HU215241B - Eljárás telepstimuláló faktor-1 új formáinak előállítására, valamint az eljárásban alkalmazható expressziós kazetta, vektor és rekombináns gazdasejtek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás hűmán CSF–1 NŃ3 vagy NŃ2 műteinjénekelőállítására. A találmány értelmében úgy járnak el, hőgy egy legalábba következő aminősavszekvenciával rendelkező műteint: i) NŃ–3 vagy NŃ–2(SCSF)CŃ150, vagy ii) NŃ–3 vagy NŃ–2(LCSF)CŃ150, vagy iii) az i) vagy ii) aminősavszekvencia módősítőtt alakja, amelyben 1–5aminősav helyettesítve van vagy hiányzik, – ahől SCSF jelentése a CSF rövid főrmája, LCSF jelentése a CSF hősszúfőrmája, és a Ń jelölés egy vagy több hiányzó aminősavat jelent az N-terminális végen, vagy azt műtatj , hőgy a mőlekűla C-terminálisánálegymást követő aminősavak kiiktatása következtében csőnkőlt–,mimellett a fenti műteinek dimerjei serkentik a primer makrőfágtelepek képződését az in vitrő CSF– vizsgálatban,kódőló DNS-szekvenciát gazdasejtben ismert módőn kifejeznek. A találmány kiterjedaz új eljárásban alkalmazható expressziós kazetta, vektőr ésrekőmbináns gazdasejtek előállítására is. ŕ

Description

A jelen találmány rekombináns technológia alkalmazásával foglalkozik limfokinek előállítására, amelyek normálisan csak kis koncentrációban termelődnek. Pontosabban a jelen találmány humán telepstimuláló faktor1 -et (CSF-1) kódoló új DNS szekvenciák klónozásával és kifejezésével foglalkozik. A sokféle szövetben, igen kis koncentrációban termelődő egyes faktoroknak az a képessége, hogy stimulálják a csontvelő progenitor sejtek növekedését és fejlődését granulocitákká és/vagy makrofágokká, már csaknem 15 éve ismert. Az ilyen faktorok jelenléte a szérumban, vizeletmintákban és szövetkivonatokban egy sor fajnál mutatható ki olyan in vitro mérést alkalmazva, amely a félig szilárd tenyésztő közegre szélesztett csontvelősejtek által kialakított telepképződés stimulálását végzi. Nem ismeretes viszont értékelhető in vivő vizsgálat. Mivel ezek a faktorok ilyen telepek képződését indukálják, ezeket együttesen telepstimuláló faktoroknak (CSF) nevezik.

Legutóbb kimutatták, hogy a humán CSF fehéqéknek legalább négy alosztálya van, amelyek a keletkezett telepekben talált sejtek típusai szerint határozhatók meg. Az egyik alosztály, a CSF-1 olyan telepeket eredményez, amelyek zömmel makrofágokat tartalmaznak. Más alosztályok olyan telepeket alakítanak ki, amelyek mind neutrofíl granulocitákat, mind makrofágokat tartalmaznak; amelyek túlnyomórészt neutrofil granulocitákat tartalmaznak; és amelyek neutrofil és eozinofil granulocitákat és makrofágokat tartalmaznak.

A fenti humán CSF-ek közül az első háromnak vannak analóg rágcsáló faktorai. Ezeken kívül van egy olyan rágcsáló faktor, amelyet IL-3-nak neveznek; ez rágcsáló csontvelő sejtekből olyan telepeket indukál, amelyek mindhárom sejttípust tartalmazzák, valamint tartalmaznak megakariocitákat, eritrocitákat és hízósejteket (mást cells) különböző kombinációkban. Ismeretes a humán IL-3 is. Ezekről a CSF-ekről az alábbi összefoglalók jelentek meg: Dexter T. M.: Natúré, 309, 746 (1984); Vadas M. A. és munkatársai, J. Immunoi. 130, 793 (1983); Metcalf D.: Science, 229, 16-22 (1985); Clark S. C. és munkatársai; Science, 236, 1229-1237 (1987).

A jelen találmány olyan fehéqék rekombináns termelésére vonatkozik, amelyek ezen alosztályok közül az elsőnek, a CSF-l-nek tagjai. Ezt az alosztályt tovább jellemezték és körvonalazták fajlagos radioimmunoassay-val és radioreceptor méréssel - például tisztított CSF-1 ellen kialakult antitestek képesek fajlagosan elnyomni a CSF-1 aktivitást anélkül, hogy hatnának a többi alosztály biológiai aktivitásaira, és a J774 makrofág sejtvonal olyan receptorokat tartalmaz, amelyek fajlagosan kötődnek a CSF-1-hez. Ezeknek a vizsgálatoknak a leírását Das S. K. és munkatársai közölték [Blood, 58, 630, (1981)].

Közölték különböző CSF fehéqék tisztítási módszereit is.

Stanley E. R. és munkatársai [J. Bioi. Chem. 252, 4305 (1977)] beszámoltak rágcsáló L929 sejtekből CSF fehérje tisztításáról mintegy 1Ί0⁸ egység/mg fajlagos aktivitásra, amely CSF főleg a makrofág termelést stimulálja. Waheed A. és munkatársai [Blood, 60, 238 (1982)] leírják egér L-sejt eredetű CSF-1 tisztítását látszólagos homogenitásig, nyúl antitest oszlopot alkalmazva; a rágcsáló szekvencia első 25 aminosaváról is beszámoltak [Ben-Avram C. M. és munkatársai: Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA), 882, 4486 (1985)].

Stanley E. R. és munkatársai [J. Bioi. Chem. 252, 4305-4312 (1977)] beszámoltak egy CSF-1 tisztítási eljárásról emberi vizeletből; Das S. K. és munkatársai [Blood, 58, 630 (1981)] 5-10⁷ egység/mg fajlagos aktivitású humán vizelet-eredetű CSF-1-et kaptak, amely csak makrofág telepeket képez; ebben a közleményben körvonalazzák a tenyésztett egér L-sejtekből és emberi vizeletből készített CSF-1 fehérjék glikozilezésének kapcsolatát aktivitásukkal. Wang F. F. és munkatársai [J. Cell. Biochem. 21, 263 (1983)] 10⁸ egység/mg fajlagos aktivitású humán vizelet-eredetű CSF-1-et izoláltak. Waheed A. és munkatársai ismertették humán vizelet-eredetű CSF-1 tisztítását 0,7-2,3-10⁷ egység/ml fajlagos aktivitásra nyúl antitest oszlopon [Exp. Hemat. 12, 434(1984)].

Wu M. és munkatársai beszámoltak CSF fehérjék előállításáról tenyésztett humán pankreász-karcinoma (MIAPaCa) sejtekből, amely fehérjék rágcsáló granulocitás és makrofág telepek növekedését idézik elő. Az így létrejött fehéije mintegy 7-10⁷ egység/mg fajlagos aktivitással rendelkezik [J. Bioi. Chem. 254, 6226(1979)].

Különböző CSF-ek részben tisztított készítményeiről is beszámoltak humán és egét tüdősejt kondicionált közegből [Fojo S. S. és munkatársai, Biochemistry, 17, 3109 (1978)]; [Burgess A. W. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 252, 1998 (1977)]; humán T-limfoblaszt sejtekből [Lusis A. J. és munkatársai: Blood, 57, 13 (1981)]; 4,438,032 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás); humán placenta kondicionált közegből látszólagos homogenitásig és 7-10⁷ egység/ml aktivitásig [Wu M. és munkatársai: Biochemistry, 19, 3846 (1980)].

A CSF fehérjék, főleg a CSF-1, bármilyen hasznos tevékenységre való felhasználásának az a jelentős nehézsége, hogy nem áll rendelkezésre megfelelő mennyiségben elkülönült és jellemezhető formában ahhoz, hogy gyakorlati gyógyászati alkalmazása lehetséges legyen.

[Egy különböző alosztály, az egér és humán GM-CSF, CSF fehérjéjét tisztították és a cDNS-eket klónozták. Erről a fehérjéről kimutatták, hogy eltér a többi CSF-től, például a CSF-l-től, amint ezt Gough és munkatársai leírták [Natúré, 309, 763-767, (1984)]. Ezt a GM-CSF fehérjét leírják továbbá a W087/02060 PCT közzétételi iratban, amelyet 1987. április 9-én publikáltak; leírják, hogy alkalmas rákos betegek kezelésére, hogy a hagyományos rákkezelés után a leukocitákat regenerálja, és csökkenti a vírusos, bakteriális, gombás és parazitás fertőzések valószínűségét, például a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) esetében. Az egéreredetű IL-3-at Fung M. C. és munkatársai klónozták [Natúré, 307, 233 (1984)]. Humán és gibbon IL-3-at klónoztak Yang Y. C. és munkatársai [Cell, 47, 3-10 (1986)] és Dorssers L. és munkatársai (Gene,

HU 215 241 Β

1987, nyomtatás alatt). A témakörrel kapcsolatban lásd még az alábbi irodalmi helyeket: Yokota T. és munkatársai: PNAS 81, 1070-1074 (1984); Wong G. G. és munkatársai: Science, 228, 810-815 (1984); Lee F. és munkatársai: PNAS, 82, 4360—4364 (1985) és Cantrell M. A. és munkatársai: PNAS, 82, 6250-6254 (1985)}.

A humán CSF-1 egyik formáját kódoló cDNS klónozásáról, főleg az alábbiakban pcCSF-17-nek jelzett kiónról, már szintén beszámoltak [Kawasaki E. S. és munkatársai: Science, 230, 292-296 (1985)]; WO 86/04607 számú PCT közzétételi irat, amelyet 1986. augusztus 14-én publikáltak. A humán CSF-1 egyik „hosszú formáját” kódoló klón kinyerését közlik Wong G. G. és munkatársai [Science, 235, 1504—1509 (1987)], valamint Ladner és munkatársai [EMBO J. 6, 2693-2698 (1987)].

A jelen találmány a humán CSF-1 és rágcsáló CSF-1 eddig le nem írt formáival foglalkozik. A találmány főleg a humán és a megfelelő egér fehéijék különböző „hosszú” formáit ismerteti, valamint a rövid formából származó speciális új muteineket.

így egyik szempontja szerint a jelen találmány humán és rágcsáló CSF-1 fehérjék új alkészleteivel (huCSF-1 és muCSF-1) foglalkozik és az ezeket a fehérjéket kódoló DNS-ekkel. Az itt ismertetett fehérjék bizonyos speciális kiviteli módokban mintegy 522 aminosavat tartalmaznak, vagy az ilyen hosszúságú natív szekvenciákból származó fragmentumokat és/vagy muteineket; mások a pcCSF-17 által kódolt fehérje egyedi vagy kettős helyettesítési muteinjei. A hosszú formával rokon humán fehéijéket leltjük a 2. ábrában bemutatott aminosav szekvenciához viszonyítva (ezt LCSF-nek nevezzük), és a rövid formával rokon humán fehérjéket leírjuk az 1. ábrában bemutatott aminosav szekvenciához viszonyítva (ezt SCSF-nek nevezzük).

Egy további szempont szerint a találmány ezeknek a fehérjéknek az előállításában használatos anyagokra és módszerekre, az ezeknek az előállításában alkalmazható módosított mikroorganizmusokra és sejtvonalakra, az előállítás javított módszereire, az ezeket az anyagokat tartalmazó, gyógyszerészeti és terápiás alkalmazásokban használható kompozíciókra, és az ezeknek a kompozícióknak a felhasználási módszereire vonatkozik.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat:

Az 1. ábra a DNS és kikövetkeztetett aminosav szekvenciákat mutatja be egy olyan cDNS kiónnál, amely a humán CSF-1 „rövid” formáját (SCSF) kódolja; ezt a cDNS-Ι pcCSF-17nek nevezzük.

A 2. ábra a cDNS és kikövetkeztetett aminosav szekvenciát mutatja be olyan cDNS-hez, amely a huCSF-1 „hosszú” formáját (LCSF) kódolja.

A 3. ábra a genomiális klón diagramja, amely bemutatja a humán CSF-1 rövid és hosszú formáinak eredetét.

A 4. ábra a cDNS és kikövetkeztetett aminosav szekvenciát mutatja be egy 4 kb-s, muCSF-1-et kódoló rágcsáló klónnál.

Az 5. ábra a cDNS- és kikövetkeztetett aminosav szekvenciát mutatja be egy 2 kb-s, hasonló muCSF-l-et kódoló rágcsáló kiónnál.

A 6. ábra az E. coliban, egy SCSF/CV158 kódoló gén kifejezéséből termelt rekombináns CSF-1 RP-HPLC-jeit mutatja be.

A 7. ábra az E. coliban, egy asp₅₉ SCSF/CV150 kódoló gén kifejezéséből termelt rekombináns CSF-1 RP-HPLC-ját mutatja be.

A 8. ábra a megfelelő N-terminális kiiktatott forma, az asp₅₉ SCSF/NV2CV150 RP-HPLC elemzését mutatja be.

A 9. ábra az asp₅₉ SCSF/NV3CV150 kódoló gén kifejeződési termékének RP-HPLC-jét mutatja be.

Az alábbiakban a találmány megvalósításának módjait írjuk le.

A) Meghatározások

A „telepstimuláló faktor-1 (CSF-1) aktivitással bíró fehérje” kifejezés olyan fehérjére vonatkozik, amely olyan aktivitás spektrumot mutat, amelyet a szakterületen a CSF-1-re értenek - azaz amikor a standard in vitro telepstimuláló vizsgálatban [Metcalf D.: J. Cell. Physiol. 76, 89 (1970)] alkalmazzák, az elsősorban makrofág telepek képződését idézi elő. A natív CSF-1 glikozilezett dimer: bizonyos esetekben a dimerizálásról úgy gondoljuk, hogy szükséges az aktivitáshoz. A találmány oltalmi körén és a CSF-1 definícióján belül értjük mind a dimer, mind a monomer formákat. A monomer formát dimerré alakíthatjuk megfelelő körülmények in vitro kialakításával, ez a monomer önmagában is alkalmas antigénként, hogy antiCSF-1 antitesteket állítson elő.

Úgy tűnik, van bizonyos faj-specifitás. A humán CSF-1 működőképes mind humán, mind rágcsáló csontvelő sejteken; a rágcsáló CSF-1 nem mutat aktivitást humán sejtekkel. Ennek megfelelően a humán CSF-1-nek pozitívnak kell lennie a fajlagos rágcsáló radioreceptor vizsgálatban [Das S. K. és munkatársai: Blood, 58, 630, (1981)], bár nincs szükségszerűen teljes korreláció. A fehéije biológiai aktivitását általában gátolja a humán vizelet-eredetű CSF-1-et semlegesítő antiszérum (Das S. K. és munkatársai: fentebb idézett munka). Bizonyos speciális körülmények között azonban (például, ahol egy adott antitest készítmény egy, a biológiai funkció szempontjából nem esszenciális CSF-1 epitópot ismer fel, amely epitóp nincs jelen az adott, vizsgálandó CSF-1 muteinben) ez a kritérium nem elégül ki.

A CSF-1 bizonyos egyéb tulajdonságait nemrégiben ismerték fel, ezek közé tartozik ennek a fehéijének az a képessége, hogy stimulálja E prosztaglandinok sorozatának, interleukin 1-nek és interferonnak a kiválasztását érett makrofágokból [Moore R. és munkatársai: Science, 223, 138 (1984)]. Ez utóbbi aktivitások mechanizmusát jelenleg még nem értjük, és a meghatározás céljára, a meghatározás teljesítéséhez, a kritériumok azok a képességek maradnak, hogy a megfelelő fajokból, mint kiindulási anyagokból származó csontvelősejteket alkalmazva stimulálja a monocita/makro3

HU 215 241 Β fág telepek képződését; ezt az aktivitást bizonyos körülmények között (lásd fentebb) gátolhatja egy tisztított humán vizelet-eredetű CSF-1 elleni semlegesítő antiszérum; és válasza pozitív a radioreceptor mérésre. (Ismeretes, hogy a CSF-1 sejtosztódást kiváltó hatása a mononukleáris fagocitás sejtcsaládra szorítkozik [Stanley E. R.: The Lymphokines (1981); szerkesztők: Stewart W. C. és munkatársai, kiadó: Humana Press, Clifton, New Jersey; 102-132 oldal), és hogy a CSF-1 receptorai ezekre a sejtvonalakra (Byme Ρ. V. és munkatársai: Cell. Bioi. 91, 848 (1981) és a placenta tropoblaszt-rokon sejtekre szorítkoznak].

Mint az összes fehérje esetében, a pontos kémiai szerkezet számos tényezőtől függ. Amikor ionizálható amino- és karboxilcsoportok vannak jelen a molekulában, egy adott fehérjét megkaphatunk savas vagy bázisos só formájában, vagy semleges formában. Minden olyan készítményt, amely megőrzi aktivitását, amikor megfelelő körülmények közé helyezzük, beleértünk ebbe a meghatározásba. A primer aminosavszekvenciát, továbbá, ha ez megtehető az aktivitás elpusztítása nélkül, oxidációval vagy redukcióval módosítani lehet, vagy meg lehet toldani származék képzéssel cukor-gyököket (glikozilezés) vagy más kiegészítő molekulákat, például lipideket, foszfátokat, acetilcsoportokat stb. alkalmazva; a legközönségesebb a szacharidokkal történő konjugálás.

Az itt ismertetett gének által kódolt fehérjéket fel lehet dolgozni proteolízissel is. Úgy véljük, hogy a CSF-1 előfordulhat a természetben egy vagy több, Cterminálison deléciós formában. A primer aminosav szerkezet (akár meg van rövidítve a C-terminálisnál, akár nem) szintén aggregálódhat, komplexeket képezve, leggyakrabban dimereket. A natív humán vizeleteredetű CSF-1-et 45-90 kD-os, nagy mértékben glikozilezett dimerként izoláljuk, a mérési módszertől és a mérést végző személyétől függően. Különböző más forrásokból, például monocitákból, HL-60-ból és PanC sejtvonalakból származó natív humán CSF-1-ek hasonló jellemzőkkel bírnak. A MIAPaCa-eredetű CSF-1 glikozilezett dimer fehérjék komplex keverékének tűnik 70; 48; 40; 30 és 26 kD molekulatömegű monomerekkel, amint ezt SDS-PAGE-val végzett immunfoltképzéssel meghatározták. Az ilyen bővítés bizonyos formáit a termelő gazdaszervezet transzláció utáni feldolgozó rendszere végzi el; más ilyen módosításokat in vitro lehet elvégezni. Az ilyen módosítások mindenesetre csak addig esnek a meghatározás körén belül, amíg a fehérje aktivitása, amelyet fentebb meghatároztunk, nem szenved csorbát. Természetesen várható, hogy az ilyen módosítások mennyiségileg vagy minőségileg hatnak az aktivitásra, vagy csökkentve vagy növelve a fehérje aktivitását a különböző mérésekben. Azt azonban mi mutattuk ki, hogy bizonyos mérésekben a nem glikozilezett monomernek is lehet aktivitása.

A deglikozilezett monomer molekula tömegét tanulmányozták, de határozott következtetéseket nem tudtak levonni annak a nehézségnek a következtében, hogy nehéz biztosítani a proteolízis hiányát a fermentáció és a tisztítás során és a deglikozilezési reakcióban. Ennek a deglikozilezett dimemek a molekulatömegét Das S. K. és munkatársai csak 14-17 kD-nak írták le (J. Bioi. Chem. 257, 13679-13684). A rekombináns úton termelt CSF-l-ről Wong G. G. és munkatársai számoltak be (1987, fentebb idézett munka), mintegy 21 kD-nak határozva meg a molekulatömeget. Másrészt a CSF 224 aminosavat tartalmazó „rövid” formájánál (SCSF) kikövetkeztetett aminosavszekvencia alapján ez a 26 kD nagyság körül lehet, míg a „hosszú” formánál ez az 55 kD körüli értékre számítható ki. Amikor ezeknek a géneknek kiiktatásokkal rendelkező konstrukcióit fejezzük ki E. coli-ban (ahol a glikozilezés nem megy végbe), akkor természetesen lényegesen kisebb molekulatömegű fehéijék jönnek létre —17-18 kD SCSF/CV150-nél ez mintegy 30 kD LCSF/CV221-nél. Amikor LCSF-et vagy SCSF-et fejezünk ki emlős vagy rovar sejtekben, nagyobb molekulatömegeket kapunk, de azt nehéz megmondani, hogy ez milyen mértékben tulajdonítható a glikozilezésnek, és milyen mértékben a primer aminosavszekvenciának magának. Amint fentebb megállapítottuk, úgy tűnik, hogy a natív formában termelt fehéije valóban tartalmazhat C-terminális csonkításokat.

Természetesen jól ismert, hogy bakteriálisán termelt érett fehérjék, amelyeket közvetlenül megelőz egy ATG start kodon, tartalmazhatnak vagy nem tartalmazhatnak egy N-terminális metionint abban az állapotban, ahogy termelik és kinyerik ezeket. Következésképpen mindkét forma ide értendő. Ezen kívül az N-terminális szekvencia enyhe módosítása segíthet az N-terminális metionin feldolgozásában, és az alábbiakban majd kimutatjuk, hogy az 1 - és 2-gyökök (mindkettő glutaminsav) vagy az 1-3. gyökök (glul-glu-val) kiiktatása segít ilyen módon. Következésképpen ezek a formák szintén határozottan benne vannak ebben a meghatározásban.

Azoknak a kifejezési termékeknek a megadásán kívül, amelyek hatékonyabban dolgozódnak fel az N-terminálisnál, ezek az NV2 és NV3 muteineket kódoló génekből az E. coli-ban termelt fehérjék viszonylag homogének, amikor ezt fordított fázisú HPLC-vel (RP-HPLC) becsüljük meg, összehasonlítva azokat a formákat kódoló génekből származó kifejezési termékekkel, amelyek megtartják a két N-terminális glutaminsav-gyököt. Ez a heterogenitás lehet az ezeknek a fehéijéknek a bakteriális kifejezéseivel együttjáró tünet, mivel ez nem jelenik meg, amikor a géneket emlőssejtekben, például CV-1 sejtekben fejezzük ki.

Ami az N-terminális módosítások hatását illeti az N-terminális metionin feldolgozására: amikor az érett fehérjét kódoló konstrukciókat fejezzük ki E. coli-ban, úgy tűnik, hogy lényegében a termelt fehérjék egyike sem dolgozódik fel úgy, hogy az N-terminális metionin eltávolítódjék - vagyis a fehérje tisztítás után kinyert minden szekvencia-elemzésnek alávetett anyag met-tel kezdődik. Ha azonban hasonló körülmények között NV2-deléciós CSF-1 muteineket kódoló megfelelő konstrukciókat fejezünk ki, a fehérje 23%-a az N-terminálison met-nélküli formájú. AzNV3 konstrukcióknál a fehéije százaléka, amely az N-terminálisnál úgy dolgozódik fel, hogy a metionin eltávolítódjék, mintegy 95%ra növekszik.

HU 215 241 Β

A heterogenitást illetően, amikor fordított fázisú HP_lC elemzést végzünk a különböző rekombináns konstrukciókból E. coli-ban termelt redukált CSF-1 fehérjéken, azok a konstrukciók, amelyek az érett N-terminálist kódolják, két szinten mutatnak heterogenitást. Először két csúcs van mintegy azonos molekulatömeggel és azonos látszólagos aminosav-összetétellel, ezek a csúcsok mintegy 70:30 területi arányt hordoznak. Van egy további csúcs is, amely egy belső újraindulásból ered, amely azokban a kiónokban fordul elő, amelyek az 59. gyöknél tirozint kódolnak, amint ez a 6. ábrán látható. Ez a komplikáció kiküszöbölhető a gén újratervezésével a 65. helytől felfelé, amint ezt az alábbiakban leírjuk. Azok a konstrukciók, amelyek az NV2 és NV3 formákat kódolják, és egy asp-ot kódolnak az 59. gyöknél, előnyösen GAT kodon révén, nem mutatják a belső újraindulási fragmentumot és csak egyetlen fehérjét mutatnak, amely az érett fehérje kompozíciók 70%os csúcsának retenciós idejével bír.

Összegezve: az N-terminális és C-terminális deléciókon és aggregálódásokon kívül egyes aminosav gyököket a láncon belül lehet módosítani oxidációval, redukcióval, vagy más származékképzéssel, és ezeket a fehérjéket lehet hasítani és/vagy aggregálni, hogy olyan fragmentumokat kapjunk, amelyek megőrzik aktivitásukat. Az ilyen változtatások, amelyek az aktivitást nem roncsolják el, nem zárják ki ezeket a fehérje-szekvenciákat a meghatározás köréből, ezek speciálisan ide értendők. Más fajokból származó CSF-1 is beilleszkedhet egy olyan fehérje-meghatározásba, hogy „humán” CSF-1 aktivitással bír, azon az alapon, hogy a kellő aktivitásmintát mutatja, amint azt a humán szubsztrátumra vonatkozólag leírtuk.

Az 1. ábra a pcCSF-17 rekombináns cDNS klón által kódolt humán CSF-1 egy adott formáját mutatja be. Ez a fehérje 224 aminosavat tartalmaz az érett szekvenciában, és tartalmaz egy 32 aminosavas vezető szekvenciát. Amint itt bemutatjuk, az ennek a kiónnak kifejezési termékeként termelt fehérje aktív a CSF-l-re fajlagos vizsgálatokban, nevezetesen a csontvelő sejtosztódási vizsgálatokban (ahol az aktivitást anti-CSF-1 antitestek hozzáadása szünteti meg), telepstimuláló vizsgálatokban és radioreceptor vizsgálatokban.

Az 1. ábrán szemléltetett, és az ott bemutatott cDNS klónból kikövetkeztetett aminosavszekvenciájú érett fehérjét rövid CSF-1-nek (SCSF) nevezzük. Az 1. ábra bemutatja egy 32 gyökös vélt szignálszekvencia jelenlétét, amely valószínűleg lehasad az emlőssejtekből való kiválasztáskor; az SCSF-et ebben az ábrában az 1-224 aminosavak képviselik. Találmányunkban speciálisan benne foglaltatnak azok a muteinek, amelyek az SCSF bizonyos rokon formáinak monomerjei és dimerjei, amelyeket itt az SCSF-től való eltéréseikkel jelölünk.

Kényelmi szempontokból az SCSF aminosavszekvenciáját alkalmazzuk referenciaként és más szorosan rokon szekvenciákat, amelyek CSF-1 aktivitással bírnak, úgy jelölünk, hogy az 1. ábrán bemutatott szekvenciára utalunk vissza. Mivel az N-terminális metionin vagy jelen van, vagy nincs, mindkét formát ideértjük minden esetben, ahol a CSF-1 fehérje termelődik baktériumokban. Egy adott aminosav behelyettesítését úgy jelöljük, hogy utalunk arra az aminosavgyökre, amelyet ez helyettesít. így például a ser₉₀SCSF olyan fehérjére utal, amely az 1. ábrán bemutatott szekvenciával bír, azzal a kivétellel, hogy a 90. helyzetnél lévő aminosav szerin cisztein helyett. A végződéseknél (terminálisoknál) lévő deléciókat NV-gel jelöljük, amelyet az N-terminális szekvenciából kiiktatott aminosavak száma követ, illetve CV-gel jelöljük és az utolsó aminosav helyzetével, amely megmarad, amikor gyököket iktatunk ki a C-terminális szekvenciából. így az „SCSF/NV4” vagy az „SCSF/NV4 formája” olyan 1. ábra szerinti CSF-lre utal, ahol az első 4 aminosav a natív N-terminálisról el van távolítva; az „SCSF/CV130” vagy az „SCSF CV130 formája” olyan CSF-l-re utal, ahol a 130. aminosavat követő 94 aminosav ki van iktatva. Az alábbiakban bemutatjuk majd például az asp₅₉SCSF-et (amely az 59. helyzetnél a gén által kódolt aszparaginsav gyököt tartalmaz a cDNS által kódolt tirozin gyök helyett) és az SCSF/CV158-at, amely az SCSF-nek csak az 1-158. aminosavait foglalja magában.

A CSF-1 fehérjéket, amelyek a kinyert „hosszú” formájú cDNS-ből következtetett aminosavszekvenciára vonatkoztatott aminosavszekvenciákat tartalmazzák - azaz amelyek a pcCSF-17 által kódolt fehérje 150. gyökénél beiktatva egy 298 aminosavas „extra” szegmenst foglalnak magukban - tekintjük a fehérje hosszú formáinak, és a 2. ábrán 1-522-ként bemutatott aminosav-szekvenciákat önkényesen LCSF-nek jelöljük. Itt is az a helyzet, hogy E. coli-ban végzett előállításnál metionin előzheti meg a szekvenciát, de hiányozhat is. Az LCSF muteinjeivel kapcsolatban a jelölések analógok azzal, amelyeket az SCSF-fel kapcsolatban fentebb leírtunk.

A például pcDBhuCSF-4-ben és ennek megfelelő kiónokban kódolt 522 aminosavas szekvencia az LCSF szekvenciája, és ezt lehet jelölni huCSF-l-nek is. A rágcsáló szekvenciáknál mindkét kinyert klón 520 aminosavat tartalmazó „hosszú” formát kódol. Ezt a két szorosan homológ szekvenciát együttesen muLCSF-l-nek jelöljük. Az itt alkalmazott rövidítések magukban foglalják a „huCSF-l”-et a fehérje összes humán formájára és a ,ynuCSF-l”-et a rágcsáló formáira.

Amint itt használjuk, a „diszkrét peptid” vagy „mutein” kifejezések olyan adott primer aminosavszekvenciára vonatkoznak, amely nem egy nagyobb szekvencia része. így ezek a kifejezések olyan peptidmolekulákra utalnak, amelyek nem rendelkeznek további Nés C-terminális aminosavszekvencia kiterjesztésekkel. A találmányunk szerinti, CSF-1 aktivitással bíró fehérjekészítmények azonban lehetnek ezeknek a diszkrét peptideknek vagy muteineknek monomerjei, dimerjei vagy egyéb aggregátumai.

A „működőképesen összekapcsolt” kifejezés olyan csatlakozási helyzetre utal, ahol a komponensek normális funkcióját végre lehet hajtani. így például, ha egy kódoló szekvencia „működőképesen összekapcsolt” kontroll szekvenciákkal, ez olyan kapcsolási konfigurá5

HU 215 241 Β dóra utal, ahol a kódoló szekvenciát ki lehet fejezni ezeknek a szekvenciáknak az ellenőrzése alatt.

A „kontroll szekvenciák” kifejezés olyan DNSszekvenciákra utal, amelyek egy működőképesen összekapcsolt kódoló szekvencia kifejezéséhez szükségesek egy bizonyos gazdaszervezetben. Azok a kontroll szekvenciák, amelyek prokariótákhoz alkalmasak, magukban foglalnak például egy promotert, adott esetben egy operátor-szekvenciát, egy riboszóma kötőhelyet, és esetleg más szekvenciákat is, amelyek szerepét még csak kevéssé értjük. Az eukarióta sejtekről tudjuk, hogy használnak promótereket, poliadenilező szignálokat és fokozókat (enhancer-eket).

A „kifejező rendszer” olyan DNS-szekvenciákra vonatkozik, amelyek egy kívánt kódoló szekvenciát és kontrollszekvenciákat tartalmaznak működőképes kapcsolatban, úgy, hogy az ezekkel a szekvenciákkal transzformált gazdaszervezetek képesek a kódolt fehérjék termelésére. Abból a célból, hogy a transzformálást végrehajthassuk, a kifejező rendszert egy vektorba lehet belefoglalni; a szóbanforgó DNS-t azonban lehet integrálni is a gazdaszervezet kromoszómájába.

A „sejt”, „sejtvonal” és „sejttenyészef ’ kifejezéseket, ahogyan itt használjuk, egymás között kicserélhetően alkalmazzuk, és minden ilyen kifejezés magában foglalja az utódokat is. így a „transzformánsok” vagy „transzformáit sejtek” kifejezések magukban foglalják a szóban forgó primer sejteket és a belőlük származó tenyészeteket, tekintet nélkül a transzferek számára. Lehetséges, hogy nem minden utód pontosan azonos a DNS-tartalmát illetően a szándékos vagy véletlen mutációk következtében. Azok a mutáns utódok, amelyek ugyanolyan működőképességgel bírnak az átvizsgálás során, mint az eredetileg transzformált sejtek, ide értendők. Ahol határozottan elkülönült jelöléseket szándékozunk alkalmazni, azt világosan jelezzük a szövegösszefüggésben.

A „hatékony mennyiség” kifejezés olyan mennyiséget fejez ki, amely hatékony a megadott funkció véghezviteléhez, például tumorok dőléséhez vagy tumorterhelés csökkentéséhez, vagy fertőző betegségek megelőzéséhez vagy gyógyításához.

B) CSF-1 termelése gyógyászati felhasználáshoz: a gén helyreállítása

Bár a CSF-1-nek jelölt aktivitási séma létezése már bizonyos ideje ismert, az ezért felelős fehéijét még sohasem kapták meg sem kellő tisztaságban, sem kellő mennyiségben, hogy szekvencia-meghatározást hajthassanak végre; és sem a tisztaság, sem a mennyiség nem volt elegendő, hogy hasznos gyógyászati tevékenységhez anyagként szolgáljon. Mivel sem a fehérjének teljesen tiszta gyakorlati mennyisége, sem az ezt kódoló DNS nem állt rendelkezésre, nem volt lehetséges optimalizálni a szerkezet módosítását muteinek előállításával, és nem volt lehetséges alkalmazni ezt a fehérjét terápiás összefüggésben sem.

A rekombináns technikák alkalmazása helyrehozza ezeket a hiányosságokat. Amint ezt a WO 86/04607 számú PCT közzétételi iratban ismertetik, izolált, humán vizelet-eredetű CSF-1 N-terminális szekvencián alapuló mintákat alkalmaztak, hogy átvizsgálják a humán genomkönyvtárat a teljes hosszúságú gén megszerzésére. A humán genomiális klónozott szekvenciát közvetlenül ki lehet fejezni saját kontroll szekvenciáit alkalmazva, vagy intronok feldolgozására képes emlős rendszerekhez megfelelő konstrukciókban. A genomiális szekvenciákat alkalmazták vizsgáló mintákként is CSF-1-et termelő sejtvonalból kapott humán cDNS-könyvtárhoz, hogy megkapják a CSF-1 aktivitással bíró fehéijét kódoló pcCSF-17 cDNS-t. Ezt a cDNS-t, ha megfelelő módon állították elő, ki lehet fejezni közvetlenül COS vagy CV-1 sejtekben, és gazdaszervezetek széles választékában kifejeződésre alkalmas vektorokba lehet építeni. Amint a fentebbi bejelentésben leírják, a primer szerkezet bizonyos módosításai szintén mutatnak CSF-1 aktivitást.

Találmányunk értelmében a fehéije 224 aminosavas formáját kódoló humán cDNS-t alkalmazzuk vizsgáló mintaként, hogy kinyerjük a rágcsáló CSF-1-et kódoló szekvenciákat egy olyan cDNS-bankból, amelyet CSF-1 termelési képességre előzőleg dúsított L-929 mRNS-ből állítottunk elő ÁgtlO-ben. Két kiónt nyerünk ki, amelyek egy hasonló 520 aminosavas fehérjét kódolnak. A konok drámai módon eltérnek a 3’ nem transzlatált területben. A hosszabb 4 kb-s rágcsáló kiónban a 3’ nem transzlatált terület több mint 2 kb nagyságú és kevéssé hasonló a megfelelő humán szekvenciához; a másik, 2 kb-nál rövidebb klón mintegy 500 bázispárt tartalmaz a nem transzlatált területben és jelentős homológiát mutat a megfelelő humán DNS-hez.

A CSF-1-nek ezeket a hosszú, rágcsáló könyvtárból kapott formáit alkalmazzuk ezután alapként, hogy vizsgáló mintákat állítsunk elő a megfelelő hosszú humán szekvencia helyreállítására, amelynek primer szerkezete a genomban kódolódik. A rágcsáló cDNS-eknek a humán genomiális szekvenciával való összehasonlítására alapozva a gén egyik területéről, amely néha intron területként viselkedik, úgy látjuk, hogy a rágcsáló szekvenciában található „extra” 298 aminosavas szegmenshez jelentős homológiát mutató aminosavszekvenciát kódol. Ez lehetővé teszi az „extra” DNS-re alapozva egy oligonukleotid vizsgáló minta megalkotását; ez az „extra” DNS rágcsáló rendszerben fehéijévé transzlatálódik. Mivel a humán genomiális szekvencia rendelkezésre áll, a vizsgáló mintát arra szánjuk, hogy helyreállítsuk a precíz humán szekvenciát.

A pcCSF-17-et Okayama-Berg vektorként állítjuk elő CSF-1-et kódoló anyagokban dúsított MIAPaCa mRNS-ből; a cDNS-könyvtárat viszont, amelyből a hosszú formát kódoló cDNS-t kapjuk, MIAPaCa sejtekből kivont teljes mRNS-ből készítjük és Ágt 10-be klónozzuk. A λ gtlO könyvtárat először átvizsgáljuk, vizsgáló mintaként pcCSF-17 szekvenciákat alkalmazva, és a kiválasztott, erre a vizsgáló mintára pozitív jelölteket átvizsgáljuk olyan oligonukleotid vizsgáló mintát alkalmazva, amely a rágcsáló cDNS „extra” transzlatált szekvenciáján alapul, de módosítva van, hogy megfeleljen a humán genomban levő rokon területnek. Számos kiónt nyerünk, amely egy humán fehérje megfelelő „hosszú” formáját tartalmazza.

HU 215 241 Β

A „hosszú” forma nyilvánvalóan az mRNS érésében (splicing) levő különbségből származik, amint ez a 3. ábrán látható. Az „extra” kódoló szekvencia az mRNSben a 6. exon felfelé eső végénél levő DNS-ből származik; ez az érés folyamán kivágódik a rövid formából. A különböző mRNS-ek által kódolt LCSF-ek eltérnek a 3’-végnél is (de a fehérje-szekvenciában nem). A fehérje „hosszú” formáját kódoló cDNS-t akár a rágcsáló, akár a humán rendszerekből hasonló módon lehet kifejezni, mint ahogyan ezt a rövid formánál fentebb megtárgyaltuk. A megfelelő gazdaszervezetek között vannak emlőssejtek, amelyeknél a primer fehérje termék hatásosabb feldolgozását kaphatjuk meg, és kifejező vektorokba való ligálás következtében a baktériumok, élesztők, rovarsejtek vagy egyéb gazdaszervezetek.

Az ezeknek a szekvenciáknak bármelyikét kódoló DNS hozzáférhetősége természetesen azt az előnyös lehetőséget nyújtja, hogy a kodon szekvenciáit úgy módosítsuk, hogy CSF-1 aktivitással rendelkező mutein formákat kapjunk.

így ezek az eszközök a teljes kódoló szekvenciát szolgáltathatják humán vagy rágcsáló CSF-l-hez, amelyekből gazdaszervezet rendszerek széles választékához alkalmazható kifejező vektorok alkothatok meg és a kódolószekvencia kifejezhető. A rendelkezésre álló gazdaszervezetek széles választéka az ilyen gazdaszervezetekhez alkalmas kifejező vektorokkal együtt lehetővé teszi a válogatást a transzláció utáni feldolgozó rendszerek között és lehetővé teszi az így termelt fehérje konformáció szabályozását szolgáltató környezeti tényezők kiválasztását.

Az előzőekből nyilvánvaló, hogy a CSF-1-et kódoló szekvencia részei alkalmasak vizsgáló mintaként, hogy újra alkossunk más CSF-1-et kódoló szekvenciákat fajok széles választékában. Következésképpen a legalább hat aminosavat kódoló cDNS vagy genomiális DNS részeit replikálhatjuk E. coli-ban és a denaturált formát alkalmazhatjuk vizsgáló mintaként, hogy újra alkossunk további, CSF-1-et kódoló DNS-eket. Mivel lehet, hogy nincs egészen pontos illeszkedés a humán formában és a más fajok megfelelő részeiben levő nukleotid szekvenciák között, mintegy 18 nukleotidot tartalmazó (a 6 aminosavas kiterjesztést kódoló) oligomerek valószínűleg szükségesek, hogy hibridizálást kapjunk megfelelően szigorú körülmények között, hogy kiküszöböljük a téves pozitív eredményeket. A hat aminosavat kódoló szekvenciák az ilyen vizsgáló mintákhoz elegendő információt szolgáltatnak.

C) Megfelelő gazdaszervezetek, szabályzó rendszerek és módszerek

Általánosan a CSF-1 rekombináns formájának termelése tipikusan magában foglalja az alábbiakat.

Először az érett (ahogyan itt használjuk, beleértve az összes muteineket) fehéijét, a preproteint, vagy a CSF-1 fehérjének egy olyan további szekvenciához való fúziós termékét, amely nem rontja le aktivitását, vagy egy olyan további szekvenciához való fúziós termékét, amely szabályozott körülmények (például peptidázzal végzett kezelés) között lehasítható, hogy aktív fehéije keletkezzék, kódoló DNS-t kapunk. Ha a szekvencia nátronokkal nincs megszakítva, alkalmas kifejeződésre bármilyen gazdaszervezetben. Ha vannak intronok, a kifejezés olyan emlős vagy más eukarióta rendszerekben kapható meg, amelyek képesek feldolgozni ezeket. Ez a szekvencia legyen kimetszhető és kinyerhető formában. A kimetszett vagy kinyert kódoló szekvenciát azután előnyösen működőképes kapcsolatba hozzuk megfelelő szabályozó szekvenciákkal egy replikálható kifejező vektorban. A vektort megfelelő gazdaszervezet transzformálására alkalmazzuk, és a transzformált gazdaszervezetet kedvező körülmények között tenyésztjük, hogy a rekombináns CSF-1 termelését megvalósítsuk. Kívánt esetben a CSF-1-et a tápközegből vagy a sejtekből izoláljuk; a fehérje kinyerése és tisztítása bizonyos esetekben, amikor némi szennyező megtűrhető, szükségtelen lehet. így például olyan sejtek in vitro tenyésztésénél, amelyekből limfokin faktort izolálunk, majd egy betegbe való beadáshoz, a teljes tisztaság néha nem szükséges. A közvetlen alkalmazás a terápiában egy betegnek való beadás útján azonban természetesen igényelheti a termelt CSF-1 tisztítását.

Az előzőekben említett lépések mindegyikét sokféleképpen lehet elvégezni. így például a kívánt kódoló szekvenciákat megkaphatjuk megfelelő cDNS előállításával celluláris messenger-ből (hírvivőből) és a cDNS manipulálásával, hogy megkapjuk a teljes szekvenciát. Egy másik módszer szerint genomiális fragmentumokat kaphatunk és alkalmazhatunk közvetlenül megfelelő gazdaszervezetekben. A gazdaszervezetek széles választékában működőképes kifejező vektorokhoz való konstrukciókat úgy hozhatunk létre, hogy megfelelő replikonokat és szabályozó szekvenciákat alkalmazunk, amint ezt később bemutatjuk. Megfelelő restrikciós helyeket - ha normális úton nem állnak rendelkezésre hozzá lehet tenni a kódoló szekvencia végeihez úgy, hogy kimetszhető gént szolgáltasson az ezekbe a vektorokba való beiktatáshoz.

A szabályozó szekvenciák, kifejező vektorok és transzformáló módszerek függenek a gén kifejezéséhez alkalmazott gazdasejt típusától. Általában gazdaszervezetként jelenleg prokarióta, élesztő-, rovar- vagy emlőssejtek használatosak. Mivel a natív CSF-1 glikozilezett dimerként választódik ki, azokat a gazdarendszereket véljük előnyösnek, amelyek képesek a megfelelő transzláció utáni feldolgozásra. Mivel a prokatióta gazdaszervezetek nem képesek glikozilezés vagy szabályozott dimerizálás kivitelezésére, ezek a gazdaszervezetek csak akkor alkalmasak, ha a nem glikozilezett formát lehet tisztítani és aktív formára feldolgozni. Ez a helyzet, amint kiderül, a CSF-1 esetében. A CSF-1-et hatékonyan lehet termelni monomerként E. coli-ban és újra összehajtogatni különböző technikákat alkalmazva aktív, nem glikozilezett dimer formává.

Eukarióta sejtek azonban szintén alkalmazhatók. Különösen a rovar- vagy emlőssejtek előnyösek. Ha a kiválasztás kívánatos, itt több bizonyosság van arra, hogy a rovar- vagy emlőssejt gazdaszervezet felismeri a natív szignál szekvenciát, lehetővé téve az ilyen kiválasztást, és ennél fogva könnyebbé téve a tisztítást. A CSF-1 -et stabilan termelik a CHO sejtek, és termel7

HU 215 241 Β hető stabilan transzformált CV-1 sejtekben és vírussal fertőzött rovarsejtekben is.

A humán CSF-1 esetében mostanában összegyűlt bizonyítékok jelzik, hogy a fehérje C-terminálisánál jelentős deléciók fordulhatnak elő mind rekombináns, mind természetes körülmények között, és hogy a fehérje in vitro aktivitása még megőrződik. Úgy tűnik, hogy az izolált natív fehérjék lehetnek bizonyos mértékig a C-terminálison megcsonkított formában, vagy lehetnek ilyen fehérjék keverékei, és különböző C-terminális feldolgozást mutathatnak. Ezeknek a „megcsonkított” formáknak az aktivitását világosan megalapozza tudatos termelésük. Az SCSF/CV150-et kódoló DNS-ből termelt mutein például teljesen aktív a CSF-l-re végzett vizsgálatokban, akárcsak az a mutein, amely az LCSF/CV130-at kódoló cDNS-ből termelődik. A gének mind hosszú, mind rövid formája rekombináns kifejeződésének termékei, úgy tűnik, alegység molekulatömeget mutatnak, amelyek kisebbek, mint ami a teljes hosszúságú szekvenciából várható lenne. Úgy hisszük, hogy „természetes” feldolgozás történhet proteolitikus helyek széles választékánál, beleértve például a hosszú formában a 223. helynél levő arg-gyököt, a 238. helynél levő lys gyököt, a 249. helynél levő arg gyököt, vagy a 411. helynél levő arg gyököt. Mivel világos, hogy bizonyos C-terminálison rövidített formák aktívak, az alkalmazott konstrukciók magukban foglalhatják a kódoló szekvencia megfelelő rövidített formáit is.

C) 1. Szabályozó szekvenciák és megfelelő gazdaszervezetek

A prokariótákat leggyakrabban az E. coli különböző törzsei képviselik. Más mikrobiális törzsek is alkalmazhatók azonban, például Bacillusok, mint a Bacillus subtilis, a Pseudomonas különböző fajai, vagy más baktériumtörzsek. Az ilyen prokarióta rendszerekben olyan plazmid vektorokat alkalmazunk, amelyek a gazdaszervezettel összeférhető fajból származó replikációs helyeket és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. így például az E. colit tipikusan úgy transzformáljuk, hogy a pBR322 származékait alkalmazzuk; ez olyan plazmid, amely E. coli fajból származik [Bolivár és munkatársai: Gene, 2, 95 (1977)]. A pBR322 tartalmaz ampicillin és tetraciklin rezisztencia géneket, és így további markereket szolgáltat, amelyek vagy megmaradnak, vagy elroncsolódnak a kívánt vektor megalkotása során. Az általánosan alkalmazott prokarióta szabályozó szekvenciák, amelyeket itt meghatározunk, hogy az átírás beindításához promotereket - kívánt esetben operátorral együtt biztosítsunk a riboszóma kötőhely szekvenciák mentén, magukban foglalják a leggyakrabban alkalmazott promotereket, például a β-laktamáz (penicillináz) és laktóz (lac) promoter rendszereket [(Chang és munkatársai: Natúré, 198, 1056 (1977)], a triptofán (trp) promoter rendszert [Goeddel és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980)] és a lambda eredetű PL promótert és N-gén riboszóma kötőhelyet [Shimatake és munkatársai: Natúré, 292, 128 (1981)], amelyeket úgy készítenek el, hogy „hordozható” szabályozó kazettaként legyenek alkalmazhatók. Bármilyen rendelkezésre álló promoter rendszer alkalmazható azonban, amely a prokariótákkal összeférhető.

Kezdetben volt bizonyos idegenkedés azzal kapcsolatban, hogy bakteriális rendszereket alkalmazzanak a CSF-1 esetében, mivel ez nagymértékű transzláció utáni feldolgozást igényel, amely magában foglalja a glikozilezést és a dimerizálást. Ezen kívül nagy számú cisztein gyök is van jelen, főleg a fehéqe N-terminális részén. Itt valójában összesen tíz cisztein gyök van az LCSF alegységben. Az utolsó a 225. helyen van; a SCSF-ben hét cisztein gyök van. így mindkettő cisztein gyököt tartalmaz a 7, 21, 49, 90, 102, 139 és 146 helyeknél; a hosszú forma rendelkezik még további ciszteinekkel a 157, 159 és 225 helyeknél. Úgy hisszük, hogy a feldolgozás dimerek képződéséhez magában foglalja több láncon belüli és legalább egy láncok közötti kötés képzését. Rendelkezésre állnak azonban azok a technikák, amelyek az ilyen típusú, bakteriális úton termelt fehérjék újrahajtogatását elvégzik, és kifejlesztettek olyan speciális munkameneteket, amelyek alkalmasak tisztított, biológiailag aktív CSF-1 előállítására baktériumokból.

A baktériumokon kívül eukarióta mikroorganizmusokat, például élesztőket is lehet alkalmazni gazdaszervezetként. Saccharomyces cerevisiae (sütőélesztő) laboratóriumi törzseit alkalmazzuk leggyakrabban, bár egy sor más törzs is rendelkezésre áll. Míg egyrészt a 2 mikronos replikációs origót alkalmazó vektorokat leírták [Broach J. R. és munkatársai: Meth. Enz. 101, 307 (1983)], más plazmid vektorok is ismeretesek, amelyek alkalmasak élesztőben való kifejezéshez [lásd például Stinchcomb és munkatársai: Natúré, 282, 39 (1979); Tschempe és munkatársai: Gene, 10, 157, (1980); és Clarké L. és munkatársai: Meth. Enz. 101, 300, (1983)]. Az élesztő vektorokhoz való szabályozó szekvenciák között találjuk a glikolitikus enzimek szintéziséhez tartozó promotereket [Hess és munkatársai: J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149, (1968); Holland és munkatársai: Biochemistry, 17, 4900, (1978)]. További promoterek is ismeretesek a szakterületen, beleértve a 3-foszfoglicerát-kinázt [Hitzeman és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 2033 (1980)], és más glikolitikus enzimekhez tartozó promotereket, mint például a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvátkináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz. Más promoterek, amelyek további előnye a növekedési körülményekkel szabályozott átírás, az alkohol-dehidrogenáz-2, izocitokróm C, savas foszfatáz, nitrogén metabolizmussal kapcsolatos bontó enzimek, és maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimek (Holland, fentebb idézett munka). Úgy véljük, hogy terminátor szekvenciák kívánatosak a kódoló szekvenciák 3’ végénél. Az ilyen terminátorokat a 3’ nem transzlatált területben találjuk az élesztő-eredetű génekben levő kódoló szekvenciákat követően. Több, a szakirodalomban bemutatott vektor tartalmaz olyan szabályozószekvenciákat, amelyek az enoláz gént tartalmazó peno46 plazmidból [Holland M. J. és munkatársai: J.

HU 215 241 Β

Bioi. Chem. 256, 1385 (1981)], vagy a LEU2 génből erednek, mely utóbbit YEpl 3-ból kapunk meg [Broach J. és munkatársai: Gene, 8, 121, (1978)], bármilyen vektor alkalmas azonban, amely élesztővel összeférhető promotert, replikációs origót és más szabályozó szekvenciákat tartalmaz.

Természetesen lehetséges kifejezni polipeptideket kódoló géneket többsejtű organizmusokból származó eukarióta gazdasejt tenyészetekben is. Ezzel kapcsolatban lásd például az alábbi szakkönyvet: Tissue Culture, Academic Press, szerkesztők: Cruz és Patterson (1973). Az alkalmas gazdasejtvonalak lehetnek például az N51 rágcsáló mielóma, VERŐ és Hela sejtek, és a kínai hörcsög petefészek sejtek (CHO). Az ilyen sejtekhez való kifejező vektorok rendesen emlős sejtekkel összeférhető promotereket és szabályozó szekvenciákat foglalnak magukban, ilyenek például a Simian Vírus 40ből (SV 40 majomvírus) származó, általánosan használt korai és késői promóterek [Fiers és munkatársai: Natúré, 273, 113, (1978)], vagy más víruseredetű promóterek, például azok, amelyek poliómából, adenovírus 2-ből, szarvasmarha papillóma vírusból, vagy madár szarkóma vírusból származnak, vagy immunglobulin promóterek és hősokk-promóterek. Az emlős sejt gazdaszervezet rendszer transzformálásának alapvető szempontjait Axel írta le az 1983. augusztus 16-án megjelent 4,399,216 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Most úgy tűnik, hogy a fokozó (enhancer) területek fontosak a kifejeződés optimalizálásában; ezek általában olyan szekvenciák, amelyek a promoter területtől fölfelé találhatók. Replikációs origókat lehet kapni, ha szükséges, víruseredetű forrásokból. A kromoszómába való integrálás azonban általános mechanizmus a DNS replikációhoz eukariótákban. Növényi sejtek szintén rendelkezésre állnak gazdaszervezetként, és növényi sejtekkel összeférhető szabályozó szekvenciák, mint például a nopalin szintáz promoter és poliadenilező szignál szekvenciák [Depicker A. és munkatársai: J. Mól. Appl. Gén. 1, 561 (1982)] szintén rendelkezésre állnak.

Nemrégiben ezeken kívül rovarsejteket alkalmazó kifejező rendszereket írtak le, amelyek baculovírus vektorok által szolgáltatott szabályozó rendszereket használnak [Miller D. W. és munkatársai a „Genetic Engineering” című szakkönyvben, szerkesztők: Setlow J. K. és munkatársai; kiadó: Plenum Publishing; 8. kötet 277-297. oldal (1986)]. Ezek a rendszerek sikeresek a CSF-1 termelésében is.

C) 2. Transzformálás

Az alkalmazott gazdasejttől függően transzformálást végzünk, az ilyen sejtekhez alkalmas standard technikákat alkalmazva. A kalcium-kloridot alkalmazó kalciumos kezelést, amint ezt Cohen S. N. leírta [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69, 2110 (1972)] alkalmazzuk prokariótákhoz vagy más olyan sejtekhez, amelyek jelentős sejtfal-akadályt tartalmaznak. Agrobacterium tumefacienssel végzett fertőzést [Shaw C. H. és munkatársai: Gene, 23, 315 (1983)] alkalmazunk bizonyos növényi sejtekhez. Ilyen sejtfalakkal nem rendelkező emlős sejtekhez Graham és van dér Eb kalcium-foszfátos kicsapási módszere az előnyös [Virology, 52, 546 (1978)]. Élesztőbe való transzformálást hajtunk végre Van Solingen P. és munkatársai módszere szerint [J. Bact. 130, 946 (1977) és Hsiao C. L. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3829 (1979)].

C) 3. mRNS vizsgálata Northern-blot módszerrel;

cDNS vagy genom könyvtár átvizsgálása

RNS-t frakcionálunk Northern-blot módszerhez agaróz lap gélelektroforézissel teljesen denaturáló körülmények között, formaldehidet alkalmazva [Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Herbor Press, 202-203. oldal) vagy 10 mmol/literes higany-metilátot (CH₃HgOH) alkalmazva (Bailey J. M. és munkatársai: Anal. Biochem. 70, 75-85, (1976); és Sehgal P. B. és munkatársai: Natúré, 288, 95-97 (1980)] denaturálószerként. A higany-metilát géleknél 1,5%-os géleket készítünk agaróz olvasztásával futtató pufferben (100 mmol/liter bórsav, 6 mmol/liter nátrium-borát, 100 mmol/liter nátrium-szulfát, 1 mmol/liter EDTA, pH 8,2), 60 °C-ra való lehűtéssel, és 1/100 térfogat 1 mol/literes CH₃HgOH hozzáadásával. Az RNS-t feloldjuk 0,5 x futtató pufferben és denaturáljuk 10 mmol/literes higany-metilátban, 10 percen át, szobahőmérsékleten. Glicerint (20%) és bróm-fenolkéket (0,05%) adunk a mintákhoz. A mintákat elektroforézisnek vetjük alá 500-600 Volt-órával, a puffer recirkuláltatásával. Elektroforézis után a gélt 40 percig mossuk 10 mmol/liter 2-merkapto-etanollal, hogy a higany-metilátot detoxifikáljuk, és Northern-blot módszer szerinti foltokat készítsünk olyan módon, hogy az RNS-t a gélről egy membránszűrőre visszük át.

A cDNS- vagy genom könyvtárakat azután átvizsgáljuk, a telep- vagy tarfolt-hibridizációs eljárást alkalmazva. A bakteriális telepeket, vagy a fágok tarfoltjait átemeljük két párhuzamosan nitrocellulóz szűrőpapírra (S & S típus, BA-85). A tarfoltokat vagy telepeket lizáljuk és a DNS-t a szűrőhöz rögzítjük egymás után kezelve 5-5 percig 500 mmol/liter NaOH-val és 1,5 mol/liter NaCl-dal. A szűrőket kétszer mossuk 5-5 percig 5 x standard sóoldatos citráttal (SSC) és levegőn szárítjuk, majd 80 °C hőmérsékleten két órán át sütjük.

A géleket Northern-blot módszer szerinti foltképzéshez vagy a párhuzamos szűrőket cDNS vagy genom átvizsgáláshoz 25N2 °C hőmérsékleten előhibridizáljuk 6-8 órán át 10 ml/szűrő DNS hibridizáló pufferrel vizsgáló minta nélkül (0-50% formamid; 5-6 χ SSC, pH 7,0; 5 x Denhardt oldat [poli(vinil)-pirrolidon] + Ficoll + szarvasmarha szérum albumin; 1 χ = 0,02% mindegyikből); 20-50 mmol/liter nátrium-foszfát puffer, pH 7,0; 0,2% SDS, 20 pg/ml poli U (amikor cDNSt vizsgálunk át), és 50 μg/ml denaturált lazac sperma DNS). A mintákat azután hibridizáljuk a megfelelő hőmérsékleten inkubálva mintegy 24-36 órán át, a polinukleotid-kinázzal kezelt vizsgáló mintát (oligomerekhez) tartalmazó hibridizáló puffért alkalmazva. A hosszabb cDNS vagy genom fragmentum vizsgáló mintákat nick (hézag) transzlációval vagy primer kiterjesztéssel jelöljük.

HU 215 241 Β

A feltételek mind a prehibridizálásnál, mind a hibridizálásnál függenek a megkívánt szigorúságtól és változnak például a vizsgáló minta hosszával. A tipikus feltételek viszonylag hosszú (például több, mint 30-50 nukleotid) vizsgáló mintákhoz 42 °C-55 °C hőmérséklet és mintegy 20-50% formamidot tartalmazó hibridizáló puffer. A mintegy 15 nukleotidos oligomer vizsgáló mintákhoz szükséges kisebb szigorúságnál kisebb, mintegy 25-42 °C hőmérsékleteket és kisebb formamid koncentrációkat (0-20%) alkalmazunk. Hosszabb vizsgáló mintákhoz a szűrőket moshatjuk például négyszer 30 percig, minden alkalommal 40-55 °C hőmérsékleten 2 * SSC-t, 0,2% SDS-t és 50 mmol/liter nátrium-foszfát puffért tartalmazó oldattal (pH 7), majd kétszer mossuk 0,2 * SSC-vel és 0,2% SDS-sel, levegőn szárítjuk és autoradiografiának vetjük alá -70 °C hőmérsékleten 2-3 napon át. A mosási körülmények valamivel enyhébbek a rövidebb vizsgáló mintákhoz.

C) 4. Vektorok megalkotása

A kívánt kódoló és szabályozó szekvenciákat tartalmazó megfelelő vektorok megalkotásához standard ligálási és restrikciós technikákat alkalmazunk, amelyek a szakterületen jól ismertek. Izolált plazmidokat, DNS-szekvenciákat vagy szintetikus oligonukleotidokat hasítunk, szabunk, és újra ligálunk a kívánt formára.

Helyspecifikus DNS hasítást végzünk a megfelelő restrikciós enzimmel (vagy enzimekkel) végzett kezeléssel olyan körülmények között, amelyek általában a szakterületen jól ismertek, és amelynek részleteit ezeknek a kereskedelmi forgalomban levő restrikciós enzimeknek a gyártói pontosan megadják. Lásd például, New England Biolabs, Termékkatalógus. Általában 1 pg plazmidot vagy DNS-szekvenciát egy egység enzimmel hasítunk mintegy 20 pl pufferoldatban; az itteni példákban tipikusan restrikciós enzim felesleget alkalmazunk, hogy biztosítsuk a DNS szubsztrátum teljes emésztését. Az inkubálási idők általában 1 óra és 2 óra között vannak 37 °C hőmérsékleten, bár változtatások elfogadhatók. Az egyes inkubálások után a fehérjét fenol/kloroformmal végzett extrahálással eltávolítjuk, és ezt követheti éteres extrahálás is, és a nukleinsavat a vizes frakciókból etanolos kicsapással nyerjük ki. Ha kívánatos, a hasított fragmentumok méret szerinti elkülönítését is elvégezhetjük poli(akril-amid) gél vagy agaróz gél elektroforézissel, standard technikákat alkalmazva. A méret szerinti elkülönítés általános leírása megtalálható az alábbi irodalmi helyen: Methods in Enzymology, 65, 499-560 (1980).

A restrikciós hasított fragmentumok lehetnek tompa végűek úgy, hogy az E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmentumával (Klenow) kezelünk a négy dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTP) jelenlétében körülbelül 15-25 perc inkubálási időt és 20-25 °C hőmérsékletet alkalmazva olyan pufferban, amely 50 mmol/liter trisz-t (pH 7,6-t), 50 mmol/liter NaCl-t, 6 mmol/liter MgCl₂-t, 6 mmol/liter dTT-t és 5-10 pmol/liter dNTP-t tartalmaz. A Klenow fragmentum betölti az 5’ ragadós végeket, de visszaemészti a kiálló 3 ’ egyfonalas részeket, még akkor is, ha a négy dNTP jelen van. Kívánt esetben szelektív helyreállítást is lehet végezni a dNTP-knek csak egyikét vagy néhányát alkalmazva, a ragadós végek természete által diktált korlátokon belül. A Klenow-val végzett kezelés után a keveréket fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Megfelelő körülmények között Slnukleázzal végzett hasítás bármely egyfonalas rész hidrolízisét eredményezi.

Szintetikus oligonukíeotidokat lehet készíteni Matteucci és munkatársai triészter módszerével [J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 (1981)], vagy automatizált szintézis-módszereket alkalmazva. Az egyfonalas részek polinukleotid-kinázos kezelését az összeforrasztás vagy jelzés előtt úgy hajtjuk végre, hogy feleslegben alkalmazunk polinukleotid-kinázt, például mintegy 10 egység polinukleotid-kinázt 1 n mól szubsztrátumhoz 50 mmol/liter trisz-t (pH 7,6), 10 mmol/liter MgCl₂-t, 5 mmol/liter ditio-treitolt és 1-2 mmol/liter ATP-t tartalmazó oldat jelenlétében. Ha a polinukleotid-kinázos kezelés a vizsgáló minta jelzését szolgálja, az ATP tartalmaz nagy fajlagos aktivitású 32γ P-t.

A ligálást 15-30 ml térfogatban hajtjuk végre az alábbi standard körülmények között és hőmérsékleten: 20 mmol/1 trisz-HCl (Ph, 7,5); 10 mmol/1 MgCl₂; 10 mmol/1 dTT, 33 pg/ml BSA; 10-50 mmol/1 NaCl; és vagy 40 pmol/l ATP és 0,01-0,02 (Weiss) egység T4 DNS-ligáz 0 °C hőmérsékleten (a tapadós vég ligálásokhoz), vagy 1 mmol/1 ATP és 0,3-0,6 (Weiss) egység T4 DNS-ligáz 14 °C hőmérsékleten (a tompa vég ligálásokhoz). Az intermolekuláris tapadós vég ligálásokat általában 33-100 pg/ml teljes DNS koncentrációknál (5-100 nmol/1 teljes végkoncentrációnál) hajtjuk végre. Az intermolekuláris tompa vég ligálásokat (általában a kapcsolóknak 10-30-szoros moláris feleslegét alkalmazva) 1 pmol/l teljes végkoncentrációnál hajtjuk végre.

A „vektor fragmentumokat” alkalmazó vektor konstrukciókban a vektor fragmentumokat általában bakteriális alkálikus foszfatázzal (BAP) kezeljük abból a célból, hogy az 5’ foszfátot eltávolítsuk és megakadályozzuk a vektor újra ligálását. A BAP-vel végzett emésztést pH 8-nál hajtjuk végre mintegy 150 mmol/1 trisz-ben, Na⁺ és Mg⁺² jelenlétében, 1 pg vektorhoz mintegy 1 egység BAP-et alkalmazva, 60 °C hőmérsékleten mintegy 1 órán át. Abból a célból, hogy a nukleinsav fragmentumokat kinyerjük, a készítményt fenol/kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Egy más módszer szerint az újra ligálást azokban a vektorokban, amelyeket kettős emésztésnek vetettünk alá, úgy akadályozhatjuk meg, hogy a nem kívánt fragmentumokat további restrikciós enzimes kezelésnek vetjük alá.

C) 5. DNS-szekvencia módosítása cDNS-ből vagy genomiális DNS-ből származó vektorok részeihez, amelyek szekvencia-módosításokat igényelnek, helyspecifikus, primer-irányított mutagenezist alkalmazunk. Ez a technika már standard módszer a szakterületen, és a mutegenizálandó egyfonalas fág DNS-sel komplementer primer szintetikus oligonukleotidot alkalmazva hajtjuk végre, azzal a kivétellel, hogy

HU 215 241 Β az oligonukleotidban korlátozott mértékű mismatch van, amely a kívánt mutációt képviseli. Röviden, a szintetikus oligonukleotidot alkalmazzuk primerként egy, a fághoz komplementer szál szintézisének irányításához, és az így létrejött kétfonalas DNS-t egy fággal fertőzött gazdabaktériumba transzformáljuk. A transzformált baktériumok tenyészeteit fedőagarra szélesztjük, és az egyedi sejtekből, amelyek a fágot befogadták, lehetővé tesszük a tarfolt-képződést.

Elméletileg az új tarfoltok 50%-ának tartalmaznia kell azt a fágot, amely egyedi szálként a mutált formát tartalmazza; 50%-a pedig az eredeti szekvenciával bír. A tarfoltokat hibridizáljuk a kinázzal kezelt szintetikus printerrel olyan hőmérsékleten, amely egy pontos illesztés (match) hibridizálását lehetővé teszi, de amelynél az eltérések az eredeti száltól elegendőek ahhoz, hogy megakadályozzák a hibridizálást. Azokat a tarfoltokat, amelyek a vizsgáló mintával hibridizálnak, kiválasztjuk, tenyésztjük, és a DNS-t kinyerjük. A helyspecifikus mutagenezis részleteit az alábbiakban az egyes példákban leíijuk.

C) 6. A konstrukció igazolása

Az alább ismertetendő konstrukciókban a plazmid konstrukciókhoz tartozó korrekt ligálásokat úgy igazoljuk, hogy először transzformálunk E. coli MM294 törzset, vagy más alkalmas gazdaszervezetet a ligálási keverékkel. Sikeres transzformánsokat választunk ki ampicillin, tetraciklin vagy más antibiotikum rezisztencia alapján, vagy más markereket alkalmazva a plazmid konstrukciómódjától függően, amint ez a szakterületen jól ismert. A transzformánsokból plazmidokat készítünk ezután Clewell D. B. [a munkatársai módszereivel (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 62, 1159 (1969)], kívánt esetben klóramfenikolos sokszorozási követően [Clewell D. B.: J. Bacteriol. 110, 667 (1972)]. Az izolált DNS-t restrikcióval és/vagy Sanger F. és munkatársai didezoxi-módszere szerinti szekvencia analízissel [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74, 5463 (1977)] elemezzük; ez utóbbi módszert leírják még Messing és munkatársai is [Nucleic Acide Rés. 9, 309 (1981)], de elemezhetjük Maxam és munkatársai módszerével is [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)].

C) 7. A példákban alkalmazott gazdaszervezetek

A klónozásban és kifejezésben alkalmazott gazdatörzsek az alábbiak.

A klónozáshoz és szekvenciaelemzéshez, és a konstrukció kifejezéséhez a legtöbb bakteriális promoter szabályozása alatt az E. coli MM294 törzset, amelyet az E. coli Genetic Stock Center-tői kaphatunk meg GCSC # 6135 számon, alkalmazzuk gazdaszervezetként. A kifejezéshez a PLN_rbs promoter szabályozása alatt E. coli K12 MCI000 lambda lizogén, N₇N₅₃cI857 SusP₈₀ törzset (ATCC 39531) alkalmazzuk.

Az Ml3 fág rekombinánsokhoz olyan E. coli törzseket alkalmazunk, amelyek fogékonyak a fág-fertőzésre, ilyen például az E. coli KI2 DG98 törzs. A DG98 törzset az ATCC-nél 1984. július 13-án deponálták, ahol ez az ATCC 39 768 deponálási számot kapta.

Az emlős kifejeződést itt COS-7, COS-A2, CV-1 és CHO sejtekkel hajtjuk végre.

D) Előnyös kiviteli módok

A jelen találmány szerinti rekombináns CSF-1 fehérjéket az alap-fehérjék két sorozatának tekinthetjük: LCSF és muteinjei, valamint az SCSF bizonyos speciális muteinjei. Ezeknek a fehérjéknek a primer aminosavszekvenciája hasonló, de nem azonos, és hosszúságuk is különböző; mindegyikük olyan, vagy fajlagos olyan muteinné hasítható, amely mutatja a CSF-1-re jellemző aktivitás-spektrumot - azaz ezek képesek stimulálni a csontvelő sejteket, hogy differenciálódjanak zömmel monocitákká, és a fenti Meghatározások fejezetben ismertetett korlátokon belül immunreaktívak a natív CSF-1 ellen keletkezett antitestekkel, és a CSF-1 aktivitással kapcsolatos receptorokkal. Az SCSF-fel kapcsolatos muteinek bizonyos kiviteli formái nincsenek részletesen ismertetve a W086/04607 számú PCT közzétételi iratban; nem ismertetik a CSF-1 humán és rágcsáló hosszú formáit sem, főleg az LCSF-et és rokon muteinjeit. Az LCSFnek bizonyos N- és C-terminálison deléciós formái különösen előnyösek.

Az SCSF muteineknek bizonyos speciális kiviteli formáit ismerteti a fenti nemzetközi bejelentés. Amint ezt leírják, az 59. helyzet változó lehet asp és tyr között - az eredetileg kiegészített SCSF-en kívül - ide értve mindazokat a muteineket, ahol az SCSF szekvencia megváltozik az asp behelyettesítésével tyr helyett az 59. helynél (például asp₅₉ SCSF). Viszont pedig az LCSF asp-pal rendelkezik az 59. helynél, és a tyr-rel helyettesíthető (tyr₅₉ LCSR).

A jelen leírásban ismertetjük SCSF és LCSF muteineknek azt az osztályát, amelyből az N-terminálisnál 2 vagy 3 gyök hiányzik, és így az N-terminális szekvencia Val-ser-glu-tyr-cys-ser vagy ser-glu-tyrcys-ser lehet. Ezek az NV2 vagy NV3 muteinek képviselhetik az SCSF és LCSF érett formáinak NV2, NV3 muteinjeit - azaz SCSF/NV2-t, SCSF/NV3-at, LCSF/NV2-t és LCSF/NV3-at. Ezen kívül azonban ezeknek az NV2 és NV3 muteineknek C-terminálison csonkított formái, valamint a helyenként helyettesített muteinek is ide értendők, amint ezt később leírjuk.

Szintén rendkívül érdekesek a különböző C-terminális deléciós muteinek. A fentebb idézett nemzetközi bejelentés csak az SCSF rövidített formáit ismerteti, és csak a CV158-at és a hosszabb változatokat. A szakterület addigi ismeretei alapján nem világos, hogy a natív fehéijék milyen mértékben változtathatók meg a C-terminálistól kezdve in vivő. Most megállapítjuk, hogy a C-terminális terület legalább az SCSF 150. aminosaváig visszamenőleg kiiktatható és a fehérje megtartja in vitro CSF-1 aktivitását a csontvelő sejtosztódási mérésekben. Ezen kívül úgy hisszük, hogy a 23 aminosavas hidrofób szekvencia, amely a rövid formában a 166-188. helyek között és a hosszú formában a 464-486. helyek között terül el, membrán lehorgonyzó funkcióval bírhat, és el lehet különíteni ezt a fehérjéből, amikor az áthalad a membránon és kiválasztódik. Ez a rész lehet felelős a membránkötésért is, és lehetővé teszi a CSF-1 számára, hogy amikor a sejtmembránhoz kötődik, kölcsönhatásba lépjen más sejtekkel kötődési

HU 215 241 Β helyénél. Ezek a szekvenciák függetlenül lehetnek részben vagy egészben mellőzhetők. Mindenesetre úgy tűnik, hogy a CSF-l-nek azok a formái, amelyek rövidebbek, mint akár a kódolt SCSF vagy LCSF, megtalálhatók a natív fehérje izolálásánál és a rekombináns tér- 5 melésből kapott kiválasztott fehérjékben. A jelen adatok azt jelzik, hogy az SCSF-et kódoló konstrukciók kifejezése CV-1 sejtekben SCSF/CV158-at eredményezhet a felülúszóban.

Következésképpen a jelen találmány keretein belül vannak mindazok a CSF-1 fehérjék, amelyek az SCSF-nek vagy LCSF-nek csak az első 150 aminosavát tartalmazó aminosavszekvenciájával rendelkeznek, valamint ezeknek az 59. helyen lévő cserélhető tyr vagy asp muteinjei, amint azt fentebb leírtuk (amelyek ennél fogva azonosak az utóbbi aminosav kivételével), vagy ezek NV2 vagy NV3 változatai, kívánt esetben kiterjesztve tetszés szerinti számú aminosawal egy további szekvenciában. Ezek közül különösen az alábbi C-terminális deléciók az előnyösek: SCSF/CV150; SCSF/CV158; LCSF/CV150; LCSF/CV190;

LCSF/CV191; CSF/CV221; LCSF/CV223;

LCSF/CV236; LCSF/CV238; LCSF/CV249;

LCSF/CV258 és LCSF/CV411, és ezeknek megfelelő NV2 és NV3 formái.

Szintén előnyösen a fentebb említett C-terminális deléciókat kódoló olyan konstrukciók, ahol egy vagy több aminosavat, előnyösen 1-5 aminosavat és még előnyösebben 1-2 aminosavat az alap-szekvenciához képest a szekvenciában megváltoztattunk.

így a különböző CSF-1 formák tartalmazhatnak olyan mutációkat, amelyek nem rontják le a működőképességet azokon a területeken, amelyek nem őrződnek meg nagy mértékben a fajok között. Ezek 1-5 aminosavas deléciók és/vagy helyettesítések a 15-20, 51-52 és/vagy 75-84 helyeknél. További ilyen terület a 191-193 terület a SCSF-ben és a 489-491 terület az LCSF-ben. A fentebb idézett nemzetközi szabadalmi bejelentés csak az SCSF mutánsait és ezek C-terminális muteinjeit ismerteti, amelyek a CV 158-ig terjedő deléciót tartalmaznak; következésképpen a jelen muteinek újak, mivel ezek mind hosszú formájú LCSF-re, mind muteinjeire vonatkoznak, vagy a tovább rövidített SCSF/CV150-158-ra is vonatkoznak. Pontosabban úgy találjuk, hogy mind az SCSF-nek, mind az LCSF-nek glu₅₂ formái és ezek muteinjei aktívak.

Azt is kimutatjuk itt, hogy egy vagy több glikozilező hely megváltoztatása aktív fehérjéket eredményezhet. Az LCSF négy glikozilező helyzettel bír - a 122-124, 140-142, 349-351 és 383-385 helyeknél; az

SCSF a fentiek közül csupán az első két hellyel rendelkezik. így ide értendő bármilyen mutein, amely ezek közül a helyek közül egynél vagy többnél inaktiváló mutációt tartalmaz.

Ezen kívül a ciszteinről a 90. helyen kimutattuk, hogy szükségtelen az immunreaktivitás szempontjából. Következésképpen azok a muteinek, amelyek alat>₀ vagy ser₉₀ szerkezetűek, ide értendők, amikor a szándékolt cél csak az antigenicitásra vonatkozik. Az LCSF 157. és 10 159. helyén lévő ciszteinek szintén nélkülözhetők az aktivitás szempontjából; a ser₁₅₇ ser_]59 és ser_]57 ser₁₅₉ muteinek (beleértve az N- és C-terminálison deléciós formákat) HPLC-vel vizsgálva javított homogenitást mutatnak. Úgy hisszük, hogy a vélt membránlehorgony15 zó területek mind az LCSF-nél, mind az SCSF-nél nélkülözhetők a CSF-1 aktivitás bizonyos típusainál.

A jelen találmány szerinti további előnyös formák között találjuk az 5. és 6. ábrákban bemutatott, rágcsáló fehéije aminosavszekvenciáknak megfelelő muteineket, 20 valamint ezeknek azokat a muteinjeit, amelyek a humán LCSF-nél korábban ismertetetteknek felelnek meg.

A CSF-1-et kódoló DNS előnyös kiviteli formái

Az aminosavszekvenciák módosításán kívül a fehérjét kódoló DNS-szekvenciát is lehet módosítani, hogy 25 elősegítsük a kifejeződést adott rendszerekben. E. coliban például a natív szekvencia első hat aminosavához tartozó kodonok megváltoztatása olyan kodonokká, amelyek baktériumokban kedvezőek, mind az LCSF-nél, mind az ACSF-nél, mind ezek megcsonkított formáinál a 30 termelés magasabb szintjét eredményezi. így a vektorok a GAAGAAGTITCIGAATAI N-terminális kódoló szekvenciáinak vagy ennek NV2 vagy NV3 csonkításainak DNS-eit tartalmazzák (az ilyen vektorokat a továbbiakban O/E-nek nevezzük („overexpressing” = túlterme35 lő). Ezt szintetikus HindlII/BstXI fragmentumként alkalmazzuk, és a natív GAGGAGGTGTCGGAGTAC-től a bemutatott aláhúzott helyeknél különbözik. A jelen találmány egyik megvalósítási módja olyan formában lévő CSF-1-et kódoló DNS-t szolgáltat, amely az intra40 cellulárisan baktériumban való kifejezéshez az N-terminálisnál megfelelő számú olyan kodont tartalmaznak, amelyek megfelelnek a baktériumok számára előnyös kodonok szabályainak.

Szintén a bakteriális kifejeződésre való tekintettel a 45 65. helyzetnél lévő ATG-től fölfelé lév DNS-szekvenciákat módosítani lehet, hogy kiküszöböljük ennek az ATG-nek, mint belső starthelynek az alkalmazását. Ez komolyabb probléma a tyr₅₉ konstrukcióknál, mint az asp₅₉ konstrukcióknál. Egy alábbi primer szekvenciát 50 (5’-3’) * * * * *

GGTACAAGATATCATGGAAGATACAATGCGCTTC alkalmazunk a helyspecifikus mutagenezisben, hogy elvégezzük a csillaggal jelölt változásokat a natív génben. A kódolt aminosavakban ez változást nem eredményez.

E) A találmány szerinti fehérjék hatása és alkalmazása

A jelen találmány szerinti CSF-1 fehérjék képesek mind a monocita-prekurzor/makrofág sejttermelés stimulálására az utód velő sejtekből, így növelve az immunrendszer hatékonyságát, mind ezen differenciált sejtek olyan funkciói stimulálására, mint például a limfokinek kiválasztása az érett makrofágokban. Fertőzés elleni, főleg antivirális és antimikrobiális szerekként is hasznosak.

HU 215 241 Β

Az egyik alkalmazásban ezek a fehéqék alkalmasak kiegészítőként a kemoterápiához. Érthető, hogy a kemoterápiás kezelés az immunrendszer szuppresszióját eredményezi. Gyakran, bár sikeresek a tumorsejtek elpusztításában, amelyek ellen irányulnak, a kemoterápiás kezelések a beteg halálát okozzák a kemotoxikus szerek mellékhatásai következtében az immunrendszer sejtjeire. CSF-1 beadása ilyen betegeknek, a CSF-1 nek azon képessége miatt, hogy közvetíti és növeli a csontvelő-eredetű prekurzorok növekedését és makrofágokká való differenciálódását, azt eredményezi, hogy az immunrendszer újra stimulálódik, ennek a mellékhatásnak a megelőzésére, és így megakadályozza a betegnek arra való hajlamát, hogy ne tudjon ellenállni a másodlagos fertőzéseknek. Más betegek, akiknek az ilyen kezelés segíthet, azok, akiket leukémia ellen kezelnek csontvelő-átültetéssel; ezek gyakran vannak immunszuppresszált állapotban, hogy a szerv kilökődését megakadályozzák. Ezeknél a betegeknél is az immunszuppresszált állapot visszafordítható CSF-1 beadásával.

Általában bármilyen beteg, aki immunszuppresszált állapotban akár kemoterápia, akár csontvelő-átültetés, akár az immunszuppresszió más lehetséges formája, például betegség (például szerzett immunhiányos szindróma) miatt, előnyt élvezhet abból, hogy a CSF-1 gyógyászati célra rendelkezésre áll. Ezen kívül a betegeknek lehet adni megnövekedett mennyiségű előzetesen differenciált makrofágot, hogy kiegészítsük a veleszületett rendszer makrofágjait, amely makrofágokat CSF-1-gyei kezelt in vitro csontvelő-tenyészettel vagy más megfelelő készítmény CSF-1 -gyei tenyészetével állítunk elő. Ezek a készítmények lehetnek például a beteg saját vér monocitái, amelyeket lehet tenyészteni és vissza lehet vinni helyi vagy szisztémás terápiánál.

A CSF-1-nek az a képessége, hogy stimulálja a makrofágok által termelt limfokinek előállítását és növeli ezek képességét a célsejtek elpusztítására, szintén közvetlenül használhatóvá teszi a CSF-1-et a neopláziák és a fertőzések kezelésére.

A CSF-1 stimulálja az interferonok termelését is rágcsáló eredetű makrofágokkal [Fleit Η. B. és munkatársai: J. Cell. Physiol. 108, 347 (1981)], és aMIAPaCa sejtekből származó humán, részben tisztított CSF-1 stimulálja az interferon és TNF poli-IC által indukált termelését humán monocitákból. Ezen kívül a CSF-1 stimulálja a mieloid CSF termelését humán vér monocitákkal.

AIDS-ben szenvedő betegek kezeléséről CSF-1gyei, egymagában vagy eritropoietinnel és/vagy valamely antivirális szerrel és/vagy IL-2-vel együtt beszámolnak a W087/03204 számú PCT közzétételi iratban, amelyet 1987. június 4-én tettek közzé. Az 1984. november 13-án közzétett 4,482,485 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás megállapítja, hogy a CSF-1-et lehet alkalmazni támogató szerepben rák kezelésében. Ezen kívül az 1984. szeptember 19-én közzétett EP 118,915 számú szabadalmi leírás beszámol CSF-1 alkalmazásáról granulocitopénia és makrofagocitopénia megelőzézésére és kezelésére olyan betegekben, akik rák-terápiát kaptak, valamint fertőzések megelőzésére és beültetett csontvelővel rendelkező betegek kezelésére. Ralph és munkatársai [Cell. Immunoi. 105, 270-279 (1987)] beszámolnak a CSF-1 és limfokin kombinációjának megnövekedett tumorpusztító hatásáról TU5 rágcsáló szarkóma esetében.

[A rágcsáló CSF-1-ről következetlenül számolnak be, például, hogy stimulálja a rágcsáló makrofágokat arra, hogy citosztatikusak legyenek P815 tumorsejtekre, lásd Wing E. J. és munkatársai: J. Clin. Invest. 69, 270 (1982), vagy például nem pusztít el más leukémia célpontokat, lásd például Ralph P. és munkatársai: Cell. Immunoi. 76, 10 (1983). Nogawa R. T. és munkatársai arról számolnak be a Cell. Immunoi. 53, 116 (1980) irodalmi helyen, hogy a CSF-1 stimulálhatja a makrofágokat, hogy megemésszék és elpusztítsák az élesztőket.] így az immunszuppresszió leküzdésén kívül a CSF-1-et lehet alkalmazni közvetve a behatoló organizmusok és rosszindulatú sejtek elroncsolására a makrofág kiválasztás és aktiválás stimulálása révén.

A CSF-l-et lehet alkalmazni más limfokinekkel és citokinekkel együtt, például a-IFN-nel, β-IFN-nel, γ-IFN-nel, IL-l-gyel, IL-2-vel, IL-3-mal, IL-4-gyel vagy TNF-fel együtt tumorok kezelésére.

A találmány szerinti CSF-l-et hagyományos módszerekkel lehet formulázni, amelyek már standard módszerek a fehérje vegyületek beadásához a szakterületen. Az injekciós beadás az előnyös; a formulázott készítmény lehet oldat, vagy szuszpenzió, emulzió vagy olyan szilárd készítmény, amely injektálható formára alakítható vissza. Megfelelő segédanyagok lehetnek például a Ringer-oldat, a Hank-oldat, víz, fiziológiás sóoldat, glicerin, glükóz-oldat, és hasonlók. Ezen kívül a találmány szerinti CSF-l-et lehet előinkubálni sejtkészítményekkel megfelelő válasz stimulálására, és/vagy a teljes készítményt, vagy az ebből kapott felülúszót lehet beadni a betegnek. Amint az alábbiakban kimutatjuk, a CSF-1 stimulálásra a különböző típusú vérsejtek által válaszként termelt anyagok hatásosak a kívánt célpontok ellen, és ezeknek a vérsejteknek azt a tulajdonságát, hogy megtámadják a vírusokat vagy neoplazmákat, fokozni lehet. A beteg saját sejtjeit kivehetjük és ezen a módon felhasználhatjuk, vagy például más, összeférhető egyén monocitáit vagy limfocitáit alkalmazzuk az inkubálásban.

Előnyös, ha a CSF-1 „humán” formáját alkalmazzuk gyógyszerkészítményekben; ennek a fehérjének a rágcsáló formája azonban különösen alkalmas jól kezelhető modell-rendszerként egerekben, hogy meghatározzuk a CSF-1 aktivitások komplex spektrumát.

Az alábbi példákban részletesen ismertetjük a találmány megvalósítását a korlátozás szándéka nélkül.

F) Példák

Humán CSF-1 klónozása és kifejezése

Az alábbiakban mutatjuk be a humán CSF-1-hez szolgáló kódoló szekvencia kinyerésében alkalmazott módszereket, valamint ennek a szekvenciának a behelyezését kifejező vektorokba, és a kívánt fehérje kifeje13

HU 215 241 Β zésének megvalósítását. Természetesen a DNS kinyerését nem szükséges megismételni; a bemutatott szekvenciákat megkaphatjuk részben vagy egészben szintézissel is.

F) 1. Natív CSF-1 tisztítása és vizsgáló minta tervezése

Humán vizelet eredetű CSF-l-et részlegesen tisztítunk standard módszerekkel, amint ezt Das S. K. és munkatársai leírták [Blood, 58, 630 (1981)], ezt afftnitás-tisztításos lépés követi, rágcsáló CSF-l-re kialakított patkány monoklonális antitestet alkalmazva (amelyet YYG 106-nak nevezünk) Sepharose 4B oszlophoz rögzítve [Stanley E. R.: Methods Enzymol. 116, 564 (1985)]. Az utolsó lépés a tisztításban a fordított fázisú HPLC 0,1% TFA/30% acetonitril - 0,1% TFA/60% acetonitril puffer-rendszerben. A részleteket, a tisztítás eredményeit és a vizsgáló minták tervezését a fentebb már idézett W086/04607 számú PCT közzétételi irat írja le.

F) 2. Humán genomiális szekvencia előállítása

CSF-l-et kódoló humán genomiális szekvenciát állítunk elő a Maniatis humán genom könyvtárból beszerzett Charon 4 lambda fágból, olyan vizsgáló mintákat alkalmazva, amelyeket a humán fehérje N-terminális szekvenciájának kódolására terveztek, amint ezt a fentebb már említett W086/04607 PCT közzétételi irat leírja. A CSF-1 szekvenciát tartalmazó Charon 4A fágot, amint ezt az alább leírt módon vizsgáló mintához való hibridizálással igazoltuk, phCSF-l-nek neveztük, és 1985. április 2-án letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nál, ahol az ATCC 40 177 számot kapta. Ennek a fágnak a későbbi tanulmányozásával arra jöttünk rá, hogy átrendeződésnek és/vagy deléciók fordulnak elő és a korrekt szekvencia nem marad meg. Ezért egy, a genom könyvtárból azonos módon kapott másik telepet, amelyet úgy szaporítottunk, hogy igazoltuk stabilitását a replikáció során, és amelyet phCSF-la-nak neveztük, szintén deponáltunk az ATCC-nél, 1985. május 21-én, ahol az az ATCC 40185 számot kapta. A phCSF-la tartalmaz egy mintegy 18 kb-s inszerciót és képes olyan restrikciós enzimes emésztési termékeket kialakítani, amelyek szintén hibridizálódnak a vizsgáló mintához, és ezeket használtuk a szekvencia meghatározásához és további vizsgáló minták megalkotásához.

A phCSF-la-ban található teljes 18 kb-s gént szekvenciaelemzésnek vetjük alá. A gén 9 exont tartalmaz, amelyek 8 intronnal vannak elkülönítve, amikor összehasonlítjuk ezt az 1. ábra pcCSF-17 szekvenciáival. Az érett fehérje cDNS területei pontosan megfelelnek a genomiális exon kodonoknak az 59. kodon kivételével; a humán CSF-1 fehérje „hosszú” formája kiterjesztett kódoló területet mutat a 6. exon 5’ végénél, amint ezt a továbbiakban leírjuk.

A 3. ábra a humán CSF-1 genomiális szerkezetének sematikus ábrázolása. Az első exon tartalmazza a nem transzlatált 5'-szekvenciát és a szignál szekvencia első 13 aminosavgyökét. A szignál szekvencia maradék 19 aminosava és az érett CSF fehérje első 22 aminosava a 2. exonban kódolódik. A stop kodon a 8. exonban helyezkedik el, ami tartalmazza a nem transzlatált 3’szekvencia 9 bázispárját is. A gén mintegy 18 kb-t ér át és legalább 9 exont, legvalószínűbben 10 exont tartalmaz, amelyek mérettartománya 63 bp és a feltételezett maximum, 2-3 kb között van. Úgy véljük, hogy a 3’ nem transzlatált szekvenciát teljessé lehet tenni vagy a 9., vagy a 10. exonnal. Bár két külön exont mutatunk ki, nem világos, vajon ban-e 9. intron vagy 10. exon, vagy vajon van-e alternatív hasítóhely a 9. exonon belül. Amint azt az alábbiakban leírjuk, a CSF-1 rövid formája a 6. exon 3’ vége felé levő hasítóhely hasznosításából származik; a hosszú forma abból a hasítóhelyből származik, amelyet a 3. ábrán bemutatunk ennek az exonnak a kezdeteként.

A 3. ábrán bemutatott exonok és intronok méretét az alábbiakban mutatjuk be:

Exon	Méret (bp)	Intron	Méret (kb)
1	217	I	3,1
2	123	II	1,3
3	63	III	1,3
4	171	IV	4,6
5	148	V	1,2 vagy 2,1
6	1025 vagy 131	VI	0,6
7	49	VII	0,3
8	60	VIII	0,8
9	1400(?)	(IX)	9
(10)	?

Azt, hogy a genomiális klón a hasítóhelyektől függően átíródik egy sor RNS átiratba, Northern elemzéssel igazoljuk. MIAPaCa sejteket indukálunk szérummentes körülmények között 50 ng/ml PMA-val és 10 pmol/l retinasavval 3 napon át három egymást követő indukcióban és mRNS-t izolálunk a harmadik indukció után az alább leírt általános eljárás szerint. Az mRNS izolátumot elektroforézisnek vetjük alá 2,5 mol/1 formaldehidet tartalmazó 1%-os agaróz ellen, mikrocellulózra visszük át foltképzésre, és a megfelelő oligonukleotiddal átvizsgáljuk. Egy sor sávot kapunk, amelyek megfelelnek a 16S, 18S, 26S, 28S és 22-25S mRNS-einek.

Az ML06, az a 20-mer, amely a genom 8. exonjában levő kódoló szekvenciának felel meg, mindezek átiratához hibridizál; így igazoljuk, hogy mind CSF-l-et kódol. A 8. exon szekvenciája természetesen közös mind a rövid, mind a hosszú formában. (Egy másik vizsgáló minta, a GM 15, amely 21-mer, és amely a rágcsáló 3’ nem transzlatált szekvenciáihoz illeszkedik, amelyek nem mutatnak homológiát a humán kiónokhoz, nem hibridizál az MIAPaCa átiratok egyikéhez sem.)

A GM11, ez a 40-mer, amely a 6. hosszú exon 5’ végénél helyezkedik el, és így megfelel a 894 bp-t tartalmazó „extra” inszerciónak a hosszú formájú szekvenciában, hibridizál a 285 átiratokhoz és a 22-25S csoporthoz, de nem hibridizál a további háromhoz. így, nyilvánvalóan, ezek olyan átiratok, amelyek a hosszú formának felelnek meg.

HU 215 241 Β

A JV30, ez a 20-mer, amely a genom 9. exonjának 5’ végén illeszkedik, hibridizál a 22-25 S csoporthoz és a 16S és 18S mRNS-eihez, de nem hibridizál a 26S vagy 28S átiratokhoz. Ennek megfelelően úgy tűnik, a 26S és 28S annak a feldolgozásnak az eredménye, amelyet a 3. ábrán mutatunk be, amely magában foglalja a vélt 10. exont. Egy további vizsgáló minta, mely humán CSF-1 genomiális fragmentumából készült 4,2 kb-s vizsgáló minta, és 1500 bp-vel kezdődik a 9. exonban, csak a 26S és 28S átiratokkal hibridizál.

A CSF-1-et kódoló genomiális fragmentumot olyan eukarióta sejtekben alkalmazhatjuk kifejeződéshez, amely képes intronok feldolgozására. Abból a célból, hogy a genom fragmentumot kifejezzük, a beiktatást megfelelő gazda vektorba, például szarvasmarha papilloma vírusba, vagy más emlős vírusvektorba ligáljuk, egy megfelelő promotertől, például rágcsáló vagy humán metallotionein promotertől közvetlenül lefelé.

F) 3. Humán CSF-l-et kódoló cDNS kinyerése.

A pcCSF-17 (SCSF)

A humán eredetű MIAPaCa-2 pankreász karcinóma sejtvonalat alkalmazzuk mRNS forrásaként, hogy a vizsgáló mintákat érvényesítsük és egy, a humán CSF-1 kódoló szekvencia intronmentes formáját tartalmazó cDNS könyvtárat alakítsunk ki. Az MIAPaCa sejtvonal CSF-l-et termel olyan szinten, amely mintegy tízszeresen alatta van a rágcsáló L-929 sejtek szintjénél. A pcCSF-17-et ebből a könyvtárból kaptuk, a W086/04607 számú PCT közzétételi iratban ismertetett módon.

Röviden: dúsított MIAPaCa mRNS-ből Okayama és Berg módszerével kapott mintegy 300000 tagú klónkönyvtárat vizsgálunk át nagyon szigorú körülmények között, a genomiális DNS-ből származó exon II vizsgáló mintát alkalmazva. A vizsgáló mintával hibridizáló tíz telepet kiválasztunk és teleptisztításnak vetünk alá. Ezeket a kiónokat átvizsgáljuk CSF-1 kódoló szekvenciák jelenlétére COS-7 sejtekben végzett átmeneti kifejeződéssel. Olyan klónozó vektort alkalmazunk a COS-7 sejtek transzformálására, amely tartalmazza az SV40 promotert.

A 10 pozitív klónból plazmid DNS-t tisztítunk CsCl gradienst alkalmazva, és COS-7 sejteket transzferálunk a kalcium-foszfátos együtt-kicsapásos módszer egyik módosítását alkalmazva [Wang A. M. és munkatársai: Science, 228, 149 (1985)). Három napos inkubálás után a CSF-1 termelést úgy vizsgáljuk, hogy a tenyészet felülúszóit radioreceptor vizsgálatnak vetjük alá, lényegében olyan módon kivitelezve, ahogyan ezt Das S. K. és munkatársai leírták [Blood, 58, 630 (1981)] és telep-stimuláló (csontvelő-sejtosztódási) vizsgálatnak vetjük alá, lényegében olyan módon kivitelezve, ahogyan ezt Prystowsky Μ. B. és munkatársai leírták [Am. I. Pathol. 114, 149 (1984)]. A kiválasztott 10 klón közül 9 nem mutat átmeneti CSF-1 termelést COS-7 sejtekben. Az egyik kiónt, amely kifejeződik, tenyésztjük, a plazmid DNS-t izoláljuk, és az inszerciót szekvencia-elemzésnek vetjük alá. A DNS szekvenciát, a kikövetkeztetett aminosav-szekvenciával együtt, az 1. ábrán mutatjuk be. A teljes hosszúságú cDNS 1,64 kb-s és a 224 aminosavas érett CSF-1 fehérjét (SCSF) kódolja, amint ez az 1. ábrából látható. A kiónt CSF-17nek jelöljük, CMCC 2347 Cetus deponálási számon; ezt a törzset az American Type Culture Collection-nál is deponáltuk, 1985. június 14-én, ATCC 53 149 letéti számon. A CSF-l-et kódoló DNS-t hordozó plazmidot pcCSF-17-nek nevezzük.

LCSF-et kódoló kiónok

A fentebb leírt módon készített pcCSF-17-et alkalmazzuk vizsgáló mintaként, hogy további CSF-l-et kódoló kiónokat kapjunk humán cDNS könyvtárból. MIAPaCa sejtekből teljes mRNS-t készítünk pontosan úgy, ahogyan azt a már korábban említett W086/04607 számú PCT közzétételi iratban leírták és ezt alkalmazzuk, hogy ÁgtlO fág vektorokban cDNS könyvtárat hozzunk létre, a fordított átiratokat EcoRI kapcsolókhoz ligáivá, és az így kapott cDNS EcoRIemésztési termékét ÁgtlO EcoRI helyére inszertálva, amint ezt Huynh Τ. V. és munkatársai leírták [DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, kiadó: IRL Press, Oxford (1984) szerkesztő: Glover D.].

Több mint egymillió fágot vizsgálunk át, CSF-17ből származó, egyfonalas, nagy mértékben jelzett vizsgáló mintát alkalmazva, standard eljárások szerint, amelyeket röviden az alábbiakban foglalunk össze.

A pcCSF-17 DNS EcoRI fragmentumát, amely magában foglalja a CSF-1 teljes kódoló szekvenciáját (van itt egy EcoRI hely, amely közvetlenül követi a pcCSF-17-ben levő kódoló szekvencia stop kodonját), M13-ba inszertáljuk, és egy jelzett második szálat szintetizálunk a következőképpen. Az egyfonalas, EcoRIgyel emésztett pcCSF-17-et tartalmazó Ml3 mintegy 1 pmólját melegítjük 10 pmol szekvenáló primerrel 20 mmol/1 triszt (pH 7,9), 20 mmol/1 MgCl₂-t, 100 mmol/1 NaCl-t és 20 mmol/1 β-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban 67 °C hőmérsékleten 5 percen át, majd átvisszük 42 °C hőmérsékletre 45 percig. A melegítésnek alávetett készítményt kiegészítjük 100-100 pmól/l dATP-vel, dCTP-vel és dTTP-vel, és 2,5 pmol P32-jelzett (a)dGTP-vel, 5 egység Klenow fragmentummal együtt. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 20 percig, és P-6 dG (Bio-Rad) forgó oszlopon a DNS-t kinyerjük, és 10 percig forraljuk, hogy a szálakat elkülönítsük.

Az így készített vizsgáló mintákat alkalmazzuk, hogy a tarfoltokat átvizsgáljuk (amelyeket előzőleg nitrocellulózra vittünk át) hibridizálással szigorú körülmények között (50% formamid, 5 * SSC, 5 * Denhardt), 42 °C hőmérsékleten, 18 órán át.

Mintegy 150 fág tarfolt pozitív. Ebből a 150. vizsgáló mintával 5 pozitív tarfoltnál újból pozitív vizsgálati eredmények adódnak a ID11 oligonukleotidot alkalmazva; ez a ID1114-mer, amely komplementer a 2. és 3. exon hasítási csatlakozásának területén levő bázisokkal; a hibridizálást 45 °C hőmérsékleten végezzük egy éjszakán át 5 * SSC-t és 5 * Denhardt-ot tartalmazó oldatban.

Az 5, ID11-gyei pozitív kiónt azután GM11 oligonukleotiddel való hibridizálásnak vetjük alá; ez olyan szekvenciával rendelkezik, amely komplementer a 2.

HU 215 241 Β ábrában látható 506-545. nukleotidokkal. Amint fentebb leírtuk, ez a szekvencia pontos párja a humán genomiális szekvencia azon részletének, amely megfelel a rágcsáló cDNS alább leírt „extra” részének, és amely a rágcsáló CSF-1 fehérje „hosszú” formájában levő „extra” 298 aminosavat kódolja. A hibridizálást 20% formamidot, 5 x SSC-t és 5 x Denhardt-ot tartalmazó oldatban végezzük 18 órán át. Három klón pozitív, beleértve a szóban forgó 4. és 25. kiónokat.

A 4. és 25. kiónokban lévő cDNS inszerciók ide vonatkozó kódoló területéhez szolgáló teljes DNS szekvenciát a kikövetkeztetett aminosavszekvenciával együtt a 2. ábra mutatja be. A szekvencia onnan származik, hogy a fentebb leírt phCSF-la genomiális klón ismert szekvenciáját rendszerbe szedjük, az alább leírt rágcsáló szekvencia 298 aminosavas „extra” beiktatását alkalmazva vezérfonalként, hogy kikövetkeztessük a bemutatott teljes szekvenciát. Az ábrázolt szekvencia megmutatja az „extra” szegmens - amely elegendő a génben a 6. exon 5’ végén elhelyezkedő 298 „extra” aminosav kódolására - inszertálását a pcCSF-17 szekvenciájában a 150 aminosavhelynél levő Gly gyökhöz tartozó kódon első nukleotidjánál, a CSF-17 szekvencia további részével azonos leolvasó keretben. Az inszerció megváltoztatja a kodont a 150. helynél az aszparaginsav kodonjára, a következő kodon az inszerció végénél helyreáll Gly-vé, és a gyökök megmaradó szekvenciája His-Glu-Arg-gal stb., folytatódik a C-terminális Val gyöke irányába lefelé, ugyanúgy, mint a pcCSF-17-ben. Az LCSF egyébként azonos szekvenciájában az ACSF-fel a 150. gyökig, azzal a különbséggel, hogy az 59. helynél Asp van Tyr helyett. A kiónok közül kettőt, a 4. és 25. kiónokat,

M13mpl8-ba vagy M13mpl9-be klónozzuk szekvenciaelemzéshez, hogy igazoljuk a 2. ábrán bemutatott eredményeket, az EcoRI restrikciós helyeket alkalmaz10 va. Ez a két klón azonosnak tűnik a restrikciós enzimes elemzés alapján. A 4. klón teljes szekvenciáját meghatározzuk és ezt a 2. ábrán mutatjuk be; a 25. klón részleges szekvenciaelemzése egyező eredményeket ad. Ezeket azután szubklónozzuk a módosított pcDB

Okayama-Berg vektorba, amelyet a már publikált pcDVl éspLl Okayama-Berg vektorokból állítunk elő a következőképpen: [Okayama H. és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3, 280-289 (1983)].

pcDVl-et emésztünk HindlII-mal és KpnI-gyel, és a nagy fragmentumot, amely az Amp^R-et, a pBR322 replikációs origót és egy poliadenilező helyet szolgáltat, izoláljuk. pLl-et emésztünk HindlII-mal és Pstl-gyel és a kis fragmentumot, amely az SV40 promotert és replikációs origót szolgáltatja, izoláljuk. Eze25 két a fragmentumokat újra ligáljuk, három-utas ligálásban a szintetikus, KpnI/Pstl-gyel emésztett oligonukleotid fragmentummal

CTGCAGGAGCTCAGATCTTCTAGAGAATTCTCGAGCGGCCGCATCGATGGTACC

GACGTCCTCGAGTCTAGAAGATCTCTTAAGAGCTCGCCGCGCTAGCTACCATGG, hogy megkapjuk a pcDB-t, egy olyan plazmidot, amely a referenciában bemutatott pcD-x-nek felel meg, ahol „x” valamely polilinkerrel helyettesíthető be. így a pcDB tartalmazza az SV40 korai promotert, és tartalmaz egy közvetlenül lefelé levő kapcsolót (linkért), amelyet egy poliadenilező hely követ. A polilinker területbe ligáit szekvenciákat ki lehet fejezni az SV40 korai promoter szabályozása alatt.

A kifejezés vizsgálata előtt, mivel a 4. és 25. kiónokból, úgy tűnik, hiányzik néhány 5’-végszekvencia a CSF-17-tel összehasonlítva, a pcCSF-17-ből származó felfelé levő részekkel helyettesítjük a 4. és 25. kiónok megfelelő részeit.

Ennek a helyettesítésnek a munkamenete az alábbi: pcCSF-asp₅₉-BamBcl-et (lásd alább) emésztünk Smalgyel, amely hasítja a nem transzlatált szekvencia extra 5’ végét (lásd 1. ábra), és a linearizált plazmidot EcoRI kapcsolókhoz ligáljuk és újból lezárjuk. Az újra ligáit plazmidot azután EcoRI-gyel emésztjük, amely eltávolítja a teljes kódoló területet az extra 5’ végénél lévő Smal helytől közvetlenül a stop kodontól lefelé levő EcoRI helyig. Ezt az EcoRI helynél ligáljuk a pcDB polilinkerjébe. A BstXI helytől lefelé levő kódoló szekvenciákat, amely hely mintegy az érett CSF-17 fehéijeszekvencia 8. aminosavát kódoló kodonnál helyezkedik el (lásd 1. ábra), BstXI-gyel és KpnI-gyel végzett emésztéssel távolítjuk el. (A KpnI belehasít a kapcsolóba a stop kodon utáni EcoRI helytől kissé lefelé.) Ezt a kiiktatott lefelé levő szekvenciát a pM13-4-ből és pM13-25-ből származó analóg Bstl/KpnI fragmentum helyettesíti. Az így létrejövő kiónok, a pcDBhuCSF—4 és pcDBhuCSF-25, így tartalmazzák a

4., illetve 25. klónokból származó mintegy nyolc aminosavhoz tartozó kodontól lefelé levő kódoló szekvenciákat, és a pCSF-17-ből származó felfelé levő szekvenciákat. A ligáit szekvencia az SV40 korai promoter leolvasó keretében és szabályozása alatt van.

Muteint kódoló szekvenciák (eukarióta kifejező vektorok Módosításokat végzünk a pcCSF-17 inszerciókon, hogy az SCSF fehérjék muteinjeit kódoló megfelelő plazmidokhoz jussunk. A hely-specifikus mutagenezishez a pcCSF-17-et és M13mpl8-at azonos restrik45 ciós enzimmel emésztjük, kimetszve a CSF-1 kódoló szekvencia megfelelő területét, és a kimetszett szekvenciát M13 vektorba ligáljuk. A második szál szintézishez és a kívánt mutált DNS kinyeréshez az alábbi oligonukleotid primereket alkalmazzuk:

a pro₅₂SCSF-hez az ’-TACCTTAAACCGGC ATTTCTC-3 ’-t, amely új Hpall helyet alakít ki az 52-53. kodonoknál;

a gln₅₂SCSF-hez az

5’-TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3’-t, amely új Stul helyet alakít ki az 52-53. kodonoknál; az asp₅₉SCSF-hez az

5-GGTACAAGATATCATGGAG-3 ’-t, amely új EcoRV helyet alakít ki az 59-60.

kodonoknál.

HU 215 241 Β

A Klenow-fragmentumot alkalmazó második szál kiterjesztése után a fágot E. coli DG98-ba transzformáljuk és az így létrejött tarfoltokat polinukleotid-kináz segítségéve] jelzett vizsgáló mintával átvizsgáljuk. Tarfolt tisztítás után a kívánt mutált inszerciókat visszavisszük, hogy helyettesítsük a nem mutált inszerciókat a pcCSF-l-ben, így kapjuk meg a pCSF-pro₅₂-t, pCSF-gln₅₂-t, illetve pCSF-asp₅₉-et.

Olyan plazmidokat is készítünk, amelyek három deléciós mutánst tartalmaznak, amelyek a C-terminálison deléciós SCSF/CV158-at kódolják: pCSF-Bam, pCSF-BamBcl és pCSF-BamTGA. A pCSF-Bam-hoz a pcCSF-17-et, pCSF-BamHI-gyel emésztjük, és a kódoló területtől felfelé levő BamHI/BamHI fragmentumot izoláljuk, és visszaligáljuk a vektor fragmentumhoz. A ligáló keveréket E. coli MM294-be transzformáljuk és a korrekt orientációval rendelkező plazmidokat izoláljuk. Az így létrejött pCSF-Bam és CSF-1 fehéije 158 aminosavát kódolja a vektor C-terminálisából származó hat gyökhöz fuzionálva; ez a hat gyök: arg-his-asp-lys-ile-his.

A pCSF-BamBcl-nél, amely a teljes CSF-1 kódoló szekvenciát tartalmazza, azzal a kivétellel, hogy a 159. helynél a szerin stop kodonná van mutálva, a kódoló szekvenciát a pcCSF-17-ből kimetsszük és M13-ba ligáljuk az alábbi prímért alkalmazva a hely-specifikus mutagenezishez 5’-GAGGGATCCTGATCACCGCA GCTCC-3’. Ez új Bell helyet eredményez a 159-160. kodonnál. A mutált DNS-t BstXI/EcoRI-gyel kimetsszük és a BstXI/EcoRI-gyel emésztett pcCSF-17be ligáljuk, a ligációs keveréket E. coli DG105-be (amely dam~ gazdaszervezet) transzformáljuk, és a plazmid DNS-t izoláljuk.

A pCSF-BamTGA-nál, amelyben a 159. helynél levő stoptól lefelé a kodonok ki vannak iktatva, pCSF-BamBcl-et emésztünk Xhol-gyel és BclI-gyel, és az inszerciót XhoI/BamHI-gyel emésztett pcCSF-17-be ligáljuk.

Ezen kívül elkészítjük a pCSF-Gly 150-et is, amely TGA stop kodont tartalmaz a 151. helynél hisztidin helyett, ezt pCSF-17 inszercióból készítjük helyspecifikus mutagenezissel a megfelelő prímért alkalmazva, amint fentebb leírtuk. A megfelelő primer az 5-AGCCAAGGCTGATCAAGGCAGTCC-3’. így a kódoló szekvencia lefelé levő részét kimetsszük a pcCSF-17-ből BstXI/EcoRI-gyel Ml3 vektorokba mutagenezishez, és tarfolt tisztítás után visszavisszük, mint BstXI/EcoRI inszerciót.

„Kettős” muteineket készítünk hasonló módon. így például pCSF-asp₅₉-gly 150-hez, amely asp₅₉SCSF/CV 150-et kódol, pcCSF-asp₅₉-et emésztünk BstXI/EcoRI-gyel, hogy a C-terminális fragmentumot Ml 3-ba helyezzük hely specifikus mutagenezishez ugyanazzal a primerrel, amelyet fentebb a pCSF-glyl50 kialakításánál bemutattunk. A mutált fragmentumot azután visszavisszük a vektorba, hogy megkapjuk a pCSF-l-asp₅₉-gly 150-et.

Hasonlóképpen a pCSF-BamBcl készítésénél leírt folyamatot ismételjük meg (azzal a különbséggel, hogy pCSF-asp₅₉-et alkalmazunk pcCSF helyett kiindulási anyagként), így kapjuk meg a pCSF-asp₅₉BamBclI-et.

A pCSF-gln₅₂ és pCSF-asp₅₉ előállításánál fentebb leírtakhoz analóg technikákat alkalmazva elkészítjük azokat a megfelelő plazmidokat, a pLCSF-gln₅₂-t és pLCSF-tyr59-et, amelyek a megfelelő muteinek hosszú formáit tartalmazzák. Az eljárás a fentebb leírttal azonos, azzal a kivétellel, hogy amikor abban az eljárásban pcCSF-17-et alkalmazunk, ezt pcDBhuCSF—4-gyel vagy ennek ekvivalens plazmidjával helyettesítjük, és a megfelelő változtatásokat a primerben a tyr59 muteinhez elvégezzük.

Helyspecifikus mutagenezist is alkalmazunk, hogy mindkét fehérje glikozilező helyeinél a kívánt mutációkat megkapjuk, és a 90. helynél a ciszteint helyettesítsük; ezt lehet alkalmazni ahhoz is, hogy az LCSFet kódoló DNS különböző C-terminális delécióit kapjuk.

F) 4. CSF-1 átmeneti kifejezése—pcCSF-17 kifejezése

CSF-17-ből származó plazmid DNS (pcCSF-17) kifejeződéseit COS-7 sejtekben igazoljuk és mennyiségileg értékeljük a csontvelő sejtosztódási vizsgálatot, a telep-stimuláló vizsgálatot és a radioreceptor vizsgálatot alkalmazva. Emlékeztetünk itt arra, hogy a csontvelő sejtosztódási vizsgálat fajlagossága CSF-1 nél csak a CSF-1 antiszérumnak abból a képességéből ered, hogy csökkenti az aktivitást; a telepstimuláló vizsgálatnál pedig a kapott telepek természetéből ered a fajlagosság. Mindkét vizsgálat azt mutatja, hogy a CSF-1 termelés többezer egység/ml nagyságrendben van.

Csontvelő sejtosztódás

A csontvelő stimulálási méréshez, amely a fehérje biológiai aktivitását méri, Balb/C egerekből származó csontvelősejteket kezelünk 72 órás felülúszók sorozathígításaival, és a sejtek osztódását mérjük a jelzett timidin felvételével, lényegében úgy, ahogyan ezt Moore R. N. és munkatársai leírták. [J. Immunoi. 131, 2374 (1983)], valamint Prystowsky Μ. B. és munkatársai leírták [Am. J. Pathol. 114, 149 (1984)]. Az indukált MIAPaCa sejtekből származó közeget használjuk kontrollként. A CSF-1 fajlagosságát a humán vizelet-eredetű CSF-1 ellen keletkezett nyúl antiszérumnak azzal a képességével igazoljuk, hogy visszaszorítja a timidin felvételét. A pcCSF-17-tel fertőzött COS-7 sejt felülúszóknál (CSF-17 felülúszó) az eredményeket 1:16 hígításnál az 1. táblázat mutatja be.

1. táblázat

	3H-timidin beépülés (cpm)
adalékok nélkül	normál szérum	anti-humán CSF-1 szérum
Közeg	861	786	2682
MIAPaCa felülúszó	12255	16498	3302
CSF-17 felülúszó	16685	21996	2324

HU 215 241 Β (Az anti-humán CSF-1 szérumot úgy készítjük el, amint ezt fentebb idézett munkájukban Das és munkatársai leírták.)

A MIAPaCa felülúszó (a fentebb alkalmazott 1:16 hígításnál) 125 egység/ml CSF aktivitást tartalmaz, ez megfelel 2000 egység/ml-nek a hígítatlan felülúszóban, ahol 1 egység telepstimuláló aktivitást úgy határozunk meg, mint azt a mennyiséget, amely 1 telep előállításához szükséges 10⁵ csontvelősejt/ml-ből Stanley E. R. és munkatársai vizsgálatában [J. Láb. Clin. Med. 79, 657, (1972)].

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a csontvelő stimuláló aktivitás kapcsolódik a CSF-1-gyei, mivel a timidin felvételét az anti-CSF-1 szérum gátolja. Az eredmények regressziós elemzése ebben a csontvelő sejtosztódási vizsgálatban, amely eredményeként négy, 1:8 és 1:64 közti hígításnál kapunk, CSF-1-re a CSF-17 felülúszóban 2538 egység/ml becsült eredményt ad, amely 424 egység/ml-re csökkent antiszérum jelenlétében, de látszólagos növekedést mutat 3693 egység/ml-re nem-immun szérum jelenlétében. Ez összehasonlítható az alább ismertetett radioreceptor vizsgálatban kapott szintekkel.

Telepstimulálás

A CSF-17 felülúszók közvetlen vizsgálata telepstimulálásra (Stanley E. R. és munkatársai: J. Láb. Clin. Med., fentebb idézett közlemény) 4287 egység/ml eredményt mutat, amelyet a nem-immun szérum jelenléte lényegében nem befolyásol, de 0 egység/ml-re csökken nyúl anti-humán CSF-1 jelenlétében. Ez összevethető az MIAPaCa felülúszókban levő 2562 egység/ml értékkel. A pcCSF-17-tel transzformált COS-7 felülúszóval indukált telepek 85%-a mononukleáris morfológiájú; az MIAPaCa felülúszó által indukált telepek 94% makrofág - 6% granulocita arányt mutatnak. Radioreceptor vizsgálat

A radioreceptor vizsgálat a versengést méri a ¹²⁵Ivel jelzett CSF-1 és a vizsgált vegyület között a fajlagos receptorokért J774.2 egér makrofág sejteken. MIAPaCa felülúszót, amelyet a fentiek szerint vizsgáltunk, telepstimuláló aktivitásra alkalmazunk standardként (2000 egység/ml). A pcCSF-17-tel transzformáit COS-7 felülúszók CSF-1 koncentrációjáról azt találjuk, hogy 2470 egység/ml értéket mutat 1:10 hígításra alapozva és 3239 egység/ml értéket mutat 1:5 hígításra alapozva.

így a pcCSF-17-tel transzformált COS-7 sejtek tápközegében a CSF-1 koncentrációra hasonló értékeket találunk mindegyik vizsgálatban.

SCSF kifejezése

Hasonló módon, mint ahogyan ezt a pcCSF-17-nél fentebb leírtuk, a mutein-kódoló plazmidokat COS-A2 sejtekre transzfektáljuk, és a CSF-1 aktivitás átmeneti kifejeződését vizsgáljuk a csontvelő sejtosztódási vizsgálattal és radioimmunoassay-val, anti-CSF antitesteket alkalmazva. A pCSF-pro₅₂ kifejeződési terméke inaktív, jelezve azt, hogy amint várható, a prolinnal történő helyettesítés nem őrződik meg. Az összes többi mutein mutat aktivitást mindegyik vizsgálatban, amint ezt az alábbi eredmények mutatják.

2. táblázat

CSF-1 konstrukciók kifejezése COS sejtekben

CSF-1 plazmid	Radio- immun- assay (egység/ml)	Csontvelő sejtosztódási vizsgálat (egység/ml)	Telep- stimulálás (egység/ml)
	3 130	2 798	11 100
pcCSF-17	3 080	3 487	9750
	3 540	3 334	11500
	54,8	25	100
pCSF-pro52	51,9	25	100
	45,3	25	100
	1 890	2969	6200
pCSF-gln52	2250	2 308	5 500
	1910	2229	4400
	3210	3 381	9000
pCSF-asp59	4680	3417	6 800
	3470	2812	10600
	9600	8 048	22600
pCSF-Bam	8 750	8441	21900
	8400	10995	21700
	8800		26000
pCSF-BamBcl	10700		21600
	15450		24200
	8450		22 600
pCSF-BamTGA	7550		23 200
	9700		20000
pCSF-Glyl50	26850		55710

3. táblázat

Egér csontvelő telep vizsgálat

CSF-1 plazmid	Telepképző egység/ml
pCSF-17	1 2 3	25000 25000 23 000
pCSF-asp59gly150	1 2 3	131000 125 000 132000
pCSF-asp59BamBC]	1 2	72000 78000

pcDBhuCSF-4 és pcDBhuCSF-25 kifejezése

A humán CSF-1-et kódoló DNS hosszú formáját tartalmazó Okayama/Berg típusú vektorokat transzfektáljuk COS-A2 sejtekbe olyan módon, amely pontosan analóg azzal, amelyet a COS-7 sejtek pCSF-17tel végzett transzfekciójára már leírtunk. A transzfektált sejtek felülúszóit elemezzük, radioimmunassay-t alkalmazva olyan antiszérummal, amely CSF-1 ellen készült, ahogyan ezt Das és munkatársai leírták (fentebb idézett munka), valamint csontvelő sejtosztódási vizsgálatot alkalmazva, amint fentebb leírtuk. Az eredményeket CSF-1 egység/ml-ben a 4. táblázat mutatja be.

HU 215 241 Β

4. táblázat pcDBhuCSF-4 és-25 kifejeződése COS-12 sejtekben

Minta	RIA (egység/ml)	BM vizsgálat (egység/ml)
pcDBhuCSF-4	16,979	9,200
pcDBhuCSF-25	15,926	8,000
közeg	12,5	<50
Ál-fertőzés	25,0	<50

Amint látszik, a vektorok bármelyikével fertőzött sejtek felülúszói tartalmaznak CSF-1 aktivitással bíró fehérjét.

Hasonló módon ezen speciális hosszú formájú LCSF fehéijék mutein formáit is megkaphatjuk.

F) 5. CSF-I eukarióta kifejeződése stabilan transzformált sejtekben

A COS-7 vagy COS-12 rendszerek rekombináns CSF-1-et biztosítanak, lehetővé téve az Okayama-Berg típusú vektor szekvenciák replikációját és ezek kifejeződését. Ez átmeneti kifejező rendszer.

A humán vagy rágcsáló CSF—1 szekvenciákat lehet stabilan kifejezni prokarióta vagy eukarióta rendszerekben is. Általában a prokarióta gazdaszervezetek a termelés megkönnyítését segítik elő, míg az eukarióták lehetővé teszik a natív szignál-szekvencia alkalmazását a kiválasztás kivitelezéséhez és bármilyen kívánt, transzláció utáni feldolgozás véghezviteléhez. Ez fontos lehet CSF-1 esetében, mivel a natív fehérje dimer. A baktériumok a CSF-1-et monomerként termelik, amelyet azután dimerizáló körülményeknek kell alávetni kivonás után, ha szükséges.

A pcCSF-17 Okayama-Berg plazmidot, vagy a muteineket kódoló DNS-t tartalmazó analóg vektorokat, például pCSF-asp₅₉-gly₁₅₀-et és pCSF-asp₅₉-BamBcl-t vagy az analóg pcDBhuCSF-4, pcDBhuCSF-25, pcDBmuCSF-L és pcDBmuCSF-S vektorokat, vagy más, LCSF muteineket kódoló vektorokat, amelyek CSF-1-et kódoló cDNS-t tartalmaznak az SV40 promoter szabályozása alatt, alkalmazhatjuk, hogy stabil kifejeződést éljünk el majom CV-1 sejtekben, abban a szülő-sejtvonalban, amelyből a COS-7 vonal származik.

A gazda majom CV-1 sejteket összefolyásig növesztjük, majd együtt transzformáljuk, 10 μg kifejező vektort és különböző mennyiségű (1, 2, 5 és 10 μg) pRSV-NEO2-t [Gorman C. és munkatársai: Science, 221, 551-553 (1983)] alkalmazva 500000 sejthez. A transzformánsokat 10% FBS-t és 100 μg/ml G418 antibiotikumot tartalmazó DMEM tápközegben növesztjük, erre az antibiotikumra biztosít rezisztenciát a pRSV-NEO2 plazmid. A CV-1 sejtvonal mintegy 10^_5>¹² telep (10⁶ sejt) μg DNS transzformációs gyakoriságot mutat.

A CV-1 sejteket kotranszformáljuk, amint fentebb leírtuk, és G418-at tartalmazó tápközegben szelektáljuk. A rezisztens kiónokat a G418-rezisztens fenotípus stabilitására megvizsgáljuk olyan módon, hogy G418mentes tápközegben növesztjük, majd visszavisszük G418-at tartalmazó tápközegbe. Ezeknek a tenyészeteknek az a képessége, hogy túlélnek, amikor visszakerülnek antibiotikumtartalmú tápközegbe, azt sugallja, hogy a pRSV-NEO2 DNS állandó módon integrálódik a sejt genomba. Mivel egy marker plazmiddal stabilan transzformált sejteknél mintegy 50% valószínűsége van, hogy egy kotranszfektált plazmid DNS-ét integrálták, ezeknek a sejteknek mintegy fele tartalmazza a CSF-1 fehérjéhez tartozó kifejező rendszert is kromoszomális DNS-ében.

A CV-1 sejtek G418-rezisztens készletéből néhány kiónt, amelyről kimutatjuk, hogy a fentiek szerint stabilan transzformálva van, kiválasztunk és növesztünk két párhuzamos lombikban csaknem teljes összefolyásig. Az egyes párhuzamosakból egy lombikot fertőzünk SV40 vírussal 5 χ-ös multiplicitással, és a tápközeget 6 nappal a fertőzés után kinyerjük radioimmunoassay-t alkalmazó CSF-1 vizsgálathoz. Az immunassay a ¹²⁵Ivel jelzett MIAPaCa CSF-1 és a tisztított humán vizelet-eredetű CSF-1 ellen kialakult „Rabbit 52” poliklonális antiszérum közti versengésen alapul.

A pcCSF-17-tel végzett fertőzésből kiválasztott CV-1 kiónok egyike 2335 egység/ml CSF-1 termelést mutat e szerint a vizsgálat szerint, míg az SV40-nel nem fertőzött sejtek kevesebb, mint 20 egység/ml-t mutatnak. 10 μg pcCSF-17-tel transzformált COS-7 sejteket alkalmazó kontroll 2400 egység/ml CSF-1 termelést mutat SV40 fertőzés nélkül.

A CSF-1-termelő CV-1 sejtvonal tartalmazza a CSF-1 kifejező rendszert stabilan integrálva genomjában, így lehet alkalmazni CSF-1 termelésére SV40nel való fertőzéssel. A fertőzésről feltételezzük, hogy „kiszabadítja” a kifejező rendszert a genomból, és szolgáltatja a kiszabadított DNS replikációjához szükséges SV40 T-antigént. SV40 fertőzés nélkül a CSF-1-et kódoló integrált gén hatékonyan nem fejeződik ki.

A CSF-1-et kódoló szekvencia CV-1 (CSF-17) sejtvonal általi kifejezésének optimuma 6500-8000 egység/ml-t mutat, amikor radioimmunassay-val mérjük hat nappal az SV40 fertőzés után, legalább 1 x-es fertőzési multiplicitást és 10% FBS tápközeget alkalmazva. 10 ^xes multiplicitásnál végzett vizsgálatok a kifejeződési szintre hasonló termelést mutatnak, de a termelés csökken az FBS eltávolításával a tápközegből a fertőzés utáni második napon.

Egy másik módszer szerint más eukarióta gazdaszervezetekben kifejeződést lehetővé tevő megfelelő szabályozó rendszereket és gazda vektorokat alkalmazhatunk, hogy a CSF-1-et kódoló inszerciókat kapjunk, így például CHO sejteket és megfelelő vektorokat alkalmazhatunk. Ezen kívül ezeket a szekvenciákat tartalmazó baculovirus vektorokat alkalmazunk, hogy rovarsejteket fertőzzünk fehérje termelésére, amint ezt Miller D. W. és munkatársai leírták (Genetic Engineering, 277-297 oldal, fentebb idézett szakkönyv).

F) 6. Prokarióta kifejeződés

A prokarióta kifejezéshez a cDNS kiónt, vagy a például helyspecifikus mutagenezissel kimetszett intronokkal ellátott genomiális szekvenciát megváltoztatjuk úgy, hogy ATG start kodont helyezünk el közvetlenül az N-terminálisnál levő glutaminsavtól fölfelé, és

HU 215 241 Β egy HindlII helyet helyezünk el közvetlenül az ATG-től fölfelé abból a célból, hogy kényelmes helyet biztosítsunk az alábbi standard gazda kifejező vektorokba való inszertáláshoz. Ezt közvetlenül is el lehet végezni helyspecifikus mutagenezis inszertálással a kívánt AAGCTTATG-vel komplementer új szekvenciát tartalmazó szintetikus oligomerrel, amelyet a natív vezető és N-terminális kódoló szekvenciákkal komplementer nukleotid szekvenciák határolnak.

A teljes kódoló szekvenciát tartalmazó DNS fragmentumot kimetsszük a pcCSF-17-ből vagy pcDBhuCSF—4-ből EcoRI-gyel végzett emésztéssel, agaróz gél elektroforézissel izoláljuk, és elektroelucióval kinyerjük. Hogy a mutagenezist kivitelezzük, az M13mpl 8 gazda bakteriofág DNS-t szintén EcoRI-gyel kezeljük és a tisztított fragmentummal ligáljuk standard körülmények között és fagyasztott, kompetens E. coli KI2 DG98 törzsbe transzferáljuk. A sejteket olyan tápközegre széiesztjük, amely 51(H izopropil-tiogalaktozidot (IPTG) Sigma Chem. St. Louis, Missouri) és 40 pg/ml X-gal-t tartalmaz. Nem komplementáló fehér tarfoltokat oltunk át friss tápközegre. Mini-tenyészeteket vizsgálunk át várt méretű rekombináns egyfonalas fág DNS-re, és a kívánt rekombináns fág szerkezetét restrikciós elemzéssel igazoljuk.

Egy 34-mert, amely komplementer a CSF-1 szekvencia N-terminális és vezető kódoló területeihez, de tartalmazza a kívánt AAGCTTATG szekvenciára komplementer részt is, szintetizálunk és tisztítunk. Egy másik változat szerint, amikor Μ13 negatív irányú szálat alkalmazunk, a pozitív irányú 34-mert használjuk. Ennek a 34-mer készítménynek egy részletét, amelyet később vizsgáló mintaként alkalmazunk, radioaktív jelzéssel látjuk el Maxam és Gilbert fentebb ismertetett technikájának módosított változata szerint [Maxam A. és munkatársai: Methods in Enzymology, 68, 521, (1980), Academic Press],

Hogy a mutagenezist végrehajtsuk, a fentebb készített rekombináns bakteriofágot elkészítjük E. coli KI2 DG98 törzsben, és az egyfonalas fág DNS-t tisztítjuk. 1 pmol egyfonalas fág DNS-t és 10 pmol fenti szintetikus nukleotid prímért (amely nincs polinukleotidkinázzal kezelve) 1 percen át 67 °C hőmérsékleten, majd 30 percen át 37 °C hőmérsékleten melegítünk 15 pl oldatban, amely 20 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 8), 20 mmol/1 MgCl₂-t, 100 mmol/1 NaCl-t és 20 mmol/1 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A melegítésnek alávetett DNS-t DNS-polimeráz I-gyel (Klenow) és 500 pmol dNTP keverékkel ínkubáljuk 30 percen át 0 °C hőmérsékleten, majd átvisszük 37 °C hőmérsékletre. 5 perc, 20 perc és 45 perc után elikvotokat (0,05 vagy 0,25 pmol) veszünk ki, transzformálunk E. coli K12 DG98 törzsbe, és szélesztünk.

A növesztés után a telepeket 4 °C hőmérsékletre hűtjük és tarfoltokat emelünk le Biodyne vagy S & S szűrőkből kapott Pali membránokkal (1-2 perc az első szűrőben, és több, mint 10 perc a második szűrőben). A szűrőket denaturáljuk 2,5 mol/l NaCl-t és 0,5 mol/l NaOH-t tartalmazó oldatban (5 perc). A denaturáló közeget 3 mol/l nátrium-acetáttal semlegesítjük (pH 5,5) vagy 1 mol/l NaCl-t tartalmazó 1 mol/l-es trisz-HCl-lel (pH 7,5) semlegesítjük, a szűrőket 80 °C hőmérsékleten vákuumban sütjük, majd szigorúan betartva a követelményeket, előhibridizáljuk. A szűrőket azután átvizsgáljuk a polinukleotid-kinázzal kezelt, fentebb készített szintetikus 34-merrel a követelményeket szigorúan betartva mossuk, és autoradiográfiának vetjük alá egy éjszakán át -70 °C hőmérsékleten.

Az egyes kívánt mutált fágok RF formáját EcoRIgyel kezeljük, Klenow-fragmentummal tompa végűvé tesszük, majd HindlII-mal emésztjük, hogy a gént HindlII/tompa vég fragmentumként kimetsszük.

A pFC54.t plazmidot (ATCC39 789), amely tartalmazza a P_L promotort és a Bacillus thuringiensis pozitív retroregulátor szekvenciát (amint ezt a 717,331 számú Európa szabadalmi közzétételi irat leírja, ezt 1985. március 29-én tették közzé), alkalmazzuk gazda vektorként. A pFC54.t-t HindlII/BamHI-gyel emésztjük (tompa vég), és a kívánt kódoló szekvenciát a vektorba ligáljuk, a pcCSF-17-ből vagy pcDBhuCSF—4-ből származó mutált Ml3-ból való HindlII/EcoRI (tompa) kimetszett fragmentumot alkalmazva. Az E. coli MCI000 lambda lizogén törzsbe való transzformáció és indukció után CSF-1 termelést, feltehetően SCSF, illetve LCSF termelést kapunk, és ezt úgy igazoljuk, ahogyan fentebb leírtuk.

így például a pcCSF-17-ből származó mutált M13 szubsztrátumból való HindlII/EcoRI tompa fragmentumot pFC54.t-be ligáljuk, amint fentebb leírjuk, hogy a pP_LCSF-17-et megkapjuk. A pP_LCSF-17-et azután BamHI-gyel emésztjük, és újra ligáljuk, hogy a pP_LCSF-17/CV158-at hagyjuk meg, amely tartalmazza az érett SCSF kódoló szekvenciáját, amelyet egy ATG start kodon előz meg, és megcsonkítjuk úgy, hogy olyan fehérjét kódoljon, amely az SCSF szekvencia első 158 aminosavával bír, ezt követi egy leolvasó kereten belüli prolin, és stop kodon a pFC54.t retroregulátor szekvenciájából. A pP_LCSF-17/CV158-at tovább módosítjuk helyspecifikus mutagenezissel. A HindlII/BamHI kódoló szekvenciát kimetsszük és Ml3-ba ligáljuk. Megfelelő prímért alkalmazunk, hogy stop kodont helyezzünk el közvetlenül a 158. aminosavat kódoló kodon után és ezt TGA kövesse. Ez a későbbi manipulációkhoz BamHI/BclI helyet alakít ki. A mutált fragmentumot azután Ml3-ból kimetsszük és újra ligáljuk HindlII/BamHI-emésztett pP_LCSF-17/CV158ba, hogy megkapjuk a pP_LCSF-17/CV158TGA-t. További konstrukciók között, amelyek helyettesítő aminosavakat kódoló kodonokkal bírnak, találjuk a lys-et helyettesítő módosítását az 52. helynek gln-re vagy prora, és/vagy a tyr-1 helyettesítő módosítást asp-ra az SCSF-ben. Ezeket a konstrukciókat analóg módon készítjük el az eredeti pP_LCSF-17-ből való HindlII/EcoRI (tompa) fragmentumot tartalmazó Ml3 inszerciók helyspecifikus mutagenezisével. Az ezekből a mutált fágokból való HindlII/EcoRI fragmentumokat azután az eredeti HindlII/EcoRI inszerciók helyett alkalmazzuk megfelelő vektorok konstrukcióiban. Általában kívánt mutációkat lehet végezni kiválasztott helyeken ennek a standard technikának a variációi szerint.

HU 215 241 Β

Lehetséges megjavítani a CSF-1 termelés szintjét a fenti konstrukciók bármelyikéből, megváltoztatva a harmadik nukleotidot az N-terminális első hat kodonjának mindegyikében. A bármilyen mutein CSF-1-et kódoló fragmentumát tartalmazó pFC54.t-t emésztjük HindlII/BstXI-gyel, és a kimetszett fragmentumot (amely az ATG-t és az ezt követő kódoló szekvencia egy rövid részét tartalmazza) helyettesítjük szintetikus HindlII/BstXI szegmenssel, ahol az első hat kodon szekvenciája az alábbi: GAAGAAGTTTCT GAATAT. Az így létrejött analóg kifejező vektor nem képvisel változást a kódolt aminosav-szekvenciában; a kifejeződés szintje azonban javul, amikor ezt a módosított vektort alkalmazzuk. A megfelelő vektorokat az O/E előjellel látjuk el (over-expression - magas kifejeződés), így például O/E pP_LCSF-17-et, O/E pP_LCSF-17/ CV158-at, és O/E pP_LCSF-17/CV158TGA-t alakítunk ki.

A megfelelő vektort, az O/E pP_LCSF-17asp₅₉/ CV158TGA-t szintetizáljuk úgy, ahogyan fentebb leírtuk, azzal a kivétellel, hogy az eredeti EcoRI inszerciót tartalmazó M13-at kétszer mutáljuk, hogy behelyezzünk egy HindlII helyet és egy ATG start kodont közvetlenül az érett fehérje 1. aminosava elé, és helyettesítsük az 59. gyöknél lévő tirozin kodont aszparaginsavat képviselő kodonnál. Ilyen módon megfelelő módon képezzük a megfelelő O/E pP_LCSF-17asp₅₉/ CV158 és O/E pP_LCSF-17asp₅₉/CV158TGA vektorokat. Az előző esetek mindegyikében az intermedier vektorok mindegyikét HindlII-mal és BstXI-gyel emésztjük, és az első hat aminosavat kódoló natív szekvenciát helyettesítjük az előnyös kodonokat tartalmazó szintetikus DNS fragmentumokkal.

Ezen kívül az összes fenti vektort úgy módosítjuk, hogy N-terminális deléciókkal bíró fehéijéket kódoljanak, ezt úgy végezzük el, hogy a kimetszett HindlII/BstXI DNS-t a megfelelő szintetikus fragmentummal helyettesítjük. Ezen a módon a CSF/NV2-t és NV3-at, amelyekből glu-glu, illetve glu-glu-val hiányzik kódoló megfelelő vektorokat alkotjuk meg.

Olyan analóg vektorokat is megalkotunk, amelyek az SCSF fehéije 150. helyénél levő glicin gyök után közvetlenül terminációs kodont tartalmaznak. Ezeket a vektorokat a pP_LCSF-17 vagy pP_LCS-17asp₅₉-ből vagy megfelelő muteinjeikből származó HindlII/EcoRI fragmentum HindlII/Smal-emésztett Ml3-ba végzett mutagenezisével kapjuk meg. Az így létrejött vektorok, például a pP_LCSF-17/CV15O és a pP_LCSF-17asp₅₉/CV150, kódolják például az érett SCSF fehéije első 150 aminosavgyökét.

Az előbbiekben említett vektorok, amikor azokat E. coli lizogén gazdaszervezetbe, például DG116-ba transzformáljuk és magas hőmérsékleten (mintegy 42 °C hőmérsékleten) indukáljuk, CSF-1-et és muteinjeit termelik monomer vagy aggregált deglikozilezett formában. Ennek a fehérének a termelését standard radioimmunassay vagy más CSF-1 fajlagos vizsgálatok alkalmazásával mutatjuk be. A fehérje aktivitása mérhetően javítható az újrahajtogatási eljárások alkalmazásával.

Úgy is készítünk konstrukciókat, hogy a foszfatáz A promotert és kiválasztó vezető szekvenciát alkalmazunk a P_L promotor helyett. A szabályozó szekvenciákat, beleértve a pFC54.t-nek megfelelő szabályozó szekvenciákat, a kívánt kódoló szekvencia inszertálásával alakítjuk ki Narl/BamHI emésztett pSYC 1089-be; ez olyan vektor, amely tartalmazza ezeket a szabályozókat.

Abból a célból, hogy ezeket a vektorokat hasznosítsuk, az idevágó CSF-kódoló szekvenciákat újra ligáljuk Ml3-ba, hogy megváltoztassuk az ATG-t közvetlenül megelőző HindlII helyet Clal hellyé. A mutált szekvenciát azután Clal/BclI fragmentumként kimetsszük és az emésztett pSYC1089 vektorba ligáljuk, amint leírtuk. Ennek a konstrukciónak a termékei, amelyek a P_L promotor szabályozása alatt a P_L vektor-sorozatban termelt rövid formákkal felelnek meg, a periplazmás térbe választódnak ki, amikor E. coliban fejeződnek ki, és viszonylag oldhatók P_L szabályozás alatt kifejezett gének termékeivel összehasonlítva. Azok között a vektorok között, amelyeket az itt leírt phoA rendszert alkalmazva alkothatunk meg, találjuk a pPhoA-LCSF/C 158-at és pPhoA/N 3C 150-et. Ezeket a vektorokat a kifejezéshez nem '¹· lizogén gazdaszervezetbe, például E. coli MM294-be, transzformáljuk.

Vektorokat alkothatunk meg a hosszú formájú klónból származó DNS-t alkalmazva is. A fentebb leírt O/E pP_LCSF-17asp₅₉/C 150-et alkalmazzuk gazda vektorként a hosszú formájú konstrukciókhoz és különböző C-terminálison csonkított alakokhoz a hosszú formához tartozó kódoló szekvenciában. Mivel a BstXI helytől fölfelé levő szekvenciák közösek mind a rövid, mind ahosszú formákban, a rövid formát és muteinjeit tartalmazó vektorokat átalakíthatjuk hosszú formájú vektorokká, kicserélve ennek a vektornak a BstXI/BamHI fragmentumát olyan módon, hogy kimetsszük a szekvencia lefelé eső területét végig, beleértve a TGA stop kodont is, és behelyettesítjük a 4. klónból vagy annak C-terminálison csonkított alakjából származó hosszú formájú kódolt szekvenciát tartalmazó Ml3 BstXI/BamHI fragmentumot.

Közvetkezésképpen a 4. klóninszerciót tartalmazó M13 kiónt a megfelelő oligomerekkel mutagenizálunk, hogy stop kodonokat iktassunk be a 150., 190., 191., 221., 223., 236., 238., 249., 258. és 411. helyek után. így például a 4. klón inszerciót tartalmazó Ml3 fordított szálat a GGCTTGACCTGATCAGACTCTGAGG oligonukleotiddal indítjuk be abból a célból, hogy egy stop kodont helyezzünk el a 191. helynél levő treonin gyök után, és egy egyedi Bell helyet szolgáltassunk közvetlenül ez után. A fág mutagenizált RF formáját BstXI-gyel és BamHI-gyel emésztjük és Bstl/BamHIemésztett O/E pP_LCSF-17 asp₅₉/CVl50-be ligáljuk, hogy megkapjuk az O/E pP_LCSFasp₅₉/CV 150-et.

A mutált hosszú formát lehet alkalmazni az N-terminális deléciókkal rendelkező CSF-1 fehérjéket kódoló vektorokból, valamint a phoA-szabályozott vektorokban lévő megfelelő konstrukciókból származó megfelel rövid formájú fragmentumok helyettesítésére. így például megalkotjuk a pPhoA-LCSF/NV3CV2 és pPhoA-LCSF/CV221-et, és E. coli MM294-be transz21

HU 215 241 Β formáljuk. Természetesen a hosszú formák több mint egy mutációját lehet hatékonyan kivitelezni; aminosav helyettesítéseket is végzünk, például a gly₅₂-t vagy tyr₅₉-et.

További konstrukciókat is készíthetünk SCSF-et, LCSF-et és muteinjeiket kódoló muteinekhez, ahol a 122-124. és 140-142. helyeken lévő, mindkét fehérjénél közös glikozilező helyeken olyan aminosavakkal helyettesítjük, amelyek nem tárgyai a glikozilezésnek. Ezeknek a konstrukcióknak a bakteriális kifejezéséből termelt CSF fehérjék aktívak a biológiai mérésekben: ez igazolja azt az állítást, hogy a glikozilezés nem szükséges az aktivitáshoz. A risztéin gyökök bármelyikének kicserélése azonban szerinre vagy alaninra az 1-50. helyzetek között inaktív fehérjéket eredményez, kivéve a 90 helyzetnél helyettesített muteineket; ezeknek van immunreaktivitása. Nyilvánvaló, hogy mind a hét risztéin jelenléte szükséges, vagy legalább is kívánatos, a megfelelő újrahajtogatáshoz.

A jelen találmány szerinti NV2 és NV3 muteinek megalkotása a fenti vektorokból rendkívül egyszerű, és csupán abból áll, hogy kiiktatjuk a HindlII/BstXI fragmentumot és helyettesítjük olyan szintetikus fragmentummal, amely nem foglalja magában az első két vagy három aminosav kodonjait, ahogy éppen szükséges. így az előzőekben említett vektorok mindegyikét lehet módosítani, hogy a találmány szerinti muteineket kódoló vektorokat kapjunk ezzel az egyszerű helyettesítési eljárással.

A készített rekombináns organizmusok között vannak az alábbi plazmidokkal transzformált E. coli DG116 λ-lizogén törzsek, amelyek a jelzett rövid formából származó CSF-1 mutein formák kifejezéséhez szolgáló konstrukciók.

Konstrukció pP_LCSF-17 pP_LCSF-17gln₅₂ pP_LCSF-17pro₅₂ pP_LCSF-17/CV158 pP_LCSF-17gln₅₂/CV158 pP_LCSF-17pro₅₂/CV158 pP_LCSF-17asp₅₉ pP_LCSF-17/CV158TGA O/E pP_LCSF-17/CV158TGA pP_LCSF-l 7pro₅₂/CVl58TGA pro₅₂SCSF/CV 158 pP_LCSF-l7asp₅₉/CV 158TGA asp₅₉SCSF/CV 158 O/E pP_LCSF-17asp₅₉/

Kódolt fehéije

SCSF gln₅₂SCSF pro₅₂SCSF

SCSF/CV158-pro gln₅₂SCSF/CV158-pro pro₅₂SCSF/CV158-pro asp₅₉SCSF

SCSF/CV158

SCSF/CV158 asp₅₉SCSF/CV158 SCSF/CV150 SCSF/CV150 asp₅₉SCSF/CV 150 asp₅₉SCSF/CV150

CV158TGA pP_LCSF-17/CV150 O/E pP_LCSF-17/CV150 pP_LCSF-17asp₅₉/CV150 O/E pP_LCSF-l 7asp₅₉/CV 150 O/E pP_LCSF-l7asp₅₉/NV2CVl 50 asp₅₉SCSF/NV2CVl50 O/E pP_LCSF-17asp₅₉/

NV3CV150

A hosszú formájú variációkat kódoló alábbi analóg rekombináns organizmusokat alkotjuk meg:

O/E pP_LLCSF/CV150 LCSF/CV1/CV150

O/E pP_LLCSFgln₅₂/CV150 gln₅₂LCSF/CV150 asp₅₉SCSF/NV3CV150

O/E pP_LLCSFtyr₅₉/CV 190 O/E pP_LLCSF/CV191 O/E pP_LLCSF/NV2CV191 O/E pP_LLCSF/CV221 O/E pP_LLCSF/NV3CV221 O/E pP_LLCSF/CV223 O/E pP_LLCSF/CV236 O/E pP_LLCSF/CV238 O/E pP_LLCSF/CV249 O/E pP_LLCSF/CV250 O/E pP_LLCSF/CV411 phoA-LCSF/CV221 phoA-LCSF/NV3C V221 O/E phoA-LCSF/CV221 tyr₅₉LCSF/CV190

LCSF/CV191

LCSF/NV2CV190

LCSF/CV221

LCSF/NV3CV221

LCSF/CV223

LCSF/CV236

LCSF/CV238

LCSF/CV249

LCSF/CV250

LCSF/CV411

LCSF/CV221

LCSF/NV3CV221

LCSF/CV221

O/E phoA-LCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 A konstrukciók kifejezéséhez megfelelően transzformáit E. coli-t (λ-lizogén, például DG116, a P_L konstrukciókhoz, és nem lizogén, például MM294 a PhoAhoz) tenyésztünk kívánt sejtsűrűségig, majd a kódolt fehérje termelését indukáljuk. Ha a kifejezés a P_L promoter szabályozása alatt történik, a hőmérséklet növelése 37 °C-ra vagy 42 °C-ra indukálja a kifejeződést. A tápközeghez mintegy 0,5-2% kazaminosav sósavval hidrolizált kazein) hozzáadása szintén segítséget jelent a kifejeződés növelésében. A fentebb leírt konstrukciók a CSF-1 képződését oldhatatlan, intracelluláris fehéreként eredményezik, amelyet a lizált sejtekből lehet kinyerni, tisztítani és újrahajtogatni. Hasonló eljárást lehet alkalmazni a phoA-val szabályozott génekkel transzformált E. coli periplazmatikus terébe kiválasztott CSF-1 tisztítására és újrahajtogatására is.

Általában az újrahajtogatás a szolubilizált monomerrel kezdődik kaotróp környezetben, amelyet redukáló körülmények között tartunk fenn. Az ilyen fenntartás magában foglalhatja egy megfelelő redukálószer, például β-merkapto-etanol vagy ditiotreitol (DTT) alkalmazását, de a CSF-1 már redukált lehet, és elegendő az oxidálószerek kizárása. A szolubilizált fehérjét tipikusan például 8 mol/l-es karbamidban vagy 7 mol/literes guanidínium-hidrokloridban tartjuk fenn, mint 7-8,5 közti pH-η, mintegy 25-100 mmol/1 tiol vegyület jelenlétében. Ebből a szolubilizált formából kiindulva a monomert lehet újrahajtogatni közvetlenül, vagy a megmaradó fehérjékből tisztított formában, ezt megfelelő tisztítási eljárásokkal, például adszorbens gélen végzett kromatográfiával vagy gélpermeációs kromatográfiával érhetjük el az újrahajtogatás előtt. A gélpermeációs kromatográfía az előnyös, mivel az lehetővé teszi a kívánt monomerhosszúság - ami általában előre ismert - szerinti könnyű elkülönítést az eltérő molekulatömegű szennyezésektől. Szükséges, hogy a tisztítást redukáló körülmények között hajtsuk végre abból a célból, hogy megelőzzük a diszulfidon átkapcsolt aggregátumok keletkezését. így tekintet nélkül az alkalmazott kromatográfiás eljárásra, megfelelő redukálószer szükséges a kromatográfiás oszlopokra vagy adagokra való terheléshez alkalmazott oldatokban és az eluáló oldatokban. Bizonyos esetekben az alacsony pH helyettesítheti a redukálószert, mivel az alacsony pH megakadályozza a diszulfid kötés kialakulá22

HU 215 241 Β sát bizonyos kromatográfiás rendszerekben, még redukálószer távollétében is.

A részben tisztított monomert ezután újrahajtogatási körülményeknek teszik ki, hogy dimert képezzünk. A fehérje koncentráció ennek a lépésnek a során különös fontosságú. Általában a kitermelés növekszik, ha a fehérjekoncentráció kevesebb, mint 2 mg/ml CSF-1 fehérje; 0,03-0,3 mg/ml koncentrációtartomány az előnyös. Az újrahajtogatási körülmények magukban foglalhatják a kaotróp környezet fokozatos eltávolítását megfelelő időtartamon belül, általában néhány órán belül. Az egyik könnyű módszer a minta hígítása a kaotróp szer kívánt koncentrációjára, de ez bizonyos esetekben lehet, hogy nem előnyös, mivel a fehérje szintén hígítottá válik. Előnyösebbek azok a módszerek, amelyek állandó fehérjekoncentrációt biztosítanak, ilyen a dialízis vagy az üreges rost diafiltrálás. Az eljárás végén, amikor a kaotróp környezet kimerült, nemdenaturáló szintet érünk el. így például, ha guanidinhidrokloridot alkalmazunk kaotróp szerként, kevesebb, mint 2 mol/liter, előnyösen 0,5-1 mol/liter végső koncentrációt érünk el.

Az újrahajtogatást a kaotróp környezet eltávolítása során olyan módon hajtjuk végre, hogy lehetővé váljék a szulfhidrilcsoportok oxidálása diszulfidokká abból a célból, hogy létrejöjjön egy biológiailag aktív dimer konfiguráció, amely CSF-1 esetében stabilizálva van diszulfidok képzésével, melyek közül egy vagy több kapcsolhatja össze a két láncot. Láncon belüli diszulfidok is keletkeznek. Megfelelő redox körülmények, amelyek a dimer ilyen képződését elősegítik, lehetnek az SH/diszulfid reagens kombinációk, mint például az oxidált és redukált glutation. A redukált és oxidált glutation vagy más szulfhidril/diszulfid kombinációk aránya tipikusan mintegy 2 mmol/0,1 mmol/liter és 0,5 mmol/1,0 mmol/1 között van. Más módszerek is elfogadhatók ennek az oxidációnak a végrehajtására. A redukálószer egyszerű eltávolítása óvó rendszabályok nélkül, hogy a levegőt és a fémionokat kizárjuk, kielégítheti bizonyos korrekt diszulfid kötések hatékony képződését, de ez kevéssé előnyös. Mindenesetre az oldat pH-ját az újrahajtogatási folyamat során mintegy pH 7,5-9,0 tartományban kell tartani. Világos, hogy az újrahajtogatás folyamatában a redukáló körülményeket, amelyek között a kezdeti tisztítást végezzük, tovább nem alkalmazzuk.

Az újrahajtogatási folyamat során a monomer aggregátumai képződhetnek, amelyek oldhatatlanok. Ez minimumra csökkenthető hőmérsékletszabályozás révén, ahol az alacsony, mintegy 0-4 °C hőmérsékleten előnyösebbek a magasabb, 25-37 °C hőmérséklethez viszonyítva. Miután az újrahajtogatás teljes lett, a dimert megtisztítjuk a többi fehérjéktől, standard eljárásokat alkalmazva.

Amikor az N-terminálison csökkentett muteineket kódoló konstrukciókat fejezünk ki E. coliban, amint fentebb említettük, a metionin az N-terminálisnál sokkal hatékonyabban dolgozódik fel, mint a megfelelő érett szekvenciák esetében. Pontosabban, a pP_LCSFV-17/CV150 kifejeződése olyan fehérjét eredményez, amelyben legtöbb, ha nem az összes szekvencia-elemzett molekula tartalmaz N-terminális metionint; a pP_LCSF-17/NV2CV150 megfelelő kifejeződése olyan fehérjét eredményez, ahol a molekuláknak csak 78%-a őrzi meg az N-terminális metionint. A pP_LCSF-17/NV3CV150 kifejeződése olyan fehéijét ad, ahol a terméknek csupán mintegy 5%-a tartalmaz metionint az N-terminálisnál.

A 6-9. ábrák az N-terminális deléciók hatását mutatják be az így létrejött fehérjék heterogenitására. A 6. és

7. ábrák E. coliban kifejezett tisztított CSF-1 RP-HP_LC elemzéseit mutatják be, pP_LCSF-17/CV158 (tyr₅₉-et, illetve pP_LCSF-17/CV150 (asp₅₉)-et alkalmazva. Amint mindkét ábrán bemutatjuk, két fő csúcs van mintegy 18 kD-nál redukáló körülmények között, amelyek között ezeket az elemzéseket futtatjuk. A vezető csúcs, és a megfelelő csúcs a 7. ábrán, amelyet a 6. ábrán 18K-Anak jelzünk, mintegy 70%-át tartalmazza a teljes 18 kDos fehérjének, és lényegében ugyanolyan aminosavösszetétellel és SDS-PAGE alegység molekulatömeggel bír, mint a hátsó csúcs (amelyet 18 K-B-vel jelzünk). Ezen kívül a 158 kodon konstrukció eredményezi a fő szennyezést egy 15 kD-os fehéije formájában, amely nyilvánvalóan egy belső új start terméke. Ez a csúcs, úgy tűnik, hiányzik a 150 kodon (asp₅₉) konstrukció termékéből, amint ez a 7. ábrán látható.

A 7. ábra eredményeinek megfelelően hasonlónak kell lenniök a 8. és 9. ábra eredményeihez, amelyek a pP_LCSF-17 (NV2 CV150, illetve pP_LCSF-17/NV3 CV150 kifejeződéséből származó termékek RP-HP_LC elemzéseit képviselik. Mindkét esetben a RP-HP_LC-nél látható jelentős heterogenitás eltűnik, és a 7. ábra vezető 70%-os csúcsának megfelelő egyedi csúcsot kapunk.

G) Rágcsáló CSF-1

Érett rágcsáló CSF-1-et kódoló, intron nélküli DNS szekvenciát állítunk elő, rágcsáló fibroblaszt sejtvonalat alkalmazva, amely nagy mennyiségű CSF-l-et termel. Az L-929 vonalat, amely az ATCC-től szerezhető be, alkalmazzuk mRNS forrásaként abból a célból, hogy cDNS könyvtárat kapjunk. A CSF-1 „hosszú” formáját kódoló két kiónt nyerünk ki, vizsgáló mintaként humán „rövid” formájú cDNS-t alkalmazva. A rágcsáló CSF-1-ről úgy hisszük, hogy mintegy 80%-ban homológ a humán anyaggal az N-terminális szekvenciák homológiája miatt, amiatt a képesség miatt, hogy mind a humán, mind a rágcsáló CSF-1 készítmények stimulálják a csontvelő sejtekből származó makrofág telepeket, és korlátozott kereszt-reaktivitás miatt a radioreceptor és radioimmunassay tekintetében [Das S. K. és munkatársai: Blood, 58, 630 (1981)].

A rágcsáló CSF-1 fehérje különösen hasznos modell-rendszerekben, hogy értelmezzük a CSF-1 aktivitás profilját.

G) 1. Rágcsáló CSF-1 cDNS készítése

CSF—17 vizsgáló minta alkalmazása

Teljes hírvivő RNS-t vonunk ki és tisztítunk rágcsáló L-929 sejtekből. Rágcsáló L-929 sejteket tenyésztünk 8 napon át DME tápközegben, majd centrifúgálással kinyerjük. Teljes citoplazmás hírvivő RNS-t izolá23

HU 215 241 Β lünk a sejtekből azonos munkamenet szerint, mint amelyet föntebb az MIAPaCa mRNS-hez leírtunk.

A teljes mRNS készítményt szacharóz gradiensen futtatjuk, amint ezt a WO 86/04 607 számú, fentebb már idézett PCT közzétételi irat leírja, az MIAPaCa sejtekből származó mRNS előállításával kapcsolatban, azzal a kivétellel, hogy 5-25% szacharóz gradienst alkalmazunk a fentebb alkalmazott 5-20% gradiens helyett.

A gradiensben levő egyes frakciókból alikvotokat injektálunk Xenopus laevis oocitákba és a termékeket radioimmunassay-val mérjük anti-CSF-1 antitestek ellen, amelyeket Das és munkatársai korábban már idézett munkája szerint készítünk. Itt két mRNS csúcs van a 17-20 és 23-26 frakcióknál, amelyek CSF-1-gyei immunreaktor transzlatált terméket mutatnak.

A 19-20 és 24-25 funkciókat összegyűjtjük és cDNS könyvtár megalkotására használjuk ÁgtlO-bcn, amint ezt Huynh és munkatársai fentebb idézett munkájukban leírták. A beiktatás előtt a nyers cDNS készítményt EcoRI kapcsolókhoz ligáljuk, EcoRI-gyel emésztjük, és a kettős szálú cDNS-t elektroforézisnek vetjük alá 5% akrilamid gélen. Csak a több, mint 1800 bp-t tartalmazó DNS-t eluáljuk, majd ligáljuk a kft 10 karokkal, és becsomagoljuk, Vector Cloning Systems (Stratagene) Gigapak-ot alkalmazva.

Mintegy 1 millió fág tarfoltot vizsgálunk át ³²P-jelzett egyfonalas CSF-17 DNS-sel, amelyet úgy készítünk el, ahogy ezt a humán CSF-1 hosszú formájával kapcsolatban fentebb leírtuk.

Egy sor fág tarfoltot, amely a vizsgáló mintához hibridizál, tisztítunk, és két kiónt, az egyiket mintegy 2 kbos inszercióval, a másikat mintegy 4 kb-os inszercióval, kiválasztunk a további vizsgálatokhoz. A restrikciós térképezés azt mutatja, hogy ezek a kiónok nagy közös területet tartalmaznak, és mindkét kiónt szubklónozzuk M13mp 18-ba és M13mp 19-be didezoxi-szekvenciaelemzéshez: a kiónokat mindkét szálon szekvenciaelemzésnek vetjük alá. A nukleotid szekvenciákat mindkét kiónhoz, és az ezek által kódolt kikövetkeztetett aminosavszekvenciákat a 4. és 5. ábra mutatja be.

Amint a 4. ábrából látható, a hosszabb, 4 kb-s klón a 24. nukleotidnál kezdődik az 1. ábrán bemutatott humán CSF-17-hez viszonyítva, és 159 bp nem transzlatált 5’ szekvenciával bír, amelyet a vezető szekvenciát kódoló DNS 96 bp-ja követ. Az érett fehérjéhez tartozó kódoló szekvencia ennek a kiónnak a 256. nukleotidjánál kezdődik és folytatódik további 1560 nukleotidon át, így egy 520 aminosavas fehérjét kódol. Jelentős szekvencia-homológia áll fenn a humán „hosszú” formájú CSF-1 kódoló szekvenciával. Az 1816. nukleotidnál levő stop kodon után azonban a nukleotid szekvencia jelentősen eltér a pcCSF-17-ben és a „hosszú” formájú kiónokban levő humán 3’ nem transzlatált szekvenciától.

A rövidebb, 2 kb-s klón mintegy 500 bp-s 3’ nem transzlatált szekvenciával bír, amely sokkal nagyobb homológiát mutat a CSF-17-ben talált 3’-nem transzlatált szekvenciához. A rövidebb, 2 kb-s kiónhoz tartozó DNS szekvenciát az 5. ábra mutatja be. Ez 90 bp-vel rövidebb az 5’ végnél, de ugyanazt a kódoló szekvenciát tartalmazza, mint a 4 kb-s klón, 2 nukleotid változás kivételével; mindkettő változást okoz az aminosavszekvenciában. A szóban forgó hely az 1034. hely a hosszabb (994. hely a rövidebb) kiónban, és az 1192. hely a hosszabb (1102. hely a rövidebb) kiónban. A G a rövidebb klón 944. helyében Gly-t eredményez az érett fehérje 259. helyénél: a hosszabb klón megfelelő A-ja Asp-ot eredményez ezen a helyen. A második változás, a T-ről a hosszabb kiónban V-re a rövidebb kiónban változást eredményez a 312. helyen, szerinről prolinra a rövidebb kiónban.

így amint ez a 4. és 5. ábrákon látható, a rágcsáló CSF fehéije durván homológ a humán fehéije hosszú formájához, és látszólag egy olyan 296 aminosavas szegmenst tartalmaz, amely a CSF-17 DNS által kódolt pepiidbe iktatott „extra” peptidnek felel meg.

A fentebb leírt és az 5. és 6. ábrákban bemutatott rágcsáló CSF-1-et kódoló hosszabb és rövidebb kiónokat Ágt 10-ből kimetsszük EcoRI emésztéssel, és a pcDB módosított Okayama/Berg klónozó vektorba klónozzuk, így helyezve ezeket az SV40 korai promoter ellenőrzése alá, és így a pcDBmuCSF-L-t, illetve pcDBmuCSF-S-t kapunk.

Mutein formák

Fentebb a humán szekvenciákkal kapcsolatban leírtakhoz pontosan hasonló módon a rágcsáló szekvencia mutált formái most rendelkezésre állnak az izolált DNS alapján. Pontosabban a tyr₅₉ és gln₅₂ és tyr₅₉gln₅₂ formákat megkaphatjuk úgy, hogy a pcDBmuCSF-L és pcDBmuCSF-S DNS inszercióit módosítjuk a pcCSF-17-nél fentebb leírtakhoz pontosan hasonló módon. A módosított vektorok ekkor a fehéijének azokat a mutein-formáit kódolják, amelyeket asp₅₉-muLCSFnek, gln₅₂-muLCSF-nek, illetve tyr₅₉gln₅₂-muLCSFnek nevezünk.

G) 2. Rágcsáló CSF-1 DNS kifejeződése

A pcDBmuCSF-L- és pcDBmuCSF-S kifejező vektorokat COS-A2 sejtekbe transzfektáljuk DEAE dextránt alkalmazva klorokin hozzáadásával, amint fentebb leírtuk.

A felülúszókat 72 óra után összegyűjtjük és CSF-1 aktivitásra megvizsgáljuk a fentebb leírt csontvelő sejtosztódási vizsgálatot alkalmazva. A felülúszók mind tartalmaznak CSF-L aktivitást e szerint a vizsgálat szerint, amint ezt az 5. táblázat eredményei bemutatják.

5. táblázat pcDBmuCSF-L és pcDBmuCSF-S kifejeződése COS-12 sejteken

Minta	BM vizsgálat (egység/ml)
(2 kb egér klón) pcDBmuCSF-S	11,533
(4 kb egér klón) pcDBmuCSF-L	5,033

Hasonló módon kapjuk meg a rágcsáló szekvencia mutein formáit is.

H. CSF-1 formulázása

A rekombináns úton termelt humán CSF-1 rövid vagy hosszú formáit a beadáshoz standard gyógyszeré24

HU 215 241 Β szeti eljárásokat alkalmazva formulázhatjuk. A CSF-1 et általában injektálható formában készítjük és alkalmazhatjuk vagy egyedüli hatóanyagként, vagy más fehérjékkel vagy más vegyületekkel együtt, amelyek kiegészítő vagy hasonló aktivitással bírnak. Az ilyen más vegyületek közt lehetnek a más jellegű tumorellenes szerek, mint az IL-1, IL-2, IL-3; az alfa-, béta- és gamma interferon, és a tumor nekrózis faktor. A CSF-1 hatóanyag hatása fokozható vagy növelhető ilyen jellegű további komponensek jelenlétével. Amint fentebb leírtuk, a CSF-1 előnyös módon lép kölcsönhatásba a megfelelő vérsejtekkel, és a találmány szerinti kompozíciók ezért magukban foglalják az ilyen sejtek inkubációs keverékeit is CSF-1-gyei, adott esetben további limfokinek jelenlétében. Az ilyen inkubáló keverékeknek vagy a felülúszó fúnkcióit, vagy a sejteket tartalmazó teljes keveréket alkalmazhatjuk. Deponálások

1985. április 2-án az American Type Culture Collection-nál (Rockville, Maryland, USA) (ATCC) deponáltuk a phCSF-1 fágot E. coli dG98-ban ATCC 40177 deponálási számon. 1985. május 21-én a phCSF-1 a-t, amely a Cetus gyűjteményében CMCC 2312 néven szerepel, és amelyet a deponálásnál phCSF-1 a/λ Charon 4A-nak neveztünk, deponáltuk az ATCC-nél, ahol ez az ATCC 40185 deponálási számot kapta. 1985. június 14-én a pcCSF-17-et E. coli MM294-ben deponáltuk CMCC 2347 jelzéssel az ATCC-nél, ahol ez az ATCC 53 149 deponálási számot kapta.

Ezeken kívül a pcDBCS4-et, amelyet itt pcDBhuCSF-4 (CMCC 2894)-nek jelölünk, deponáltuk az ATCC-nél 1986. október 24-én, ahol az az ATCC 67250 deponálási számot kapta. 1987. április 7-én a pP_LCSF-17asp₅₉/CV 150-et deponáltuk DG1 lóban (CMCC 2946) az ATCC-nél, ahol ez az ATCC 67 383 deponálási számot kapta. A rágcsáló szekvenciájú pcDBmuCSF53 és pcDBmuCSF-L plazmidokat, amelyeket itt pcDBmuCSF-S-nek, illetve pcDBmuCSF-L-nek jelöltük, ugyanakkor deponáltuk az ATCC-nél; ezek CMCC számai: 2892, illetve 2893, az ATCC-nél pedig az ATCC 67248, illetve ATCC 67 249 deponálási számot kapták.

További deponálásokat végeztünk 1987. április 14én az alábbiak szerint:

Törzs	CMCC szám	ATCC szám
pPhoA-LCSF/CV221 MM294-ben	3084	67391
O/E pPLCSF/NV3CV221 DG 116-ban	3095	67390
O/E pPLCSF17aspS9/CV 150 DG 116-ban	3044	67389

Ezeket a deponálásokat a Budapesti Szerződés előírásai szerint végeztük [Mikroorganizmusok deponálásának nemzetközi elismerése szabadalmi eljárások céljaira; és ennek Szabályzata (Budapesti Szerződés)].

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán CSF-1 NV3 vagy NV2 műfemjének előállítására, azzal jellemezve, hogy egy legalább a következő aminosavszekvenciával rendelkező muteint:

   i) NV3 vagy NV2/SCSF/C V150, vagy ii) NV3 vagy NV2/LCSF/CV150, vagy iii) az i) vagy ii) aminosavszekvencia módosított alakja, amelyben 1-5 aminosav helyettesítve van vagy hiányzik,

   - ahol SCSF jelentése a CSF rövid formája, LCSF jelentése a CSF hosszú formája, és a V jelölés egy vagy több hiányzó aminosavat jelent az N-terminális végen, vagy azt mutatja, hogy a molekula C-terminálisánál egymást követő aminosavak kiiktatása következtében csonkolt -, mimellett a fenti muteinek dimeijei serkentik a primer makrofág telepek képződését az in vitro CSF-1 vizsgálatban, kódoló DNS-szekvenciát gazdasejtben ismert módon kifejezünk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. ábra szerinti 150-447. aminosavakat tartalmazó CSF-1 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SCSF, gln₅₂SCSF, pro₅₂SCSF, SCSF/CV158-pro, gln₅₂SCSF/CVl 58-pro, pro₅₂SCSF/CV158-pro, SCSF/CV158, pro₅₂SCSF/CV158, SCSF/CV150, LCSF/CV150, gln₅₂LCSF/CV15O, tyr₅₉LCSF/CV190, LCSF/CV191, LCSF/CV221, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV250és LCSF/CV411 polipeptidek bármelyikének NV3 műfemjét kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő CSF-1 polipeptidek:

   I. LCSF, SCSF, LCSF/CV 150, tyr₅₉LCSF/CV150, SCSF/CV150NV3 muteinjei és ezek gln₅₂ muteinjei;

   II. az LCSF/CV 149-től az LCSF/CV521-ig terjedő bármely lehetséges, C-terminálisán csonkolt polipeptid NV3 muteinje, és ezek tyr₅₉, gln₅₂ és tyr₅₉gln₅₂ muteinjei;

   III. LCSF/CV190, LCSF/CV191, LCSF/CV221,

   LCSF/CV223, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV258 és

   LCSF/CV411 NV3 muteinjei és ezek tyr₅₉, gln₅₂, tyr₅₉gln₅₂, ser_!57, ser₁₅₉ és ser₁₅₇ser_]59 muteinjei;

   IV. SCSF/CV158 NV3 muteinjei és ezek gln₅₂ muteinjei, valamelyikét kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy LCSF/NV3CV221 vagy

   LCSFser₁₅₇ser₁₅₉NV3CV221 vagy

   HU 215 241 Β

   SCSF/NV3CV158 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
6. 6. Eljárás expressziós kazetta előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban alkalmazott DNS-szekvenciát működésképesen megfelelő kontrollszekvenicákhoz kapcsolunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
7. 7. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 6. igénypont szerinti expressziós kazettát és egy egysejtű szervezetben működő replikont megfelelő hordozóba építünk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC 67 390 számon letétbe helyezett E. coli törzsből kinyerhető O/E pP_LLCSF/NV3CV221 vektort állítunk elő.

   5 (Elsőbbsége: 1987. 04. 16.)
9. 9. Eljárás rekombináns gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy kiindulási gazdasejteket egy 7. igénypont szerinti vektorral transzformálunk.

   (Elsőbbsége: 1986. 10. 24.)
10. 10 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformálást egy 8. igénypont szerinti vektorral végezzük.