラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと共に取り込ませ、薬剤Ｇ４１
８耐性の細胞を選択した。この細胞をクローン化し、そ
の株細胞をＣＨＯ−１２−５−１２と命名した。該細胞
を、１０％ｃａｌｆ−ｓｅｒｕｍを含むＤＭＥＭで培養
し、培養液の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ
） ＥＴを測定した結果、図６に示した通り、細胞の増
殖（白ぬきの三角は全細胞数を示す）と共に、ｉｍｍｕ
ｎｏｒｅａｃｔｉｖｅなエンドセリン（黒ぬりの四角）
とｂｉｇ−エンドセリン（白ぬきの四角）の分泌が認め
られた。 実施例６ ヒト・エンドセリン、エンドセリン前駆体のＣＨＯ細胞
形質転換体での発現とその構造決定 ヒトＥＴ−２のｃＤＮＡを組込んだ発現プラスミドｐＴ
Ｓ６１２で形質転換したＣＨＯ細施であるＣＨＯ−１２
−５−１２細胞の培養上清１５００ｍｌを３つに分け、
各５００ｍｌづつを以下の通り処理した。■０．２２μ
ｍのフィルターでろ過、■ＡｗＥＴＮ４０−アフィニテ
ィカラムクロマトグラフィ（作り方は後出）にかけ、■
吸着物をＲＰ−ＨＰＬＣで分離（図７）、■各フラクシ
ョンを真空乾燥、■ヒトｂｉｇ−ＥＴ−２（１−３７）
のエンザイム・イムノ・アッセイにかけ、■ヒトｂｉｇ
−ＥＴ−２（１−３７）合成品よりも２分前に溶出され
る分画を分取（図７の２４ピーク）、そして■アミノ酸
配列の決定を行なった。
【００４０】ＡＢ１のモデル４７７Ａで配列を決定した
結果、Ｎ端から２０個のアミノ酸配列はＸ−Ｓｅｒ−Ｘ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｘ−（Ｈｉｓ）−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｘ と決定された。 Ｎ端から７番目のＬｅｕはＥＴ−２のｃＤＮＡの塩基配
列をアミノ酸に翻訳した時のＬｅｕに一致していること
が明らかである。またＮ端はＣｙｓと推定され、Ｃｙｓ
の位置１，３，１１，１５位とを考慮して、ＥＴ−２の
配列と推定された。
結果、Ｎ端から２０個のアミノ酸配列はＸ−Ｓｅｒ−Ｘ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｘ−（Ｈｉｓ）−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｘ と決定された。 Ｎ端から７番目のＬｅｕはＥＴ−２のｃＤＮＡの塩基配
列をアミノ酸に翻訳した時のＬｅｕに一致していること
が明らかである。またＮ端はＣｙｓと推定され、Ｃｙｓ
の位置１，３，１１，１５位とを考慮して、ＥＴ−２の
配列と推定された。
【００４１】図７のピーク２４のｉｍｍｕｎｏｒｅａｃ
ｔｉｖｅ（ｉｒ）−ｂｉｇ−ＥＴ−２のＮ端のアミノ酸
配列は先に示したが、全分子量とＣ端のアミノ酸配列決
定のため、ピーク２４の分画を質量分析機（ＪＥＯＬ
ＪＭＳ−ＨＸ１１０ＨＦとＪＥＯＬ ＤＡ−５００
）により解析した。その結果、分子量は４３４２と測定
され（図８）、ヒトｂｉｇＥＴ−２（１−３７）のｃＤ
ＮＡの塩基配列に基くアミノ酸１−３７のＣ端にＡｒｇ
が１個結合した３８個のアミノ酸からなる次のものであ
ることが推定された。 １ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌ
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ ＡｓｐＩｌｅ
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ ＰｒｏＰｒｏ Ａｒｇ
３８ この新規ペプチドをヒトｂｉｇ ＥＴ−２（１−３８
）と命名する。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈ
ａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕ
ｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）での分析でこの
ヒトｂｉｇ ＥＴ−２（１−３８）と同じ位置に溶出
される分子はヒト血中、あるいはヒト腎ガン細胞ＡＣＨ
Ｎの培養上清にも存在すると推定され、ｂｉｇＥＴ−２
（１−３７）と共にＥＴ−２の前駆体である。
ｔｉｖｅ（ｉｒ）−ｂｉｇ−ＥＴ−２のＮ端のアミノ酸
配列は先に示したが、全分子量とＣ端のアミノ酸配列決
定のため、ピーク２４の分画を質量分析機（ＪＥＯＬ
ＪＭＳ−ＨＸ１１０ＨＦとＪＥＯＬ ＤＡ−５００
）により解析した。その結果、分子量は４３４２と測定
され（図８）、ヒトｂｉｇＥＴ−２（１−３７）のｃＤ
ＮＡの塩基配列に基くアミノ酸１−３７のＣ端にＡｒｇ
が１個結合した３８個のアミノ酸からなる次のものであ
ることが推定された。 １ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌ
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ ＡｓｐＩｌｅ
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ ＰｒｏＰｒｏ Ａｒｇ
３８ この新規ペプチドをヒトｂｉｇ ＥＴ−２（１−３８
）と命名する。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈ
ａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕ
ｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）での分析でこの
ヒトｂｉｇ ＥＴ−２（１−３８）と同じ位置に溶出
される分子はヒト血中、あるいはヒト腎ガン細胞ＡＣＨ
Ｎの培養上清にも存在すると推定され、ｂｉｇＥＴ−２
（１−３７）と共にＥＴ−２の前駆体である。
【００４２】ＡｗＥＴＮ４０を使用した抗体カラムは以
下のようにして製造した。ＡｗＥＴＮ４０抗体を常法に
従い、ｔｒｅｓｙｌ ＴＯＹＯＰＡＬ（登録商標）に
結合した。Ｇｅｌ １ｍｌで５００ｍｌのＣＨＯ−１２
−５−１２細胞の培養上清を処理した。すなわち、直径
１ｃｍのカラムに０．５ｃｍの高さに抗体結合カラムを
詰め、次のステップによりＲＰ−ＨＰＬＣ用の試料を調
製した。■８ｍｌの０．０５Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣ
ｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌを流す。 ■３０ｍｌのリン酸バッファーを流す。 ■５００ｍｌの細胞培養上清を流す。 ■３０ｍｌのリン酸バッファーでカラムを洗浄する。 ■１０ｍｌの蒸留水で洗浄する。 ■９ｍｌの６０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡで溶出す
る。 次いでＮ２ガス存在下に２００〜３００μｌに濃縮して
ＲＰ−ＨＰＬＣにかけ、エンドセリン−２、ｂｉｇ−エ
ンドセリン２の免疫反応陽性の物質を分画した（図７）
。ＲＰ−ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。カラムは
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０（登録商標、４．６ｍｍ
１Ｄ×２５ｃｍ）、溶出条件はＡ液：５％ＣＨ３ＣＮ
、０．０５％ＴＦＡ； Ｂ液：６０％ＣＨ３ＣＮ、０
．０５％ＴＦＡとして、ＣＨ３ＣＮの１８〜６０％の溶
液の濃度勾配で溶出した。各分画から１部とり、ヒトｂ
ｉｇＥＴ−２（１−３７）のＥＩＡで測定した。
下のようにして製造した。ＡｗＥＴＮ４０抗体を常法に
従い、ｔｒｅｓｙｌ ＴＯＹＯＰＡＬ（登録商標）に
結合した。Ｇｅｌ １ｍｌで５００ｍｌのＣＨＯ−１２
−５−１２細胞の培養上清を処理した。すなわち、直径
１ｃｍのカラムに０．５ｃｍの高さに抗体結合カラムを
詰め、次のステップによりＲＰ−ＨＰＬＣ用の試料を調
製した。■８ｍｌの０．０５Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣ
ｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌを流す。 ■３０ｍｌのリン酸バッファーを流す。 ■５００ｍｌの細胞培養上清を流す。 ■３０ｍｌのリン酸バッファーでカラムを洗浄する。 ■１０ｍｌの蒸留水で洗浄する。 ■９ｍｌの６０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡで溶出す
る。 次いでＮ２ガス存在下に２００〜３００μｌに濃縮して
ＲＰ−ＨＰＬＣにかけ、エンドセリン−２、ｂｉｇ−エ
ンドセリン２の免疫反応陽性の物質を分画した（図７）
。ＲＰ−ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。カラムは
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０（登録商標、４．６ｍｍ
１Ｄ×２５ｃｍ）、溶出条件はＡ液：５％ＣＨ３ＣＮ
、０．０５％ＴＦＡ； Ｂ液：６０％ＣＨ３ＣＮ、０
．０５％ＴＦＡとして、ＣＨ３ＣＮの１８〜６０％の溶
液の濃度勾配で溶出した。各分画から１部とり、ヒトｂ
ｉｇＥＴ−２（１−３７）のＥＩＡで測定した。
【００４３】このようにして、エンドセリン−２（ＥＴ
−２）の２１個のアミノ酸を含む、エンドセリン前駆体
の発現を動物細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞で行い、エン
ドセリンおよびこれより分子の大きいｂｉｇ−ＥＴ−２
（１−３７）や、さらに大きい分子であるヒトｂｉｇ−
ＥＴ−２（１−３８）等の蛋白を細胞培養液中に分泌さ
せた。これら発現系はＥＴ−２の合成、分泌機構を知り
、その阻害方法を開発するのに役立つものであり、エン
ドセリン−１，−３に関するものと合わせ、三種のエン
ドセリンの合成阻害剤の開発に役立つものである。
−２）の２１個のアミノ酸を含む、エンドセリン前駆体
の発現を動物細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞で行い、エン
ドセリンおよびこれより分子の大きいｂｉｇ−ＥＴ−２
（１−３７）や、さらに大きい分子であるヒトｂｉｇ−
ＥＴ−２（１−３８）等の蛋白を細胞培養液中に分泌さ
せた。これら発現系はＥＴ−２の合成、分泌機構を知り
、その阻害方法を開発するのに役立つものであり、エン
ドセリン−１，−３に関するものと合わせ、三種のエン
ドセリンの合成阻害剤の開発に役立つものである。
【００４４】
【発明の効果】以上より、ヒト・エンドセリン−２の前
駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングし、その構造
を決定した。このｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、
エンドセリン−２およびその前駆体を発現させることが
可能となった。また、このヒト・エンドセリン−２のｃ
ＤＮＡをプローブとして使用し、これまでに本発明者ら
が得たヒト・エンドセリン−１、−３と共にエンドセリ
ン−２の遺伝子発現をＤＮＡレベルで明らかにすること
が出来るようになり、エンドセリンが関係する疾病の診
断を、先に開発したエンドセリンのＥＩＡと併用して行
うことが可能となった。
駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングし、その構造
を決定した。このｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、
エンドセリン−２およびその前駆体を発現させることが
可能となった。また、このヒト・エンドセリン−２のｃ
ＤＮＡをプローブとして使用し、これまでに本発明者ら
が得たヒト・エンドセリン−１、−３と共にエンドセリ
ン−２の遺伝子発現をＤＮＡレベルで明らかにすること
が出来るようになり、エンドセリンが関係する疾病の診
断を、先に開発したエンドセリンのＥＩＡと併用して行
うことが可能となった。
【００４５】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１２１８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ヒト・
エンドセリン−２ＤＮＡ 起源：ヒト腎臓癌細胞ＡＣＨＮ ｃＤＮＡ配列 ＡＧＧＡＣＧＣＴＧＧ ＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣ ＴＣＣ
ＣＴＧＣＴＣＣ ＡＧＴＣＣＡＧＣＣＴ ＧＣＧＣＧＣ
ＴＣＣＡ ＣＣＧＣＣＧＣＴ ５８ＡＴＧ ＧＴ
Ｃ ＴＣＣ ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ
ＴＧＣ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＣＣ
ＣＴＧ ＣＴＣ １０６Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ １ ５
１０
１５ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ
ＧＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＧ
１５４Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
２０
２５ ３０ＣＣＡ
ＧＣＧ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＣＣ
ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＧＧ Ｃ
ＴＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ２０２Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｒｇ ３５
４０
４５ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＣＣ
ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＧＣ Ｇ
ＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ２５０Ｃ
ｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ ５０
５５
６０ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＣ
ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ
ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＣ
２９８Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖ
ａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ６５
７０
７５
８０ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＣＣＧ ＣＣＡ
ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＣＣ Ｃ
ＴＧ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ３４６Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｃｙｓ
８５ ９
０ ９５ＣＡＧ
ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ Ｃ
ＣＣ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧ
Ｃ ＣＴＴ ＣＧＡ ３９４Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ａｒｇ １００
１０５
１１０ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＴ Ｇ
ＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＧ
Ｃ ＣＧＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ４
４２Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ １１
５ １２０
１２５ＧＡＣ ＧＴＧ Ｔ
ＴＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＧ
Ｇ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＴＴ
ＣＴＣ ４９０Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
１３０ １３
５ １４０ＣＡＡ
ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＣＣ Ａ
ＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＣ
Ｃ ＡＡＧ ＣＧＡ ５３８Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ａｒｇ １４５
１５０ １５５
１６０ＣＡＡ ＣＡ
Ｇ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ
ＣＧＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＧＧ
ＴＧＧ ＡＧＧ ５８６Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｍｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒ
ｇ １６５
１７０
１７５ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＧＴ
ＣＧＴＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡ ＴＴＧＧＧＡ
ＡＧＧＡ ＡＧＣＣＣＧＣＧＧＧ ＧＡＧＡＧＡＧＧＡ
Ｇ ６４５Ｌｙｓ Ａｒｇ ＊ １７９ ＧＡＧＡＧＡＡＧＴＧ ＧＣＣＡＧＧＧＣＴＴ ＧＴＧ
ＧＡＣＴＣＴＣ ＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣ ＣＴＧＧＡＣ
ＣＧＧＧ ＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣ ７０５ＣＡＧＡＣ
ＡＧＣＴＧ ＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧ ＣＣＡＧＧＡＴＴ
ＧＧ ＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣ ＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧ
ＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣ ７６５ＡＡＧＧＣＡＧＴＴＣ
ＴＧＴＧＴＣＣＴＣＧ ＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧ ＧＧ
ＡＡＧＣＣＣＴＣ ＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡ ＣＴＧＣＧ
ＧＡＧＣＡ ８２５ＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧ ＣＴＧＧ
ＣＴＧＣＴＧ ＧＣＣＣＡＣＡＧＣＴ ＣＴＧＣＴＧＧ
ＡＡＧ ＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧ ＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴ
８８５ＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧ ＣＴＧＣＧＴＣＣＴ
Ｇ ＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣ ＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧ Ｇ
ＣＴＡＣＡＡＡＣＣ ＡＧＧＡＧＣＡＡＣＣ ９４５
ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣ ＧＡＡＣＡＣＧＣＡＴ ＧＣＣ
ＴＣＡＧＣＣＡ ＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡ ＣＴＧＧＡＴ
ＧＧＣＴ ＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣ １００５ＴＧＧＣＡ
ＴＣＣＴＧ ＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧ ＴＣＣＴＣＴＣＣ
ＡＧ ＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴ
ＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡ １０６５ＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧ
ＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧ ＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣ ＣＴ
ＧＣＴＣＴＧＣＴ ＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴ ＧＴＡＴＡ
ＴＡＡＣＴ １１２５ＴＡＴＴＴＧＣＣＣＴ ＡＡＧＡ
ＡＣＴＴＴＧ ＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡ ＴＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴ ＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＧＡＣＣＣＴ
１１８５ＣＴＡＴＴＴＡＣＣＴ ＧＣＧＡＡＣＴＴＧ
Ｔ ＧＴＴＴＡＴＡＡＴＡ ＡＡＴ
１２１８
。
エンドセリン−２ＤＮＡ 起源：ヒト腎臓癌細胞ＡＣＨＮ ｃＤＮＡ配列 ＡＧＧＡＣＧＣＴＧＧ ＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣ ＴＣＣ
ＣＴＧＣＴＣＣ ＡＧＴＣＣＡＧＣＣＴ ＧＣＧＣＧＣ
ＴＣＣＡ ＣＣＧＣＣＧＣＴ ５８ＡＴＧ ＧＴ
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ＴＧＣ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＣＣ
ＣＴＧ ＣＴＣ １０６Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｓ
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１０
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２０
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５５
６０ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＣ
ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ
ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＣ
２９８Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖ
ａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ６５
７０
７５
８０ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＣＣＧ ＣＣＡ
ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＣＣ Ｃ
ＴＧ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ３４６Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｃｙｓ
８５ ９
０ ９５ＣＡＧ
ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ Ｃ
ＣＣ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧ
Ｃ ＣＴＴ ＣＧＡ ３９４Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ａｒｇ １００
１０５
１１０ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＴ Ｇ
ＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＧ
Ｃ ＣＧＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ４
４２Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ １１
５ １２０
１２５ＧＡＣ ＧＴＧ Ｔ
ＴＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＧ
Ｇ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＴＴ
ＣＴＣ ４９０Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
１３０ １３
５ １４０ＣＡＡ
ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＣＣ Ａ
ＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＣ
Ｃ ＡＡＧ ＣＧＡ ５３８Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ａｒｇ １４５
１５０ １５５
１６０ＣＡＡ ＣＡ
Ｇ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ
ＣＧＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＧＧ
ＴＧＧ ＡＧＧ ５８６Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｍｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓ
ｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒ
ｇ １６５
１７０
１７５ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＧＴ
ＣＧＴＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡ ＴＴＧＧＧＡ
ＡＧＧＡ ＡＧＣＣＣＧＣＧＧＧ ＧＡＧＡＧＡＧＧＡ
Ｇ ６４５Ｌｙｓ Ａｒｇ ＊ １７９ ＧＡＧＡＧＡＡＧＴＧ ＧＣＣＡＧＧＧＣＴＴ ＧＴＧ
ＧＡＣＴＣＴＣ ＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣ ＣＴＧＧＡＣ
ＣＧＧＧ ＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣ ７０５ＣＡＧＡＣ
ＡＧＣＴＧ ＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧ ＣＣＡＧＧＡＴＴ
ＧＧ ＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣ ＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧ
ＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣ ７６５ＡＡＧＧＣＡＧＴＴＣ
ＴＧＴＧＴＣＣＴＣＧ ＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧ ＧＧ
ＡＡＧＣＣＣＴＣ ＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡ ＣＴＧＣＧ
ＧＡＧＣＡ ８２５ＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧ ＣＴＧＧ
ＣＴＧＣＴＧ ＧＣＣＣＡＣＡＧＣＴ ＣＴＧＣＴＧＧ
ＡＡＧ ＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧ ＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴ
８８５ＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧ ＣＴＧＣＧＴＣＣＴ
Ｇ ＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣ ＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧ Ｇ
ＣＴＡＣＡＡＡＣＣ ＡＧＧＡＧＣＡＡＣＣ ９４５
ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣ ＧＡＡＣＡＣＧＣＡＴ ＧＣＣ
ＴＣＡＧＣＣＡ ＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡ ＣＴＧＧＡＴ
ＧＧＣＴ ＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣ １００５ＴＧＧＣＡ
ＴＣＣＴＧ ＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧ ＴＣＣＴＣＴＣＣ
ＡＧ ＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴ
ＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡ １０６５ＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧ
ＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧ ＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣ ＣＴ
ＧＣＴＣＴＧＣＴ ＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴ ＧＴＡＴＡ
ＴＡＡＣＴ １１２５ＴＡＴＴＴＧＣＣＣＴ ＡＡＧＡ
ＡＣＴＴＴＧ ＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡ ＴＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴ ＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＧＡＣＣＣＴ
１１８５ＣＴＡＴＴＴＡＣＣＴ ＧＣＧＡＡＣＴＴＧ
Ｔ ＧＴＴＴＡＴＡＡＴＡ ＡＡＴ
１２１８
。
【００４６】配列番号：２
配列の長さ：１７８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔ
ｈｒ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １
５
１０ １５Ｖａｌ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ ２０
２５
３０Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｒｇ ３５
４０
４５Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔ
ｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ ５０
５５
６０Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ ６５ ７
０ ７５
８０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｃｙｓ ８５
９０
９５Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｃ
ｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ １００
１０５
１１０Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
１１５ １２０
１２５Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ １４５
１５０
１５５
１６０Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｍｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒｇ
１６５
１７０
１７５Ｌｙｓ Ａｒｇ ＊ １７８。
ｈｒ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １
５
１０ １５Ｖａｌ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ ２０
２５
３０Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｒｇ ３５
４０
４５Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔ
ｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ ５０
５５
６０Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ ６５ ７
０ ７５
８０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｃｙｓ ８５
９０
９５Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｃ
ｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｒ
ｇ １００
１０５
１１０Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
１１５ １２０
１２５Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ １４５
１５０
１５５
１６０Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｍｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｒｇ
１６５
１７０
１７５Ｌｙｓ Ａｒｇ ＊ １７８。
【００４７】配列番号：３
配列の長さ：３７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌ
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２
０ ２５
３０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ ３５。
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２
０ ２５
３０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ ３５。
【００４８】配列番号：４
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌ
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２
０ ２５
３０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ ３５
。
ｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２
０ ２５
３０Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ ３５
。
【００４９】配列番号：５
配列の長さ：７９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣ
ＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧ
ＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧ。
ＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧ
ＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧ。
【図１】各種エンドセリンのアミノ酸配列を比較して示
した図である。
した図である。
【図２】本発明で得られたヒト・エンドセリン−２をコ
ードするｃＤＮＡの制限酵素断片地図である。
ードするｃＤＮＡの制限酵素断片地図である。
【図３】本発明で得られたヒト・エンドセリン−２をコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列、およびその塩基配列から
判明したアミノ酸配列である。
ードするｃＤＮＡの塩基配列、およびその塩基配列から
判明したアミノ酸配列である。
【図４】ヒト・エンドセリン−２の前駆体のアミノ酸配
列である。
列である。
【図５】実施例５におけるヒト・エンドセリン発現用プ
ラスミドの構築図である。
ラスミドの構築図である。
【図６】本発明のヒト・エンドセリンおよびその前駆体
発現に関するグラフである。
発現に関するグラフである。
【図７】本発明のヒト・エンドセリンおよびその前駆体
発現に関する逆相高速クロマトグラムである。
発現に関する逆相高速クロマトグラムである。
【図８】本発明のヒト・ビッグ・エンドセリン（１−３
８）の質量分析図である。
８）の質量分析図である。
Claims (9)
- 【請求項１】ヒト・エンドセリン−２をコードするｃＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ。 - 【請求項２】ヒト・エンドセリン−２をコードするｃＤ
ＮＡが〔式１〕の塩基配列を含有あるいはその一部で表
わされる、請求項１記載のＤＮＡ。 〔式１〕 １ Ａ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＡ
Ａ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＣＴ ＧＣＴ
２８ ２９ ＣＣＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ
ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ
５８ ５９ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＣＣ
ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ８８ １ Ｍ Ｖ
Ｓ Ｖ Ｐ Ｔ Ｔ Ｗ Ｃ
Ｓ １０ ８９ ＧＴＴ ＧＣ
Ｇ ＣＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＣＣ
ＣＴＧ ＣＡＴ １１８ １１ Ｖ
Ａ Ｌ Ａ Ｌ Ｌ Ｖ
Ａ Ｌ Ｈ ２０ １１９
ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ １４８ ２１
Ｅ Ｇ Ｋ Ｇ Ｑ Ａ
Ａ Ａ Ｔ Ｌ ３０
１４９ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＣ
ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＡＡ １
７８ ３１ Ｅ Ｑ Ｐ Ａ
Ｓ Ｓ Ｓ Ｈ Ａ Ｑ
４０ １７９ ＧＧＣ ＡＣＣ ＣＡＣ Ｃ
ＴＴ ＣＧＧ ＣＴＴ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＣ
Ｃ ２０８ ４１ Ｇ Ｔ Ｈ
Ｌ Ｒ Ｌ Ｒ Ｒ Ｃ
Ｓ ５０ ２０９ ＴＧＣ ＡＧＣ
ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＡＧ
ＴＧＣ ＧＴＣ ２３８ ５１ Ｃ
Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ Ｋ
Ｅ Ｃ Ｖ ６０ ２３９ Ｔ
ＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴ
Ｃ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ２６８ ６１
Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ Ｌ Ｄ
Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ ７０ ２
６９ ＡＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＡＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＣ ２９
８ ７１ Ｎ Ｔ Ｐ Ｅ
Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ
８０ ２９９ ＣＴＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＣＣ
Ｇ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ
３２８ ８１ Ｌ Ｇ Ｎ
Ｐ Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ｒ
Ｒ ９０ ３２９ ＴＣＣ ＣＴＧ
ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣ ＡＧＴ ３５８ ９１ Ｓ
Ｌ Ｐ Ｒ Ｒ Ｃ Ｑ Ｃ
Ｓ Ｓ １００ ３５９ ＧＣ
Ｃ ＡＧＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＣＣ
ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ３８８ １０１
Ａ Ｒ Ｄ Ｐ Ａ Ｃ
Ａ Ｔ Ｆ Ｃ １１０ ３８
９ ＣＴＴ ＣＧＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ Ａ
ＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＣＡ ４１８
１１１ Ｌ Ｒ Ｒ Ｐ Ｗ
Ｔ Ｅ Ａ Ｇ Ａ
１２０ ４１９ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＧＧ
ＡＡＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＧＴＧ
４４８ １２１ Ｖ Ｐ Ｓ
Ｒ Ｋ Ｓ Ｐ Ａ Ｄ
Ｖ １３０ ４４９ ＴＴＣ ＣＡＧ Ａ
ＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＣ
Ｔ ＡＣＡ ４７８ １３１ Ｆ Ｑ
Ｔ Ｇ Ｋ Ｔ Ｇ Ａ
Ｔ Ｔ １４０ ４７９ ＧＧＡ
ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ５０８ １４１
Ｇ Ｅ Ｌ Ｌ Ｑ Ｒ
Ｌ Ｒ Ｄ Ｉ １５０ ５０９
ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＴ
Ｃ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＧＡ ５３８
１５１ Ｓ Ｔ Ｖ Ｋ Ｓ
Ｌ Ｆ Ａ Ｋ Ｒ １
６０ ５３９ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣ
ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＧＧ ＴＣＣ
５６８ １６１ Ｑ Ｑ Ｅ
Ａ Ｍ Ｒ Ｅ Ｐ Ｒ Ｓ
１７０ ５６９ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＣ
Ｃ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＡＧ
ＴＧＴ ５９８ １７１ Ｔ Ｈ
Ｓ Ｒ Ｗ Ｒ Ｋ Ｒ
＊ １７９ ５９９ ＣＧＴ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＧＧ Ｇ
ＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ６２８ ６２９ Ｃ
ＣＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧ
Ａ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣＣ ６５８ ６５９
ＡＧＧ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＴＣＴ
ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ６８８ ６
８９ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＧＴ
ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ７１
８ ７１９ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＧＧ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ
７４８ ７４９ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＣＣ
Ｔ ＣＧＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ
７７８ ７７９ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＣＡ
ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＴＣ
ＧＧＣ ８０８ ８０９ ＣＴＣ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ Ｇ
ＴＧ ＣＴＧ ８３８ ８３９ ＧＣＴ Ｇ
ＣＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧ
Ｇ ＡＡＧ ＡＡＣ ８６８ ８６９ ＴＧ
Ｃ ＡＴＧ ＧＧＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＴＣ
ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ８９８ ８９９
ＣＧＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＧＣＴ ９２８ ９２
９ ＡＣＡ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＡ Ｃ
ＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＧＡＡ ９５８
９５９ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＧ
Ｃ ＣＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＴＧ
９８８ ９８９ ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＴ
１０１８１０１９ ＧＧＣ ＴＧＴ ＧＴＣ
ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＣＣ Ｃ
ＣＡ １０４８１０４９ ＧＡＧ ＴＴＣ Ｔ
ＴＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＧ
Ｇ ＡＣＣ １０７８１０７９ ＣＴＣ ＣＣ
Ａ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＣＴ
ＧＣＴ ＴＴＴ １１０８１１０９ ＣＣＴ
ＧＴＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＡＴＴ
ＴＧＣ ＣＣＴ ＡＡＧ １１３８１１３９
ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＣＣＣ ＡＡＴ Ｔ
ＡＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＡ １１６８１１６９
ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＡＣＣ ＣＴ
Ｃ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＣＴ ＧＣＧ １１９８１
１９９ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ
ＴＡＡ ＡＴ １２
１８ - 【請求項３】３′末端にｐｏｌｙＡシグナルＡＡＴＡＡ
Ａの配列を有するヒト・エンドセリン−２をコードする
ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ。 - 【請求項４】ヒト・エンドセリン−２の前駆体蛋白質。
- 【請求項５】〔式２〕のアミノ酸配列で表される請求項
４記載の前駆体蛋白質。 〔式２〕 １０ ２０
３０ ４０
５０ ６０Ｎ−ＭＶＳＶＰＴＴＷＣＳＶ
ＡＬＡＬＬＶＡＬＨＥＧＫＧＱＡＡＡＴＬＥＱＰＡＳＳ
ＳＨＡＱＧＴＨＬＲＬＲＲＣＳＣＳＳＷＬＤＫＥＣＶ
７０ ８０
９０ １００ １１
０ １２０ ＹＦＣＨＬＤＩＩＷＶＮＴ
ＰＥＱＴＡＰＹＧＬＧＮＰＰＲＲＲＲＲＳＬＰＲＲＣＱ
ＣＳＳＡＲＤＰＡＣＡＴＦＣＬＲＲＰＷＴＥＡＧＡ
１３０ １４０
１５０ １６０ １７０
ＶＰＳＲＫＳＰＡＤＶＦＱＴＧＫＴＧＡＴＴＧＥＬ
ＬＱＲＬＲＤＩＳＴＶＫＳＬＦＡＫＲＱＱＥＡＭＲＥＰ
ＲＳＴＨＳＲＷＲＫＲ＊ −Ｃ - 【請求項６】〔式２〕のＮｏ．４９−８５のアミノ酸配
列 Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ
Ｌ Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ
Ｇ Ｎ Ｐ Ｐ で表わされる請求項４記載の前駆体蛋白質。 - 【請求項７】〔式２〕のＮｏ．４９−８６のアミノ酸配
列 Ｃ Ｓ Ｃ Ｓ Ｓ Ｗ Ｌ Ｄ
Ｋ Ｅ Ｃ Ｖ Ｙ Ｆ Ｃ Ｈ
Ｌ Ｄ Ｉ Ｉ Ｗ Ｖ Ｎ Ｔ Ｐ
Ｅ Ｑ Ｔ Ａ Ｐ Ｙ Ｇ Ｌ
Ｇ Ｎ Ｐ Ｐ Ｒ で表わされる請求項４記載の前駆体蛋白質。 - 【請求項８】ヒト・エンドセリン−２をコードするｃＤ
ＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質転換体。 - 【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養し、培養
物中に成熟エンドセリン−２を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする成熟エンドセリン−２蛋白質
の製造方法。
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