JP2553829B2 - 組換えコロニー刺激因子−１ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ヒト−コロニー刺激
因子−１（ＣＳＦ−１）並びにその製造方法及びその使
用に関する。

【０００２】

【従来の技術】種々の組織中で非常に低濃度で生産され
る若干の因子の、骨髄前駆細胞の増殖及び顆粒球及び／
又はマクロファージへの発達を刺激する能力が最近１５
年来知られて来た。多数の種からの血清、尿サンプル及
び組織抽出物中でのこれらの因子の存在は、半固体培地
中にプレートされた骨髄細胞によるコロニー形成の刺激
を測定するインビトロ測定法を用いて示される。これら
の因子は、このようなコロニーの形成を誘導するため、
コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇ ｆａｃｔｏｒ；ＣＳＦ）と総称されている。

【０００３】一層最近になって、生ずるコロニー中に見
出される細胞のタイプに従って定義され得るヒトＣＳＦ
蛋白質の少なくとも４つのサブクラスが存在することが
示された。１つのサブクラスＣＳＦ−１は主としてマク
ロファージを含有するコロニーをもたらす。他のサブク
ラスは、好中顆粒球及びマクロファージの両者を含有す
るコロニー、主として好中顆粒球を含有するコロニー、
及び好中顆粒球及び好酸顆粒球並びにマクロファージを
含有するコロニーを形成する。

【０００４】上記ヒトＣＳＦの最初の３種類に類似する
ネズミの因子が存在する。さらに、ＩＬ−３と称される
ネズミ因子はネズミ骨髄細胞からコロニーを誘導し、こ
のコロニーはこれらすべての細胞タイプのほかに巨核
球、赤血球、及び肥満細胞を種々の組み合わせで含有す
る。これらのＣＳＦ類はＤｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９８４）３０９：７４６；及びＶａｄａｓ，
Ｍ．Ａ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）１３
０：７９３に総説されている。

【０００５】この発明は、これらのサブクラスの第１の
構成員である蛋白質ＣＳＦ−１の組換製造に関する。こ
のサブクラスは特異的ラジオイムノアッセイ及びラジオ
リセプターアッセイによりさらに特徴付けられそして描
写されている……例えば、精製されたＣＳＦ−１に対し
て生じた抗体は他のサブクラスの生物学的活性に影響を
与えることなくＣＳＦ−１活性を特異的に抑制すること
ができ、そしてマクロファージセルラインＪ７７４はＣ
ＳＦ−１に特異的に結合するリセプターを含有する。こ
れらのアッセイの記載はＤａｓ，Ｓ．Ｋ．等、Ｂｌｏｏ
ｄ（１９８１）５８：６５０により発表されている。

【０００６】種々のＣＳＦ蛋白質の精製方法が発表され
ており、そして次のパラグラフで記載する。Ｓｔａｎｌ
ｅｙ，Ｅ．Ｒ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７
７）５２：４３０５はネズミＬ９２９細胞からのＣＳＦ
蛋白質の約１×１０⁸ ユニット／mgまでの精製を報告し
たが、これも主としてマクロファージ生産を刺激した。
Ｗａｈｅｅｄ，Ａ．，等Ｂｌｏｏｄ（１９８２）６０：
２３８はラビット抗体カラムを用いることによるマウス
Ｌ−細胞ＣＳＦ−１の見かけ上均一への精製を記載し、
そしてネズミ配列の最初の２５アミノ酸を報告した（Ｂ
ｅｍ−Ａｖｒａｍ，Ｃ．Ｍ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）８８２：４４
８６）。

【０００７】Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．等、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２：４３０５−４３１
２は、人尿からのＣＳＦ−１の精製方法を開示し、そし
てＤａｓ，Ｓ．Ｋ．等、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５８：
６３０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５
７：１３６７９はマクロファージコロニーのみを生成す
る人尿ＣＳＦ−１を５×１０⁷ ユニット／mgの比活性で
得、そして培養されたマウスＬ−細胞から及び人尿から
調製されたＣＳＦ−１蛋白質のグリコシル化とそれらの
活性との間の関連を要約している。Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｆ．
等、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）２１：
２６３は人尿ＣＳＦ−１を１０⁸ Ｕ／mgの比活性で単離
した。Ｗａｈｅｅｄ，Ａ．等はラビット抗体カラム上で
の人尿ＣＳＦ−１の０．７〜２．３×１０⁷ Ｕ／mgの比
活性への精製を開示している。〔Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．
（１９８４）１２：４３４〕。

【０００８】Ｗｕ，Ｍ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９７９）２５４：６２２６は培養されたヒト膵臓癌
（ＭＩＡＰａＣａ）細胞からのＣＳＦ蛋白質の調製を報
告しており、これはネズミ顆粒球及びマクロファージコ
ロニーの増殖をもたらす。得られた蛋白質は約７×１０
⁷ ユニット／mgの比活性を有していた。種々のＣＳＦの
部分的に精製された調製物も報告されており、これらは
ヒト及びネズミ肺細胞条件化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅ
ｄ）培地から〔Ｆｏｊｏ，Ｓ．Ｓ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（１９７８）１７：３１０９；Ｂｕｒｇｅｓ
ｅｓ，Ａ．Ｗ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７
７）２５２：１９９８〕、ヒトＴ−リンパ芽球細胞から
〔Ｌｕｓｉｓ，Ａ．Ｊ．等、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５
７：１３；米国特許No．４，４３８，０３２〕、ヒト胎
盤条件化培地から見かけ上均一にそして７×１０⁷ Ｕ／
mgの比活性に〔Ｗｕ，Ｍ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ（１９８０）１９：３８４６〕得られた。

【０００９】一般にＣＳＦ蛋白質に、そして特にＣＳＦ
−１になんらかの有用な機能を行わせることの有意な困
難性は、それらを実際に又は可能性としてさえ療法的に
使用するのに十分な量で、区別し得るそして特徴付け得
る形態で入手することができないことであった。この発
明は組換技法により有用な量で精製されたヒト及びネズ
ミＣＳＦ−１を提供することによってこれらの不足を救
済する。

【００１０】異るサブクラスのＣＳＦ蛋白質、ネズミ及
びヒトＧＭ−ＣＳＦが精製され、そしてｃＤＮＡがクロ
ーン化された。この蛋白質は他のＣＳＦ、例えばＣＳＦ
−１と異ることがＧｏｕｇｈ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
４）３０９：７６３−７６７により示された。ネズミＩ
Ｌ−３はＦｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．等によりクローン化された
〔Ｍ．Ｃ．Ｆｕｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０
７：２３３〕。さらに、Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．等ＰＮＡＳ
（１９８４）８１：１０７０−１０７４；Ｗｏｎｇ，
Ｇ．Ｇ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：８１
０−８１５；Ｌｅｅ，Ｆ．等、ＰＮＡＳ（１９８５）８
２：４３６０−４３６４；及びＣａｎｔｒｅｌｌ，Ｍ．
Ａ．等、ＰＮＡＳ（１９８５）８２：６２５０−６２５
４を参照のこと。

【００１１】

【本発明の開示】１つの観点において、この発明は組換
ＣＳＦ−１蛋白質に関し、これには天然蛋白質の一次ア
ミノ酸配列の変更を含む生物学的に活性な蛋白質が包含
される。組換形のＣＳＦ−１蛋白質は多量に得られ、宿
主により提供される翻訳後プロセシングの制御により有
利に修飾され得、そしてその望ましい性質を増強するた
めに遺伝子レベル又は蛋白質レベルで意図的に変形され
得る。例えば、ポリペプチドのカルボキシ末端の３分の
１の実質的部分の欠失を有するミューテインは活性であ
る。すなわち、組換形のＣＳＦ−１の入手可能性は天然
蛋白質に関しては得られない柔軟性及び幾つかの量的利
点を提供し、このため蛋白質の療法的適用を可能にす
る。

【００１２】他の観点において、この発明は組換ＣＳＦ
−１をコードする単離されたＤＮＡ配列、この配列のた
めの組換発現系及びこれらを含有するベクター、これら
のベクターにより形質転換された組換宿主、並びに組換
蛋白質を生産する培養物に関する。この発明はさらに組
換蛋白質の製造方法及びその製造において重要な材料に
関する。

【００１３】さらに、この発明は医薬的及び療法的適用
において有用なＣＳＦ−１を含有する組成物に関する。

【００１４】

【発明を実施するための態様】

Ａ．定義 “コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）”は、当業界に
おいてＣＳＦ−１について理解されている活性のスペク
トルを示す蛋白質を意味する……すなわち、Ｍｅｔｃａ
ｌｆ，Ｐ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９７
０）７６：８９の標準的インビトロコロニー刺激アッセ
イに適用した場合に、このものは一次マクロファージコ
ロニーの形成をもたらす。天然ＣＳＦ−１はグリコシル
化されたダイマーであり；活性のためにダイマー化が必
要である。ダイマー形及びモノマー形の両者がこの発明
の範囲内及びＣＳＦ−１の定義内のものと意図される。
モノマー形は細胞内条件のインビトロでの提供によりダ
イマーに転換され、そしてモノマーはそれ自体抗−ＣＳ
Ｆ−１抗体を生産するための抗原として有用である。

【００１５】幾つかの種特異性が存在するようであり、
ヒトＣＳＦ−１はヒト及びネズミの両者の骨髄細胞に対
して作用可能であり；ネズミＣＳＦ−１はヒト細胞につ
いて活性を示さない。従って、“ヒトＣＳＦ−１は、完
全な相互関係が必然的に存在するわけではないにして
も、Ｄａｓ，Ｓ．Ｋ．等、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５
８：６３０の特異的ネズミラジオリセプターアッセイに
おいて陽性であるべきである。この蛋白質の生物学的活
性は一般にまた、人尿ＣＳＦ−１に対する中和抗血清に
よっても阻害されるであろう（Ｄａｓ，Ｓ．Ｋ．等、前
掲）。しかしながら、ある特別な状況（例えば、特定の
抗体調製物が生物学的機能のために必須でないＣＳＦ−
１エピトープを認識し、そしてこのエピトープが試験さ
れる特定のＣＳＦ−１ミューテイン中に存在しない場合
のごとき）においては、この基準は妥当しないであろ
う。

【００１６】ＣＳＦ−１の幾つかの他の性質が一層最近
になって認識されたが、これらの性質は一連のＥプロス
タグランジン、インターロイキン−１、及びインターフ
ェロンの成熟マクロファージからの分泌を刺激するこの
蛋白質の能力を含む〔Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．等、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８４）２２３：１７８〕。これら後者の活性
のための機作は現在のところ理解されておらず、そして
ここでの定義のため、定義の達成のための基準は出発材
料として適切な種からの骨髄細胞を使用しての単核球／
マクロファージコロニーの形成を刺激する能力、ほとん
どの状況（上記を参照のこと）のもとでの精製人尿ＣＳ
Ｆ−１に対する中和抗血清によるこの活性の阻害、及び
種タイプについて適切な場合にはラジオリセプターアッ
セイに対する陽性反応に存在する。

【００１７】〔ＣＳＦ−１の増殖効果が単核性貧食性系
統の細胞に限定されること（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．
Ｒ．，Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ（１９８１），
Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｗ．Ｅ．，II、等編集、Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ、クリフトン、ＮＪ，１０２−１２３
頁）、並びにＣＳＦ−１のリセプターがこれらのセルラ
インに限定されること（Ｂｙｒｎｅ，Ｐ．Ｕ．等、Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８１）９１：８４８）が知られ
ている。〕すべての蛋白質の場合と同様に、正確な化学
構造は多数の因子に依存する。分子中にイオン化可能な
アミノ基及びカルボキシル基が存在する場合、特定の蛋
白質が酸性塩もしくは塩基性塩として、又は中性の形で
得られる。適当な環境条件に置かれた場合にそれらの活
性を維持しているそれらすべての調製物が定義に含まれ
る。さらに、一次アミノ酸配列に、糖成分を用いる誘導
体化（グリコシル化）により又は他の補足的分子、例え
ば脂質、ホスフェート、アセチル基等により、さらに一
般的にはサッカライドとの接合により、付加を行うこと
ができる。

【００１８】一次アミノ酸構造はまた集合して複合体、
最もしばしばダイマーを形成することができる。たしか
に、天然人尿ＣＳＦ−１は高度にグリコシル化されたダ
イマーとして単離される。このような付加の幾つかの観
点は生産宿主の翻訳後プロセシング系により達成され、
このような他の変形はインビトロで導入される。ともか
く、このような変形は、上に定義した蛋白質の活性が破
壊されない限り定義に含まれる。言うまでもなく、この
ような変形は種々のアッセイにおいて蛋白質の活性を増
強し又は低下せしめることにより活性に量的又は質的な
影響を与えるであろうことが予想される。

【００１９】さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基を酸
化、還元、又は他の誘導体化により変形することがで
き、そして蛋白質を切断して活性を維持している断片を
得ることができる。活性を破壊しないこのような変形は
蛋白質配列を定義から排除しない。翻訳中に配列中に導
入されるアミノ酸の欠失、付加又は変更により一次構造
それ自体に対する変形を、蛋白質の活性を喪失すること
なく行うことができる。このような置換又は他の変更は
“ＣＳＦ−１のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列を有する”蛋白質の定義に属するアミノ酸配列を有
する蛋白質をもたらす。確かに、ヒト及びネズミ由来Ｃ
ＳＦ−１蛋白質は、高い相同性を示す、同一ではないが
類似の一次アミノ酸配列を有する。

【００２０】便宜上、ここに例示されるｃＤＮＡクロー
ンから推定される図７及び８中に示される、ダイマー蛋
白質のモノマー部分の成熟蛋白質アミノ酸配列をｍＣＳ
Ｆ−１（成熟ＣＳＦ−１）と称する。図７及び８は、哺
乳類細胞からの分泌の際におそらく開裂されるであろう
３２残基の推定上のシグナル配列の存在を示す。ｍＣＳ
Ｆ−１はこの図においてアミノ酸１−２２４により代表
される。具体的には、そのモノマー及びダイマーがｍＣ
ＳＦ−１、及びｍＣＳＦ−１からのそれらの差異により
命名されるｍＣＳＦ−１の関連形がヒトＣＳＦ−１の定
義に含まれる。他の種に由来するＣＳＦ−１は、ヒト基
質について上に示した活性の必要なパターンを示すこと
により“ヒト”ＣＳＦ−１の定義に妥当する。

【００２１】やはり便宜上、ｍＣＳＦ−１のアミノ酸配
列が参照として使用され、そしてＣＳＦ−１活性の点で
これと実質的に同等である他の配列が図７及び８中に示
される配列に言及することにより命名されるであろう。
特定のアミノ酸の置換は、それを代替するアミノ酸残基
への言及により示されるであろう。従って、例えば、ｓ
ｅｒ₉₀ＣＳＦ−１は９０位のアミノ酸がシステインでは
なくセリンである点を除き図７及び８中に示される配列
を有する蛋白質を意味する。

【００２２】欠失はΔと、これに続くＮ−末端配列から
除去されたアミノ酸の個数により、あるいは残基がＣ−
末端配列から除去される場合には、残りのアミノ酸配列
の個数とこれに続くマイナス記号により示される。すな
わち、Δ₄ ＣＳＦ−１はＮ−末端からの最初の４個のア
ミノ酸が欠失している図７及び８のＣＳＦ−１を意味
し；Δ_130-はアミノ酸１３０に続く最後の９４個のアミ
ノ酸が欠失しているＣＳＦ−１を意味する。例えば、５
９位においてｃＤＮＡによりコードされるチロシン残基
ではなく遺伝子（図４〜６）によりコードされるアスパ
ラギン酸残基を含むａｓｐ₅₉ＣＳＦ−１、及びｍＣＳＦ
−１のアミノ酸１−１５８のみから成るΔ ₁₅₈ −ＣＳＦ
−１を下記に例示する。

【００２３】“作用可能に連結された”（ｏｐｅｒａｂ
ｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）なる語は、構成成分の正常な機能
が達成され得るような並置を意味する。すなわち制御配
列に“作用可能に連結された”コード配列は、これらの
配列の制御のもとに該コード配列が発現され得るような
配置を意味する。“制御配列”は、特定の宿主生物中
で、作用可能に連結されたコード配列の発現のために必
要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物のために適当な制
御配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペ
レーター配列、リボゾーム結合部位、及びおそらく他の
従来あまり理解されていない配列を包含する。真核生物
はプロモーター、ポリアデニレーションシグナル及びエ
ンハンサーを用いることが知られている。

【００２４】“発現系”は、目的とするコード配列及び
作用可能に連結された制御配列を含有するＤＮＡ配列で
あって、これらの配列により形質転換された宿主がコー
ドされた蛋白質を生産することができるようなＤＮＡ配
列を意味する。形質転換を行うためには、発現系がベク
ター上に導入されることができ、しかしながら該当する
ＤＮＡはさらに宿主の染色体中に取り込まれることもで
きる。

【００２５】ここで使用する場合、“細胞”、“細胞
系”（セルライン）、及び“細胞培養物”は相互交換的
に使用され、そしてこれらすべての名称は子孫を含む。
すなわち、“形質転換体”又は“形質転換された細胞”
は一次対象細胞、及び経代の数に関係なくこれらに由来
する培養物を包含する。意図的な又は非意図的な変異に
基き、すべての子孫がＤＮＡ含有において正確に同一で
あるとは限らないことが理解される。最初に形質転換さ
れた細胞においてスクリーニングされたのと同一の機能
を有する変異体子孫が含まれる。区別された命名が意図
される場合、それは文脈から明らかであろう。

【００２６】Ｂ．一般的記載 この発明のＣＳＦ−１蛋白質は、骨髄前駆細胞からの単
球−前駆体／マクロファージ細胞の生産を刺激して免疫
系の効率を増強すること、及び成熟マクロファージにお
けるリンホカインの分泌のごときこれらの分化した細胞
の機能を刺激すること、の両者を行うことができる。

【００２７】１つの用途において、これらの蛋白質は化
学療法への付加物として有用である。化学療法剤による
治療が免疫系の抑制をもたらすことはよく理解されてい
る。しばしば、これらがそれに対して向けられている腫
瘍細胞を破壊することに成功したとしても、化学療法剤
による治療は免疫系の細胞に対する化学毒性剤のこの副
作用のために対象の死をもたらす。

【００２８】このような患者へのＣＳＦ−１の投与は、
骨髄由来前駆細胞の増殖及びマクロファージ及び単球へ
の分化を中介しそして増強しそしてこれらの成熟細胞の
機能を刺激するＣＳＦ−１の能力のために、免疫系の再
刺激をもたらし、これによってこの副作用が回避され、
そして患者が二次感染に倒れる傾向が回避される。この
ような治療によって救済されるであろう他の患者には、
骨髄移植によって白血病の治療をされる患者が含まれ
る。これらはしばしば、拒絶を回避するために免疫抑制
状態にある。これらの患者についても、ＣＳＦ−１の投
与により免疫抑制が逆転され得るであろう。

【００２９】一般に、化学療法、骨髄移植、又は疾患
（例えば後天性免疫不全症候群）のごとき他の偶然的な
形の免疫抑制のいずれかにより免疫抑制にかかっている
すべての対象は、薬理学的使用のためＣＳＦ−１の入手
可能性により利益を得るであろう。さらに、生来的な系
のそれを補足するために、ＣＳＦ−１により処理された
骨髄又は他の適当な調製物のインビトロ培養により生産
されるすでに分化したマクロファージの増加した量を患
者に提供することができよう。これらの調製物には、培
養され、そして局所療法又は全身療法のために返還され
得る患者自身の血液単球の調製物が含まれる。

【００３０】マクロファージによるリンホカインの生産
を刺激し、そして標的細胞を殺す能力を増強するＣＳＦ
−１の能力はまた、新生物及び感染の治療においてＣＳ
Ｆ−１を直接有用なものとしている。ＣＳＦ−１はネズ
ミ由来マクロファージによるインターフェロンの生産を
刺激し〔Ｆｌｅｉｔ，Ｈ．Ｂ．等Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．（１９８１）１０８：３４７〕、そしてＭＩ
ＡＰａＣａ細胞からのヒトの部分的に精製されたＣＳＦ
−１は、後に示すように、ヒト単球からのインターフェ
ロン及びＴＮＦのポリＩＣ−誘導生産を刺激する。さら
に、ＣＳＦ−１はヒト血液単球によるミエロイドＣＳＦ
の生産を刺激する。

【００３１】さらに、ネズミ肉腫ＴＵ５標的を殺すため
に正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＷマウス末梢マクロファージを刺激
するネズミＣＳＦ−１（Ｌ−細胞−条件化培地から）の
能力の証明を下記に示す。この活性は、ＣＳＦ−１が前
処理として、そしてエファクター期間の間に使用される
場合に最も有効である。これを行うＣＳＦ−１の能力
は、後で図９に示す他のコロニー刺激因子により示され
るそれよりも非常に大きい。さらに、ウイルスを攻撃す
るネズミ細胞の能力はＣＳＦ−１により非常に増強され
る。

【００３２】ネズミＣＳＦ−１は、Ｐ８１５腫瘍細胞
（Ｗｉｎｇ，Ｅ．Ｊ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．（１９８２）６９：２７０）に対して制細胞的であ
るようにネズミマクロファージを刺激するとして、又は
他の白血病標的を殺さない（Ｒａｌｐｈ，Ｐ．等、Ｃｅ
ｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）７６：１０）とし
て、一貫性なしに報告されている。Ｎｏｇａｗａ．Ｒ．
Ｔ．等、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）５
３：１１６は、ＣＳＦ−１が酵母を摂食しそして殺すよ
うにマクロファージを刺激することを報告している。

【００３３】従って、免疫抑制それ自体の克服に加え
て、ＣＳＦ−１は、マクロファージの分泌及び活性の刺
激により間接的に侵入生物又は悪性細胞を破壊するため
使用され得る。この発明のＣＳＦ−１は、蛋白質物質の
投与のために当業界において標準的な常法において製剤
化され得る。注射による投与が好ましく、製剤は溶液も
しくは懸濁液、乳剤、又は注射可能に再構成するための
固体組成物を包含する。適当な賦形剤は例えばリンゲル
溶液、ハンク溶液、水、塩溶液、グリセリン、デキスト
ロース溶液等を包含する。さらに、この発明のＣＳＦ−
１を該当する反応を刺激するために細胞の調製物と共に
プレインキュベートし、そして全調製物又はその上清を
対象に導入することができる。

【００３４】後に示すように、ＣＳＦ−１刺激に反応し
て種々のタイプの血液細胞により生産される物質は所望
の標的に対して効果的であり、そして侵入ウイルス又は
新生物を攻撃するこれらの血液細胞自体の性質が増強さ
れるであろう。対象自体の細胞を取り出し、そしてこの
方法において使用することができ、あるいは例えば、他
の適合性個体からの単球又はリンパ球をインキュベーシ
ョンにおいて使用することができる。

【００３５】ＣＳＦ−１と称する活性のパターンの存在
はしばらくの間知られているが、対応する蛋白質は配列
決定を可能にするのに十分な純度及び十分な量において
も、有用な療法的機能を得るのに十分な純度及び量にお
いても得られていない。完全に純粋な実際的量の蛋白質
も、そのコード配列も得られていないので、上記Ａ項に
おいて記載したような代替物を提供するために構造への
変形を最適にすることも不可能であり、療法的観点にお
いてこの蛋白質を使用することも不可能であった。

【００３６】この発明はこれらの欠点を補う。種々の追
加の精製手順を通して、若干のアミノ酸配列を提供する
のに十分な純度のＣＳＦ−１が人尿から得られ、従って
ＤＮＡオリゴマープローブの造成が可能となった。この
プローブは完全蛋白質のコード配列を得るのに有用であ
る。下に例示される１つの方法は、適当なコード配列部
分を得るためにヒトゲノムライブラリーをプローブする
ためにヒトＮ−末端配列について設計されたプローブを
用いる。

【００３７】ヒトゲノムクローン化配列はそれ自体の制
御配列を用いて直接に、又はイントロンをプロセシング
することができる哺乳類系に適する造成物中で発現され
得る。ＣＳＦ−１を生産するセルラインから得られたヒ
トｃＤＮＡライブラリーのためのプローブとしてゲノム
配列を使用してこの蛋白質をコードするｃＤＮＡが得ら
れる。ｃＤＮＡは、適切に調製された場合、ＣＯＳ又は
ＣＶ−１細胞中で直接発現することができ、また広範囲
の宿主中での発現に適するベクターに造成することがで
きる。

【００３８】従って、これらの道具はヒトＣＳＦ−１の
ための完全コード配列を提供することができ、これから
種々の宿主系に適する発現ベクターを造成することがで
き、そしてコード配列が発現される。入手し得る種々の
宿主及び該宿主のために適当な発現ベクターが翻訳後プ
ロセシング系中の、及びこうして生産された蛋白質のコ
ンホーメーション制御をもたらす環境因子の選択を可能
にする。

【００３９】Ｃ．適当な宿主、制御系及び方法 一般に、組換形のＣＳＦ−１の製造は次のことを含む：
まず、成熟（ここでは、すべてのミューティンを含む意
味で使用される）蛋白質、プレ蛋白質、又はＣＳＦ−１
蛋白質とその活性を破壊しない追加の配列又は制御され
た条件下（例えばペプチダーゼによる処理）で開裂され
て活性な蛋白質をもたらす追加の配列との融合体をコー
ドするＤＮＡを得る。配列がイントロンにより中断され
ていない場合、これは任意の宿主中での発現のために適
当である。

【００４０】イントロンが存在する場合、これらをプロ
セシングすることができる哺乳動物系又は他の真核生物
系において発現が得られる。この配列は切り出し可能で
あり且つ回収可能な形であるべきである。次に、切り出
され又は回収されたコード配列は複製可能な発現ベクタ
ー中で適当な制御配列と作用可能に連結される。このベ
クターが適当な宿主を形質転換するために使用され、そ
して形質転換された宿主が組換ＣＳＦ−１の生産を行う
のに好都合な条件下で培養される。

【００４１】場合によっては、ＣＳＦ−１が培地から又
は細胞から単離される。幾らかの不純物が許容される幾
つかの場合においては、蛋白質の回収及び精製は必要で
ない。例えば、対象に投与するためにリンホカイン因子
が単離されるであろう細胞のインビトロ培養のためには
完全な純度は必要でない。しかしながら、対象に投与す
ることによる療法における直接的使用は、言うまでもな
く生産されたＣＳＦ−１の精製を必要とするであろう。

【００４２】上記の段階のそれぞれは種々の方法で行う
ことができる。例えば、所望のコード配列は、細胞性メ
ッセンジャーから適当なｃＤＮＡを調製し、そしてこの
ｃＤＮＡを操作して完全配列を得ることにより、得るこ
とができる。別の方法として、ゲノム断片を得、そして
適切な宿主中で直接使用することができる。種々の宿主
中で作用可能な発現ベクターの造成は、後に記載するよ
うに、適切なレプリコン及び制御配列を用いて行われ
る。天然に得られなければ適当な制限部位をコード配列
の末端に付加して、これらのベクターに挿入するために
切出し可能な遺伝子を得ることができる。

【００４３】制御配列、発現ベクター、及び形質転換法
は遺伝子を発現するために使用される宿主細胞のタイプ
に依存する。一般に、原核細胞、酵母、又は哺乳類細胞
が現在のところ宿主として有用である。天然ＣＳＦ−１
はグリコシル化されたダイマーとして分泌されるので、
適切な翻訳後プロセシングを行うことができる宿主系が
好ましい。

【００４４】従って、一般に、原核性宿主が組換蛋白質
の生産のために最も効率的でありそして便利であるが、
これらのプロセシングが可能であるためには真核細胞、
そして特に哺乳類細胞が好ましい。細菌により生産され
る組換ＣＳＦ−１はインビトロでのダイマー化を必要と
するであろう。さらに、天然シグナル配列が哺乳類細胞
によって確認され、分泌を可能にし、そしてそれ故に精
製を容易にするであろうという一層の革新が存在する。

【００４５】Ｃ．１．制御配列及び対応する宿主 原核生物は最もしばしばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種
々の株によって代表される。しかしながら、他の微生物
株、例えばバシルス、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の色々な種、又は他の細菌
株を使用することもできる。このような原核系において
は、宿主と適合性の種に由来する複製部位及び制御配列
を含有するプラスミドベクターが使用される。例えば、
Ｅ．コリは典型的には、Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ
（１９７７）２：９５によってＥ．コリ種から誘導され
たプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質
転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性の遺伝子を含有し、そしてそれ故に所望の
ベクターの造成において維持され得るか又は破壊され得
る追加のマーカーを提供する。

【００４６】この明細書において転与開始のためのプロ
モーター、場合によってはオペレーター、及びリボゾー
ム結合部位配列を含むものとして定義される、一般に使
用される制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーター系〔Ｃｈａ
ｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６〕
及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
（１９８０）８：４０５７〕、並びにＰ_L プロモーター
及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位〔Ｓｈｉｍａｔａｋ
ｅ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８〕（こ
れは、米国特許No. ４，７１１，８４５明細書中に記載
されているように、ポータブル制御カセットとして有用
にされている）のごとき一般に使用されるプロモーター
を包含する。しかしながら、原核生物と適合性の任意の
入手可能なプロモーター系を使用することができる。

【００４７】細菌に加えて、真核性微生物、例えば酵母
を宿主として使用することもできる。パン酵母サッカロ
ミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験室株が最も使用される。
但し、他の多くの株も一般に入手可能である。２ミクロ
ン複製開始点を用いるベクターが例示される〔Ｂｒｏａ
ｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ．（１９８３）１０
１：３０７〕が、酵母での発現に適当な他のプラスミド
ベクターが知られている〔例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍ
ｂ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：３９、Ｔｓｃ
ｈｅｍｐｅ等、Ｇｅｖｅ（１９８０）１０：１５７、及
びＣｌａｒｋｅ，Ｌ．等Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ．（１９８
３）１０１：３００〕。

【００４８】酵母ベクターのための制御配列は、解糖系
酵母の合成のためのプロモーターを包含する〔Ｈｅｓｓ
等、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｑ．（１９６８）
７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（１９７８）１７：４９００〕。当業界において知
られている他のプロモーターは、３−ホスホグリセレー
トキナーゼのためのプロモーター〔Ｈｉｔｚｅｍａｎ
等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２
０７３〕、並びに他の解糖系酵母、例えばグリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラク
トキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナ
ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのそれを包
含する。

【００４９】転写が増殖条件により制御されるという追
加の利点を有する他のプロモーターはアルコールデヒド
ロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファター
ゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及
びガラクトースの資化を担当する酵母（Ｈｏｌｌａｎ
ｄ、前掲）のためのプロモーター領域である。さらに、
コード配列の３′末端にターミネーター配列が望ましい
と信じられる。このようなターミネーターは、酵母由来
遺伝子のコード配列に続く３′非翻訳領域中に見出され
る。例示されるベクターの多くが、エノラーゼ遺伝子含
有プラスミドｐｅｎｏ４６〔Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．
等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：１
３８５〕由来の制御配列又はＹＥｐ１３〔Ｂｒｏａｃ
ｈ，Ｊ．等、Ｇｅｎｅ（１９７８）８：１２１〕から得
られたＬＥＵ２遺伝子を含有するが、しかしながら、酵
母に適合性のプロモーター、複製開始点及び他の制御配
列を含有する任意のベクターが適当である。

【００５０】言うまでもなく、多細胞生物由来の真核性
宿主細胞培養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を
発現させることも可能である。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ、アカデミックプレス、Ｃｒｕｚ及びＰ
ａｔｔｅｒｓｏｎ編集（１９７３）を参照のこと。有用
な宿主細胞系はネズミ骨髄腫Ｎ５１，ＶＥＲＯ及びＨｅ
ｌａ細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を含有する。

【００５１】このような細胞の発現ベクターは通常、哺
乳類細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、例えば
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からの初期及び後期
プロモーター〔Ｆｉｅｒｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７
８）２７３：１１３〕、又は他のウイルスプロモータ
ー、例えばポリオーマ、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫
ウイルスもしくはトリ肉腫ウイルス、あるいは免疫グロ
ブリンプロモーター及びヒートショックプロモーターを
包含する。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的観点は１
９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌの米国特許N
o. ４，３９９，２１６に記載されている。

【００５２】さらに、今や“エンハンサー”領域が発現
を最適化するために重要なようであり、これらは一般に
プロモーター領域の上流に見出される配列である。必要
であれば、ウイルス源から複製開始点を得ることができ
る。しかしながら、染色体への組み込みが真核生物にお
けるＤＮＡの複製のための一般的な機構である。今や植
物細胞も宿主として利用可能であり、そして植物細胞と
適合性の制御配列、例えばノパリン合成酵素プロモータ
ー及びポリアデニレーションシグナル配列〔Ｄｅｐｉｃ
ｋｅｒ，Ａ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．（１
９８２）１：５６１〕が利用可能である。

【００５３】Ｃ．２．形質転換 使用される宿主細胞に依存して、これらの細胞に適する
標準的技法を用いて形質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ，
Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）（１９７２）６９：２１１０により記載され
ているような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理
が原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他の細胞の
ために使用される。若干の植物細胞のためにはアグロバ
クテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）〔Ｓｈａｗ，Ｃ．
Ｈ．等、Ｇｅｎｅ（１９８３）２３：３１５〕による感
染が用いられる。このような細胞壁を有しない哺乳類細
胞についてはＧｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カ
ルシウム沈澱法が好ましい。酵母への形質転換は、Ｖａ
ｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｐ．等、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９
７７）１３０：９４６、及びＨｓｉａｏ，Ｃ．Ｌ．等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
（１９７９）７６：３８２９の方法に従って行われる。

【００５４】Ｃ．３．ナサンブロットによるｍＲＮＡの
プロービング： ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのプローブ 変性剤としてホルムアルデヒド〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓ
ｓ，２０２−２０３頁〕又は１０mMメチル水銀（ＣＨ₃
ＨｇＯＨ）〔Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．等Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．（１９７６）７０：７５−８５：及びＳｅ
ｈｇａｌ，Ｐ．Ｂ．等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８
８：９５−９７〕を用いる十分な還元条件下でのアガロ
ース・スラブ・ゲル電気泳動により、ＲＮＡをナサンブ
ロットのために分画する。メチル水銀ゲルのため、ラン
ニング緩衝液（１００mM硼酸、６mM硼酸ナトリウム、１
０mM硫酸ナトリウム、１mMＥＤＴＡ，pH８．２）中でア
ガロースを溶融し、６０℃に冷却し、そして１／１００
容量の１Ｍ ＣＨ₃ ＨｇＯＨを添加することにより１．
５％ゲルを調製する。

【００５５】ＲＮＡを０．５×ランニング緩衝液に溶解
し、そして１０mMメチル水銀中で室温にて１０分間イン
キュベートすることにより変性する。グリセリン（２０
％）及びブロモフェノールブルー（０．０５％）を加え
てサンプルを負荷する。緩衝液を循環させながら５００
〜６００ボルト−時で電気泳動する。電気泳動の後、ゲ
ルを１０mM２メルカプトエタノール中で４０分間洗浄し
てメチル水銀を脱毒し、そしてＲＮＡをゲルからメンブ
ランフィルターに移すことによりナサンブロットを調製
する。

【００５６】ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーを、コロ
ニー又はプラークハイブリダイゼーション法を用いてス
クリーニングする。細菌コロニー又はファージのプラー
クを２枚のニトロセルロース濾紙（Ｓ＆ＳタイプＢＡ−
８５）に上げる。５００mMＮａＯＨ及び１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌで５分間ずつ逐次的に処理することにより、プラー
ク又はコロニーを溶解し、そしてフィルターに固体す
る。フィルターを、５分間ずつ２回、５×標準塩クエン
酸塩（ＳＳＣ）で洗浄し、そして空気乾燥し、そして８
０℃にて２時間加熱（ｂａｋｅ）する。

【００５７】ナサンブロット用ゲル又はｃＤＮＡもしく
はゲノムスクリーニング用２枚の濾紙を、２５〜４２℃
にて６〜８時間、フィルター当り１０mlのプローブを含
まないＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液〔０−５０
％ホルムアミド、５〜６×ＳＳＣ（pH７．０）、５×デ
ンハート溶液（ポリビニルピロリドン＋フィコール及び
ウシ血清アルブミン；１×＝０．０２％ずつ）、２０〜
５０mMリン酸ナトリウム緩衝剤（pH７．０）、０．２％
ＳＤＳ、２０μｇ／mlポリＵ（ｃＤＮＡをプローブする
場合）、及び５０μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡ〕とプレ
ハイブリダイズせしめる。次に、キナーゼ処理された
（オリゴマーについて）プローブを含有するハイブリダ
イゼーション緩衝液を用いて適当な温度での約２４〜３
６時間のインキュベーションにより、サンプルをハイブ
リダイズせしめる。一層長いｃＤＮＡ又はゲノム断片プ
ローブはニックトランスレーションにより又はプライマ
ー延長によりラベルされた。

【００５８】プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションの両者の条件は望まれるストリンジェン
シー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に依存し、そして例えば
プローブの長さにより異る。比較的長い（例えば３０〜
５０ヌクレオチド以上）プローブのための典型的な条件
は４２〜５５℃の温度及び約２０〜５０％のホルムアミ
ドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いる。約１
５ヌクレオチドのオリゴマープローブのために必要とさ
れる一層低いストリンジェンシーのためには、約２５℃
〜４２℃の一層低い温度及び一層低いホルムアミド濃度
（０％〜２０％）を用いる。長いプローブについては、
フィルターを例えば３０分間ずつ４回、各場合に４０℃
〜５５℃にて２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ及び５０mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH７）により洗浄し、次に０．
２×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳにより２回洗浄し、空気
乾燥し、そして−７０℃にて２〜３日間オートラジオグ
ラフ処理する。洗浄条件は、より短いプローブについて
は幾分苛酷である。

【００５９】Ｃ．４．ベクターの造成 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクタ
ーの造成は、当業界においてよく理解されている標準的
連結及び制限酵素処理技法を用いる。単離されたプラス
ミド、ＤＮＡ配列、又は合成オリゴヌクレオチドが開裂
され、仕立てられ、そして所望の形に再連結される。

【００６０】部位特異的ＤＮＡ開裂は、適当な制限酵素
（１種類又は複数種類）を用いて当業界において一般に
理解されている条件下で行われ、その詳細はこれらの商
業的に入手可能な制限酵素の製造者により記載されてい
る。例えば、ニューイングランドビオラブスの製品カタ
ログを参照のこと。一般に、約１μｇのプラスミド又は
ＤＮＡ配列が２０μｌの緩衝液中で１ユニットの酵素に
より開裂され、この発明の例においては典型的にはＤＮ
Ａ基質の完全な消化を保証するために過剰の制限酵素が
使用される。

【００６１】約３７℃における約１〜２時間のインキュ
ベーション時間が実行可能であるが、変更することも許
容される。各インキュベーションの後、フェノール／ク
ロロホルムによる抽出により蛋白質を除去し、そしてそ
の後でエーテル抽出を行い、そして核酸をエタノールを
用いる沈澱により水性画分から回収する。所望により、
標準的技法を用いてポリアクリルアミドゲル又はアガロ
ースゲル電気泳動により、開裂された断片のサイズ分離
を行うことができる。サイズ分離の一般的記載がＭｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６
５：４９９−５６０に見出される。

【００６２】制限開裂された断片は、４種類のデオキシ
ヌクレオチドトリホスクェート（ｄＮＴＰ）の存在下で
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）により、５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．６），５０mM
ＮａＣｌ，６mM ＭｇＣｌ₂ ，６mM ＤＴＴ及び５〜１
０μＭ ｄＮＴＰ中２０〜２５℃にて約１５〜２５分間
のインキュベーション時間を用いて、平滑末端化するこ
とができる。Ｋｌｅｎｏｗ断片は５′接着末端において
フィルインするが、４種類のｄＮＴＰが存在する場合で
も突出３′単鎖をチューバックする。所望により、接着
末端の種類により決定される制限内で唯一の又は選択さ
れたｄＮＴＰを供給することにより選択的修復を行うこ
とができる。Ｋｌｅｎｏｗで処理した後、混合物をフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱
を行う。Ｓ１ヌクレアーゼによる適当な条件下での処理
が単鎖部分の加水分解をもたらす。

【００６３】合成オリゴヌクレオチドはＭａｔｔｅｕｃ
ｃｉ等〔Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｃ．（１９８１）１
０３：３１８５−３１９１〕のトリエステル法により、
又は自動合成法を用いて調製することができる。アニー
リングに先立つ、又はラベル化のための単鎖のキナーゼ
処理は、過剰の、例えば１nmolの基質に対して約１０ユ
ニットのポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５０mM
Ｔｒｉｓ（pH７．６），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，５mMジチ
オスレイトール、１〜２mM ＡＴＰの存在下で達成され
る。キナーゼ処理がプローブのラベル化のためのもので
あれば、ＡＴＰ高比活性３２γＰを含む。

【００６４】連結は１５〜３０μｌの容積中で次の標準
的条件及び温度のもとに行われる：２０mM Ｔｒｉｓ−
Ｃｌ（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＤＴ
Ｔ，３３μｇ／ml ＢＳＡ，１０mM−５０mM ＮａＣ
ｌ；及び０℃にて４０μＭＡＴＰ，０．０１−０．０２
（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（“接
着末端”連結の場合）、又は１４℃にて１mM ＡＴＰ，
０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（平滑末端連結の場合）。分子間“接着末端”
連結は、３３〜１００μｇ／mlの合計ＤＮＡ濃度（５〜
１００nM合計末端濃度）で通常行われる。分子間平滑末
端連結（通常、１０〜３０倍過剰のリンカーを用いる）
は１μＭの合計末端濃度において行われる。

【００６５】“ベクター断片”を用いるベクターの造成
において、５′リン酸を除去しそしてベクターの再連結
を防止するため、ベクター断片は一般に細菌アルカリホ
スファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡＰ消化はpH８
にて約１５０mMのＴｒｉｓ中で、Ｎａ⁺ 及びＭｇ⁺²の存
在下でベクターμｇ当り約１ユニットのＢＡＰを用いて
６０℃にて約１時間行われる。核酸断片を回収するた
め、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そし
てエタノール沈澱を行う。別の方法として、不所望の断
片の追加の制限酵素消化により二重消化されたベクター
において再連結を防止することができる。

【００６６】Ｃ．５．ＤＮＡ配列の変更 ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のベクターの配列の変更
を必要とする部分のため、部位特異的プライマー指令変
異誘発を用いる。この技法は当業界において標準的なも
のであり、そして所望の変異を代表する限定されたミス
マッチを除き変異誘発されるべき単鎖ファージＤＮＡに
相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行
われる。要約すれば、ファージに対して相補的な鎖の合
成を指令するためにプライマーとして合成オリゴヌクレ
オチドが使用され、そして生ずる２本鎖ＤＮＡがファー
ジ支持性宿主微生物に形質転換される。形質転換された
細菌の培養物を上層寒天にプレートし、ファージを担持
する単一細胞からのプラーク形成を可能にする。

【００６７】理論的には、新しいプラークの５０％が変
異形を単鎖として有するファージを含有し、５０％がも
との配列を含有するであろう。プラークをキナーゼ処理
された合成プライマーと、正確なマッチのハイブリダイ
ゼーションを許容するがもとの鎖とのミスマッチがハイ
ブリダイゼーションを回避するのに十分な温度において
ハイブリダイズせしめる。次に、プローブとハイブリダ
イズするプラークを拾い、培養し、そしてＤＮＡを回収
する。部位特異的変異法の詳細を特定の例において下記
する。

【００６８】Ｃ．６．造成の確認 下記の造成において、プラスミド造成のための正しい連
結は、まずＥ．コリＭＭ２９４株又は他の適当な宿主を
連結混合物により形質転換することにより確認される。
好結果の形質転換体は、当業界において理解されている
ように、プラスミド造成の方法に依存して、アンピシリ
ン、テトラサイクリン又は他の抗生物質に対する耐性に
より、あるいは他のマーカーを用いて、選択される。

【００６９】次に、形質転換体からのプラスミドが、場
合によってはクロラムフェニコール増幅〔Ｃｌｅｗｅｌ
ｌ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７２）
１１０：６６７〕の後に、Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６
９）６２：１１５９の方法に従って調製される。単離さ
れたＤＮＡは制限処理により分析され、そして／又はＳ
ａｎｇｅｒ，Ｆ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９７７）７４：５４６３により
記載されＭｅｓｓｉｎｇ等Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．（１９８１）９：３０９によりさらに記載さ
れたジデオキシ法により、又はＭａｘａｍ等Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：
４９９の方法により配列決定される。

【００７０】Ｃ．７．宿主の例示 この発明でクローニング及び発現において使用される宿
主株は次の通りである。クローニング及び配列決定のた
め、並びにほとんどの細菌プロモーターの制御のもとで
の造成物の発現のため、Ｅ．コリ・ゼネティックストッ
クセンターＧＣＳＣ＃６１３５から得られるＥ．コリＭ
Ｍ２９４株を宿主として使用した。Ｐ_LＮ_RBS プロモー
ターの制御のもとでの発現のため、Ｅ．コリＫ１２株Ｍ
Ｃ１０００ラムダ溶原株、Ｎ₇ Ｎ_53C Ｉ８５７ Ｓｕｓ
８０，ＡＴＣＣ ３９５３１が使用される。

【００７１】Ｍ１３ファージ組換体のため、ファージ感
染に対して感受性のＥ．コリ株、例えばＥ．コリＫ１２
株ＤＧ９８が使用される。ＤＧ９８株は、１９８４年７
月１３日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号３９７
６８を有する。哺乳類発現はＣＯＳ−７及びＣＶ−１細
胞で行われた。

【００７２】Ｄ．好ましい態様 この発明の組換ＣＳＦ−１は、類似であるがしかし必ず
しも同一ではない一次アミノ酸配列を有し、そのすべて
がＣＳＦ−１に特徴的な活性パターンを示すか又はその
ような活性パターンを示すミューテインに特異的に開裂
され得る一セットのミューテインであると考えることが
できる…すなわち、これらは支配的に単球に分化するよ
うに骨髄細胞を刺激することができ、そして定義の項で
前記したように、天然ＣＳＦ−１に対して生じた抗体及
びＣＳＦ−１活性と関連するリセプターと免疫反応性で
ある。しかしながら、これらのミューテインの幾つかの
具体例が好ましい。

【００７３】ｍＣＳＦ−１について図７及び８に示す一
次配列は要求される活性を有し、そして言うまでもなく
好ましい具体例に属する。さらに、ｍＣＳＦ−１中の１
又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換によって配列
のある部分が変化しているミューテインが好ましい。
“保存的”アミノ酸置換は、蛋白質の活性特性を変化せ
しめずそして一般に交換された２つの残基の側鎖の化学
的類似性により特徴付けられるそれを意味する。

【００７４】例えば、酸性残基は他の酸性残基により、
塩基性残基は塩基性残基により、疎水性残基は疎水性残
基により、バルキーな残基はバルキーな残基により、等
々で保存的に置き換えられる。要求される類似性の程度
は、言うまでもなく置換が行われるアミノ酸の臨界性及
びその性質に依存する。すなわち、一般に、システイン
のための好ましい置換はセリン及びアラニンであり；ア
スパラギン酸のためにはグルタミン酸であり；リジン又
はアルギニン残基のためにはヒスチジン、ロイシン、イ
ソロイシン又はバリンであり；トリプトファン残基のた
めにはフェニルアラニン又はチロシンであり；等々であ
る。

【００７５】変化に対して最も耐えられるＣＳＦ−１蛋
白質の領域は、ヒト及びマウス種間の既知の低相同性領
域（残基１５−２０及び７５−８４）；蛋白質分解的開
裂に対する感受性を提供する領域（残基５１と５２、及
び残基１９１−１９３）；ジスルフィド結合に関与しな
いシステイン、又は活性のために絶対的に必須ではない
領域（残基１５８−２２４）である。

【００７６】従って、ｍＣＳＦ−１の位置１５８及び２
２４の間（１５８及び２２４を含む）の１もしくは複数
のアミノ酸及び／又はアミノ酸の１もしくは複数の配列
の欠失又は保存的置換により特徴付けられるＣＳＦ−１
ミューテインが特に好ましい。さらに、ｍＣＳＦ−１の
位置５１及び５２、及び／又は位置１９１，１９２及び
１９３の１又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換に
より特徴付けられるものが好ましい。これらは見かけ上
低い相同様の領域を代表するので、他の好ましい１セッ
トの具体例はｍＣＳＦ−１の位置１５−２０及び／又は
位置７５−８４における１又は複数のアミノ酸の欠失又
は保存的置換により特徴付けられるものである。なお、
特許請求の範囲において、「アミノ酸配列に対して１も
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加され
ているアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、図７
に示す２２４個のアミノ酸から成るヒト−コロニー刺激
因子−１のアミノ酸配列に対して１もしくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失及び／又は付加されているアミノ酸配
列を有するポリペプチドであって、ヒト−コロニー刺激
因子−１の生物学的活性を有しており、且つ例えば部位
特定変異誘発法等、自体周知の方法により修飾できる程
度の数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
るものを意味する。

【００７７】さらに、ジスルフィド結合の形成のために
必須でない任意の部位のシステイン残基の欠失又は保存
的置換により特徴付けられるミューテインも好ましい。
さらに、ｍＣＳＦ−１の位置５９のチロシン残基の欠失
又は置換、特にアスパラギン酸残基による置換により特
徴付けられる蛋白質が好ましい。

【００７８】Ｅ．ヒトＣＳＦ−１のクローニング及び発
現 次に、ヒトＣＳＦ−１のコード配列を得、この配列を発
現ベクター中に配置し、そして目的蛋白質の発現を得る
のに使用した方法を例示する。

【００７９】Ｅ．１．天然ヒトＣＳＦ−１の精製及びプ
ローブの設計 人尿ＣＳＦ−１をＤａｓ，Ｓ．Ｋ．等Ｂｌｏｏｄ（１９
８１）５８：６３０により記載されている標準的方法に
より部分精製し、そしてセファロースＢカラムに付加さ
れたＹＹＧ１０６と称するネズミＣＳＦ−１に対するラ
ットモノクローナル抗体を用いてアフィニティー精製段
階を行った。精製の最終段階に、０．１％ＴＦＡ／３０
％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ／６０％アセトニト
リル緩衝液系中の逆相ＨＰＬＣであった。

【００８０】ホルボールミリステートアセテートと共に
インキュベートすることにより無血清生産されたＭＩＡ
ＰａＣａ ＣＳＦ−１について、細胞上清をリン酸カル
シウムゲルクロマトグラフィー〔Ｄａｓ（前掲）によ
る〕にかけ、次にレンズ豆レクチンを用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィー（ＤａｓのＣｏｎＡアフィニテ
ィー段階に代えて）を行い、そして次にセファロースＢ
に接合したＹＹＧ１０６モノクローナル抗体を用いる免
疫アフィニティー段階、及び逆相ＨＰＬＣ（いずれも上
記の通り）にかけた。

【００８１】均一に精製された尿からの蛋白質及びＭＩ
ＡＰａＣａ蛋白質を自動化シーケンサー上でのエドマン
分解を用いるアミノ酸配列決定にかけた。図３に示すプ
ローブの造成を可能にするのに十分なヒトＣＳＦのＮ−
末端配列を決定した。

【００８２】Ｅ．２．ヒトゲノム配列の調製 ヒト蛋白質のＮ−末端配列をコードするように設計され
たプローブを用いて、λファージ・シャロン４中のＭａ
ｎｉａｔｉｓヒトゲノムライブラリーから、ＣＳＦ−１
をコードするヒトゲノム配列を得た。ヒト−ゲノムのＨ
ａｅIII ／ＡｌｕＩ部分消化、ＥｃｏＲＩリンカーへの
連結、及びＥｃｏＲＩ消化されたシャロン４ファージへ
の前記断片の挿入を用いてライブラリーを造成した。上
記のプローブとのハイブリダイゼーションにより判定さ
れた、ＣＳＦ−１配列を含有しそしてｐＨＣＳＦ−１と
命名されたシャロンファージが、１９８５年４月２日に
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）に寄託され、そして受託番号４０１７７を有す
る。

【００８３】このファージのその後の研究の際、再配置
（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）及び／又は除去が起
こり、そして正しい配列が維持されなかったことが見出
された。従って、同様にしてゲノムライブラリーから得
られ、そして複製中の安定性が増殖によって確認された
他のコロニーがｐＨＣＳＦ−ａと命名され、そして１９
８５年５月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番
号４０１８５が与えられた。ｐＨＣＳＦ−１ａは１８kb
の挿入部を含有し、そしてやはりプローブにハイブリダ
イズすることができ、そして下記のようにして配列決定
及び追加のプローブ造成のために使用された。もしＣＳ
Ｆ−１コード配列が完全な形で存在すれば、その存在は
Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ（１９８１）２３：１
７５により記載されているようにしてＣＯＳ−７細胞中
での発現によって証明され得る。

【００８４】試験断片を、ＳＶ４０の複製開始点を含有
するように変形されたｐＢＲ３２２由来のプラスミド
〔ｐＧＲＩ，Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐ
ｐｌ．Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：１６５−１７５〕中
にクローン化した。生じた高コピー数ベクターをＣＯＳ
−７細胞に形質転換し、そしてＣＳＦ−１遺伝子の発現
を２４，４８、及び７２時間後に、Ｄａｓ（前掲）によ
り記載されたラジオリセプターアッセイ法によりアッセ
イする。発現は天然ＣＳＦ−１制御配列の制御のもとに
ある。この方法により試験されたｐＨＣＳＦ−１ａの約
１８kbの挿入部のＨｉｎｄIII 消化物は発現に失敗し、
従ってＨｉｎｄIII が遺伝子を消化したことが示され
た。これは、その後のマッピングにより確認された。

【００８５】しかしながら、最初の配列決定のため、
３．９kbのＨｉｎｄIII 断片をｐＨＣＳＦ−１ａファー
ジから得、そしてＭ１３クローニングベクターにクロー
ン化した。ＨｉｎｄIII 断片は部分的に配列決定され、
そしてその結果が図４〜６中に推定ペプチド配列と共に
示される。これは、図１に示すようにアミノ酸配列が決
定されているヒトＣＳＦ−１蛋白質の部分の正しいコド
ンを含む。約１４００bpのイントロンの存在が、得られ
るアミノ酸配列から推定された。さらに、アミノ酸２４
−３４をコードするゲノム配列（図４〜８中、上方に線
を付した部分を参照のこと）に基いて、ｃＤＮＡライブ
ラリーのための３２−マーのプローブを調製し、そして
下記のように使用した。

【００８６】さらに詳細には、ゲノムクローンｐＨＣＳ
Ｆ−１ａを得るため、図３中に示すオリゴマーの２つの
混合物を用いてＭａｎｉａｔｉｓライブラリーをプロー
ブした。ＥＫ１４及びＥＫ１５を選択した。但し、示さ
れている他のオリゴマーも同様に有用である。Ｎ−末端
配列のための“十分な長さの”プローブを１６種の３５
−マーの混合物として使用した。より短いオリゴマーＥ
Ｋ１５を６４種の１８−マーの混合物として使用した。
キナーゼ処理された両プローブにハイブリダイズするフ
ァージを拾い、そしてＥ．コリＤＧ９８又は他のコンピ
テント株の感染により培養した。

【００８７】ＥＫ１４及びＥＫ１５を用いるプロービン
グのための特定の条件は次の通りである。ＥＫ１４のた
めには、緩衝液は１５％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（pH
７．０）、５×デンハート、２０mMリン酸ナトリウム、
０．２％ＳＤＳ及び５０μｇ／mlの変性サケ精子ＤＮＡ
を含有した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションを４２℃にて行い、そしてフィルターを
２×ＳＳＣ中で５２℃にて洗浄した。

【００８８】ＥＫ１５のためには、ハイブリダイゼーシ
ョン及びプレハイブリダイゼーションのために同様の条
件を使用したが、但しホルムアルデヒド濃度を０％と
し、洗浄をわずかに低い温度である４２℃にて行った。
陽性にハイブリダイズするファージｐＨＣＳＦ−１ａか
ら単離された約１８kbのＤＮＡ挿入部をＨｉｎｄIII で
処理し、そして断片をＳｏｕｔｈｅｒｎの方法に従うア
ガロースゲル上での電気泳動にかけた。ゲルをニトロセ
ルロースフィルター上にレプリカし、そしてこのフィル
ターをＥＫ１４及びＥＫ１５によりさらにプローブし
た。両プローブが３．９kb断片にハイブリダイズした。

【００８９】陽性断片をゲルから切り出し、溶出し、そ
してジデオキシ配列決定のためにＨｉｎｄIII 処理され
たＭ１３ｍｐ１９にサブクローン化した。部分配列を図
４〜６に示す。下線部はヒトＣＳＦ−１のすでに決定さ
れているＮ−末端配列に正確に対応し、点記号を有する
残基はネズミ配列と相同である。図４〜６中、精製され
た蛋白質から決定されたヒト配列から推定される、アミ
ノ酸２２及び２３のコドン間の１．４kbイントロン領域
は翻訳されないで示されている。Ｎ−末端配列の上流の
配列は推定上のリーダーを含有し、ｃＤＮＡクローン
（下記参照のこと）配列決定の予備的な結果により試し
に確認された、成熟蛋白質にすぐ臨接するこのリーダー
の部分の翻訳が示される。しかしながら、上流部分は翻
訳して示されていない。これらの部分はｃＤＮＡとの比
較によりイントロンを含むことが確認される。

【００９０】約１３kbを得るための完全な１８kb遺伝子
の配列決定は、遺伝子が８個のイントロンにより分離さ
れた９個のエクソンを含有することを示す。成熟蛋白質
ｃＤＮＡの領域は、下にさらに記載するように、コドン
５９を除きゲノム・エクソンのコドンに正確に対応す
る。ＨｉｎｄIII ３．９kb断片をＰｓｔＩで消化して既
知のＮ−末端配列及び約１kbの追加の上流配列を含む１
kbＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ断片を生じさせることにより追加
のＭ１３サブクローンを得た。

【００９１】Ｅ．３．ヒトＣＳＦ−１をコードするｃＤ
ＮＡ ヒト膵臓癌セルラインＭＩＡＰａＣａ−２をｍＲＮＡの
入手源として使用してプローブの有効性を確認し、そし
てイントロンを含まない形のヒトＣＳＦ−１コード配列
を含有する。ｃＤＮＡライブラリーを形成した。ＭＩＡ
ＰａＣａセルラインは、ネズミＬ−９２９細胞に比べて
約１０倍低いレベルでＣＳＦ−１を生産する。

【００９２】血清不含有培地、すなわちＣＳＦ−１を生
産しない条件下、で維持されたＭＩＡＰａＣａ細胞から
負対照ｍＲＮＡを調製した。ＣＳＦ−１を生産する細胞
は、血清の除去の後のＣＳＦ−１生産の再誘導により得
られた。１０％のウシ胎児血清を含有するダルベコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用してローラーボトル中
で細胞をコンフルエンスに増殖せしめ、そしてＣＳＦ−
１を２０００〜６０００ユニット／ml生産せしめた。細
胞培養物を洗浄し、そして無血清で再インキュベートし
てＣＳＦ−１の生成を抑制した。負対照について、１日
又は２日後に検出可能なＣＳＦ−１は生産されなかっ
た。ホルボールミリステートアセテート（１００ng／m
l）の添加により再誘導された細胞を得て、数日後に１
０００〜２０００ユニット／mlの生産を得た。

【００９３】リボヌクレオシド・パナジル複合体〔Ｂｅ
ｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１
９７９）１８：５１４３〕の存在下での０．５％ＮＰ−
４０を含有する等張緩衝液中での細胞の溶解、並びにそ
れに続くフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈
澱及びオリゴｄＴクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを
単離し、そして濃縮されたｍＲＮＡ調整物を得た。さら
に詳細には、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化塩溶液）中で
２回洗浄し、そして１０mMのバナジル・アデノシン複合
体（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．等、前掲）を含有するＩＨ
Ｂ（１４０mMＮａＣｌ，１０mM Ｔｒｉｓ，１．５mM
ＭｇＣｌ₂ ，pH８）中に再懸濁する。

【００９４】エチレンオキシドポリマータイプのイオン
性浄剤（ＮＰ−４０）を０．５％に加えて細胞膜（しか
し核膜ではない）を溶解する。１０００×ｇにて１０分
間の遠心により核を除去する。核除去後（ｐｏｓｔ−ｎ
ｕｃｌｅａｒ）の上清を、２容量のＴＥ〔１０mM Ｔｒ
ｉｓ，１mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），pH
７．５〕飽和フェノール・クロロホルム（１：１）に加
え、そして０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
及び１０mM ＥＤＴＡに調整する。上清を４回再抽出
し、そして２，０００×ｇでの１０分間の遠心より相分
離を行う。

【００９５】サンプルを０．２５Ｍ ＮａＣｌに調整
し、２容量の１００％エタノールを添加しそして−２０
℃に貯蔵することによりＲＮＡを沈澱せしめる。ＲＮＡ
を５，０００×ｇにて３０分間ペレット化し、７０％及
び１００％のエタノールで洗浄し、そして次に乾燥せし
める。オリゴｄＴセルロース〔Ａｖｉｖ，Ｊ．等、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７２）６
９：１４０８−１４１２〕上でのクロマトグラフィーに
より全細胞質ＲＮＡからポリアデニル化（ポリＡ⁺）メ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。ＲＮＡをＥＴ
Ｓ（１０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤ
Ｓ，pH７．５）中に２mg／mlの濃度で溶解する。

【００９６】この溶液を６５℃にて５分間加熱し、そし
て４℃に急速に冷却する。ＲＮＡ溶液を室温にした後、
０．４Ｍ ＮａＣｌに調整し、そしてあらかじめ結合緩
衝液（５００mM ＮａＣｌ，１０mM Ｔｒｉｓ，１mM
ＥＤＴＡ，pH７．５，０．０５％ＳＤＳ）により平衡化
したオリゴｄＴセルロースカラムにゆっくりと通過せし
める。流過液をさらに２回カラムに通す。次に、カラム
を１０容量の結合緩衝液により洗浄する。ポリＡ⁺ ｍＲ
ＮＡをＥＴＳのアリコートにより溶出し、ＴＥ−飽和フ
ェノール・クロロホルムで１回抽出し、そして０．２Ｍ
へのＮａＣｌ及び２容量の１００％アルコールの添加に
より沈澱せしめる。ＲＮＡを２回再沈澱せしめ、そして
乾燥に先立って７０％エタノール中で１回、及び次に１
００％エタノール中で洗浄する。

【００９７】全ｍＲＮＡを、ベックマンＳＷ４０ロータ
ーを用いて２０℃及び２７，０００rpm にて１７時間、
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），１mM ＥＤＴ
Ａ及び０．５％ＳＤＳ中５〜２０重量％シュークロース
グラジェント遠心にかけた。次に、ｍＲＮＡ画分をエタ
ノール沈澱によりグラジェントから回収し、そして標準
的形質転換アッセイにおいてキセノプス（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ）の卵母細胞に注射した。

【００９８】ＲＮＡ画分の卵母細胞生成物を骨髄増殖ア
ッセイ〔Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｎ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９８３）１３１：２３７４、及びＰｒｙｓｔｏ
ｗｓｋｙ，Ｍ．Ｂ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１
９８４）１１４：１４９に記載されている〕においてア
ッセイし、そして画分それ自体をゲノム配列の第２エク
ソン（エクソンIIプローブ）中のＤＮＡに対応する３２
−マーのプローブへのドット・ブロット・ハイブリダイ
ゼーションによりアッセイした。（図４〜８中の上方の
線はエクソンIIプローブを示す。）これらの結果を図１
０に示す。

【００９９】図１０中Ａの破線はキセノプス（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ）卵母細胞からの上清の骨髄増殖アッセイにおけ
る反応を示し、図１０中Ｂはドット・ブロットの結果を
示す。最も強くハイブリダイズする画分１１は１８Ｓマ
ーカーよりもわずかに大きなサイズに相当し、他方最も
活性な画分８及び９は１４〜１６Ｓに相当する。画分
８，９、及び１１を用いて、下記のようにして濃縮され
たｃＤＮＡライブラリーを形成した。

【０１００】（ｍＲＮＡはまた、変性ホルムアルデヒド
ゲル上で画分し、ニトロセルロースに移し、そしてエク
ソンIIプローブによりプローブした。ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下でさえ、１．５kbから
４．５kbにわたるサイズの幾つかの区別される種が見出
された。ＣＳＦ−１をコードする複数遺伝子の可能性を
除去するため、種々の制限酵素によるゲノムＤＮＡの消
化物をサザンブロットにかけ、そしてｐｃＣＳＦ−１７
ＤＮＡを用いてプローブした。制限パターンはＣＳＦ−
１をコードする１個のみの遺伝子の存在と一致した。）
プローブとハイブリダイズする能力は比較的低いが最高
の骨髄増殖活性を有するグラジェント画分８及び９から
のｍＲＮＡを一緒にした。画分１１（１８Ｓよりわずか
に大きい）がプローブと最も強くハイブリダイズした。
やはりエクソンIIプローブにハイブリダイズする一層高
分子の画分は含めなかった。なぜなら、誘導されていな
いＭＩＡＰａＣａ細胞からの対応するｍＲＮＡもエクソ
ンIIプローブにハイブリダイズしたからである。

【０１０１】ｃＤＮＡライブラリーを、全ヒトｍＲＮＡ
又は濃縮されたヒトｍＲＮＡから、２つの方法で調製し
た。１つの方法はλｇｔ１０ファージベクターを用い、
そしてＨｕｙｎｎ，Ｔ．Ｖ．等、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスホー
ド、１９８４，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編、により記載されて
いる。

【０１０２】好ましい方法は、ポリＡテイルのオリゴｄ
Ｔプライミング及びＡＭＶ逆転写酵素を用い、Ｏｋａｙ
ａｍａ，Ｈ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９
８３）３：２８０−２８９を用いる。この記載を引用に
よりこの明細書に導入する。この方法は、ポリｄＧテイ
リングに比べて高い比率で十分な長さのクローンをもた
らし、そして宿主ベクターとして、その文献に記載され
ておりそして著者から容易に入手できる２つのベクター
ｐｃＤＶ１及びｐＬ１の部分を使用する。得られるベク
ターは、近位ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を含有す
るベクター断片間に挿入部を含み；このベクターはｐＢ
Ｒ３２２複製開始点、及びＡｍｐ耐性遺伝子、並びにＣ
ＯＳ−７細胞中で挿入された配列の発現を行うベクター
の能力をもたらすＳＶ４０制御要素を含有する。

【０１０３】次に、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ法によ
り上記の濃縮されたＭＩＡＰａＣａｍＲＮＡから得られ
た３００，０００個のクローンライブラリーを、エクソ
ンIIプローブを用いて高ストリンジェンシーの条件下で
プローブした。このプローブにハイブリダイズする１０
個のコロニーを拾い、そしてコロニーを精製した。こら
れのクローンを、ＣＯＳ−７細胞での一時的（ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ）発現によりＣＳＦ−１コード配列の存在に
ついてアッセイした。ＳＶ４０プロモーターを含むクロ
ーニングベクターは、ＣＯＳ−７細胞の形質転換におい
てそれ自体使用された。

【０１０４】プラスミドＤＮＡを１０個の陽性クローン
からＣｓＣｌグラジェエントを用いて精製し、そしてリ
ン酸カルシウム共沈法の変法〔Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．等、
Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１４９〕を用いて
ＣＯＳ−７細胞を形質転換した。３日間のインキュベー
ションの後、培養上清をＤａｓ，Ｓ．Ｋ．等、Ｂｌｏｏ
ｄ（１９８１）５８：６３０により開示されているのと
実質上同様にして行われるラジオリセプターアッセイ
に、及びＰｒｙｓｔｏｗｓｋｙ，Ｍ．Ｂ．等、Ａｍ．
Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８４）１１４：１４６により
開示されているのと実質的に同様にして行われるコロニ
ー刺激（骨髄増殖）アッセイにかけることにより、ＣＳ
Ｆ−１生産をアッセイした。

【０１０５】拾われた１０コロニーの内９個はＣＯＳ−
７細胞中での一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）ＣＳＦ−１
生産を示すことに失敗した。発現を示した１つのコロニ
ーを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、そして挿入部
を配列決定する。ＤＮＡ配列を推定されるアミノ酸配列
と共に図７及び８に示す。十分な長さのｃＤＮＡは１．
６４kbであり、そして２２４アミノ酸の成熟ＣＳＦ−１
蛋白質をコードする。このクローンをＣＳＦ−１７と称
し、このものはシタス寄託番号ＣＭＣＣ２３４７を有
し、そして１９８５年６月１４日に、受託番号No. ５３
１４９として、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレ
クションに寄託された。ＣＳＦ−１コードＤＮＡを有す
るプラスミドはｐｃＣＳＦ−１７と命名された。

【０１０６】Ｅ．４．ＣＳＦ−１の一時的発現 ＣＳＦ−１７からのプラスミドＤＮＡのＣＯＳ−７細胞
中での発現を、骨髄増殖アッセイ、コロニー刺激アッセ
イ及びラジオリセプターアッセイを用いて確認しそして
定量した。ＣＳＦ−１についての骨髄増殖アッセイの特
異性は活性を減少せしめるＣＳＦ−１抗血清の能力のみ
に存すること；コロニー刺激アッセイのそれが得られる
コロニーの性質に存することが思い出されよう。両アッ
セイは、ＣＳＦ−１生産がml当り数千ユニットのオーダ
ーであることを示した。

【０１０７】骨髄増殖 蛋白質の生物学的活性を測定する骨髄刺激アッセイのた
め、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの骨髄細胞を７２時間上清
の逐次稀釈物により処理し、そして細胞の増殖を、Ｍｏ
ｏｒｅ，Ｒ．Ｎ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８
３）１３１：２３７４；Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙ，Ｍ．
Ｂ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８４）１４
４：１４９により記載されているのと実質的に同様にし
て、ラベルされたチミジンの取り込みにより測定した。
誘導されたＭＩＡＰｃＣａ細胞からの培地を対照として
使用した。ＣＳＦ−１の特異性を、チミジンの取り込み
を抑制する、人尿ＣＳＦ−１に対するラビット抗血清の
能力により確認した。ｐｃＣＳＦ−１７によりトランス
フェクトされたＣＯＳ−７細胞の上清の１：１６稀釈に
おける結果を表１に示す。

【０１０８】

【表１】

【０１０９】（抗ヒトＣＳＦ−１血清はＤａｓ等、前掲
の方法により調製された。）ＭＩＡＰａＣａ上清（上に
用いられた１：１６稀釈における）は１２５Ｕ／mlのＳ
ＦＳ活性を含有し、これは未稀釈の上清中２０００Ｕ／
mlに相当した。ここで、コロニー刺激活性の１ユニット
は、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｅｄ（１９７２）７９：６５７のアッセイにおい
て、１０⁵ ／mlの骨髄細胞から１個のコロニーを生じさ
せるのに必要な量として定義される。

【０１１０】チミジンの取り込みが抗−ＣＳＦ−１血清
により阻害されるから、これらのデータは骨髄刺激活性
がＣＳＦ−１と関連していることを示している。１：８
〜１：６４の４つの稀釈において得られたこの骨髄増殖
アッセイにおける結果の回帰はＣＳＦ−１７上清中のＣ
ＳＦ−１の２３５８Ｕ／mlの予想活性を示し、これは抗
血清の存在下で４２４Ｕ／mlに減少したが、非−免疫血
清の存在下で３６９３Ｕ／mlへの見かけの増加を示し
た。これは下記のラジオリセプターアッセイにおいて示
されたレベルに匹敵した。

【０１１１】コロニー刺激 コロニー刺激についてのＣＳＦ−１７上清の直接アッセ
イ（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｅｄ、前掲）は４２８７Ｕ／mlを示し、これは非
−免疫血清の存在により実質的に影響を受けなかった
が、ラビット抗ヒトＣＳＦ−１の存在下で０Ｕ／mlに低
下した。ｐｃＣＳＦ−１７によりトランスフェクトされ
たＣＯＳ−７の上清により誘導されたコロニーの８５％
が単核形態を有し、ＭＩＡＰａＣａ上清により誘導され
たコロニーは９４％のマクロファージ−６％の顆粒球の
比率を示した。

【０１１２】ラジオリセプターアッセイ ラジオリセプターアッセイは、Ｊ７７４．２マウスのマ
クロファージ細胞上の特異的リセプターに対する ¹²⁵Ｉ
−ラベル化ＣＳＦ−１と試験化合物との間の競走を測定
する。上記のようにしてコロニー刺激活性についてアッ
セイされたＭＩＡＰａＣａ上清を標準（２０００Ｕ／m
l）として用いた。ｐｃＣＳＦ−１７でトランスフェク
トされたＣＯＳ−７の上清のＣＳＦ−１濃度は、１：１
０稀釈に基いて２４７０Ｕ／mlであり、そして１：５稀
釈に基いて３２３９Ｕ／mlであることが見出された。

【０１１３】すなわち、ｐｃＣＳＦ−１７によりトラン
スフェクトされたＣＯＳ−７細胞の培地中のＣＳＦ−１
濃度について、すべてのアッセイにおいて匹敵する値が
見出された。

【０１１４】Ｅ．５．ＣＳＦ−１の安定な発現 ＣＯＳ−７系は、ベクター配列の複製及び該配列からの
発現を許容することにより組換ＣＳＦ−１をもたらす。
ヒトＣＳＦ−１配列はまた原核系又は真核系において安
定に発現され得る。一般に、原核宿主は生産の容易さを
もたらし、他方真核細胞は天然シグナル配列の使用を許
容しそして所望の翻訳後プロセシングを行う。これはＣ
ＳＦ−１の場合に特に重要である。なぜなら、この天然
蛋白質はダイマーだからである。細菌はＣＳＦ−１をモ
ノマーとして生産し、そしてこのモノマーは抽出後にダ
イマー化条件にかけられるであろう。

【０１１５】原核性発現 原核性発現のため、ｃＤＮＡクローン、又は例えば部位
特異的変異誘発によりイントロンが切り取られたゲノム
配列を変形してＡＴＧ開始コドンをＮ−末端のグルタミ
ン酸のすぐ上流に置き、そしてこのＡＴＧのすぐ上流に
ＨｉｎｄIII 部位を置くことにより下記の標準的宿主発
現ベクターへの挿入のために便利な部位を設ける。これ
は、天然リーダー配列及びＮ−末端コード配列を両端に
有する目的のAAGCTTATG に相補的な新たな配列を含有す
る合成オリゴマーによる挿入部位特異的変異誘発を用い
て直接的に行うことができる。

【０１１６】ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇの方法を用
いて得られたｃＤＮＡについて、完全なコード配列を含
有するＤＮＡ断片をｐｃＣＳＦ−１７からＸｈｏＩによ
る消化によって切り出し（宿主クローニングベクターか
ら保持されている部位において）、アガロースゲル電気
泳動により単離し、そして電気溶出により回収する。変
異誘発を行うため、宿主バクテリオファージＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡもＳａｌＩにより処理し、そして精製された
断片と標準的条件下で連結し、そして凍結処理されたコ
ンピテントＥ．コリＫ１２株ＤＧ９８にトランスフェク
トする。

【０１１７】細胞を、シグマ社（セントルイス、ＭＯ）
から得られるイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）５×１０^-4Ｍ及びＸ−ｇａｌ４０μｇ／mlを含有す
る培地上にプレートする。非補完白色プラークを新しい
培地に拾う。ミニ−カルチュアを予想サイズの組換単鎖
ファージＤＮＡについてスクリーニングし、そして目的
の組換ファージの培養物を制限分析を用いて確認する。

【０１１８】ＣＳＦ−１配列のＮ−末端コード部分及び
リーダーコード部分と相補的であるがしかし目的のAAGC
TTATG 配列に対する相補体を含有する３４−マーを合成
し、そしてＣ．４に記載の方法に従って精製する。この
３４−マー調製物の部分を、Ｃ．４に前記したＭａｘａ
ｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ〔Ｍａｘａｍ，Ａ．等、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６
８：５２１、アカデミックプレス〕の技法の変法に従っ
て放射性ラベルする。

【０１１９】変異を行うため、上に調製された組換バク
テリオファージをＥ．コリ１２株ＤＧ９８中に調製し、
そして単鎖ファージＤＮＡを精製する。１pmole の単鎖
ファージＤＮＡ及び１０pmole の上記合成ヌクレオチド
プライマー（キナーゼ処理されていない）を、１５μｌ
の２０mM Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH８），２０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１００mM ＮａＣｌ，２０mM２−メルカプトエタノ
ール中で６７℃にて１分間そして次に３７℃にて３０分
間加熱することによりアニールする。アニールされたＤ
ＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）及び５０
０μＭ ｄＮＴＰと共に０℃にて３０分間インキュベー
トし、そして次に３７℃にする。アリコート（０．０５
又は０．２５pmole ）を５分、２０分、及び４５分後に
取り出し、Ｅ．コリＫ１２株ＤＧ９８に形質転換し、そ
してプレートする。

【０１２０】増殖の後、プレートを４℃に冷却し、そし
てプラークをＢｉｏｄｙｎｅから得られるＰａｌＩ膜又
はＳ＆Ｓフィルターにより取り上げる（第１のフィルタ
ーにおいては１〜２分間、第２のフィルターのためには
１０分間以上）。フィルターを２．５Ｍ ＮａＣｌ，
０．５Ｍ ＮａＯＨ中で変性する（５分間）。変性媒体
を３Ｍ酢酸ナトリウムによりpH５．５に、又は１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（pH７．５）によ
り中和し、フィルターを真空中８０℃にて１時間加熱
（ｂａｋｅ）し、そして次に高ストリンジェンシーにお
いてプレハイブリダイズせしめる。次に、フィルターを
上記調製されたキナーゼ処理された合成３４−マーによ
りプローブし、洗浄し、そして−７０℃にて一夜オート
ラジオグラフ処理する。

【０１２１】所望の変異したファージのＲＦ形をＥｃｏ
ＲＩで処理し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化し、そして次
にＨｉｎｄIII で消化して遺伝子をＨｉｎｄIII ／平滑
断片として切り出す。（全く類似の方法で、ｐＭＣＳＦ
からのＣＳＰ−１コード配列を得、そして変形すること
ができる。）

【０１２２】次に、ヒト（又はネズミ）ＣＳＦ−１コー
ド配列を含有するこの断片をＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ
（平滑）消化されたｐＰＬＯＰ又はｐＴＲＰ３（下記参
照のこと）と連結して、ＡＴＧ開始コドンを含有するコ
ード配列をそれぞれＰ_L プロモーター又はｔｒｐプロモ
ーターのすぐ下流に置く。これらの得られたプラスミド
をＥ．コリＭＣ１０００ラムダ溶原株又はＭＭ２９４に
形質転換し、そして次にそのプロモーターに適する手段
により誘導する。細胞を遠心により収得し、高波処理
し、そして遊離したＣＳＦ−１を可溶化する。ヒト（又
はネズミ）ＣＳＦ−１の存在は、音波処理物を前記のコ
ロニー刺激アッセイにかけることにより確認される。

【０１２３】真核性発現 ＳＶ４０プロモーターの制御のもとにヒトＣＳＦ−１を
コードするｃＤＮＡを含有するＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ
ｇプラスミドｐｃＣＳＦ−１７はまた、前記ＣＯＳ−７
セルラインがそれから誘導された親セルラインであるモ
ンキーＣＶ−１細胞での安定な発現を行うために使用さ
れ得る。宿主モンキーＣＶ−１細胞をコンフルエンスに
増殖せしめ、そして次に５００，０００細胞当り１０μ
ｇのｐｃＣＳＦ−１７及び種々の量（１，２，５、及び
１０μｇ）のｐＲＳＶ−ＮＥ０２〔Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．
等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２１：５５１−５５
３〕を用いて同時形質転換した。形質転換体を、１００
μｇ／mlのＧ４１８抗生物質（ｐＲＳＶ−ＮＥ０２プラ
スミドがこれに対する耐性を付与する）を含有する１０
％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ培地中で増殖せしめた。ＣＶ−
１セルラインは１０ ^-5.12 コロニー／１０⁶ 細胞／μｇ
ＤＮＡのＧ４１８形質転換頻度を示した。

【０１２４】ＣＶ−１細胞を上記のようにして同時形質
転換し、そしてＧ４１８含有培地中で選択した。耐性コ
ロニーをＧ４１８不含有培地中で増殖せしめそして次に
Ｇ４１８含有培地に戻すことによりＧ４１８耐性表現型
の安定性について試験した。抗生物質含有培地に戻され
た際のこれらの培養物の生存能力が、ｐＲＳＶ−ＮＥ０
２ＤＮＡが細胞ゲノムに永久的に組み込まれたことを示
唆する。マーカープラスミドにより安定に形質転換され
た細胞は、約５０％の確率で同時トランスフェクトプラ
スミドのＤＮＡを組み込んでいるから、これらの細胞の
約半数はさらにそれらの染色体のＤＮＡ中にｐｃＣＳＦ
−１７ＤＮＡを含有するであろう。

【０１２５】上記のように安定に形質転換されたことが
証明されたＣＶ−１細胞のＧ４１８耐性プールの幾つか
のクローンを拾い、そして２個のフラスコ中でコンフル
エンス近くまで増殖せしめた。各２個の内の１つのフラ
スコにＳＶ−４０ウイルスを５の感染多重度で感染せし
め、そしてラジオイムノアッセイを用いるＣＳＦ−１の
アッセイのため、感染後６日目に培地を収得した。イム
ノアッセイは、精製された人尿ＣＳＦ−１に対して生じ
た“ラビット５２”ポリクローナル抗血清に対する ¹²⁵
Ｉ−ラベル化ＭＩＡＰｃＣａＣＳＦ−１との競走に基
く。

【０１２６】選択されたＣＶ−１クローンの１つはこの
アッセイに従って２３３５Ｕ／mlのＣＳＦ−１の生産を
示し、他方ＳＶ−４０により感染されていない細胞は２
０Ｕ／ml未満を示した。１０μｇのｐｃＣＳＦ−１７に
より形質転換されたＣＯＳ−７細胞を用いる対照は、Ｓ
Ｖ−４０の感染を伴わないで２４００Ｕ／mlのＣＳＦ−
１の生産を示した。

【０１２７】ＣＳＦ−１生産性ＣＶ─１セルラインはそ
のゲノムに安定に組み込まれたｐｃＣＳＦ−１ＤＮＡを
含有し、そしてそれ故にＳＶ−４０による感染の後のＣ
ＳＦ−１の安定な生産のために使用することができる。
感染はゲノムからｐｃＣＳＦ−１７ＤＮＡを“救出”
（ｒｅｓｕｃｕｅ）し、そして救出されたＤＮＡの複製
に必要なＳＶ−４０Ｔ−抗原を提供すると予想される。
ＳＶ─４０感染がなければ、組込まれたｐｃＣＳＦ−１
７ＤＮＡは効果的に発現されない。

【０１２８】ＣＶ─１（ＣＳＦ−１７）セルラインによ
るＣＳＦ−１コード配列の発現の最適化は、１以上の感
染多重度及び１０％ＦＢＳ培地を用いるＶＳ─４０感染
の６日後のラジオイムノアッセイにより測定した場合６
５００〜８０００Ｕ／mlを示した。１０の多重度におけ
る発現の研究は匹敵する生産を示したが、しかし生産は
感染後２日目に培地からＦＢＳを除去した後減少した。

【０１２９】他の方法として、適当な制御系及び真核細
胞における発現を許容する宿主ベクターを、ＣＳＦ−１
コード挿入部を受理するために用いることができる。例
えば、同じ承継人に承継され１９８２年１１月１日に出
願された米国出願No. ４３８，９９１に記載されている
ように、ＣＨＯ細胞及び適当なベクターを使用すること
ができる。前記特許出願の記載を引用によりこの明細書
に組み入れる。

【０１３０】Ｅ．６．ＣＳＦ−１の活性 ＣＳＦ−１の活性の追加の定義が、ＣＶ−１により生産
される組換材料のモデルとして、部分精製されたＭＩＡ
ＰａＣａＣＳＦ−１又はネズミＬ細胞ＣＳＦ−１を用い
て与えられた。ＣＳＦ−１は、誘導されたヒト単球によ
るインターフェロン及び腫瘍壊死因子の生産を１０倍ま
で増強せしめることが示された。なお、本発明におい
て、インターフェロン、腫瘍壊死因子等を毒性因子と称
する。ＣＳＦ−１はまた、マクロファージ抗腫瘍毒性を
刺激することが示された。

【０１３１】ヒト単球によるＴＮＦ生産の刺激 ＭＩＡＰａＣａＣＳＦ−１を上清からリン酸カルシウム
ゲル濾過及びレンズ豆レクチンクロマトグラフィーによ
り精製した。リンホカイン生産のアッセイのため、末梢
血−付着細胞を１０⁷ 細胞ずつ収容する２本のフラスコ
中でインキュベートした。１つのフラスコは上記のよう
に精製された１０００Ｕ／mlのＣＳＦ−１により処理し
た。３日後、細胞を収得し、そして洗浄し、そして５×
１０⁵ ／mlの細胞濃度で再懸濁し、そして２４−ウエル
プレートに０．５ml／ウエルでプレートした。ウエルを
１０μｇ／mlのＬＰＳ及び２０ng／mlのＰＭＡで４８時
間処理し、そして上清をＴＮＦアッセイのために収得し
た。ＣＳＦで処理された細胞は、未処理細胞に比べて約
９倍多くのＴＮＦの分泌を示した（１６２Ｕ／mlに対し
て１５００Ｕ／ml）。

【０１３２】ヒト単球によるインターフェロン生産の刺
激 インターフェロン生産に対するＣＳＦ−１の効果を実験
するための類似の実験において、末梢血付着細胞を３日
間１０００Ｕ／mlのＣＳＦ−１の存在下及び非存在下で
前記のようにしてインキュベートし、収得し、５×１０
⁵ ／mlで再懸濁し、そして上記のようにして２５−ウエ
ルプレート中にプレートした。種々の量のポリＩＣを加
えることにより細胞をインターフェロン生産のためにイ
ンキュベートした。上清を、ＶＳＶに感染されたＧＭ２
５０４細胞に対するそれらの細胞変性効果によりインタ
ーフェロン生産についてアッセイした。ＣＳＦ−１で刺
激された細胞は、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．等、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９８４）４：１６６によ
り記載されているようにして５０μｇ／mlのポリＩＣに
より誘導された場合、１００Ｕ／mlの生産を示し、他方
同様に誘導された未処理細胞は３Ｕ／ml未満生産した。

【０１３３】ヒト単球による骨髄ＣＳＦ生産の刺激 単球を±ＣＳＦ−１にて３日間インキュベートし、そし
て表１におけるごとく骨髄ＣＳＦの生産のために誘導し
た。示されている３つの代表的な実験は異る提供者から
の血液を用した。

【０１３４】

【表２】

【０１３５】ネズミマクロファージによる腫瘍細胞殺滅
の刺激；他のコロニー刺激因子との比較 マクロファージ刺激をアッセイするために、Ｌ−細胞条
件化培地から得られたネズミＣＳＦ−１を、肉腫標的を
殺すネズミマクロファージの能力の刺激を示すアッセイ
において、ｐｃＣＳＦ−１７から組換生産されたＣＳＦ
−１のためのモデルとして使用した。このアッセイにお
いて、正常２時間付着Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス末梢マクロ
ファージをインビトロで１日間ＣＳＦ−１を伴って又は
伴わないでインキュベートし、そして次に２０：１の比
率で ³Ｈ−チミジン−ラベル化マウス肉腫ＴＵ５細胞及
び１０Ｖ／Ｖ％ｃｏｎＡ−誘導（１０ng／ml）脾臓リン
ホカイン（ＬＫ）（ガンマ−インターフェロンを含有す
る）と混合した。その後の４８時間にわたるラベル化チ
ミジンの放出を腫瘍細胞死滅の測定として用いた。１２
００Ｕ／mlのＣＳＦ−１を含有するネズミＬ−細胞条件
化培地としてのＣＳＦ−１添加の効果を次の表に示す。

【０１３６】

【表３】

【０１３７】標的細胞を殺す能力の上昇は、ＣＳＦ−１
が増殖の予備的１日の間に添加された場合又はインキュ
ベーションの間に添加された場合に認められた。しかし
ながらＣＳＦ−１がこれらの両期間中に存在した場合に
最も劇的な効果が観察された。単球及びマクロファージ
の刺激の原因としての細菌リポポリサッカライド（ＬＰ
Ｓ）の汚染の可能性は排除された。すなわち、適用され
たＣＳＦ−１のＬＰＳ含量は低く〔リムルス（ｌｉｍｕ
ｌｕｓ）アメーバ細胞リセートアッセイにより、＜０．
３ng／３０００Ｕ ＣＳＦ−１〕；抗−ＣＳＦ−１カラ
ムへの適用により活性が除去され；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウ
スからのマクロファージはＣＳＦ−１に反応するがしか
しＬＰＳには反応しない。

【０１３８】５μｇのＬＰＳのIV投与後５時間に得られ
た６個のマウスの肺からＣＳＦ−ＧＭを調製した。肺を
細断し、そして血清不含有培地中で３日間インキュベー
トし、そして上清をＹＹＧ１０６アフィニティーカラム
を用いてＣＳＦ−１デプレーション（ｄｅｐｌｅｔｅ）
した（ＣＳＦ−１含量が２７０Ｕ／mlから７８Ｕ／mlに
減少した）。ＣＳＦ−Ｇを、同様に処理したＬＤＩ血清
不含有培地から調製した。ＣＳＦ−ＧＭ及びＣＳＦ−Ｇ
含量を２０００Ｕ／mlにてコロニー刺激アッセイにより
アッセイした。

【０１３９】末梢血マクロファージを４０％の前記培地
又はアッセイされたＬ−細胞培地のいずれかと共に２０
００Ｕ／mlにて１日間インキュベートし、そして次に追
加の培地と共に又はＬＫと共に４８時間インキュベート
し、そして上記のようにしてＴＵ５の死滅についてアッ
セイした。結果を図９に示す。ＣＳＦ−１はＴＵ５に対
する毒性の顕著な増強を示したが、ＣＳＦ−Ｇ及びＣＳ
Ｆ−ＧＭはいずれもなんらの効果も有しなかった。

【０１４０】ネズミ抗ウイルス活性の刺激 付着ネズミチオグリコレート誘導マクロファージをＣＳ
Ｆ−１と共に３日間インキュベートし、そしてＶＳＶに
より一夜感染せしめた。インターフェロンのＬＰＳ誘導
をブロックするためポリミキシンＢを試験サンプルに加
えた。次の表は付着したままの細胞のクリスタルバイオ
レット染色を示す。

【０１４１】

【表４】

【０１４２】従って、ＣＳＦ−１処理細胞はＶＳＶに対
するマクロファージの保護を示した。

【０１４３】Ｅ．７．ＣＳＦ−１の製剤化 組換生産されたヒトＣＳＦ−１を標準的製薬手順を用い
て投与のために製剤化することができる。通常、ＣＳＦ
−１は注射用の形で調製され、そして唯一の活性成分と
して、あるいは他の蛋白質又は補完的であるか類似する
活性を有する他の化合物との組合わせにおいて使用され
るであろう。このような他の化合物には、代替可能な抗
腫瘍剤、例えばアドリアマイシン、又はリンホカイン、
例えばＩＬ−１，−２、及び−３，α−，β、及びγ−
インターフェロン、及び腫瘍壊死因子が包含されよう。
ＣＳＦ−１活性成分の効果はこのような追加の成分の存
在によって増強又は改良されよう。上記のように、ＣＳ
Ｆ−１は有利な態様で適切な血球と相互作用することが
でき、そしてそれ故にこの発明の組成物は、場合によっ
ては追加のリンホカインの存在下でのこのような細胞と
ＣＳＦ−１とのインキュベーション混合物を包含するこ
とができる。このようなインキュベーション混合物の上
清画分、又は細胞も含有する全混合物を使用することが
できる。

【０１４４】Ｆ．ネズミＣＳＦ−１ ネズミＣＳＦ−１をコードするイントロン不含ＤＮＡ配
列を、多量のＣＳＦ−１を生産するネズミ繊維芽細胞セ
ルラインを用いて調製する。ｃＤＮＡライブラリーを形
成するためのｍＲＮＡ源として、ＡＴＣＣから入手可能
なＬ−９２９ラインを用いる。既知のネズミＮ−末端及
びＣＮＢｒ−開裂内部ペプチド配列に基いて造成された
オリゴヌクレオチドプローブを用いてこのｃＤＮＡライ
ブラリーをプローブすることにより、ネズミ型蛋白質の
ための完全コード配列を回収する。Ｎ−末端配列の相同
性、ヒト及びネズミの両者のＣＳＦ−１調製物の骨髄細
胞からのマクロファージコロニーを刺激する能力、並び
にラジオレセプター及びラジオイムノアッセイ〔Ｄａ
ｓ，Ｓ．Ｋ．等、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５８：６３
０〕に関する限定された交差反応性に基き、ネズミＣＳ
Ｆ−１はヒト物質におよそ８０％相同であると信じられ
る。

【０１４５】Ｆ．１．蛋白質の精製 ネズミＣＳＦ−１を、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．等、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９８１）４２：２
５３−２８５、及びＷａｎｇ，Ｆ．Ｆ．等、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）２１：２６３−２７
５により開示された方法、あるいはＨｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒ，Ｍ．Ｗ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２
６：３０４により総説されているＳＤＳゲル電気泳動法
に従って精製した。

【０１４６】位置１０におけるシアノゲンブロマイド開
裂を用いて分解法を延長することにより、ネズミ配列の
アミノ酸１−３９を得た。マウス蛋白質からの内部開裂
断片を得、そして配列決定した。マウス蛋白質の全体組
成データを下記のように得た。これらのデータは、良好
な回収を示すアミノ酸について正しい相対モル％を示
す。しかしながら、ヒスチジン及びシステインは良好な
収率で回収されなかったので数値は絶対的ではない。

【０１４７】

【表５】

【０１４８】残基／１２５への換算は分子量からの配列
長さの概算に基く。

【０１４９】Ｆ．２．ネズミＣＳＦ−１ｃＤＮＡの調製 ネズミＣＳＦ−１のアミノ酸配列５−１３及び内部配列
をプローブ造成の基礎として使用した。ネズミ配列に対
応する３セットのオリゴマーを調製した。図２に示すよ
うに、１つの配列は“領域Ａ”−すなわちアミノ酸９−
１３をコードするように調製され；他方は“領域Ｂ”−
すなわちアミノ酸５−９をコードするように調製され；
第３は内部配列“領域Ｃ”の位置０−６をコードするよ
うに調製された。コドンの冗長性のため、オリゴマーの
これらのクラスのそれぞれは高度に縮重性（ｄｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅ）である。

【０１５０】すなわち、領域Ａに基いて造成された１５
−マーは４８を数え；領域Ｂ（ヒスチジンのコドンの最
後のヌクレオチドを欠く）に基いて造成された１４−マ
ーもやはり４８を数え；領域Ｃに基いて造成された２０
−マーは３２を数える。これとは異り、領域Ａをコード
するように造成された１５−マーは１５個の位置の内の
４個にミスマッチを有することができ、領域Ｂに関して
造成された特定の１４−マーは６個の位置にミスマッチ
を有することができ；領域Ｃに関して造成された特定の
２０−マーは５個の位置にミスマッチを有することがで
きる。

【０１５１】下に記載するように、適切な方法設計によ
り、所望の濃縮されたネズミのｃＤＮＡライブラリーの
形成のために濃縮されたメッセンジャーＲＮＡ画分を見
出すことができ、そしてプローブとして使用するための
精密に正しいオリゴマーも確認される。ネズミＬ−９２
９細胞から全メッセンジャーＲＮＡを抽出しそして精製
する。ネズミＬ−９２９細胞をＤＭＥ培地上で８日間培
養し、そして次に遠心により収得する。全細胞質リボ核
酸（ＲＮＡ）を、ＭＩＡＰａＣａ ｍＲＮＡについて上
記したのと同じ方法により細胞から単離した。

【０１５２】ｍＲＮＡを、Ｃ．３項に記載したようにナ
サンブロットためにゲル上で画分する。領域Ａに対応す
る１５−マー配列を１２ずつの４群にわける。これらの
群のそれぞれを、対照及びネズミＬ−９２９ ｍＲＮＡ
スラブに低ストリンジェンシーのもとにハイブリダイズ
せしめるために用い、そして生ずるパターンをラジオオ
ートグラフィーにより観察した。使用した低ストリンジ
ェンシー条件のもとでは、適当な配列を含有しない画分
及び含有する画分に対してハイブリダイゼーションが生
ずる。さらに対照セルラインは、ＣＳＦ−１を生産しな
いこと以外の点においてもＬ−９２９系のそれと異るの
で、Ｌ−９２９細胞ゲル中のＣＳＦ−１に関連しない多
数のサイズ位置（対照中には存在しない）中にハイブリ
ダイゼーションが生ずる。

【０１５３】匹敵するセットの対照及びＬ−９２９ゲル
を領域Ｂを代表する４８個の１４−マーの分離物（ｓｅ
ｇｒｅｇａｔｅ）及び領域Ｃを代表する３２個の２０−
マーの分離物（ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）を用いてプローブ
する。次に、領域Ａ又はＢ、及びＣプローブに対してＬ
−９２９スラブ中で排他的にハイブリダイズするメッセ
ンジャーＲＮＡのバンドのみをさらに考慮する。段々強
化されるストリンジェンシーの条件下で、領域Ａ１５−
マー混合物の１つ又は領域Ｂ１４−マー混合物の１つ、
及び領域Ｃ２０−マー混合物の１つと結合し続けるＲＮ
Ａバンドを選択する。

【０１５４】正しいｍＲＮＡバンドを見出された場合、
領域Ａ１５−マーの各群を用いて種々のストリンジェン
シーの条件下でプローブする。最も高いストリンジェン
シーにおいて結合する群はおそらく、生産されたｍＲＮ
Ａに正確に相補的な正しい１５−マーを含有する。最も
高いストリンジェンシーにおいて結合する１個のオリゴ
マーが見出されるまで調製物をさらに分割することによ
って正しい１５−マーを確認する。領域Ｂ又はＣと結合
する正しい１４−マー又は２０−マーを確認するために
類似の方法を用いる。次に、これらの特定のオリゴマー
を、濃縮されたｍＲＮＡ画分から調製されるネズミｃＤ
ＮＡライブラリーにおけるプローブとして使用すること
ができる。

【０１５５】次に、ＣＳＦ−１のためのコード配列を含
有するものとして同定されたｍＲＮＡ画分を調製的規模
で得る。この調製においては、ポリＡ⁺ ｍＲＮＡを１０
mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），１ｍＥＤＴＡ、及び
０．５％ＳＤＳ中シュークロースグラジェント上で分画
した。ベックマンＳＷ４０ローター中で３０，０００rp
m にて１７時間遠心した後、ｍＲＮＡをグラジェントか
らエタノール沈澱により回収する。グラジェントから回
収されたＲＮＡ画分をそれぞれ標準的翻訳アッセイにお
いてキセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞に注射
し、そしてネズミＣＳＦ−１に対して生じた抗体による
ラジオイムノアッセイを用いて生成物をＣＳＦ−１につ
いてアッセイする。陽性結果が得られた画分をプール
し、そしてｃＤＮＡライブラリーを造成するために使用
した。これら同じ画分はオリゴマープローブとしハイブ
リダイズする。

【０１５６】ｃＤＮＡライブラリーを調製するための他
の方法が、言うまでもなく当業界においてよく知られて
いる。今や古典的となった１つの方法はオリゴｄＴプラ
イマー、逆転写酵素、ポリｄＧによる２本鎖ｃＤＮＡの
テイル形成、及び所望の制限部位において開裂されそし
てポリｄＣによりテイル形成されている適当なベクタ
ー、例えばｐＢＲ３２２又はその誘導体へのアニーリン
グを用いる。この代替法の詳細な記載は、例えば、同一
承継人に承継され１９８３年１２月２０日に出願された
米国特許出願No. ５６４，２２４号に見出される。この
記載を引用によりこの明細書に組み入れる。

【０１５７】ここで使用される方法においては、濃縮さ
れたｍＲＮＡ（５μｇ）を、１０mMメチル水銀を用いて
２２℃にて５分間処理することにより変性し、そして１
００mMの２−メルカプトエタノールの添加により脱毒す
る〔Ｐａｙｖａｒ，Ｆ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９７９）２５４：７６３６−７６４２〕。プラスミ
ドｐｃＤＶ１をＫｐｎＩで開裂せしめ、ｄＴＴＰにより
テイル形成し、そして変性されたｍＲＮＡにアニールす
る。このオリゴｄＴによりプライムされたｍＲＮＡを逆
転写酵素により処理し、そして新たに合成されたＤＮＡ
鎖にｄＣＴＰによりテイル形成する。最後に、ｐｃＤＶ
１ベクターの不所望の部分をＨｉｎｄIII による開裂に
より除去する。別途、ｐＬ１をＰｓｔＩで開裂せしめ、
ｄＧＴＰでテイル形成し、ＨｉｎｄIII で開裂せしめ、
そして次にｐｃＤＶ１ベクター断片により延長されたポ
リＴテイル化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体と混合し、Ｅ．
コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リガーゼにより連結し、そして混
合物をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｅ．コリ
（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リガーゼ、及びＲＮアーゼＨにより処
理する。生ずるベクターによりＥ．コリＫ１２ＭＭ２９
４をＡｍｐ^R に形質転換する。

【０１５８】次に、生ずるｃＤＮＡライブラリーを、前
記のようにしてｍＲＮＡコード配列に相補的であるとし
て同定されたオリゴマープローブを用いてスクリーニン
グする。領域Ａ又はＢ、及びＢからのプローブにハイブ
リダイズするコロニーを拾い、そして増殖せしめ、プラ
スミドＤＮＡを単離し、そしてＣＳＦ−１の完全な配列
をコードするのに十分なサイズの挿入部を含有するプラ
スミドを単離する。これらのプラスミドのそれぞれの挿
入部の配列を決定し、そして上流部分に領域Ａ及びＢを
含有する完全コード配列を含有するプラスミド調製物を
ｐｃＭＣＳＦと命名する。

【０１５９】Ｆ．３．ネズミＣＳＦ−１ＤＮＡの発現 ヒトｃＤＮＡについて前記したのと同様にして、ネズミ
ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞中での一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎ
ｔ）発現について試験し、そして安定に形質転換された
ＣＶ−１中での発現のために使用する。さらに、適切な
ＨｉｎｄIII ／ＡＴＧコード配列を変異誘発により成熟
蛋白質の上流に挿入し、そして原核性発現のためにコー
ド配列をｐＰＬＯＰ又はｐＴＲＰ３に挿入する。

【０１６０】Ｇ．宿主ベクター ｐＰＬＯＰは、Ｐ_L プロモーター、及びＨｉｎｄIII 制
限開裂部位に隣接したＮ遺伝子リボゾーム結合部位を有
し、そのためにＨｉｎｄ部位に先行されるＡＴＧ開始コ
ドンを有するコード配列の便利な挿入を許容する宿主発
現ベクターである。このベクターのバックボーンはｐＣ
Ｓ３由来の温度感受性高コピー数プラスミドである。ｐ
ＰＬＯＰは１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託さ
れ、そして受託番号３９９４７を有する。

【０１６１】ｐＴＲＰ３は、ＨｉｎｄIII 制限部位のす
ぐ上流にｔｒｐプロモーターを含有し、そして上記のｐ
ＰＬＯＰと同様の態様でのコード配列の挿入を許容する
宿主発現ベクターである。ｐＴＲＰ３のバックボーンベ
クターはｐＢＲ３２２である。ｐＴＲＰ３は１９８４年
１２月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号３
９９４６を有する。

【０１６２】ｐＰＬＯＰの造成 複製開始点 ｐＣＳ３は、高温においてｐＰＬＯＰ宿主ベクターの高
コピー数をもたらす複製開始点を提供する。この造成物
は１９８３年１０月１４日出願された米国特許出願No.
５４１，９４８に十分に記載されており、この記載を引
用によりこの明細書に組み入れる。ｐＣＳ３は１９８３
年６月３日に寄託され、そしてＡＴＣＣNo. ３９１４２
が割合てられた。

【０１６３】ｐＣＳ３はｐＥＷ２７及びｐＯＰ９に由来
する。ｐＥＷ２７はＥ．Ｍ．Ｗｏｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７
９：３５７０により記載されている。このものはその複
製開始点の近傍にコピー数の温度制御をもたらす変異を
含有する。ｐＯＰ９は、Ｃｏｌ ＥＩタイプのプラスミ
ドｐＯＰ６〔Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７５：５８６９〕
からのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕII開始点含有断片をｐＢＲ３
２２に挿入することにより造成された、全温度において
高コピー数のプラスミドである。挿入の前に、この断片
を次のように変形した。５０μｇのｐＯＰ６を２０ユニ
ットずつのＢａｍＨＩ及びＳｓｔＩにより完全消化し
た。ＳｓｔＩ３′突出末端を除去しそしてＢａｍＨＩ
５′末端をフィルインするため、消化されたｐＯＰ６Ｄ
ＮＡをＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）
により、まず２０℃にて３′ＳｓｔＩ突出末端を除去し
そして９℃にて５′末端を修復する２段階反応において
処理した。平滑末端化された断片を消化し、そして０．
０２pmole を用いてコンピテントＤＧ７５〔０′Ｆａｒ
ｒｅｌｌ，Ｐ．等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１
９７８）１３４：６４５−６５４〕を形質転換した。形
質転換体を５０μｌ／mlのアンピシリンを含有するＬプ
レート上で選択し、そして３．３kbの欠失、ＳｓｔＩ部
位の喪失、及び新たに形成されたＢａｍＨＩ部位の存在
についてスクリーニングした。

【０１６４】ｐＯＰ７と称する１つの候補を選択し、そ
して２５μｇのｐＯＰ７を２０ユニットのＢａｍＨＩで
消化し、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ断片（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）で修復し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにより再
連結することによりＢａｍＨＩ部位を除去した。コンピ
テントＤＧ７５を０．１μｇのＤＮＡで処理し、そして
形質転換体を５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ
プレート上で選択した。ｐＯＰ８を選択した。ｐＯＰ９
を得るため、ｐＢＲ３２２からのＡｖａＩ（修復）／Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｔｅｔ^R 断片を調製し、そして単離し、そし
てｐＯＰ８からの単離されたＰｖｕII（部分的）／Ｅｃ
ｏＲＩ−３５６０bp断片と連結した。

【０１６５】１．４２kb ＥｃｏＲＩ／ＡｖａＩ（修
復）Ｔｅｔ^R （断片Ａ）と３．５６kbＥｃｏＲＩ／Ｐｖ
ｕIIＡｍｔ^R （断片Ｂ）との連結は、ＥｃｏＲＩ末端の
分子間連結に好都合なように２段階反応において０．５
μｇの断片Ｂ及び４．５μｇの断片Ａを用いた。コンピ
テントＤＧ７５を５μｌの連結混合物により形質転換
し、そして形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ml）
含有プレート上で選択した。Ａｍｐ^R Ｔｅｔ^R 形質転換
体から単離されたｐＯＰ９は高コピー数、コリシン耐
性、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＰｖｕII，ＨｉｎｄIII
の１個ずつの制限部位、ＨｉｎｃIIの２個の制限部位、
並びに適当なサイズ及びＨａｅIII 消化パターンを示し
た。

【０１６６】ｐＣＳ３を得るため、５０μｇのｐＥＷ２
７ＤＮＡをＰｖｕII及びＥｃｏＲＩにより完全消化し
た。同様にして、５０μｇのｐＯＰ９をＰｖｕII及びＥ
ｃｏＲＩにより完全消化し、そして３．３kb断片を単離
した。０．３６μｇ（０．３２７pmole ）ｐＥＷ２７断
片及び０．３５μｇ（０．１６pmole ）ｐＯＰ９断片を
連結し、そしてＥ．コリＭＭ２９４を形質転換するため
に使用した。Ａｍｐ^R Ｔｅｔ^R 形質転換体を選択した。
好結果のコロニーをまずβ−ラクタマーゼアッセイプレ
ート上で３０℃及び４１℃にてスクリーニングし、そし
て次に３０℃及び４１℃における増殖後のプラスミドＤ
ＮＡレベルについてスクリーニングした。ｐＣＳ３と称
する好結果の候補を配列決定により確認した。

【０１６７】Ｐ_L Ｎ_RBS 挿入部の調製 Ｐ_L ファージプロモーター、及びＮ−遺伝子のためのリ
ボゾーム結合部位（Ｎ _RBS ）を含有するＤＮＡ配列をｐ
ＦＣ５から、そして究極的にはＳｈｉｍａｔａｋｅ及び
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９
２：１２８により記載されているｐＫＣ３０の誘導体か
ら得た。ｐＫＣ３０は、ｐＢＲ３２２からのＨｉｎｄIV
／ＢａｍＨＩベクター断片にクローン化されたλファー
ジからの２．３４kb断片を含有する。Ｐ_L プロモーター
及びＮ_RBS はｐＫＣ３０中のＢｇｌII及びＨｐａＩ部位
の間のセグメントを占める。ｐＫＣ３０の誘導体はＥｃ
ｏＲＩ部位に転換されたＢｇｌII部位を有する。

【０１６８】Ｐ_L プロモーターに直接先行するＢｇｌII
部位を次のようにしてＥｃｏＲＩ部位に転換した。ｐＫ
Ｃ３０をＢｇｌIIで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＰＴ
で修復しそしてＴ４リガーゼによりＥｃｏＲＩリンカー
（ニューイングランドビオラブスから得られる）に連結
し、そしてＥ．コリＫ１２株ＭＭ２９４λ⁺ に形質転換
した。プラスミドをＡｍｐ_U Ｔｅｔ_U 形質転換体から単
離し、そして目的とする配列を制限分析及び配列決定に
より確認した。

【０１６９】生じたプラスミドｐＦＣ３を ＰｖｕＩ及
びＨｐａＩにより２重消化して単離された約５４０bpの
断片を得、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＡＴＰで処理し、そして
次にＳ１ヌクレアーゼにより処理して３′末端配列−AG
GAGAA （ここで、−AGGAGAははＮ_RBS である）を有する
平滑末端断片を生じさせた。この断片をＥｃｏＲＩで制
限処理して、５′−ＥｃｏＲＩ（接着）末端及びＨｉｎ
ｆＩ（部分修復、Ｓ１平滑）−３′末端を有する３４７
塩基対のＤＮＡ断片を得た。

【０１７０】ｐＦＣ５を完成するため、ｐβＩ−Ｚ１５
を用いてＮ_RBS の３′のＨｉｎｄIII 部位を形成した。
ｐβＩ−Ｚ１５は、ＡＴＧ＋ｌａｃＺに融合したβＩＩ
Ｎの１４０bpを含有する配列をｐＢＲ３２２に融合せし
めることにより調製されたものであり、そして１９８４
年１月１３日にＡＴＣＣ No. ３９５７８として寄託さ
れた。ｐβＩ−Ｚ１５においては、ｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩ部位が保持されており、そして挿入部はβ−ＩＦ
ＮのＡＴＧ開始コドンに直接先行するＨｉｎｄIII 部位
を含有する。ｐβＩ−Ｚ１５をＨｉｎｄIII により制限
処理し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰにより修復し、そし
て次にＥｃｏＲＩにより消化した。

【０１７１】生ずるＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII （修復）
ベクター断片を上記のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ（修復）
断片として連結し、そして連結混合物を使用してＭＣ１
０００−３９５３１を形質転換した。好結果の造成物を
含有する形質転換体を、ラクトース最小プレート上で３
４℃にて増殖するが３０℃では増殖しない能力により同
定した。（形質転換体を３０℃及び３４℃にてＸ−ｇａ
ｌ−Ａｍｐプレート、並びに３０℃及び３４℃にて最少
−ラクトースプレート上にプレートした。適切な造成物
を含有する形質転換体は両温度においてＸ−ｇａｌ−Ａ
ｍｐプレート上で青色であるが、しかし最少ラクトース
プレート上では３４℃においてのみ増殖する。）好結果
の造成物をｐＦＣ５と命名した。

【０１７２】ｐＰＬＯＰの完成 次に、ｐＣＳ３を変形してＰ_L 及びＮ_RBS 制御配列を与
えた。ｐＣＳ３をＨｉｎｄIII で消化し、そして次にＥ
ｃｏＲＩで消化した。ベクター断片を、Ｐ_L Ｎ _RBS を含
有するｐＦＣ５からの単離されたＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
III と連結し、そしてＥ．コリＭＭ２９４に形質転換し
た。単離されたプラスミドＤＮＡの正しい構成を制限分
析及び配列決定により確認し、そしてこのプラスミドを
ｐＰＬＯＰと命名した。

【０１７３】ｐＴＲＰ３の調製 ＨｉｎｄIII 部位の後にｔｒｐ制御配列を含有する宿主
ベクターを造成するため、アテニュエーター領域を欠く
ｔｒｐプロモーター／オペレーター／リボゾーム結合部
位配列を、スタンホード大学Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙから
入手したｐＶＨ１５３から得た。ｔｒｐ配列は、当業界
において知られているこのような多くの種類のプラスミ
ド中に得られる。ｐＶＨ１５３をＨｈａＩ（このもの
は、露出された３′接着末端を残してｔｒｐプロモータ
ーのちょうど５′を切断する）で処理し、Ｋｌｅｎｏｗ
により平滑末端化し、そしてＴａｑＩにより部分消化し
た。ＴａｑＩ部位に対応する９９bp断片、ｔｒｐリーダ
ーのＡＴＧ開始コドンに先行する６ヌクレオチドを単離
し、そしてＥｃｏＲＩ（修復）／ＣｌａＩ消化されたｐ
ＢＲ３２２に連結してｐＴＲＰ３を得た。

【０１７４】１９８５年４月２日、出願人はアメリカン
・タイプ・カルチュア・コレクション、ロックビル、
Ｍ．Ｄ．米国（ＡＴＣＣ）にＥ．コリＤＧ９８中ファー
ジｐＨＣＳＦ−１を受託番号No. ４０１７７として寄託
した。１９８５年５月２１日、シタスのコレクションに
おいてＣＭＣＣ２３１２と称されるｐＨＣＳＦ−１ａ及
び寄託のためのｐＨＣＳＦ−１λシャロロ４ＡはＡＴＣ
Ｃに寄託され、そして受託番号No. ４０１８５を有す
る。１９８５年６月１４日、Ｅ．コリＭＭ２９４中ＣＳ
Ｆ−１７は、ＣＭＣＣ２３４７と称され、ＡＴＣＣに寄
託され、そして受託番号No. ５３１４９を有する。これ
らの寄託は、特許手続きのための微生物の寄託の国際的
承認に関するブタペスト条約及びそれに基く規則（ブタ
ペスト条約）の規定に基いて行われた。これは寄託の日
から３０年間生存微生物の維持を保証する。寄託はブタ
ペスト条約の規定のもとにＡＴＣＣにより入手可能にさ
れ、そして関連する米国特許の発行の後永久且つ無制限
の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣとの間の合意
にゆだねられる。ここに承継人は、培養物が適切な条件
下で培養された場合に死滅し、又は失われもしくは破損
した場合に、通知の後すみやかに同じ培養物の生存検体
により置き換えることに同意する。寄託物の入手可能性
は、いずれかの政府の権威のもとでその特許法に従って
認められた権利に反してこの発明を実施する承諾と解し
てはならない。

【０１７５】この発明の範囲は、この明細書に記載され
た例示的な具体例により限定されると解されるべきでは
なく、添付される請求の範囲に従って決定されるべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は精製された天然蛋白質から決定された、
人尿ＣＳＦ−１及びネズミＬ−９２９細胞ＣＳＦ−１の
部分的アミノ酸配列を示す。

【図２】図２はネズミＣＳＦ−１のための幾つかのオリ
ゴマープローブの配列を示す。

【図３】図３はヒトゲノムＣＳＦ−１を得るために使用
されるオリゴマープローブの配列を示す。

【図４】図４は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb ＨｉｎｄIII 断片の配列決定された部分、及びエ
クソン領域について推定されたアミノ酸配列を示す。

【図５】図５は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb ＨｉｎｄIII 断片の配列決定された部分、及びエ
クソン領域について推定されたアミノ酸配列を示す。

【図６】図６は、ヒトＣＳＦ−１配列をコードする３．
９kb ＨｉｎｄIII 断片の配列決定された部分、及びエ
クソン領域について推定されたアミノ酸配列を示す。

【図７】図７はＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡクロー
ンＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図８】図８は、ＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡクロ
ーンＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【図９】図９は、ＣＳＦ−１及び他のコロニー刺激因子
の、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力を増強する活
性の比較を示す。

【図１０】図１０はＭＩＡＰａＣａ ｍＲＮＡのシュー
クロース・グラジェント分画の結果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８２１０６８ (32)優先日 1986年１月21日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 バン アースデル，ジャネレ エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94804，リッチモンド，サーティファー スト ストリート 519 (72)発明者 ウォング，アリス エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596，ウォルナット クリーク プロ ビデンス コート 2423 (72)発明者 ラルフ，ピーター アメリカ合衆国，カリフォルニア 94563，オリンダ，クレスト ビュー ドライブ 119 (72)発明者 コイネ，メイチェ ワイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94566，プレザントン，コルテ セリト ス 5967 (72)発明者 ウォーレン，マリー ケイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94577，サン レアンドロ，ホアクイー ン アベニュ 486

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を有
   し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
   ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
   複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
   るアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方法におい
   て、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る
   発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、
   その培養物から前記ポリペプチドを採取することを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において１位から１５８位までのア
   ミノ酸から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において１位から２２４位のアミノ
   酸から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において、１５８位〜２２４位に存
   在する１又は複数のアミノ酸の欠失又は保存的置換によ
   り特徴付けられるアミノ酸配列を有する、請求項１に記
   載の方法。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において、５１位及び５２位、及び
   ／又は１９１位、１９２位及び１９３位のアミノ酸の１
   個又は複数個の欠失又は保存的置換により特徴付けられ
   るアミノ酸配列を有する請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において、１５位〜２０位、及び／
   又は７５〜８４位の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又
   は保存的置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有す
   る、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが、請求項１に記載の
   アミノ酸配列（Ｉ）において、５９位のチロシン残基の
   欠失又は置換により特徴付けられるアミノ酸配列を有す
   る請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが、成熟ｍＣＳＦ−
   １、及びａｓｐ₅₉ＣＳＦ−１から成る群から選択された
   ものである、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが、ｐＨＣＳＦ−１ａ
   又はｐｃＣＳＦ−１７にコードされたアミノ酸配列を有
   する、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチド。
11. 【請求項１１】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る、単
    球による毒性因子生産の刺激剤。
12. 【請求項１２】 前記毒性因子がインターフェロン又は
    腫瘍壊死因子である、請求項１１に記載の毒性因子生産
    刺激剤。
13. 【請求項１３】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る、マ
    クロファージによる殺細胞増強剤。
14. 【請求項１４】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る、単
    球によるＧＭ−ＣＳＦ生産増強剤。
15. 【請求項１５】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る、抗
    ウイルス感染抵抗誘導剤。
16. 【請求項１６】 ヒト−コロニー刺激因子−１の活性を
    有し、且つ次のアミノ酸配列（Ｉ）： Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 20 25 30 Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 130 135 140 Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile 165 170 175 Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg 180 185 190 Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro 195 200 205 Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 210 215 220 （Ｉ） において１位から２２４位までのアミノ酸から成るアミ
    ノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して１もしくは
    複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されてい
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る、哺
    乳類における免疫系増強剤。