NO179109B - Ekspresjonsvektor, rekombinante vertsceller samt fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt, rekombinant CSF - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke kolonistimulerende faktor med aminosyresekvens ekvivalent med human mCSF-l-aminosyren 1 til 158 i sekvensen som vist i figur 5, inkludert konservative substitusjoner eller delesjoner av en eller flere aminosyrer deri.

Oppfinnelsen angår også rekombinante vertsceller som er tranformert med den ovenfor beskrevne ekspresjonsvektor.

Til slutt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt, rekombinant CSF.

Evnen til visse faktorer som fremstilles i meget lav konsentrasjon i et antall vev, til å stimulere vekst og utvikling av benmargprogenitorceller til granulocytter og/eller makrofager, har vært kjent i nær 15 år. Nærværet av slike faktorer i sera, urinprøver og vevekstrakter fra et antall prøver kan demonstreres ved å benytte en in vitro-analyse som måler stimuleringen av kolonidannelsen av benmargceller platert i halvfast kulturmedium. Det er ingen kjent in vivo-analyse. På grunn av at disse faktorer induserer dannelsen av slike kolonier, er faktorene kollek-tivt kalt kolonistimulerende faktorer, CSF.

I den senere tid er det vist at det er minst fire underklasser av human CSF-proteiner som kan defineres i henhold til de typer celler som finnes i de resulterende kolonier. En underklasse, CSF-1, resulterer i kolonier inneholdende overveiende makrofager. Andre underklasser reproduserer kolonier som inneholder både nøytrofile granulocytter og makrofager; som inneholder utelukkende nøytrofile granulocytter; og som inneholder nøytrofile og eosinofile granulocytter og makrofager.

Det finnes murinfaktorer analoge de første tre av de ovenfor angitte human-CSF. I tillegg induserer en murinfaktor kalt IL-3, kolonier fra murinbenmargceller som inneholder alle disse celletyper pluss megakaryocytter, erytrocytter og mastceller i forskjellige kombinasjoner. Disse CSF er oppsummert av T.M. Dexter, Nature (1984 ) 309;746 og M.A. Vadas et al., J. Immunol (1983) 130:793.

Foreliggende oppfinnelse hører hjemme innen området rekombinant produksjon av proteiner som hører til den første av disse underklasser, CSF-1. Denne underklasse er ytterligere karakterisert ved og beskrevet ved spesifikke radioimmunoanalyser og radioreseptoranalyser, der antistoffer dyrket mot renset CSF-1, er i stand til å undertrykke spesifikk CSF-1-aktivitet uten å påvirke de biologiske aktiviteter til de andre underklasser, og makrofagcellelinjen J774 inneholder reseptorer som spesifikt binder CSF-1. En beskrivelse av disse analyser ble publisert av S.K. Das et al., "Blood"

(1981) 58:630.

Rensemetoder for forskjellige CSF-proteiner er publisert.

E.R. Stanley et al., "J. Biol. Chem." (1977) 252:4305 beskrev rensing av et CSF-protein fra murin L929-celler til en spesifikk aktivitet på ca. 1 x 10<8> enheter/mg, som også stimulerte hovedsakelig makrofagproduksjonen. A. Waheed et al., "Blood" (1982) 60:238 beskrev fremstilling av muse L-celler CSF-1 til tilsynelatende homogenitet ved bruk av en kanin-antistoffkolonne og rapporterte de første 25 aminosyrer av murinsekvensen (CM. Ben-Avram et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." (USA) (1985) 882:4486.

E.R. Stanley et al., "J. Biol. Chem." (1977) 252:4305-4312 beskrev en renseprosedyre for CSF-1 fra humanmurin og S.K. Das et al., "Blood", (1981) 58:630; "J. Biol. Chem." (1982) 257:13679 oppnådde en humanurin CSF-1 med en spesifikk aktivitet på 5 x IO<7> enheter/mg som produserte kun makrofagkolonier, og skisserte slektskapet med glykosylering av CSF-1-proteiner fremstilt fra dyrkede muse L-celler og fra humanurin, med deres aktiviteter. F.F. Wang et al., "J. Cell. Biochem." (1983) 21:263, isolerte humanurin CSF-1 til en spesifikk aktivitet på IO<8> U/mg. A. Waheed et al., "beskrev rensing av humanurin CSF-1 til en spesifikk aktivitet på 0,7-2,3 x IO<7> U/mg på en kanin-antistoffkolonne ("Exp. Hemat."

(1984) 12:434). M. Wu et al., J. Biol. Chem. (1979) 254:6226 rapporterte fremstilling av et CSF-protein fra dyrkede humanpankreatiske karsinom (MIAPaCa)-celler som resulterte i vekst av murin-granulocytiske og makrofagro kolonier. Det resulterende protein hadde en spesifikk aktivitet på ca.

7 x IO<7> enheter/mg.

Partielt rensede preparater av forskjellige CSF er også rapportert fra human- og muse-lungecellekondisjonerte media (S.S. Fojo et al., "Biochemistry" (1978) 17:3109, A.W. Burgess et al., "J. Biol. Chem." (1977) 252:1998): fra human T-lymfoblastceller (A.J. Lusis et al., "Blood" (1981) 57:13; US-PS 4.438.032); fra humanplacentalkondisjonert medium til tilsynelatende homogenitet og en spesifikk aktivitet på 7 x IO<7> enheter/mg (M. Wu et al., "Biochemistry" (1980) 19:3846).

En signifikant vanskelighet ved å bringe CSF-proteiner generelt og CSF-1 spesielt, til noen brukbar funksjon, har vært deres utilgjengelighet i distinkt og karakteriserbar form i tilstrekkelige mengder til å gjøre deres anvendelse i terapeutisk bruk praktisk eller sågar mulig. Foreliggende oppfinnelse bøter på disse mangler ved å tilveiebringe renset human- og murin-CSF-1 i brukbare mengder ved rekombinant-teknikker.

(Et CSF-protein av en forskjellig underklasse, murin- og human-GM-CSF er renset og cDNA'ene klonet. Dette protein viste seg å være distinkt fra andre CSF, for eksempel CSF-1, i henhold til Gough et al., "Nature" (1984) 309:763-767.

Murin IL-3 er klonet av M.C. Fung et al., "Nature" (1984 ) 307:233. Se også T. Yokota et al., "PNAS" (1984) 81:1070-1074; G.G. Wong et al., "Science" (1985) 228:810-815; F. Lee et al., "PNAS" (1985) 82:4360-4364 og M.A. Cantrell et al., "PNAS" (1985)82: 6250-6254.)

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår i et første aspekt en ekspresjonsvektor av den innledningsvis nevnte art og denne vektor karakteriseres ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte protein, operativt forbundet med egnede transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser for ekspresjon av mCSF-1 i egnede vertsceller.

Som nevnt angår oppfinnelsen også rekombinante vertsceller og disse karakteriseres ved at de er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 1, operativt forbundet med egnede kontroll-sekvenser omfattende en promoter, et ribosom-bindingssete og et bakterielt initieringssete for å lette ekspresjonen av CSF-1.

Til slutt angår oppfinnelsen som nevnt en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt, rekombinant CSF, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter dyrking av rekombinante vertsceller ifølge krav 2, operativt forbundet med egnede kontroll-sekvenser omfattende en promoter, et ribosombindingssete og et bakterielt initieringssete for å lette ekspresjonen av CSF-1, hvorefter det rekombinante protein isoleres.

Oppfinnelsen skal forklares under henvisning til tegningene.

Fig. 1 viser de partielle aminosyresekvenser av humanurin-og murin L-929-celle CSF-1, bestemt ut fra native proteiner.

Fig. 2 viser sekvensen med visse oligomerprober for murin

CSF-1.

Fig. 3 viser sekvensen av oligomerprober som benyttes for å

oppnå humangenomt CSF-1.

Fig. 4 viser den sekvenserte del av en 3,9 kb Hindlll-fragment som koder human-CSF-l-sekvenser og de avledede aminosyresekvenser for exon-regionene. Fig. 5 viser DNA og avledede aminosyresekvenser for cDNA-klonen som koder CSF-1. Fig. 6 viser en sammenlikning av aktivitetene for CSF-1 og andre kolonistimulerende faktorer med henblikk på å øke evnen til makrofagen til å drepe tumorceller. Fig. 7 viser resultatene av sukrosegradientfraksjonering av

MIAPaCa mRNA.

A. Definisjoner

"Kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1)" angir et protein som viser det spektrum av aktivitet som forstås i teknikken for CSF-1, dvs. anvendt på en standard in vitro-kolonistimulerende analyse ifølge D. Metcalf, "J. Cell. Physiol." (1970) 76.:89, resulterer dette i dannelsen av primære makrofagkolonier. Nativ CSF-1 er en glykosylert dimer; dimeriseringen kan være nødvendig for aktivitet. Innenfor rammen av oppfinnelsen og innenfor definisjonen av CSF-1 ligger både den dimere og monomere form. Den monomere form kan omdannes til den dimere ved en in vitro-tilveiebringelse av intra-cellulære betingelser, og monomeren er per se brukbar som et antigen for å produsere anti-CSF-l-antistoffer.

Det synes å være visse artsspesifisiteter; human CSF-1 er operativ både på human- og på murinbenmargceller; murin CSF-1 viser ikke aktivitet med humanceller. Derfor bør "human" CSF-1 være positiv i den spesifikke murin-radioreseptoranalyse i henhold til S.K. Das et al., "Blood" (1981 ) 58:630, selv om det ikke nødvendigvis er en komplett korrelasjon. Den biologiske aktivitet for proteinet vil generelt også inhiberes av nøytraliserende antiserum mot humanurin-CSF-1 (S.K. Das et al., supra). Ved visse spesielle omstendigheter (slik som for eksempel der et spesielt antistoffpreparat erkjenner en CSF-l-epitop som ikke er vesentlig for biologisk funksjon, og hvilken epitop ikke er tilstede i det spesielle CSF-l-mutein som prøves), er det ikke sikkert at dette kriterium oppfylles.

Visse andre egenskaper til CSF-1 er erkjent i den senere tid, inkludert evnen til dette protein til å stimulere sekresjon av serie E-prostaglandiner, interleukin-1 og interferon fra mature makrofager (R. Moore et al., "Science" (1984) 223:178). Mekanismen for disse sistnevnte aktiviteter er ikke forstått idag, og for formålet for de her gitte definisjoner ligger kriteriet for oppfyllelse av definisjonen i evnen til å stimulere dannelsen av monocytt/makrofagkolonier ved bruk av benmargceller fra de egnede arter som utgangsstoffer, under de fleste omstendigheter (se ovenfor) inhiberingen av denne aktivitet ved nøytralisering av antiserum mot renset humanurin CSF-1, og, der dette passer for artstypen en positiv respons på radioreseptoranalysen. (Det er kjent at den proliferative effekt av CSF-1 er begrenset til celler av mononukleære fagocytisk linje (E.R. Stanley, "The Lymphokines" (1981), V/.E. Stewart II et al., redaktør, Humana Press, Clifton, NJ), s. 102-132) og at reseptorer for CSF-1 er begrenset til disse cellelinjer (P.V. Byrne et al., "Cell Biol" (1981) 91:848) ).

Slik tilfellet er for alle proteiner, avhenger den nøyaktige kjemiske struktur av et antall faktorer. Da ioniserbare amino- og karboksylgrupper er tilstede i molekylet kan et spesielt protein oppnås som et surt eller basisk salt, eller i nøytral form. Alle slike preparater som bibeholder sin aktivitet når de plasseres i egnede omgivelsesbetingelser, er inkludert i definisjonen. Videre kan den primære aminosyresekvens økes ved derivatisering ved bruk av sukkerdeler (glykosylering) eller ved andre supplementære molekyler som lipider, fosfat, acetylgrupper og liknende, mere generelt ved konjugasjon med sakkarider. Den primære aminosyre-struktur kan også aggregere for derved å danne komplekser, hyppigst dimerer. Således isoleres nativ humanurin-CSF-1 som en meget glykosylert dimer på 45 kd. Visse aspekter ved slik økning gjennomføres ved post-translasjonelle behandlingssystemer av den produserende vert; andre slike modifikasjoner kan innføres in vitro. I ethvert tilfelle er slike modifikasjoner inkludert i definisjonen så lenge proteinets aktivitet som definert ovenfor ikke ødelegges. Det er selvfølgelig forventet at slike modifikasjoner kvantitativt eller kvalitativt kan påvirke aktiviteten, enten ved å øke eller redusere aktiviteten til proteinet i de forskjellige analyser.

Videre kan individuelle aminosyrerester i kjeden modifiseres ved oksydasjon, reduksjon eller andre derivatiseringsmetoder, og proteinet kan spaltes for å oppnå fragmenter som bibeholder aktiviteten. Slike endringer som ikke ødelegger aktiviteten fjerner ikke proteinsekvensen fra definisjonsom-fanget.

Modifikasjoner på primærstrukturen selv ved utelatelse, tilføyelse eller endring av aminosyrene som er innarbeidet i sekvensene under translasjon kan skje uten å ødelegge proteinets aktivitet. Slik substitueringer eller andre endringer resulterer i proteiner med en aminosyresekvens som faller innenfor proteinenes definisjon "med en aminosyresekvens i det vesentlige ekvivialent den til CSF-1". Således har human- og murin-avledede CSF-l-proteiner ikke identiske, men tilsvarende primære aminosyresekvenser som viser homologi.

For hensiktsmessighetens skyld er den maturprotein-aminosyresekvens av den monomere del av et dimert protein vist i fig. 5, avledet fra cDNA-klonen som her i er illustrert, og kalt mCSF-1 (matur CSF-1). Fig. 5 viser nærværet av en 32-rest putativ signalsekvens som antagelig er spaltet ved sekresjon fra mammalceller; mCSF-1 representeres ved aminosyrene 1-224 i figuren. Spesifikt inkludert i definisjonene av human-CSF-1 er muteiner hvilke monomerer og dimerer er mCSF-1 og relaterte former av mCSF-1, angitt ved deres forskjeller fra mCSF-1. mCSF-1 avledet fra andre arter kan passe til definisjonen av "human"-CSF-l på grunn av oppvisningen av det nødvendige mønsteret av aktivitet som angis ovenfor med henblikk på humansubstratet.

For hensiktsmessighetens skyld vil aminosyresekvensen til mCSD-1 benyttes som referanse og andre sekvenser som er i det vesentlige ekvivalente denne uttrykt ved CSF-1 aktivitet, angis under henvisning til sekvensen vist i fig. 5. Erstat-ningen av en spesiell aminosyre vil bemerkes under henvisning til aminosyreresten som den erstatter. For eksempel henviser serggCSF-l til det protein som har sekvensen vist i fig. 5 bortsett fra at aminosyren i posisjon 90 er serin i stedet for cystein. "Utelatelser er angitt med V fulgt av antallet aminosyrer som er utelukket fra N-terminalsekvensen, eller ved antallet aminosyrer som er tilbake når restene utelates fra C-terminalsekvensen, når nummeret følges av et minustegn. Således angir V4CSF-I CSF-1 ifølge fig. 5 der de første 4 aminosyrer fra N-terminus er utelatt; V±sq angir CSF-1 der de siste 94 aminosyrer efter aminosyre 130 er utelatt. Illustrert nedenfor er for eksempel aspsgCSF-l (som inneholder en aspartinsyrerest kodet av genet (fig. 4) i posisjon 59 i stedet for tyrosinresten kodet av cDNA og V^5g_CSF-l som omfatter kun aminosyrer 1-158 av mCSF-1.

"Virksomt forbundet med" henviser til plassering ved siden av hverandre slik at den normale funksjon av komponentene kan gjennomføres. Således henviser en kodingssekvens som er

"virksomt forbundet med" kontrollsekvenser til en konfigura-sjon der kodingssekvensen kan eksprimeres under kontroll av disse sekvenser.

"Kontrollsekvenser" henviser til DNA-sekvenser som er nødvendige for ekspresjon av en virksomt forbundet kodingssekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekvensen som er egnet for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter, eventuelt en operatorsekvens, et ribosom-bindingssete og eventuelt andre, til nå ikke helt forståtte sekvenser. Eukaryotiske celler er kjent for å benytte promotere, polyadenyleringssignaler og fremmere.

"Ekspresjonssystem" henviser til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodingssekvens og kontrollsekvenser i virksomt forbundethet, slik at vertene som transformeres med disse sekvenser er i stand til å produsere de kodede proteiner. For å bevirke transformering kan ekspresjonssystemet inkluderes på en vektor; imidlertid kan det relevante DNA da også integreres i vertskromosomet.

Slik uttrykkene heri benyttes, benyttes "celle", "cellelinje" og "cellekultur" om hverandre og alle slike angivelser inkluderer progeni. Således inkluderer "transformanter" eller "transformerte celler" den primære subjektcelle og kulturer som avledes derfra uten hensyn til antallet overføringer. Det skal også være klart at all progeni ikke behøver å være nøyaktig likt når det gjelder DNA-innhold, på grunn av tilsiktede eller uunngåelige mutasjoner. Mutantprogeni som har samme funksjonalitet som søkt for i den opprinnelige transformerte celle, inkludert. Der distinkte designeringer er tilsiktet, vil dette bli klart fra teksten.

B. Generell beskrivelse

CSF-l-proteinene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er i stand til både å stimulere monocytt-forløper/makrofag-celleproduksjonen fra progenitormargceller, og øker således effektiviteten i immunsystemet, og til å stimulere slike funksjoner hos disse differensierte celler som sekresjon av lymfokiner i de mature makrofager.

I en anvendelse er disse proteiner brukbare som hjelpestoffer ved kjemoterapi. Det er godt forstått at kjemoterapeutisk behandling resulterer i undertrykkelse av immunsystemet. Ofte, selv ved vellykket ødeleggelse av tumorcellene mot hvilke de er retttet, resulterer kjemoterapeutiske be-handlinger i subjektets død på grunn av denne bivirkning til de kjemotoksiske midler på cellene i immunsystemet. Administrering av CSF-1 til slike pasienter resulterer, på grunn av CSF-1's evne til å mediere og forbedre veksten og differensi-eringen av benmargavledede forløpere til makrofager, i en restimulering av immunsystemet for å forhindre denne bivirkning, og for således å forhindre propensiteten til pasienten til å overvinne sekundærinfeksjonen. Andre pasienter som ville hjelpes ved slik behandling inkluderer de som behandles for leukemi via benmargtransplantering; de er ofte i en immunosupprimert tilstand for å forhindre av-visning. Også for disse pasienter kan immunosuppresjon reverseres ved administrering av CSF-1.

Generelt vil ethvert subjekt som lider av immunosuppresjon, uansett på grunn av kjemoterapi, benmargtransplantering eller andre tilfeldige former av immunosuppresjon slik som sykdommer (for eksempel aids) trekke fordel av tilgjengelig-heten av CSF-1 for farmakologisk bruk. I tillegg kan subjekter gis økede mengder av tidligere differensierte makrofager for å supplere de i indigensystemet, hvilke makrofager fremstilles ved in vitro-kultur av benmarg eller andre egnede preparater behandlet med CSF-1. Disse preparater inkluderer de av pasientens egne blodmonocytter, som således kan dyrkes og tilbakeføres for lokal eller systemisk terapi.

CSF-1's evne til å stimulere produksjon av lymfokiner ved makrofager og å øke deres evne til å drepe målceller, gjør også CSF-1 direkte brukbar ved behandling av neoplasmer og infeksjoner.

CSF-1 stimulerer produksjon av interferoner ved murin-avledede makrofager (H.B. Fleit et al., "J. Cell. Physiol"

(1981) 108:347) og human, delvis renset, CSF-1 fra MIÅPaCa-celler stimulerer den poly-IC-induserte fremstilling av interferon og TNF fra humanmonocytter som illustrert nedenfor. I tillegg stimulerer CSF-1 produksjon av myeloid CSF ved humanblodmonocytter.

Også illustrert nedenfor er en demonstrasjon av evnen til murin CSF-1 (fra L-celle-kondisjonert medium) til å stimulere normale C3H/HeN-muse peritoneal makrofager til å drepe murinsarkom TU5-mål. Denne aktiviteten er mest effektiv når CSF-1 benyttes som forbehandling og under effektorfasen. Evnen til CSF-1 til å gjøre dette er meget større enn det som vises av andre kolonistimulerende faktorer, slik det vises i fig. 6 nedenfor. I tillegg forbedres evnen til murinceller til å angripe virus, av CSF-1.

(Murin-CSF-1 er inkonsistent angitt å stimulere murinmakrofager til å være cytostatiske overfor P815-tumorceller (E.J. Wing et al., "J. Clin. Invest" (1982) 69:270) eller ikke å drepe andre leukemimål (P. Ralph et al., "Cell. Immunol." (1983) 76:10). R.T. Nogawa et al., "Cell. Immunol."

(1980) .53:116 angir at CSF-1 kan stimulere makrofager til å fordøye og drepe gjær.)

I tillegg til å overvinne immunosuppresjon per se, kan således CSF-1 benyttes til å ødelegge invaderende organismer eller skade celler indirekte ved å stimulere makrofagsekre-sjon og -aktivitet.

Den her beskrevne CSF-1 kan formuleres på konvensjonelle måter som ér standard i denne teknikk for administrering av proteinstoffer. Administrering ved injeksjon er foretrukket; formuleringer inkluderer oppløsninger eller suspensjoner, emulsjoner eller faste preparater for rekonstituering til injiserbare preparater. Egnede drøyemidler inkluderer for eksempel Ringer's oppløsning, Eank's oppløsning, vann, saltoppløsning, glycerol, dekstroseoppløsninger og liknende. I tillegg kan CSF-1 preinkuberes med preparater av celler for å stimulere den tilsiktede respons, og enten hele preparatet eller supernatanten derfra innføres til subjektet. Som vist nedenfor er stoffene som fremstilles i respons på CSF-1-stimulering av forskjellige typer blodceller, effektive mot ønskede mål, og egenskapene til disse blodceller i seg selv til å angripe invaderende virus eller neoplasmer kan forbedres. Subjektets egne celler kan trekkes ut og benyttes på denne måte, eller for eksempel kan monocytter eller lymfo-cytter fra et annet kompatibelt individ benyttes ved inkuberingen.

Selv om eksistensen av et aktivitetsmønster kalt CSF-1 har vært kjent i en viss tid, er proteinet som er ansvarlig ikke oppnådd hverken i tilstrekkelig renhet eller i tilstrekkelige mengder til å tillate sekvensbestemmelse, heller ikke i tilstrekkelig renhet og mengde til å oppfylle en brukbar terapeutisk funksjon. Fordi hverken helt rene praktiske mengder av proteinet eller dets kodende DNA har vært tilgjengelige, har det ikke vært mulig å optimalisere modifikasjoner hva angår struktur ved å tilveiebringe slike alternativer som de som er angitt under punkt A ovenfor, heller ikke har det vært mulig å benytte dette protein i terapeutisk forbindelse.

Foreliggende oppfinnelse bøter på dette. Gjennom et antall ytterligere renseprosedyrer er tilstrekkelig ren CSF-1 oppnådd fra humanurin til å tilveiebringe noe aminosyresekvens, dette tillater konstruksjonen av DNA-oligomere prober. Probene er brukbare med henblikk på å oppnå kodingssekvensen for hele proteinet. En tilnærmelse, vist nedenfor, benytter prober konstruert med henblikk på human N-terminalsekvensen for å probe humangenebiblioteket for å oppnå den egnede kodingssekvensdel. Eumangenomklonet sekvens kan eksprimeres direkte ved bruk av sin egen kontrollsekvens, eller i konstruksjoner egnet for pattedyrsystemer i stand til å behandle introner. Genomsekvensene benyttes også som prober for human-cDNA-biblioteket oppnådd fra en cellelinje som produserer CSF-1 for å oppnå cDNA som koder dette protein. Dette cDNA, riktig fremstilt, kan eksprimeres direkte i COS-eller CV-l-celler og kan konstrueres til vektorer egnet for eksprimering i et vidt spektrum verter.

Således kan disse verktøy tilveiebringe den totale kode-sekvens for human CSF-1 hvorfra eksprimeringsvektorer som kan anvendes på en varietet av vertssystemer, kan konstrueres og kodingssekvensene eksprimeres. Varieteten av vertsceller som er tilgjengelige sammen med eksprimeringsvektorer egnet for slike verter, tillater valg mellom post-translasjonelle behandlingssystemer, og av omgivelsesfaktorer som gir kon-formasjonell regulering av de således fremstilte proteiner.

C. Egnede verter, kontrollsystemer og metoder

Generelt medfører fremstilling av en rekombinant form av CSF-1 karakteristisk følgende: Først oppnås en DNA som koder det mature (her benyttet til å inkludere alle muteiner) protein, preproteinet eller en fusjon av CSF-l-proteinet til en ytterligere sekvens som ikke ødelegger dets aktivitet eller til ytterligere sekvenser som kan spaltes under kontrollerte betingelser (som behandling med peptidase) for å gi et aktivt protein. Evis sekvensen er uavbrutt av introner, er den egnet for ekspresjon i en hvilken som helst egnet vert. Evis det foreligger introner, er ekspresjon mulig i pattedyr-eller andre eukaryotiske systemer i stand til å prosessere dem. Denne sekvens bør være i utskjærbar og gjenvinnbar form. Uthentet eller gjenvunnet kodingssekvens anbringes så i virksom forbindelse med egnede kontrollsekvenser i en replikerbar ekspresjonsvektor. Vektoren benyttes for å transformere en egnet vert og den transformerte vert dyrkes under gunstige betingelser for å bevirke produksjon av rekombinant CSF-1. Eventuelt blir CSF-1 isolert fra mediet eller fra cellene; gjenvinning og rensing av proteinet behøver ikke være nødvendig i enkelte tilfeller der enkelte urenheter kan tolereres. For eksempel er ved in vitro-dyrking av celler hvorfra en lymfokin faktor skal isoleres for administrering til et subjekt, fullstendig renhet ikke nødvendig. Imidlertid vil selvfølgelig direkte bruk i terapi ved administrering til et subjekt selvfølgelig kreve rensing av fremstilt CSF-1.

Hvert av de foregående trinn kan skje på et antall måter. For eksempel kan den ønskede kodingssekvens oppnås ved fremstilling av egnet cDNA fra cellulære meddelere og å manipulere cDNA for å oppnå den komplette sekvens. Alternativt kan genomfragmenter oppnås og benyttes direkte i egnede verter. Konstruksjoner for ekspresjonsvektorer som kan arbeide i et antall celler skjer ved bruk av egnede repli-koner og kontrollsekvenser som angitt nedenfor. Egnede restriksjonsseter kan hvis ikke vanligvis tilgjengelige, føyes til endene av kodingssekvensen for å gi et uthentbart gen for innskyting i disse vektorer.

Kontrollsekvensene, ekspresjonsvektorene og transformerings-metodene er avhengige av den type vertscelle som benyttes for å uttrykke genet. Generelt er idag prokaryoter, gjær eller pattedyrceller benyttet som verter. Fordi nativ CSF-1 sekreteres som en glykosylert dimer, er vertssystemet som er i stand til egnet post-translasjonell behandling foretrukket. I henhold til dette er, selv om prokaryotiske verter generelt er de mest effektive og hensiktsmessige for fremstilling av rekombinante proteiner, eukaryotiske celler og spesielt pattedyrceller foretrukket på grunn av deres prosesserings-kapasitet. Rekombinant CSF-1 fremstilt av bakterier vil kreve in vitro-dimerisering. I tillegg er det større sikkerhet for at nativsignalsekvensen vil erkjennes av pattedyrcellevertene som gjør sekresjon mulig, og derfor rensing lettere.

Cl. Kontrollsekvenser og tilsvarende verter

Prokaryoter er hyppigst representert ved forskjellige stammer av E. coli. Imidlertid kan andre mikrobielle stammer også benyttes slik som bacilli, for eksempel Bacillus subtilis, forskjellige arter Pseudomonas, eller andre bakterielle stammer. I slike prokaryotiske systemer benyttes vektorer som inneholder replikasjonsseter og kontrollsekvenser avledet fra en art kompatibel med den benyttede vert. For eksempel transformeres E. coli karakteristisk ved bruk av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art av Bolivar et al., "Gene" (1977) 2:95. pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklinresistans og gir således ytterligere markører som enten kan bibeholdes eller ødelegges ved konstruksjon av den ønskede vektor. Vanligvis benyttes prokaryotiske kontrollsekvenser som heri defineres til å inkludere promotere for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosom-bindingssetesekvenser, inkluderer slike vanligvis benyttede promotere som P-laktamase (penicillinase)- og laktose (lac)-promotersystemene (Chang et al., "Nature" (1977) 198:1056) og tryptofan (trp)-promotersystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057) og det \-avledede PL-promoter- og N-gene-ribosom-bindingssete (Shimatake et al., "Nature" (1981) 292:128), som er gjort brukbare som en bærbar kontrollkassett, slik som angitt i USSN 578.133 av 8. februar 1984. Imidlertid kan ethvert tilgjengelig promotersystem som er kompatibelt med prokaryoter, benyttes.

I tillegg til bakterier kan eukaryotiske mikrober som gjær også benyttes som verter, laboratoriestammer av Saccharomyces cerevisiae, Baker's gjær, er hyppigst brukt selv om et antall andre stammer generelt er tilgjengelige. Mens vektorer som benytter 2 jjm opprinnelsen av replikasjon er illustrert, J.R. Broach, "Meth. Enz." (1983) 101:307. er det kjent andre vektorer egnet for gjærekspresjon (se for eksempel Stinchcomb et al., "Nature" (1979) 282:39, Tschempe et al., "Gene"

(1980) 10:157 og L. Clarke et al., "Meth. Enz." (1983) 101:300). Kontrollsekvenser for gjærvektorer inkluderer promotere for syntesen av glykolytiske enzymer (Hess et al., "J. Adv. Enzyme Reg." (1968) 7:149; Holland et al., "Biochemistry" (1978) 17.: 4900 ). Ytterligere promotere er kjent i denne teknikk inkludert promoteren for 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., "J. Biol. Chem." (1980) 255.: 2073) og de for andre glykolytiske enzymer som glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfo-fruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglyserat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase. Andre promotere som har den ytterligere fordel av transkripsjon kontrollert ved vekts-betingelser er promoterregionene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degradative enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme og enzymer ansvarlige for maltose- og galaktose-anvendelse (Holland, ibid). Det er også antatt at terminatorsekvenser er ønskelige i 3'-enden av kodingssekvensene. Slike terminatorer finnes i den 3' ikke-translatert region efter kodingssekvensen i gjæravledede gener. Mange av vektorene som er illustrert inneholder kontroll-sekvenser avledet fra enolase-genet inneholdende plasmid peno46 (M.J. Holland et al., "J. Biol. Chem." (1981) 256:1385) eller LEU2-genet oppnådd fra YEpl3 (J. Broach et al., "Gene" (1978) 8:121). Imidlertid er enhver vektor inneholdende en gjaerkompatibel promoter, replikasjonsopprinnelse og annen kontrollsekvens, egnet.

Det er selvfølge også mulig å uttrykke gener som koder polypeptider i eukaryotiske vertscellekulturer avledet fra multicellulære organismer, se for eksempel "Tissue Culture", Academic Press, utgivere Cruz og Patterson, (1973). Brukbare vertscellelinjer inkluderer murinmyelomene N51-, VERO- og HeLa-celler, og kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler. Ekspresjonsvektorer for slike celler inkluderer vanligvis promotere og kontrollsekvenser som er kompatible med pattedyrceller som for eksempel de vanligvis benyttede tidlige og sene promotere fra Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., "Nature" (1978) 273:113), eller andre viralpromotere som de som er avledet fra polyom, Adenovirus 2, bovinpapilom-virus eller aviansarkom-virus, eller immunoglubulinpromotere og varmesjokk-promotere. Generelle aspekter ved pattedyr-celle-vertssystemtransformasjoner er beskrevet i US-PS 4.399.216. Det synes nå at også "forbedrer"-regioner er viktige ved optimalisering av ekspresjon; disse er generelt sekvenser som finnes oppstrøms promoterregionen. Replikasjonsopprinnelsen kan oppnås hvis dette er nødvendig fra virale kilder. Imidlertid er integrering inn i kromosomet en vanlig mekanisme for DNA-replikasjon i eukaryoter. Planteceller er også nå tilgjengelige som verter, og kontroll-sekvenser kompatible med planteceller som nopalinsyntase-promoteren og polyadenyleringssignalsekvenser (A. Depicker et al., "J. Mol. Appl. Gen." (1982) 1:561) er tilgjengelige.

C.2. Transformering

Avhengig av den benyttede vertscelle, benyttes transformering ved bruk av standardteknikker egnet for slike celler. Kalsiumbehandling under anvendelse av kalsiumklorid som beskrevet av S.N. Cohen, "Proe. Nati. Acad. Sei." (USA)

(1972) 6_9:2110 benyttes for prokaryoter eller andre celler som inneholder vesentlige celleveggbarrierer. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens (C.H. Shaw et al., "Gene" (1983) 23:315) benyttes for visse planteceller. For pattedyrceller uten slike cellevegger foretrekkes kalsiumfosfat-precipitering ifølge Graham og van der Eb, "Virology" (1978) 52:546. Transformering av gjær gjennomføres i henhold til P. Van Solingen et al., "J. Bact." (1977) 130:946 og CL. Esiao et al., "Proe. Nati. Acad. Sei" (USA) (1979) 76:3829. C.3. Identifisering/ Analyser av mRNA ved Northern Blot.

Probe av cDNA eller genombibliotek

RNA fraksjoneres for Northern blot ved agarose slab-gelelektroforese under full denaturering ved bruk av formaldehyd (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning" (1982) Cold Spring Harbor Press, s. 202-203) eller 10 mM metylkvikksølv (CH3HgOH) (J.M. Bailey et al., "Anal. Biochem" (1976) 70:75-85 og P.B. Sehgal et al., "Nature" (1980) 288:95-97) som denaturant. For metylkvikksølvgel blir 1,5$ geler fremstilt ved å smelte agarose i løpende buffer (100 mM borsyre, 6 mM nat r iumborat, 10 mM natr iumsulf at, 1 mM EDTA, pH 8,2), avkjøling til 60" C og tilsetning av 1/100 volum IM CH3HgOH. RNA oppløses i 0,5 x rennende buffer og denatureres ved inkubering i 10 mM metylkvikksølv i 10 minutter ved romtemperatur. 20$ glyserol og 0,05$ bromfenol-blått tilsettes for farving av prøvene. Prøver elektroforeses ved 500-600 volt/time med resirkulering av bufferen. Efter elektroforesen vaskes gelen i 40 minutter i 10 mM 2-merkaptoetanol for å detoksifisere metylkvikksølv, og Northern blots prepareres ved overføring av RNA fra gelen til et membranfilter.

cDNA eller genombibliotek screenes ved bruk av koloni- eller plaque-hybridiseringsprosedyren: Det lages et avtrykk av bakteriekoloniene eller plaquenepå et duplikat-nitrocellu-losepapirer (S & S type BA-85). Plaquene eller koloniene lyseres og DNA fikseres til filtre ved sekvensiell behandling i 5 minutter med 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl. Filtrene vaskes to ganger i 5 minutter hver gang med 5 x standard saltcitrat, SSC, og lufttørkes og oppvarmes til 80°C i 2 timer.

Gelene for Northern blot eller duplikatfiltrene for cDNA eller genomscreening prehybridiseres ved 25-42°C i 6-8 timer med 10 ml pr. filter DNA hybridiseringsbuffer uten probe (0-50 # formamid, 5-6 x SSC, pH 7,0, 5x Denhardfs oppløsning (polyvinylpyrrolidin, pluss Ficoll og bovinserumalbumin; 1 x = 0,02$ hver), 20-50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7,0, 0,2$ SDS, 20 jig/ml poly U (ved probing av cDNA), og 50 pg/ml denaturert laksesperme DNA). Prøvene hybridiseres så ved inkubering ved egnet temperatur i ca. 24-36 timer ved bruk av hybridiseringsbufferen inneholdende kinasert probe (for oligomerer). Lengre cDNA- eller genom-fragmentprober ble merket ved nick-translasjon eller ved primer-ekstensjon.

Betingelsene for både prehybridisering og hybridisering avhenger av den ønskede stringens og varierer for eksempel med probelengden. Typiske betingelser for relativt lange (det vil si mer enn 30-50 nukleotider) prober benytter en temperatur på 42-55°C og hybridiseringsbuffer inneholdende ca. 20-50$ formamid. For de lavere stringenser som er nødvendig for oligomere prober med ca. 15 nukleotider, benyttes lavere temperaturer på ca. 25-42°C og lavere formamidkonsentrasjoner på 0-20$. For lengre prober må filtrene vaskes, for eksempel fire ganger 30 minutter, og hver gang ved 40-55 °C med 2 x SSC, 0,2$ SDS og 50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7, så vaskes to ganger med 0,2 x SSC og 0,2$ SDS, lufttørket, og autoradiografert ved -70° C i 2-3 dager. Vaskebetingelsene er noe mindre rigorøse for kortere prober.

C . 4 . Vektorkonstruks. i on

Konstruksjonen av egnede vektorer inneholdende de ønskede kodings- og kontrollsekvenser benytter standard ligerings- og restriksjonsteknikker som er velkjente. Isolerte plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserte oligonukleotider spaltes, tilpasses og ligeres igjen i den ønskede form.

Setespesifikk DNA-spalting gjennomføres ved behandling med det egnede restriksjonsenzym (eller enzymer) under betingelser som er kjente i teknikken, og de detaljer som er spesifisert av de kommersielt tilgjengelige restriksjons-enzymers produsenter, se for eksempel katalogen til New England Biolabs. Generelt blir ca. 1 pg plasmid eller DNA-sekvens spaltet ved hjelp av en enhet enzym i ca. 20 pl bufferoppløsning; i dette eksempel blir karakteristisk et overskudd av restriksjonsenzym benyttet for å sikre hel nedbrytning av DNA-substratet. Inkuberingstider på ca. 1-2 timer ved ca. 37° C virker godt, selv om variasjoner kan tolereres. Efter hver inkubering blir protein fjernet ved ekstraksjon med fenol/kloroform og kan følges av eterekstra-hering, og nukleinsyren gjenvinnes fra de vandige fraksjoner ved utfelling med etanol. Hvis ønskelig kan størrelses-separering av de spaltede fragmenter gjennomføres ved polyacylamidgel- eller agarosegelelektroforese ved bruk av standardteknikker. En generell beskrivelse av størrelses-separering finnes i "Methods in Enzymology" (1980) 65:499-560.

Restriksjonsspaltede fragmenter kan være stumpendet ved behandling med det store fragment av E. coli DNA polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire deoksynukleotidtrifosfåter, dNTP'er, ved bruk av inkubasjonstider på ca. 15-25 minutter ved 20-25°C i 50 mM tris, pH 7,6, 50 mM NaCl , 6 mM MgCl2, 6 mM DTT og 5-10 jjM dNTP'er. Klenow-fragmentet fyller inn ved de 5' klebrige ender, men tygger tilbake fremragende 3' enkel tstrenger, selv om de fire dNTP'er er tilstede. Hvis ønskelig kan selektiv reparering gjennomføres ved å tilføre kun den ene av eller utvalgte dNTP'er innen de begrensninger som dikteres av arten av de klebrige ender. Efter behandling med Klenow blir blandingen ekstrahert med fenol/kloroform og etanol precipitert. Behandling under egnede betingelser med Sl-nukleaser resulterer i hydrolyse av enhver enkeltstrenget del.

Syntetiske oligonukleotider kan fremstilles ved triester-metoden til Matteucci et al., ("J. Am. Chem. Soc." (1981) 103:3185-3191 ) eller ved å benytte automatiserte syntese-metoder. Kinasering av enkelte strenger før sammensmelting eller for merking oppnås ved bruk av et overskudd, det vil si ca. 10 enheter polynukleotidkinase pr. 1 nmol substrat i nærvær av 50 mM tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinaseringen er for å merke proben, vil ATP inneholde høyspesifikk aktivitet 32 "yP.

Ligeringer gjennomføres i 15-30 pl volumer under de følgende standardbetingelser og temperaturer: 20 mM tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 pg/ml BSA, 10 mM NaCl, og enten 40 pM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 0°C "klebrig-ende""ligering) eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 14°C (for "stumpende"-ligering). Intermolekylær "klebrig-ende"-ligering gjennomføres vanligvis ved 33-100 pg/ml total DNA-konsentrasjon (5-100 nM total-endekonsentrasjon). Intermolekylær stumpende-ligering (vanligvis ved bruk av et 10-30 gangers molart overskudd av forbindere) gjennomføres ved 1 pM total sluttkonsentrasjon.

Ved vektorkonstruksjon ved bruk av "vektorfragmenter" blir vektorfragmentet vanligvis behandlet med bakteriell alkaliske fosfatase, BAP, for å fjerne 5'-fosfatet og forhindre religering av vektoren. BAP-nedbrytning gjennomføres ved pH 8 i ca. 150 mM tris i nærvær av Na<+> og Mg^<+> ved bruk av ca. 1 enhet BAP pr. pg vektor ved 60° c i ca. en time. For å gjenvinne nukleinsyrefragmentene blir preparatet ekstrahert med fenol/kloroform og etanol felt ut. Alternativt kan religering forhindres i vektorer som er dobbeltnedbrutt ved ytterligere restriksjonsenzymnedbrytning av de ikke-ønskede fragmenter.

C.5. Modifisering av DNA- sekvenser

For deler av vektorer avledet fra cDNA eller genom-DNA som krever sekvensmodifikasjon benyttes setespesifikk primer-rettet mutagenese. Denne teknikk er nå en standardteknikk og gjennomføres ved bruk av en primersyntetisk oligonukleotid som er komplementær til en enkeltstrenget fag-DNA som skal mutageniseres bortsett fra begrenset mistilpasning, som representerer den ønskede mutasjon. Kort sagt blir det syntetiske oligonukleotid benyttet som en primer for rettet syntese av en streng komplementær til fagen, og det resulterende dobbeltstrengede DNA transformeres til en fagbærende vertsbakterie. Kulturer av den transformerte bakterie såes ut i toppagar, tillates plaquedannelse fra enkelte celler som høster fagen.

Teoretisk vil 50$ av de nye plaquer inneholde fagen som, som enkelt streng har den muterte form; 50$ vil ha den opprinnelige sekvens. Plaquene hybridiseres med kinasert syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en nøyaktig tilpasning, men ved hvilken mistilpasningene med den opprinnelige streng er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plaquer som hybridiseres med proben blir så plukket opp, dyrket og DNA gjenvunnet. Detaljer for sete-spesifikke mutasjonsprosedyrer er beskrevet nedenfor i eksemplene.

C.6. Verifisering av konstruksjonen

I den nedenfor angitte konstruksjon blir korrekt ligering for plasmid-konstruksjon bekreftet ved først å transformere E. coli-stammen MM294 eller en annen vert med ligeringsblandingen. Vellykkede transformanter velges ved ampicillin-, tetracyklin- eller annen antibiotisk motstandsevne eller ved å benytte andre markører avhengig av metoden for plasmid-konstruksjonen, slik fagmannen vil forstå. Plasmider fra transformantene prepareres så i henhold til D.B. Clewell et al., "Proe. Nati. Acad. Sei" (USA) (1969) 62:1159, eventuelt fulgt av klorampfenikol-forsterkning (D.B. Clewell, "J. Bacteriol" (1972) 110:667). Den isolerte DNA analyseres ved restriksjon og/eller sekvenseres ved dideoksymetoden i henhold til F. Sanger et al., "Proe. Nati. Acad. Sei" (USA)

(1977) 74:5463, slik som ytterligere beskrevet av Messing et al., "Nucleic Acids Res." (1981) 1:309, eller ved metoden ifølge Maxam et al., "Methods in Enzymology" (1980) 65:499.

C. 7. Eksemplifiserte verter

Vertsstammer som benyttes ved kloning og ekspresjon er de følgende: For kloning og sekvensering, og for ekspresjon av konstruksjonen under kontroll av de fleste bakterielle promotere, ble E. coli-stammen MM294 oppnådd fra E. coli Genetic Stock Center GCSC #6135 benyttet som vert. For eksprimering under kontroll av PLNjjjjs-promoteren *>le E. coli-stamme K12 MC100 X-lysogen, N7<N>53cl857 SusP80, ATCC 39531 benyttet.

For M13 fag-rekombinanter benyttes det E. coli-stammer som er ømfintlige overfor fag-infeksjon, slik som E. coli K12-stamme DG98. DG98-stammen er deponert hos ATCC den 13. juli 1984 og har aksessnummer 39768.

Pattedyrekspresjon oppnås i C0S-7- og CV-l-celler.

D. Foretrukne utførelsesformer

Den rekombinante CSF-1 kan anses som et sett av muteiner som har tilsvarende, men ikke nødvendigvis identiske primære aminosyresekvenser, alle av hvilke viser eller er spesifikt spaltbare til et mutein som viser aktivitetsmønsteret som er karakteristisk for CSF-1, det vil si at de er i stand til å stimulere benmargceller til å differensiere til monocytter hovedsakelig, og, innen de begrensninger som er angitt i definisjonsseksjonen ovenfor, er immunoreaktive med antistoffer dyrket mot nativ CSF-1 og med reseptorene forbundet med CSF-l-aktivitet. Visse utførelsesformer av disse muteiner er imidlertid foretrukket.

Den primære sekvens som er vist i fig. 5 for mCSF-1 har den krevede aktivitet og er selvfølgelig blant de foretrukne utførelsesformer. Også foretrukket er muteiner hvori visse deler av sekvensen er endret enten ved utelatelse av, eller konservativ substitusjon av en eller flere aminosyrer i mCSF-1. Med en "konservativ" aminosyresubstitusjon menes en som ikke endrer proteinets aktivitetskarakteristika, og karakteriseres generelt ved kjemisk likhet i sidekjedene i de to seg imellom utbyttede rester. For eksempel kan sure rester konservativt erstattes av andre sure rester, basiske med basiske, hydrofobe med hydrofobe, voluminøse med voluminøse, og så videre. Graden av likhet som kreves avhenger selv-følgelig av hvori viktig aminosyren som erstattes er, og dennes art. Således er den foretrukne erstatning for cysteinrester serin og alanin; for aspartinsyrerester glutaminsyre; for lysin- eller argininrester histidin, leucin, isoleucin eller valin; for tryptofanrester, fenyl-alanin eller tyrosin; og så videre.

Regioner av CSF-l-proteinet som er mest tolerante overfor endring inkluderer de regioner med kjent lav homologi mellom human- og musearter (restene 15-20 og 75-84); regioner som gir ømfintlighet overfor proteolytisk spalting (restene 51 og 52 samt restene 191-193); cysteinrester som ikke deltar i disulfidbindinger, eller som ikke er absolutt nødvendige for aktiviteten (restene 158-224).

Derfor de CSF-1 muteiner spesielt foretrukne som karakteriseres ved utelatelse eller konservativ substitusjon av en eller flere aminosyrer og/eller en eller flere sekvenser av aminosyrer mellom posisjonene fra og med 158 til og med 224 i mCSF-1. Også foretrukket er de som karakteriseres ved utelatelse eller konservativ substitusjon av en eller flere av aminosyrene i posisjonene 51 og 52 og/eller posisjonene 191, 192 og 193 i mCSF-1. Fordi de representerer regioner med tilsynelatende lav homologi, er dannet foretrukket sett av utførelsesformer de som karakteriseres ved utelatelse eller konservativ substitusjon av en eller flere av aminosyrene i posisjonene 15-20 og/eller 75-84 i mCSF-1. Også foretrukket er de muteiner som karakteriseres ved utelatelse eller konservativ substitusjon av cysteinresten i en hvilken som helst posisjon som ikke er vesentlig for disulfid-bindings-dannelsen. Også foretrukket er de proteiner som karakteriseres ved utelatelse eller substitusjon av tyrosinresten i posisjon 59 i mCSF-1; spesielt substitusjon med en aspartinsyrerest.

E. Kloning og eksprimering av human CSF- 1

Det følgende illustrerer metodene som ble benyttet for å oppnå kodingssekvensen for human CSF-1, for å disponere denne sekvens i ekspresjonsvektorer og for å oppnå ekspresjon av det ønskede protein.

E.1. Rensing av nativ human CSF- 1 og probekonstruksjon Humanurin CSF-1 ble delvis renset ved standardmetoder som beskrevet av S,K. Das et al., "Blood" (1981) 58:630, fulgt av et affinitetsrensetrinn ved bruk av et rotte-monoklont antistoff mot murin CSF-1, kalt YYG106, festet til en Sepharose B-kolonne (E.R. Stanley, "Methods Enzymol." (1985) 116:564). Sluttrinnet i rensingen var reversfase HPLC i et 0,1$ TFA/30$ acetonitril - 0,1$ TFA/60$ acetonitril-buffer-system.

For MIAPaCa CSF-1 som ble fremstilt serumfritt ved induksjon med forbolmyristinacetat, ble cellesupernatanten underkastet kalsiumfosfat-gelkromatografi (i henhold til Das (supra)), fulgt av affinitetskromatografi ved bruk av lentillecitin (i stedet for ConA-affinitetstrinnet til Das), og så underkastet immunoaffinitetstrinnet ved bruk av YYG106 monoklont antistoff konjugert til Sepharose B og reversfase HPLC, begge som beskrevet ovenfor.

Urin- og MIAPaCa-proteiner som var renset til homogenitet, ble underkastet aminosyresekvensering ved bruk av Edman-nedbrytning på en automatisert sekvensør. Tilstrekkelig N-terminalsekvens av human CSF ble bestemt til å tillate konstruksjon av prober vist i fig. 3.

E. 2. Preparering av humangenomsekvensen

En humngenomsekvens som koder CSF-1 ble oppnådd fra Maniatis-humangenombiblioteket i en X-fag Charon 4 ved bruk av prober konstruert for å kode N-terminalsekvensen til humanprotein. Biblioteket var konstruert ved bruk av partiell Haelll/Alul-nedbrytning av humangenomet, ligering til EcoRI-forbindere og innskyting av fragmentene i EcoRI-nedbrutte Charon 4-fag. En Charon 4A-fag inneholdende CSF-l-sekvensen som bedømt ved hybridisering til probe som beskrevet nedenfor, og kalt pHCSF-1, er deponert ved ATCC den 2. april 1985 under aksessnummeret 40177. Ved senere studium av denne fag, ble det funnet at rearrangementer og/eller utelatelser var inntrådt og de korrekte sekvenser var ikke bibeholdt. Derfor ble en alternativ koloni oppnådd fra genombiblioteket på identisk måte og propagert for å bekrefte stabilitet ved replikasjon, kalt pHCSF-la, deponert ved ATCC 21. mai 1985 og gitt nr. 40185. pECSF-la inneholdt et 18 kb innskudd og var i stand til å generere restriksjonsenzym-nedbrytningselementer som også hybridiserte til probe, og ble benyttet for sekvensdeterminering og ytterligere probekonstruksjon som angitt nedenfor.

Hvis den CSF-l-kodende sekvens er tilstede i sin helhet, kan nærværet vises ved ekspresjon i C0S-7-celler som bestemt av Y. Gluzman, Cell (1981) 23:175. Prøvefragmentet klones inn i et plasmid avledet fra pBR322 som er modifisert for å inneholde SV40-replikasjonsopprinnelsen (pGRI, G. Ringold, "J. Mol. Appl. Genet" (1982) 1:165-175). De resulterende høykopiantallsvektorer transformeres inn i C0S-7-celler og uttrykkes av CSF-l-genet analysert efter 24, 48 og 72 timer ved radioreseptoranalysemetoden beskrevet av Das, supra. Ekspresjonen er under kontroll av de native CSF-l-kontroll-sekvenser. Hindlll-nedbrytningselementer av det omtrent 18 kb innskudd av pHCSF-la prøvet på denne måte, ga ikke ekspresjon, noe som antydet at Hindlll bryter ned til genet. Dette ble bekreftet ved efterfølgende kartlegging.

For initialsekvensering ble imidlertid et 3,9 kb Hindlll-fragment oppnådd fra pHCSF-la-fagen og klonet inn i M14-kloningsvektorer.

HindIII-fragmentet var partielt sekvensert og resultatene er vist i fig. 4 sammen med en avledet peptidsekvens. Den inneholder de korrekte kodoner for andelen av human CSF-1-proteinet for hvilket aminosyresekvensen var bestemt, som angitt i fig. 1. Nærværet av en intron på ca. 1400 bp ble avledet fra den tilgjengelige aminosyresekvens. I tillegg, og basert på genomsekvensen som koder aminosyrene 24-34 (se de overstrekede deler av fig. 4 og 5), ble 32-mer probe for cDNA-biblioteket konstruert og benyttet som beskrevet nedenfor.

I større detalj og for å oppnå genomklonet pHCSF-la, ble Maniatis-biblioteket identifisert og analysert ved bruk av to blandinger av oliogomerer vist i fig. 3. EK14 og EK15 ble valgt, selv om de andre oligomerer som er vist også kan brukes. En "full-lengde"-probe for N-terminalsekvensen, EK14 ble benyttet som en blanding av 16 35-merer. En kortere oligomer EK15 ble benyttet som en blanding av 64 18-merer. Fag-hybridisering til begge kinaserte prober ble plukket ut og dyrket ved infeksjon av E. coli DG98 eller en annen kompetent stamme.

Spesifikke betingelser for identifisering og analysering med EK14 og EK15 er som følger: for EK14 inneholdt bufferen 15$ formamid, 6 x SSC, pH 7,0, 5x Denhardfs, 20 mM natrium-fosfat, 0,2$ SDS og 50 jjg/ml denaturert laksesperma- DNA. Prehybridiseing og hybridisering ble gjennomført ved 42°C og filtrene ble vasket i 2 x SSC ved 52°C. For EK15 ble tilsvarende betingelser benyttet for hybridisering og prehybridisering bortsett fra for formamidkonsentrasjonen som var 0$; vaskingen skjedde ved noe lavere temperatur, 42°C. Det omtrent 18 kb DNA-inskudd isolert fra den positivt hybridiserende fag pHCSF-la ble behandlet med Hindlll og fragmentene underkastet elektroforese på agarosegel i henhold til Southern's metode. Gelene ble replikert på nitro-cellulosefiltre og filtrene ble analysert igjen med EK14 og EK15. Begge prober hybridiserte til et 3,9 kb fragment.

Det positive fragment ble skåret ut fra gelen, eluert og subklonet inn i HindiII-behandlet M13mpl9 for dideoksysekven-sering. En partialsekvens er vist i fig. 4. Understrekningen tilsvarer nøyaktig den tidligere bestemte N-terminalsekvens for human CSF-1; resten med punktsubskripter er homologe murinsekvensen.

I fig. 4 er 1,4 kb intronregionen mellom kodonene for aminosyrene 22 og 23, avledet fra humansekvensen bestemt fra det rensede protein, vist utranslatert. Sekvensen oppstrøms N-terminalresten inneholder den putative leder; translasjonen av porsjonen av denne leder umiddelbart nær det mature protein, som ble tentativt verifisert ved de preliminære resultater av sekvensering av cDNA-klonen (se nedenfor), er vist. Oppstrømsporsjonen er imidlertid ikke vist translatert; disse porsjoner er bekreftet ved sammenlikning med cDNA til å omfatte en intron.

Ytterligere sekvensering for å oppnå ca. 13 kb av det totale 28 kb gen viser at genet inneholder 9 exoner som er separert av 8 introner. Områdene av det mature protein cDNA tilsvarer nøyaktig de genomiske exonkodoner bortsett fra kodon 59 som ytterligere beskrevet nedenfor.

En ytterligere M14 subklon ble oppnådd ved nebrytning av Hindlll 3,9 kb fragmentet med Pstl for å generere et 1 kb Pstl/Pstl-fragment som inkluderer den kjente N-terminalsekvens og ca. 1 kb ytterligere oppstrøms sekvens.

E.3. cDNA som koder human CSF- 1

Den humanavledede pankreatiske karsinomcellelinje MIAPaCa-2 ble benyttet som kilde for mRNA for å bedømme prober og for dannelse av et cDNA-bibliotek som inneholder en intronløs form av den human CSF-l-kodende sekvens. MIAPaCa-cellelinjen produserer CSF-1 på et nivå omtrent 10 ganger under det til murin L-929-cellene.

Negativ kontroll mRNA ble fremstilt fra MIAPaCa-celler holdt i serumfritt medium, det vil si under betingelser der de ikke produserer CSF-1. Celler som produserer CSF-1 ble oppnådd ble reindusering av CSF-l-produksjonen efter fjerning av serumet.

Cellene ble dyrket til konfluens i rullekolber ved bruk av Dulbecco's Modified Eagles' Medium, DMEM, inneholdende 10$ fetalt kalveserum og produserer CSF-1 i en mengde av 2000-6000 enheter/ml. Cellekulturene ble vasket og reinkubert serumfritt for å undertrykke CSF-l-dannelse. For negative kontroller ble det ikke produsert noe påvisbart CSF-1 efter en dag eller to. Reinduserte celler ble oppnådd ved tilsetning av forbolmyristinsyreacetat (100 ng/ml) for å oppnå produksjon efter flere dager i en mengde av 1000-2000 enheter/ml.

mRNA ble isolert ved lysering av cellen i isotonisk buffer med 0,5$ NP-40 i nærvær av ribonukleosidvanadylkompleks (S.L. Berger et al., "Biochemistry" (1979) 18:5143), fulgt av fenolkloroformekstrahering, etanolprecipitering og oligo-dT-kromatografi, og det ble oppnådd et anriket mRNA-preparat. I større detalj ble celler vasket to ganger i PBS (fosfatbufret saltoppløsning) og resuspendert i IHB (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl2, pH 8) inneholdende 10 mM vanadyladenosin-kompleks (S.L. Berger et al., supra).

Et ikke-ioniske detergens av etylenoksydpolymertypen, NP-40, settes til 0,5$ for å lysere cellulære men ikke nukleære membraner. Kjerner fjernes ved sentrifugering med 1000 x g i 10 minutter. Den postnukleære supernatant tilsettes til 2 volumer TE (10 mM Tris, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 7,5) mettet fenol:kloroform (1:1) og justert til 0,5$ natriumdodecylsulfat (SDS), og 10 mM EDTA. Supernatanten ekstraheres igjen 4 ganger og fasesepareres ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter. RNA precipiteres ved justering av prøven til 0,25 M NaCl, tilsetning av 2 volumer 100$ etanol og lagring ved -20°C. RNA pelletiseres ved 5000 x g i 30 minutter, vaskes med 70$ og 100$ etanol og tørkes så. Polyadenylert (poly A<+>) mRNA oppnås fra det totale cyto-plasmiske RNA ved kromatografi på oligo-dT-cellulose (J. Aviv et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." (1972) 69:1408-1412). RNA oppløses i ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5$ SDS, pH 7,5) i en konsentrasjon av 2 mg/ml. Denne oppløsning oppvarmes til 65°C i 5 minutter og avkjøles så hurtig til 4°C. Efter å ha brakt RNA-oppløsningen til romtemperatur, justeres den til 0,4 M NaCl og føres langsomt gjennom en oligo-dT-cellulosekolonne som på forhånd er ekvilibrert med bindende buffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5, 0,05$ SDS). Gjennomløpet føres over kolonnen ytterligere 2 ganger. Kolonnen vaskes så med 10 volumer bindende buffer. Poly A<+->mRNA elueres med aliquoter ETS, ekstraheres én gang med TE-mettet fenolkloroform og precipiteres ved tilsetning av NaCl til 0,2 M og 2 volumer 100$ etanol. Dette RNA reprecipiteres 2 ganger, vaskes én gang i 70$ og så i 100$ etanol før tørking.

Det totale mRNA ble underkastet en 5-20 vekt-$ sukrose-gradientsentrifugering i 10 mM Tris HC1, pH 7,4, 1 mM EDTA og 0,5$ SDS ved bruk av en Beckman SW40-rotor ved 20° C og 27.000 omdr./min. i 17 timer. mRNA-fraksjonene ble så gjenvunnet fra gradienten ved etanolprecipitering og injisert i Xenopus-oocytter i standard translasjonsanalysen. Oocytt-produktene av RNA-fraksjonene ble analysert i benmargprolife-reringsanalysen (eller benmargprolifereringsanalysene til R.N. Moore et al., "J. Immunol." (1983) 131:2374, og til M.B. Prystowsky et al., "Am. J. Pathol." (1984) 114:149) og fraksjonene selv ble analysert ved dot-blot-hybridisering til en 32 mer probe tilsvarende DNA'et i det andre exon i genomsekvensen (exon II probe). (Overstrekningen i fig. 4 og 5 viser exon II proben.) Disse resultater oppsummert i fig. 7.

Den stiplede linje i fig. 7A viser responsen i benmarg-prolif ereringsanalysen av supernatantene fra Xenopus-oocyttene; fig. 7B viser dot-blot-resultatene. Den sterkeste hybridiserende fraksjon, 11, tilsvarer 18S, mens de mest aktive fraksjoner 8 og 9 tilsvarer 14-16S. Fraksjonene 8, 9 og 11 ble benyttet for å danne et anriket cDNA-bibliotek som beskrevet nedenfor.

(mENA'et ble også fraksjonert på en denaturerende form-aldehydgel, overført til nitrocellulose og probet med exon II probe. Diverse distinkte arter i størrelse fra 1,5 kb til 4,5 kb ble funnet, selv under stringente hybridiserings-betingelser. For å eliminere muligheten for multippelgener som koder CSF-1, ble nedbrytningselementer av genom DNA med forskjellige restriksjonsenzymer underkastet Southern-blot og probet ved bruk av pcCSF-17-DNA. Restriksjonsmønsteret var konsistent med nærværet av kun et gen som koder CSF-1.)

Den anrikede mRNA-samling ble fremstilt ved å kombinere mRNA fra gradientfraksjonene som hadde den høyeste benmargprolife-rative aktivitet, selv om evnen til å hybridisere til probe er relatiyt lav (14S-16S) med fraksjonene som hybridiserte mest intenst til probe (18S). Høyere molekylvektsfraksjoner som også hybridiserte til exon II probe ble ikke inkludert fordi tilsvarende mRNA fra ikke-induserte MIAPaCa-celler også hybridiserte til exon II probe.

cDNA-biblioteker ble fremstilt fra totalt eller anriket human mRNA på to måter. En metode benytter \gtlO-fagvektorer og er beskrevet av T.V. Huynh et al., i "DNA Cloning Techniques: A Practical Approach", IRL Press, Oxford 1984, D. Glover, utgiver.

En foretrukket metode bruker oligo-dT-priming av poly A-halene og av AMV-revers transkriptase under anvendelse av metoden til H. Okayama et al., "Mol. Cell. Biol." (1983) 3:280-289. Denne metode resulterer i en høyere andel full-lengde-kloner enn poly-dG-haling og benytter effektivt som vertsvektor andeler av to vektorer som der er beskrevet, og som lett kan oppnås fra forfatterne, pcDVl og pLl. De resulterende vektorer inneholdende innskuddet mellom vektorfragmenter inneholdende proksimale BamHI- og Xhol-restriksjonsseter; vektoren inneholder pBR322 replikasjonsopprinnelsen og Amp-resistansegenet og SV40-kontrollele-mentene som resulterer i vektorens evne til å gjennomføre ekspresjon av de innskutte sekvenser i C0S-7-celler.

Et 300.000 klonbibliotek oppnådd fra de ovenfor anrikede MIAPaCa mRNA ved metoden ifølge Okayama og Berg, ble så analysert under høystringente betingelser ved bruk av exon II proben. Ti kolonier som hybridiserte til probe ble plukket ut og kolonirenset. Disse kloner ble analysert på nærværet av CSF-1 kodende sekvenser ved transientekspresjon i C0S-7-celler. Kloningsvektoren som inneholdt SV40-promoteren ble benyttet per se ved transformeringen av C0S-7-celler.

Plasmid-DNA ble renset fra de 10 positive kloner ved bruk av en CsCl-gradient og C0S-7-cellene ble transfektert ved bruk av en modifikasjon (A.M. Wang et al., "Science" (1985) 228:149) av kalsiumfosfat-koprecipiteringsteknikken. Efter inkubering i tre dager ble CSF-l-produksjonen analysert ved å underkaste kultursupernatantene radioreseptoranalysen gjennomført i det vesentlige som beskrevet av S.K. Das et al., "Blood" (1981) 58:630, og en kolonistimulerings(benmarg-prolif ererings )analyse gjennomførte i det vesentlige som beskrevet av M.B. Prystowsky et al., "Am. J. Pathol." (1984) 114:149. 9 av de 10 kloner som ble plukket ut viste ikke transient CSF-l-produksjon i C0S-7-celler. Én klon som viste eksprimering ble dyrket, plasmid-DNA isolert og innskuddet sekvensert. DNA-sekvensen sammen med den deduserte aminosyresekvens er vist i fig. 5. Full-lengde-cDNA'et har 1,64 kb, og koder et maturt CSF-l-protein med 224 aminosyrer. Klonen ble kalt CSF-17 med Cetus deponer ingsnummer CMCC 2347 og er deponert hos ATCC den 14. juni 1985 under nummeret 53149. Plasmidet som bærer det CSF-l-kodende DNA ble kalt pcCSF-17.

E. 4 . Transientekspres. i on av CSF- 1

Ekspresjon av plasmid DNA fra CSF-17 (pcCSF-17) i C0S-7-celler ble bekreftet og kvatifisert ved bruk av benmargproli-fereringsanalysen, kolonistimuleringsanalysen og radioreseptoranalysen. Det skal påpekes at spesifisiteten for ben-margsprolifereringsanalyse for CSF-1 kun ligger i evnen for CSF-l-antiserum til å redusere aktiviteten; den til kolonistimuleringsanalysen i arten av de oppnådde kolonier. Begge analyser viste at CSF-l-produksjonen var av størrelsesorden flere tusen enheter pr. ml.

Benmargproliferering

For benmargstimuleringsanalysen som måler den biologiske aktivitet til proteinet, ble benmargceller fra Balb/C-mus behandlet med seriefortynninger av 72 timers supernatanter og proliferering av cellene ble målt ved opptak av merket tymidin, i det vesentlige som beskrevet av R.N. Moore et al., "J. Immunol." (1983) 131:2374; M.B. Prystowsky et al., "Am. J. Pathol." (1984) 114:149. Mediet fra induserte MIAPaCa-celler ble benyttet som kontroll. Spesifisiteten for CSF-1 ble bekreftet ved evnen til kanin-antisera dyrket mot humanurin-CSF-1, til å undertrykke tymidinopptaket. Resultatene for C0S-7-celle-supernatantene transfektert med pcCSF-27 (CSF-17-supernatant) ved en 1:16-fortynning er vist i tabell 1.

(Antihuman CSF-l-serum ble fremstilt som beskrevet av Das et al., supra. )

MIAPaCA-supernatanten (ved den 1:16-fortynning som ble benyttet ovenfor) inneholdt 125 enheter/ml CSF-aktivitet tilsvarende 2000 enheter/ml i den ufortynnede supernatant, der 1 enhet kolonistimulerende aktivitet defineres som den mengde CSF som er nødvendig til å produsere én koloni fra 10^ benmargceller/ml i analysen ifølge E.R. Stanley et al., "J. Lab. Clin. Med." (1972) 79:657.

Disse data viser at den benmargstimulerende aktivitet er forbundet med CSF-1 fordi tymidinopptaket inhiberes av anti-CSF-l-serum. Regresjon av resultatene i denne benmargprolife-reringsanalyse oppnådd ved fire fortynninger fra 1:8 til 1:64 ga en estimert aktivitet for CSF-1 i CSF-17-supernatanter på 2358 enheter/ml, som ble redusert til 424 enheter/ml i nærvær av antiserum, men viste en tilsynelatende økning til 3693 enheter/ml i nærvær av non-immunserum. Dette var sammenliknbart med nivåene som ble vist i radioreseptoranalysen nedenfor.

Kolonistimulering

Direkte analyse av CSF-17-supernatantene for kolonistimulering (E.R. Stanley et al., "J. Lab. Clin. Med." (supra) viste 4287 enheter/ml, noe som var i det vesentlige upåvirket av nærværet av non-immunserum, men redusert til 0 enheter/ml i nærvær av kanin-antihuman CSF-1. Dette stemmer overens med 2562 enheter/ml i MIAPaCa-supernatantene. 85$ av pcCSF-17 transformert C0S-7-supernatant induserte kolonier hadde mononukleær morfologi; MIAPaCa-supernatant induserte kolonier viste et makrofag : granulocytt-forhold på 94:6 i prosent.

Radioreseptoranalyse

Radioreseptoranalysen målte konkurransen mellom <125>I-merkedet CSF-1 og prøveforbindelsen for spesifikke reseptorer på J774.2 musemakrofagceller. MIAPaCa-supernatanten, analysert for kolonistimuleringsaktivitet som ovenfor, ble benyttet som en standard (2000 enheter/ml). CSF-l-konsentrasjonen i den pcCSF-17 transformerte C0S-7-supernatant ble funnet å være 2470 enheter/ml, basert på en 1:10-fortynning og 3239 enheter/ml basert på en 1:5-fortynning.

Således ble det funnet sammenliknbare verdier for CSF-l-konsentrasjonen i media av C0S-7-celler transformert med pcCSF-17 i alle analyser.

E.5. Stabil ekspresjon av CSF- 1

C0S-7-systemet gir rekombinant CSF-1 ved å tillate replikasjon av og ekspresjon fra vektor sekvensene. Det er et transient ekspresjonssystem.

Human CSF-l-sekvensen kan også stabilt uttrykkes i prokaryotiske eller eukaryotiske systemer. Generelt gir prokaryotiske verter lett produksjon, mens eukaryoter tillater bruk av den native signalsekvens og utfører den ønskede post-translasjonelle behandling. Dette kan være spesielt viktig når det gjelder CSF-1, fordi det native protein er en dimer. Bakterier produserer CSF-1 som en monomer som så ville underkastes dimeriseringsbetingelser efter ekstrahering.

Prokaryot ekspresjon

For prokaryot ekspresjon blir cDNA-klonen eller den genome sekvens der intronene er skåret ut, for eksempel ved setespesifikk mutagenese, endret for å plassere et ATG-startkodon umiddelbart oppstrøms glutaminsyren ved N-terminus, og et Hindlll-sete umiddelbart oppstrøms ATG for å gi et hensiktsmessig sete for innskyting i standardverten av ekspresjonsvektorene nedenfor. Dette kan skje direkte ved bruk av innskuddssete-spesifikk mutagenese med en syntetisk oligomer inneholdende en ny sekvens som er komplementær med den ønskede AAGCTTATG, flankert av nukleotidsekvenser komplementære med den native leder og N-terminal-kodingssekvensene.

For cDNA oppnådd ved bruk av metoden til Okayama og Berg, blir DNA-fragmentet inneholdende hele kodingssekvensen skåret ut fra pcCSF-17 ved nedbrytning med Xhol (på seter bibeholdt fra vertens kloningsvektor), isolert ved agarosegel-elektroforese og utvunnet ved elektroeluering. For å gjennomføre mutagenesen blir vertsbakteriofagen M13mpl8 DNA også behandlet med Sali og ligert med det rensede fragment under standardbetingelser og transfektert til frossen kompetent E. coli K12 stamme DG98. Cellene blir sådd ut på media inneholdende 5 x IO-<4> M isopropyltiogalaktosid (IPTG) oppnådd fra Sigma Chem. i St. Louis, og 40 jJg/ml X-gal. Ikke-komplementerende hvite plaquer plukkes inn i friske media. Mini-kulturer screenes for rekombinant enkeltstreng-fag-DNA av forventet størrelse og strukturen til den ønskede rekombinante fag bekreftes ved bruk av restriksjonsanalyse.

En 34-mer komplementær med N-terminalen og leder kodende deler av CSF-l-sekvensen, men inneholdende komplementet til den ønskde AAGCTTATG-sekvens, syntetiseres og renses i henhold til prosedyrene angitt i avsnitt C.4. En andel av dette 34-mer preparat radiomerkes i henhold til en modifikasjon av teknikken til Maxam og Gilbert (A. Maxam et al., "Methods in Enzymology" (1980) 68:521, Academic Press som angitt i C.4 ovenfor.

For å oppnå mutagenese blir den ovenfor fremstilte rekombinante bakteriofag preparert i E. coli K12-stamme DG 98 og enkeltstreng fag DNA renset. Et pmol enkeltstreng fag DNA og 20 pmol av den ovenfor angitte syntetiske nukleotidprimer (ikke kinasert) skjøtes ved oppvarming i 1 minutt ved 67° C og så 30 minutter ved 37° C i 15 pl 20 mM Tris-Cl, pH 8, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanol. Det skjøtede DNA inkuberes med DNA-polymerase I (Klenow) og 500 pM dNTP'er i 30 minutter, 0°C, og bringes så til 37° C. Aliquoter på 0,05 eller 0,25 pmol fjernes efter 5 minutter, 20 minutter henholdsvis 45 minutter, transformeres til E. coli K12 stamme DG98 og plateres.

Efter dyrkingene blir platene avkjølt til 4°C og plater løftet med PalI-membraner oppnådd fra Biodyne eller S&S-filtre (1-2 minutter i det første filter, mer enn 10 minutter for det andre filter). Filtrene denatureres i 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (5 minutter). Denatureringsmediet nøytraliseres med 3 M natriumacetat til pH 5,5 eller med 1 M Tris-Cl, pH 7,5, inneholdende 1 M NaCl, filtrene behandles ved 80°c i vakuum i en time og prehybridiseres så med høy stringens. Filtrene probes så med den kinaserte syntetiske 34-mer som ble fremstilt ovenfor ved høy stringens, vasket og autoradiografert over natt ved -70°C.

RF-formen av den ønskede muterte fag behandles med EcoRI, avstumpes med Klenow og brytes så ned med Eindlll for å skjære ut genet som et HindiI/stumpt fragment. (På strikt analog måte kan CSF-l-kodingssekvensen fra pMCSF oppnås og modifiseres.)

Dette fragment inneholdende human (eller murin) CSF-l-kodende sekvens ligeres så med Hindlll/BamEI (stump) nedbrutt pPLOP eller pTRP3 (se nedenfor) for å bringe kodingssekvensen inneholdende ATG-startkodonet umiddelbart nedstrøms Pl~ eller trp-promoteren. Disse resulterende plasmider transformeres til E. coli MC1000 X lysogen eller MM294, og cellene dyrkes under ikke-induserende betingelser og induseres ved midler hensiktsmessige for promoteren. Cellene høstes ved sentrifugering, sonikeres og frigjort CSF-1 oppløseliggjøres. Nærværet av human (eller murin) CSF-1 bekreftes ved å underkaste sonikatet kolonistimulerende analyse som angitt ovenfor.

Eukaryotisk ekspresjon

Okayama-Berg-plasmidet pcCSF-17 inneholdende den cDNA-kodende human CSF-1 under kontroll av SV4 0-promoteren kan også benyttes for å bevirke stabil ekspresjon i ape-CV-l-celler, opphavscellelinjen hvorfra C0S-7-linjen ble avledet. Vertsape-CV-l-cellene ble dyrket til konfluens og så kotransformert ved bruk av 10 pg pcCSF-17 og forskjellige mengder (1, 2, 5 og 10 pg) pRSV-NE02 (C. Gorman et all, "Science" (1983) 221:551-553) pr. 500.000 celler. Transformantene ble dyrket i DMEM med 10$ FBS-medium inneholdende 100 pg/ml G418-antibiotikum overfor hvilket pRSV-NE02-plasmidet gir motstandsevne. CV-l-cellelinjen viste en G418-transformasjonsfrekvens på 10~<5>'<12> kolonier pr. 10^ celler pr. pg DNA. CV-l-cellene ble kotransformert som beskrevet ovenfor og selektert i G418-holdig medium. Resistante kloner ble prøvet på stabilitet av den G418 resistente fenotype ved dyrking i G418-fritt medium og så tilbakeført til G418-holdig medium. Evnen for disse kulturer til å overleve ved tilbakeføring til antibiotikumholdig medium antyder at pRSV-NE02 DNA var integrert permanent inn i cellegenomet. Fordi celler stabilt transformert med et markørplasmid hadde ca. 50$ sannsynlighet for å ha integrert DNA fra det kotransfekterende plasmid, ville halvparten av disse celler også inneholde pcCSF-17 DNA i deres kromosome DNA.

Flere kloner av de G418-resistente samlinger av CV-l-celler som ble vist å være stabilt transformert som ovenfor, ble plukket og dyrket i duplikatkolber til nær konfluens. En kolbe av hvert duplikat ble infektert med SV-40-virus ved en infeksjonsmultiplisitet på 5, og mediet ble høstet 6 dager efter infeksjon for analyse med henblikk på CSF-1 ved bruk av radioimmunoanalyse. Immunoanalysen er basert på konkurranse mellom <125>I-merket MIAPaCa CSF-1 for "kanin 52" polyklont antiserum mot renset humanurin CSF-1.

En av de selekterte CV-l-kloner viste 2335 enheter/ml produksjon av CSF-1 i henhold til denne analyse, mens celler som ikke var infektert med SV-40 viste mindre enn 20 enheter/ml. Kontroller ved bruk av C0S-7-celler transformert med 10 jjg pcCSF-17 viste 2400 enheter/ml CSF-l-produksj on uten SV-40-infeksjon.

Den CSF-l-produserende CV-l-cellelinje inneholder pcCSF-17 DNA stabilt integrert i sitt genom, og kan således benyttes for stabil produksjon av CSF-1 ved infeksjon med SV-40. Infeksjonen antas å "redde" pcCSF-17 DNA fra genomet, og gir det SV-40 T-antigen som er nødvendig for replikering av det reddede DNA. Uten SV-40-infeksjon blir det integrerte pcCSF-17 DNA ikke effektivt uttrykt.

Optimalisering av ekspresjonen av den CSF-l-kodende sekvens med CV-1 (CSF-17)-cellelinje viste 6500-8000 enheter/ml, målt ved radioimmunoanalyse seks dager efter SV-40-infeksjon ved bruk av en infeksjonsmultiplisitet på minst 1, og et 10$ FBS-medium. Studier på ekspresjonsnivåer ved en multiplisitet på 10 viste sammenliknbar produksjon, men denne ble redusert ved fjerning av FBS fra mediet på den andre dag efter infeksjon.

I alternative kan egnede kontrollsystemer og vertsvektorer som tillater ekspresjon i eukaryotiske verter benyttes for å motta CSF-l-kodende innskudd. For eksempel kan man benytte CHO-celler og egnede vektorer, slik som beskrevet i USSN 438.991 av 1. november 1982.

E.6. Aktiviteten til CSF- 1

Ytterligere definisjon av aktiviteten til CSF-1 ble tilveie-brakt ved bruk av partielt renset MIAPaCa CSF-1 eller murin L-celle CSF-1 som modeller for CV-l-produsert rekombinant materiale. CSF-1- ble vist å øke produksjonen av interferon og tumornekrosefaktor (TNF) ved induserte humanmonocytter med optil en faktor 10. CSF-1 ble også vist å stimulere makro-frag-antitumor-toksisiteten.

Stimulering av TNF- produks. ionen av humanmonocytter

MIAPaCa CSF-1 ble renset fra supernatanten ved kalsiumfosfat-gelfiltrering og lentillectin-kromatografi. For analyse av lymfokinproduksjonen ble perifere blod-adherente celler inkubert i duplikatflasker inneholdende IO<7> celler hver. En ble behandlet med 1000 enheter/ml CSF-1 renset som ovenfor. Efter 3 dager ble cellene høstet og vasket og resuspendert i en cellekonsentrasjon på 5 x 10<5>/ml og platert i 24-brønners plater med 0,5 ml/brønn. Brønnene ble behandlet med 10 jjg/ml LPS og 20 ng/ml PMA i 48 timer og supernatantene ble høstet for TNF-analyse. Celler behandlet med CSF viste TNF-sekresjoner omtrent 9 ganger høyere enn de ubehandlede celler, nemlig 1500 sammenliknet med 162 enheter/ml.

Stimulering av interferonproduksjon ved humanmonocytter

I et analogt forsøk for å bestemme virkningen av CSF-1 på interferonproduksjonen ble perifere blod-adherente celler inkubert i 3 dager i nærvær og fravær av 1000 enheter/ml CSF-1, som beskrevet ovenfor, høstet, resuspendert ved 5 x 10^/ml og platert i en plate med 25-brønner, som beskrevet ovenfor. Cellene ble indusert for interferonproduksjon ved tilsetning av varierende mengder poly IC. Supernatantene ble analysert på interferonproduksjon ved deres cytopatiske virkning på VSV-infekterte GM 2504-celler. De CSF-l-stimulerte celler viste produksjon av 100 enheter/ml når de var indusert med 50 jjg/ml poly IC, som beskrevet av F. McCormick et al., "Mol. Cell. Biol." (1984) 4:166, mens sammenliknbart induserte ubehandlede celler produserte mindre enn 3 enheter/ml. Stimulering av myeoloid CSF- produks. ionen ved humanmonocytter Monocytter ble inkubert ± CSF-1 i 3 dager og så indusert for produksjon av myeoloid CSF som i tabell 1. De tre representa-tive eksperimenter som vises, benyttet blod fra forskjellige donorer.

Stimulering av tumorcelledreping ved murinmakrofag; Sammenlikning med andre kolonistimulerende faktorer

For å analysere makrofagstimulering ble murin CSF-1 oppnådd fra L-celle-kondisjonert medium benyttet som en modell for rekombinant fremstilt CSF-1 fra pcCSF-17 i en analyse som vist stimulering av evnen til murinmakrofager å drepe sarkommål. I denne analyse ble normale 2 hr adherente C3H/EeN-museperitoneale makrofager inkubert i 1 dag in vitro med og uten CSF-1 og så blandet i et 20:l-forhold med <3>H-tymidin-merkede musesarkom TU5-celler sammen med 10% volum/volum conA-indusert (10 jjg/ml) miltlymfokin (LK), som inneholdet "y-interf eron. Frigivelsen av merket tymidin i løpet av de følgende 48 timer ble brukt som mål på tumor-celleavlivning. Virkningen av tilsetning av CSF-1 som murin-L-celle-kondisjonert medium inneholdende 1200 enheter/ml CSF-1 er vist i den følgende tabell.

Økningen i evnen til å avlive målcellene ble notert uansett om CSF-1 ble tilsatt under den preliminære første vekstdag eller under induksjonsperioden; imidlertid ble de mest dramatiske virkninger observert når CSF-1 var tilstede under begge disse perioder.

Muligheten for kontaminert bakteriell lipopolysakkarid, LPS, som årsak for stimulering av monocytter og makrofager ble ekskludert: LPS-innholdet for det tilførte CSF-1 var lavt (<0,3 ng/3000 enheter CSF-1, ved Limulus amoebocyttlysatana-lyse); aktiviteten ble fjernet ved påføring til en anti CSF-1-kolonne; polymyksin B ble benyttet for å nøytralisere LPS; makrofagene fra C3E/EeJ-mus responderte på CSF-1, men ikke på

LPS.

CSF-GM ble fremstilt fra 6 muselunger oppnådd 5 timer efter intravenøs administrering av 5 pg LPS. Lungene ble hakket opp og inkubert i 3 dager i serumfritt medium og supernatanten ble utarmet på CSF-1 ved bruk av en YYG106-affinitetskolonne (CSF-l-innholdet ble redusert fra 270 til 78 enheter/ml). CSF-G ble fremstilt fra på samme måte behandlet LDI-serumfritt medium. Både CSF-GM- og CSF-G-innholdet ble analysert til 2000 enheter/ml ved kolonnestimulerende analyse.

De peritoneale makrofager ble inkubert med 40$ av et av de foregående media eller med L-cellemedium analysert til 2000 enheter/ml CSF-1 i 1 dag, og derefter inkubert i 48 timer enten med ytterligere medium eller med LK, og analysert på TU5-avlivning som beskrevet ovenfor.

Resultatene er vist i fig. 6. Mens CSF-1 viste markert økning

i toksisiteten overfor TU5, hadde hverken CSF-G eller CSF-GM noen virkning.

Stimulering av murin- antiviral- aktivitet

Adherente murin-tioglykolat-elisiterte makrofager ble inkubert med CSF-1 i 3 dager og infektert med VSV over natten. Polymyksin B ble satt til testprøvene for å blokkere LPS-induksjon av interferon. Den følgende tabell viser krystallfiolettflekken av celler som forble adherente.

CSF-1-behandlede celler viste derfor beskyttelse av makrofagen mot VSV.

E.7. Formulering av CSF- 1

Det rekombinant produserte human CSF-1 kan formuleres for administrering ved bruk av standard farmasøytiske prosedyrer. Vanlig CSF-1 vil fremstilles i injiserbare former og kan benyttes enten som eneste aktive bestanddel eller i kombina-sjon med andre proteiner eller andre komponenter med komplementære eller tilsvarende aktivitet. Slike andre forbindelser kan inkludere alternative antitumormidler slik som adriamycin lymfokiner, slik som IL-1, -2 og -3, a-, g- og -y-interf eroner og tumornekrosef aktor. Virkningen av den CSF-1-aktive bestanddel kan økes eller forbedres ved nærvær av slike ytterligere komponenter. Som beskrevet ovenfor kan CSF-1 reagere gjensidig på fordelaktig måte med egnede blodceller og preparatene som kan oppnås på basis av oppfinnelsen inkluderer derfor inkuberingsblandinger av slike celler med CSF-1, eventuelt i nærvær av ytterligere lymfokiner. Hvilke som helst av supernatantfraksjonene av slike inkuberingsblandinger eller hele blandingen inneholdende cellene også kan benyttes.

F. Murin CSF- 1

Det fremstilles en intronløs DNÅ-sekvens som koder murin CSF-1 ved bruk av en murin fibroblastcellelinje som produserer store mengder CSF-1. L-929-linjen, oppnåelig fra ATCC, benyttes som kilde for mRNA for å fremstille et cDNA-bibliotek. Ved bruk av oligomere prober konstruert på basis av den kjente murin N-terminal og CNBr-spaltede interne peptidsekvens, probes dette cDNA-bibliotek for å finne hele kodingssekvensen for murin-formen av proteinet. Murin CSF-1 antas å være omtrent 80$ homologt til det humane materiale på grunn av homologien for N-terminalsekvensene, evnen til både human- og murin-CSF-l-preparater å stimulere makrofagkolonier fra benmargceller, og begrenset kryssreaktivitet med henblikk på radioreseptor- og radioimmunoanalyser (S.K. Das et al., "Blood" (1981) 58:630).

F. 1. Proteinrensing

Murin CSF-1 ble renset ved standardmetoder tilsvarende de som er beskrevet av E.R. Stanley et al., "J. Immunol. Meth."

(1981 ) 42:253-284 og F.F. Wang et al., "J. Cell. Biochem."

(1983) 21:263:275, eller SDS-gelelektroforese som angitt av M.w. Hunkapiller et al., "Science" (1984) 226:304.

Aminosyrene 1-39 i murinsekvensen ble oppnådd ved å trekke fordel av cyanogenbromid-spaltingen i posisjon 10 for å utvide nedbrytningsprosedyren. Et internt spaltingsfragment fra museprotein ble også oppnådd og sekvensert.

Totale sammensetningsdata for museproteinet ble også oppnådd som vist nedenfor. Disse data viser korrekt relativ mol-% for disse aminosyrer som viser god gjenvinning; imidlertid er tallene ikke absolutte da histidin og cystein ikke ble gjenvunnet i godt utbytte.

Omdanningen til rest/125 var basert på en tilnærming av sekvenslengden fra molekylvekten.

F.2. Fremstilling av murin CSF- 1 cDNA

Amiosyresekvensen 5-13 i murin CSF-1 og den interne sekvens ble brukt som basis for probekonstruksjonen.

Det ble fremstilt 3 sett oligomerer tilsvarende murinsekvensen. Én sekvens ble preparert for å kode "region A", det vil si aminosyrene 9-13; den neste for "region B", det vil si syrene 5-9, som vist i fig. 2; en tredje for å kode posisjonene 0-6 i en intern sekvens, "region C". På grunn av kodonrikeligheten er hver av disse klasser oligomere sterkt degenerert.

Således; 15-merer konstruert på basis av region A nummer 48; 14-merer konstruert på basis av region B (under utelukkelse av siste nukleotid av kodonet for histidin) også nummer 48; 20-merer konstruert på basis av region C nummer 32. Sagt på en annen måte, en 15-mer konstruert for å kode region A kan ha en mistilpasning i fire av de femten posisjoner; en spesiell 14-mer konstruert med henblikk på region B kan ha en mistilpasning i 6 posisjoner; en spesiell 20-mer konstruert med henblikk på region C kan ha en mistilpasning i 5 posisjoner.

Som beskrevet ovenfor og ved egnet protokollkonstruksjon, kan en anriket meddeler-RNA-fraksjon finnes for fremstilling av det ønskede anrikede murin-cDNA-bibliotek, og de nøyaktige korrekte oligomerer for bruk som prober også sikres.

Totalt meddeler-RNA ekstraheres og renses fra murin L-929-celler. Murin L-929-celler dyrkes i 8 dager på DME-medium og høstes så ved sentrifugering. Total cytoplasmisk ribonuklein-syre (RNA) ble isolert fra cellene ved den samme protokoll som angitt ovenfor for MIAPaCa mRNA.

Dette mRNA fraksjoneres på gel for Northern blot som beskrevet i paragraf C.3. 15-mer-sekvensene tilsvarende region A deles i 4 grupper på 12 hver. Hver av disse grupper ble benyttet for hybridisering under lav stringens både til kontroll- og til murin L-929 mRNA-elementer og de resulterende mønstre ble betraktet ved radioautografi. Under de benyttede lavstringensbetingelser syntes hybridisering å skje til fraksjoner som ikke inneholdt den riktige sekvens, så vel som til de som gjorde dette. Videre, fordi kontrollcelle-linjen er forskjellig fra den til L-929-linjen på måter forskjellig fra det ikke å kunne fremstille CSF-1, synes hybridisering i et antall lokasjoner ikke relatert til CSF-1 i L-929-cellegeler som ikke er tilstede i kontrollene.

Komparable sett av kontroll- og L-929-geler probes med segreganter av de 48 14-merer som representerer region B og segreganter av de 32 20-merer som representerer region C. Kun båndene av meddeler-RNA som hybridiserer utelukkende i L-929-elementer for hver av regionene A og B, og C prober, blir så tatt ytterligere i betraktning.

RNA-båndet som fortsetter å binde til en av A-region 15-mer-blandingen eller en av region B 14-mer-blandingen og en av region C 20-mer-blandingen under betingelser med økende høyere stringens, selekteres.

Når det korrekte mRNA-bånd er funnet, blir hver av gruppene i region A 15-merer benyttet for å probe ved forskjellige stringensbetingelser. Gruppene som binder ved høyeste stringens inneholder antagelig den korrekte 15-mer som eksakt komplementerer den fremstilte mRNA. Den korrekte 15-mer sikres ved ytterligere splitting av preparatet inntil en enkelt oligomer finnes som binder med høyest stringens. En tilsvarende tilnærming benyttes for å sikre den korrekte 14-mer og den korrekte 20-mer som binder til region B eller C. Disse spesifikke oligomerer er så tilgjengelige som prober i et murin cDNA-bibliotek som fremstilles fra den anrikede mRNA-fraksjon.

mRNA-fraksjonen som identifiseres som inneholdende kodingssekvensen for CSF-1 oppnås så i preparativ målestokk. Ved denne fremstilling blir poly A<+> mRNA fraksjonert på en sukrosegradient i 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA og 0,5$ SDS. Efter sentrifugering i en Beckman SW40-rotor ved 30.000 omdr./min. i 17 timer, gjenvinnes mRNA-fraksjoner fra gradienten ved etanol-precipitering. RNA-fraksjoner gjenvunnet fra gradienten ble hver injisert i Xenopus-oocytter i en standard translasjonsanalyse og produktene analysert med henblikk på CSF-1 ved bruk av radioimmunoanalyse med antistoffer dyrket mot murin CSF-1. Fraksjoner for hvilke positive resultater ble oppnådd, ble slått sammen og benyttet til å konstruere cDNA-biblioteket. De samme fraksjoner hybridiserer til de oligomere prober.

Andre metoder for fremstilling av cDNA-biblioteker er selvfølgelig velkjente i denne teknikk. En, nå klassisk, metode bruker oligo-dT-primere, revers transkriptase, halefølging av den dobbeltstrengede cDNA med poly dG og sammensmelting til en egnet vektor som pBR322 eller et derivat derav, som er spaltet på det ønskede restriksjonssete og tilpasset med poly DC. En detaljert beskrivelse av denne alternative metode finnes for eksempel i US-SN 564.224 av 20. desember 1983.

I den her benyttede metode, blir anriket mRNA (5 jjg) denaturert ved behandling med 10 mM metylkvikksølv ved 22 °C i 5 minutter og detoksifisert ved tilsetning av 100 mM 2-merkaptoetanol (F. Payvar et al., "J. Biol. Chem." (1979) 254:7636-7642 ). Plasmid pcDVl spaltes med Kpnl, tilpasses med dTTP og festet til det denaturerte mRNA. Dette oligo-dT-primede mRNA behandles med revers transkriptase og den nettopp syntetiserte DNA strengen tilpasses med dCTP. Til slutt blir den uønskede del av pcDVl-vektoren fjernet ved spalting med Hindlll. Separat blir pLl spaltet med Pstl, tilpasset med dGTP, spaltet med Hindlll og så blandet med poly T tilpasset mRNA/cDNA-kompleks utvidet med pcDVl-vektorfragmentet, ligert med E. coli-ligase og blandingen behandlet med DNÅ-polymerase I (Klenow) E. coli-ligase samt RNase H. De resulterende vektorer transformeres inn E. coli K12 MM294 til AmpR.

Det resulterende cDNA-bibliotek screenes så ved bruk av oligomerprober identifisert som komplementære til mRNA-kodingssekvensen som beskrevet ovenfor. Kolonier som hybridiseres til prober fra regionene A eller B og C plukkes ut og dyrkes; plasmid DNA isoleres og plasmider inneholdende innskudd av tilstrekkelig størrelse til å kode hele sekvensen av CSF-1 isoleres. Sekvensen av innskuddet for hvert av disse plasmider bestemmes og et plasmidpreparat inneholdende hele kodingssekvensen inkludert regionene A og B i oppstrømsdelen kalles pcMCSF.

F. 3. Ekspresjon av murin CSF- 1 DNA

På en måte tilsvarende den som er angitt ovenfor for human cDNA, blir murin cDNA prøvet på transient ekspresjon i COS-celler og benyttet for ekspresjon i stabilt transformert CV-1. I tillegg blir de egnede HindIII/ATG-kodende sekvenser innskutt oppstrøms det mature protein ved mutagenese og kodingssekvensene innskutt i pPLOP eller pTRP3 for pro-karyotisk ekspresjon.

G. Vertsvektorer

pPLOP er en vertekspresjonsvektor med P^-promoteren og N-gen-ribosom-bindingssete nær et Eindlll-restriksjonsspaltings-sete, noe som tillater hensiktsmessig innskyting av en kodingssekvens med en ATG-startkodon foregått av et Hindlll-sete. Skjelettet av denne vektor er et temperatur-sensitivt høykopi-plasmid avledet fra pCS3. pPLOP ble deponert ved ATCC den 18. desember 1984 og har aksessnummeret 39947.

pTRP3 er en vertsekspresjonsvektor inneholdende en trp-promoter umiddelbart oppstrøms et Hindlll-restriksjonssete, noe som tillater innskyting av en kodingssekvens på en måte

analog den ovenfor for pPLOP. Skjelettvektoren for pTRP3 er pBR322. pTRP3 ble deponert ved ATCC den 18. desember 1984 og har aksessnummeret 39946.

Konstruksjon av pPLOP

Repl ikas. ionsopprinnelse

pCS3 gir en replikasjonsopprinnelse som gir et høyt kopitall av pPLOP-vertsvektoren ved høye temperaturer. Konstruksjonen er beskrevet i utstrakt grad i US-SN 541.948 av 14. oktober 1983. pCS3 ble deponert den 3. juni 1982 og gitt ATCC nr. 39142.

pCS3 er avledet fra pEW27 og pOP9. pE¥27 er beskrevet av E.M. Wong, "Proe. Nati. Acad. Sei." (USA) (1982) 79:3570. Det inneholder mutasjoner nær replikasjonsopprinnelsen som sørger for temperaturregulering av kopitallet. Som et resultat av disse mutasjoner skjer replikasjon i et høyt kopitall ved høye temperaturer, men ved lavt kopitall ved lavere temperaturer .

pOP9 er et høykopitall-plasmid ved alle temperaturer og som ble konstruert ved innskyting i pBR322 av det EcoRI/PvuII opprinnelsesholdige fragment fra Col El-typen plasmid p0P6 (D. Gelfand et al., "Proe. Nati. Acad. Sei" (USA) (1978) 75.:5869). Før innskyting ble dette fragment modifisert som følger: 50 pg pOP6 ble nedbrutt fullstendig med 20 enheter hver av BamHI og Sstl. For å eliminere de Sstl 3'-fremspring-ende ender og å fylle inn BamHI 5'-endene, ble det nedbrutt pOP6 DNA behandles med E. coli DNA-polymerase I (Klenow i en totrinnsreaksjon først ved 20° C for eliminering av den 3' Sstl-fremragende ende og ved 9°c for å reparere 5'-enden. Det stumpendede fragment ble nedbrutt og 0,02 pmol benyttet for å transformere kompetent DG75 (P. 0'Farrell et al., "J. Bacteriology" (1978) 134:645-654). Transformanter ble selektert på L-plater inneholdende 50 p/ml ampicillin og screenet for en 3,3 kb utelatelse, tap av et SSt I-sete og nærværet av et nydannet BamHI-sete.

En kandidat kalt pOP7 ble valgt og BamHI-setet utelatt ved nedbrytning av 25 jjg pOP7 med 20 enheter BamHI, reparering med E. coli DNA polymerase I fragment (Klenow), og religering med T4 DNA-ligase. Kompetent DG75 ble behandlet med 0,1 pg av DNA og transformanter valgt på L-plater inneholden 50 pg/ml ampicillin. Kandidater ble screenet for tap av BamHI-restriksjonssete. p0P8 ble valgt. For å oppnå pOP9 ble Aval(reparert)/EcoRI Tet<R->fragmentet fra pBR322 preparert og isolert og ligert til det isolerte PvulI(partielle)/EcoRI 3560 bp-fragment fra pOP8.

Ligering av 1,42 kb EcoRI/Aval(reparert) Tet<R> (fragment A) og 3,56 kb EcoRI/Pvul I Amp<R> (fragment B), benyttet 0,5 jjg fragment B og 4,5 jjg fragment A i en totrinnsreaksjon for å favorisere intermolekylær ligering av EcoRI-endene.

Kompetent DG75 ble transformert med 5 jjI ligeringsblanding og transfor-mantene selektert på ampicillin (50 jjg/ml )-holdige plater. p0P9, isolert fra Amp<R> Tet<R->transformanter viste høyt kopitall, kolicin-resistens, enkle restriksjonsseter for EcoRI, BamHI, PvuII, Hindlll, to restriksjonsseter for HincII og det egnede sete og Haelll-nedbrytningsmønster.

For å oppnå pCS3 ble 50 jjg pEw27 DNA nedbrutt fullstendig med PvuII og EcoRI. På samme måte ble 50 pg pOP9 nedbrutt fullstendig med PvuII og EcoRI og 3,3 kb-fragmentet ble isolert.

0,36 pg (0,327 pmol) pEW27-fragmentet og 0,35 jjg (0,16 pmol) pOP9-fragmentet ble ligert og benyttet for å transformere E. coli MM294. Amp<R> Tet<R->transformantene ble selektert. Brukbare kolonier ble til å begynne med screenet ved 30° C og 41° C på p<->laktamase-analyseplater og således for plasmid DNA-nivåer efter dyrking ved 30° C og 41°C. En vellykket kandidat, kalt pCS3, ble bekreftet ved sekvensering.

Fremstillin<g> av P^Npgg- innskuddet

DNA-sekvensen inneholden PL-fagpromoteren og ribosombindings-setet for N-gen (Njjgg) ^le oppnådd fra pFC5 og til slutt fra et derivat av pKC30 beskrevet av Shimatake og Rosenberg, Nature (1981) 292:128. pKC30 inneholder et 2,34 kb-fragment fra X-fag klonet inn Hindlll/BamHI-vektorfragmentet fra pBR322. P^-promoteren og Njjgg opptar et segment i pKC30 mellom et Bglll og Hpall-sete. Derivatet av pKC30 har Bglll-setet omdannet til et EcoRI-sete.

Bglll-setet som ligger umiddelbart foran Pj^-promoteren ble omdannet til et EcoRI-sete som følger: pKC30 ble nedbrutt med Bglll, reparert med Klenow og dNTP'er og ligert med T4-ligase til en EcoRI-forbinder (tilgjengelig fra New England Biolabs) og transformert inn i E. coli K12-stammen MM294 X<+>. Plasmider ble isolert fra Amp<R> Tet<R->transformanter og den ønskede sekvens bekreftet ved restriksjonsanalyse og sekvensering. Det resulterende plasmid, pFC3, ble dobbelt-nedbrutt med Pvul og Hpal for å oppnå et ca. 540 bp fragment, isolert og behandlet med Klenow og dATP, fulgt av Sl-nuklease, for å oppnå et stumpendet fragment med 3'-terminalsekvensen-AGGAGAA, der -AGGAGA-delen er NjjgS. Dette fragment ble begrenset med EcoRI hvorved man oppnådde et 347 bp DNA-fragment med 5'-EcoRI (klebrig)- og Hinfl (partiell repara-sjon, Sl-stump)-3'-termini.

For å fullføre pFC5 ble pPl-Z15 benyttet for å danne et Hindlll-sete 3' på Nggg. p<g>I-Z15 ble deponert den 13. januar 1984 ved ATCC under nummeret 39578, og ble fremstilt ved å kople en sekvens inneholdende ATG pluss 140 bp P-IFN smeltet til lac-Z til pBR322. I p3l-Z15 er EcoRI-setet av pBR322 bibeholdt og innskuddet inneholder et Hindlll-sete umiddelbart foran ATG-startkodonet av g-IFN. pgI-Z15 ble begrenset med Hindlll, reparert med Klenow og dNTP'er og så nedbrutt med EcoRI. Den resulterende EcoRI/Hindlll (reparerte) vektorfragment ble ligert med det ovenfor nevnte EcoRI/Hinfl (reparerte) fragment, og ligeringsblandingen ble benyttet til å transformere MC1000-39531. Transformanter inneholdende den vellykkede konstruksjon ble identifisert ved evnen til å vokse på laktose-minimale-plater ved 34°C, men ikke ved 30°C.

(Transformasjoner ble platert på X-gal-Amp-plater ved 30°C og 34°C og minimal-laktoseplater ved 30°C og 34°C. Transformanter med den riktige konstruksjon er blå på X-gal-Amp-plater ved begge temperaturer, men på minimal-laktoseplater vokser de kun ved 34°C.) Den vellykkede konstruksjon ble kalt pC5 .

Fullføring av pPLOP

pCS3 ble så modifisert for å tilveiebringe P^- og Nj>bs~ kontrollsekvensene. pCS3 ble nedbrutt med Hindlll og så nedbrutt med EcoRI. Vektorfragmentet ble ligert med et isolert EcoTI/Hindlll fra pFC5 inneholdende PlnRBS°& transformert inn i E. coli MM294. Den korrekte konstruksjon av isolert plasmid DNA ble bekreftet ved restriksjonsanalyse og sekvensering og plasmidet kalt pPLOP.

Fremstilling av pTRP3

For å konstruere vertsvektoren inneholdende trp-kontrollsekvensene bak et Hindlll-sete, ble trp-promoter/operator/- ribisomsbindingssetesekvensen uten attenuatorregionen oppnådd fra pVH153 oppnådd fra C. Yanofsky, Stanford University. Trp-sekvenser er tilgjengelige i en varietet av slike plasmider kjent i denne teknikk. pVH153 ble behandlet med Hhal (som kutter og efterlater en eksponert 3' klebrig ende akkurat 5' fra trp-promoteren) stumpendet med Klenow, og partielt nedbrutt med Taql. 99 bp fragmentet tilsvarende restriksjonen ved Taql-setet, 6 nukleotider før ATG-startkodonet til trp-lederen, ble isolert, og ligert til EcoRI (reparasjon)/ClaI nedbrutt, pR322 for å tilveiebringe pTRP3.

Den 2. april 1985 har søkerne ved ATCC, Rockville, USA deponert fagen pHCSF-1 i E. coli DG 98, aksessnr. 40177. Den 21. mai 1985 ble pHCSF-la, kalt CMCC 2312 i Cetus collection og pHCSF-1 X Charon 4A for avsetning ble deponert ved ATCC og har aksessnr. 40185. Den 14. juni 1985 ble CSF-17 i E. coli MM294, kalt CMCC 2347, deponert på ATCC under nummeret 53149. Disse deponeringer skjedde under Budapest-traktens be-stemmelser og søkeren ønsker ekspertløsningen.

Claims (3)

1. Ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke kolonistimulerende faktor med aminosyresekvens ekvivalent med human mCSF-l-aminosyren 1 til 158 i sekvensen som vist i figur 5, inkludert konservative substitusjoner eller delesjoner av en eller flere aminosyrer deri, karakterisert ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte protein, operativt forbundet med egnede transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser for ekspresjon av mCSF-1 i egnede vertsceller.

2. Rekombinante vertsceller, karakterisert ved at de er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 1, operativt forbundet med egnede kontroll-sekvenser omfattende en promoter, et ribosombindingssete og et bakterielt initieringssete for å lette ekspresjonen av CSF-1.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv, rekombinant CSF, karakterisert ved at den omfatter dyrking av rekombinante vertsceller ifølge krav 2, operativt forbundet med egnede kontroll-sekvenser omfattende en promoter, et ribosombindingssete og et bakterielt initieringssete for å lette ekspresjonen av CSF-1, hvorefter det rekombinante protein isoleres.