KR100371264B1 - 무라인 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니 자극 인자를포함하는 재조합 벡터와 그것을 발현하는 재조합아스퍼질러스 나이거 - Google Patents

무라인 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니 자극 인자를포함하는 재조합 벡터와 그것을 발현하는 재조합아스퍼질러스 나이거 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 싸이토카인을 포함하는 벡터와 그것을 발현하는 재조합 세포에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 무라인 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니 자극 인자를 포함하는 재조합 벡터와 그것을 발현하는 형질 전환된 재조합 숙주인 아스퍼질러스 나이거에 대한 발명으로 본 발명에 의해 특이성이 높은 무라인 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니 자극 인자를 대량으로 얻어서 여러 임상에 적용할 수 있다.

Description

무라인 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니 자극 인자를 포함하는 재조합 벡터와 그것을 발현하는 재조합 아스퍼질러스 나이거{Recombinant vector harboring murine GM-CSF and recombinant Aspergilus niger expressing the vector}
본 발명은 재조합 사이토카인을 포함하는 벡터와 그것을 발현하는 재조합 세포에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 무라인(murine)그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니자극인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, 이하 GM-CSF라 함)를 포함하는 재조합 벡터와 그것을 발현하는 형질 전환된 재조합 세포인 아스퍼질러스(Aspergillus niger)에 대한 발명이다.
필라멘트형 곰팡이는 발효식품, 유기산이나 비타민과 같은 1차 대사산물 및 2차 대사산물을 포함하는 다양한 산업공정에 사용된다. 게다가 필라멘트형 곰팡이는 다양한 세포외 효소의 훌륭한 생산자이다. 필라멘트형 곰팡이인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)는 진핵단백질을 정확한 폴딩과 기능을 갖는 형태로 발현할 뿐 아니라 다량의 단백질을 만들고 배출하는 능력을 포함하여 많은 장점을 가진 발현 시스템이다. 이외에도 아스퍼질러스 나이거가 관여하는 생산과정은 안전하다는 것이 밝혀졌고, 따라서 조절된 균주 육종이 가능한 안정한 재조합체를 분리할 수 있다. 아주 최근에는 아스퍼질러스 나이거는 잡종단백질의 생산을 위한 숙주로 개발되어왔다.
사이토카인은 체내의 모든 유핵세포에 의해서 생산될 수 있는 조절펩티드이고, 조혈과 숙주 방어와 리페어 과정에 관여하는 많은 다른 세포에 대해 다면적 조절효과를 가진다. 그런 사이토카인 중 하나인 그래눌로싸이트 매크로파아지-콜로니 자극인자(GM-CSF)는 그래눌로싸이트와 매크로파지모두의 발생을 자극할 수 있는 능력이 있고, 처음 정제되고 클로닝된 많은 수의 사이토카인 중 하나이다. 마우스를 포함한 몇 생물체에서 온 GM-CSF의 구조는 클로닝된 핵산 서열로부터 아미노산서열을 유추하여 결정하였고, 완전한 mGM-CSF은 25개의 아미노산의 리더펩티드와 두 N-린크된 글리코실레이션 자리를 갖는 23kDa의 124개의 아미노산으로 포함한다. GM-CSF는 그래눌로싸이트와 매크로파지 군의 생존, 분화, 증식 및 기능의 활성을 조절하는 데 관여한다. 결론적으로 GM-CSF는 급성 및 만성 호중구감소증(neutropenia)의 치료, 넌뉴트로페닉(nonneutropenic)상태에서 항-미생물을 가지고 보조치료, 항-종양효과와 항-종양활성 증가나 화학치료의 효능을 증대하기 위해 루케미아 세포의 보충 등 적어도 세 가지 주요분야의 임상에 사용된다. 따라서 GM-CSF는 임상에 사용되는 첫 사이토카인 중 하나이다. 재조합 인간 GM-CSF는 악성림프종양을 갖는 환자에서 자기골수이식 접목을 촉진하는 방법으로서 1993년 초기 미국에서 사용되는 것을 승인받았다.
대장균, 효모, 곤충세포 및 심지어 식물세포와 같은 여러 숙주세포에서 재조합 GM-CSF를 생산하는 것이 가능하다는 것을 보여주는 여러 연구들이 진행되었다. 그러나A. niger에서 GM-CSF의 발현은 전에 보고된 바가 없었기 때문에 높은 특이성을 갖는 가치있는 면역단백질을 만들 필요성이 존재하였다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 재조합 무라인 GM-CSF를 생산하는 아스퍼질러스 나이거의 형질전환체를 만들었고, 무라인 GM-CSF의 양과 기능적 활성을 각각 엘라이자(ELISA)와 바이오어세이로 결정하였다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기한 필요성에 의해 안출된 것으로 본 발명의 목적은 특이성이 높은 무라인 GM-CSF를 대량생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 발현하는 재조합 세포를 제공하는 것이다.
도 1은 무라인GM-CSF를 발현하는 재조합벡터를 만들기 위한 클로닝 그림.
도 2는 재조합 mGM-CSF의 노던 블럿 사진.
도 3은 재조합 mGM-CSF의 시간별 발현 양상을 결정하기 위한 노던 블럿 사진.
도 4는 서던 블럿 사진.
도 5는 A. niger에서 온 배양여과액의 mGM-CSF를 측정한 그림.
도 6은A. niger에서 온 배양여과액의 시간에 따른 활성을 나타낸 그림.
도 7은 재조합 mGM-CSF의 특정 활성의 정량분석 그림.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리셀알데히드 3-인산 탈수소효소(GPD)의 프로모터와 터미네이터를 갖는 무라인 GM-CSF를 갖는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터는 도 1의 pANGM-CSF 프라즈미드가 적당하다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 제조한 재조합세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 사상성 진균이다.
본 발명의 사상성 진균은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 크리포넥트리아 파라시티카(Cryphonectrica parasitica), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 아이아모리(Aspergillus awamori) 등이 바람직하며, 본 발명에서는 아스퍼질러스 나이거가 바람직하다.본 발명의 재조합 세포는 아스퍼질러스 나이거 KCTC 0661BP가 더욱 바람직하다.
무라인 GM-CSF, GPD 프로모터와 터미네이터 서열은 첨부된 염기서열 목록에 기재되어 있다.
사상성 진균(Aspergillus niger)는 완전세대가 밝혀지지 않은 불완전균에 속하며, 따라서 무성포자만을 형성한다. GM-CSF를 생산하는 재조합 아스퍼질러스 나이거는 다양한 종류의 배지에서 생장이 가능하나, 균체 생장을 위하여서는 2% 말트 추출물(malt extract), 2% 글루코스, 0.1% 펩톤을 포함하는 CM 배지가 사용되었고, 재조합 단백질 GM-CSF의 생산을 위하여서는 아스퍼질러스 나이거 고유의 단백질 분해효소 생산능력을 억제시키기 위하여, 1% 효모 추출물(yeast extract), 2% 펩톤(peptone), 2% 글루코스(glucose), 100mM NH4Cl, 0.6% 유레아(urea)를 포함하는 배지가 사용되었다.
생육조건으로는 다양한 pH와 온도에서 생육이 가능하나 pH 5.0-6.0 와, 30℃-37℃에서 생장이 재조합 단백질 발현의 최적조건이었다.
본 발명에서 특별한 언급이 없으면, 본 발명에 사용된 모든 화학물질, 배지 및 효소는 각각 Sigma Chemical CO.(St. Louis, MO), Difco Laboratories(Detroit,MI) 또는 Boehringer Mannheim(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용한다.
이하 비한정적인 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1
균주 및 배양조건
아스퍼질러스 나이거 ATCC2119는 형질전환의 수용체로 사용하였다. 분생포자를 얻기 위해서, 아스퍼질러스 나이거를 15 nM D(+)바이오틴과 8 uM 판토텐산, 질소원으로 70 mM 염화암모늄을 갖는 아가 완전배지에서 키웠다. 표준A. niger완전, 최소 및 단백질분해효소 억제배지에 계속 적용하였다. 500 ml의 액체배지를 갖는 휀바흐(Fernbach)플라스크에 2 x 108포자/ml로 접종하여서, 30 ℃, 150 rpm에서 24 시간에서 96 시간 정도 배양하였다.
재조합 벡터 생산
무라인 GM-CSF를 발현하는 재조합벡터를 만들기 위한 클로닝 전략을 도 1에 도시하였다. 도 1에서, 유전자들은 mGM-CSF,A. niger의 글리셀알데히드 3-인산 탈수소효소의 프로모터인 pGPD, 크리포넥트리아 파라시티카(C. parasitica)의 글리셀알데히드 3-인산 탈수소효소의 터미네이터인 tGPD와 하이그로마이신 B 내성유전자인 HygR이다. 유전자 아래의 화살표들은 전사위치를 나타내고, 각 막대는 절단자리를 나타낸다. 클로닝 전략을 약술하면, 무라인 GM-CSF의 cDNA를 갖는 pUC19벡터인 pGM-CSF은 서울대 의대의 허대석 박사에서 공급받았다. 상기 GM-CSF 유전자는 PCR을 통하여 쉽게 클로닝할 수 있다. 크리포넥트리아 파라시티카에서 온 글리셀알데히드-3-인산 탈수소효소(gpd)의 전사 터미네이터를 포함하는 600 bp의 절편을 pGM/tGPD를 만들기 위해서 pGM-CSF의 KpnI 자리에 삽입하였다. mGM-CSF 유전자와 gpd 터미네이터를 갖는 pGM/tGPD의 SalI와 SacI 절편을 pGPD/hph의 SpeI 자리에 블런트 엔드 라이게이션하여서, mGM-CSF를 pANGM-CSF 발현벡터의 gpd 프로모터의 조절하에 두었다. 하이그로마이신 B 내성 유전자(hph)를 선택마커로 사용하였다.
프로토프라스트의 제조
아스퍼질러스 나이거 프로토프라스트를 처칠(Chruchill)등의 방법을 다음과 같이 변형하여 제조하였다. 완전배지 1리터를 갖는 휀바흐 플라스크에 109포자를 접종하였고, 30 ℃, 65 rpm에서 16 시간 배양하였다. 어린 균사를 모아서, 베타-글루쿠로니데이즈(0.2 ml/g 균사)와 노보자임(40 mg/g 균사)를 갖는 세포벽 라이시스 효소용액을 처리하였다. 프로토프라스트를 1M 소비톨, 100 mM 트리스-염산, 100 mM 염화칼슘을 갖는 STC 4부피, 50 % 폴리에틸렌 글리콜4000MW 1 부피 및 1% DMSO를 갖는 저장버퍼에 ml당 108프로토프라스트 농도로 -70℃에서 다음 실험을 하기 위해서 저장하였다.재조합 아스퍼질러스 나이거 제조
아스퍼질러스 나이거로의 형질전환은 처칠(Churchill) 등의 방법을 변형하여 행하였다. 각 형질전환에는 10 ug의 pANGM-CSF DNA가 사용되었고, 처리된 프로토프라스트는 삼투안정제로 0.5 M의 슈크로스(sucrose)를 갖는 포테이토 덱스트로스 아가(PDA)에서 재생하였다. 12-18시간 후에 800 ug/ml의 하이그로마이신 B를 갖는 최소 톱 아가를 깔아주고, 플레이트를 콜로니 성장이 보일 때까지 30 ℃에서 2-3일간 배양하였다. 이 콜로니들을 200 ug/ml의 하이그로마이신 B를 갖는 최소배지에 트랜스퍼하여, 단일-포자를 형성하였다.
서던(Southern) 과 노던(Northern) 블럿 분석
동결건조된 균사로부터 총 DNA와 RNA를 얻었다. 5 ug의 DNA와 30 ug의 RNA이 각각 서던과 노던 블럿에 사용하였다. Hybond-N 막(Amersham,UK)에 DNA와 RNA를 트랜스퍼하고, UV 크로스링크를 하였다. 블럿을 동위원소가 표지된 mGM-CSF cDNA로 하이브리드하였다.
엘라이자에 의한 정량분석과 재조합 mGM-CSF의 활성의 측정
아스퍼질러스 나이거의 배양 여과액을 모아서, 4 ℃에서 2시간동안 2회 PBS 에 대해 투석을 하였고, 0.2 um 주사기 필터로 멸균하였다. 여과-멸균된 배양여과액의 총 단백질을 바이오-래드 단백질 분석 키트를 사용하여 브래드포드방법에 의해 측정하였고, 더 분석을 위해서, 15.5 ug/ml로 하였다. 각 멸균배양여과액 100 ul를 분석에 사용하였다. 활성을 측정하기 위해서, GM-CSF 의존 세포주인 FDC-P1을 호주의 멜버른 대학의 D.Metcalf 박사로부터 공급받아서 사용하였고, 리퀴드 신틸레이션 카운터를 사용하여 처리된 FDC-P1의 삼중수소 흡수력를 측정하였다. 아스퍼질러스 나이거로부터 만들어진 재조합 무라인 GM-CSF의 농도는 엘라이자(ELISA)에 의해서 측정하였다. 본 발명에서 스탠다드로 재조합E.coli유도된 마우스 GM-CSF를 Endogene Inc.(Woburn,MA)에서 구입하여 사용하였다.
실시예 2
아스퍼질러스 나이거의 트랜스포메이션
아스퍼질러스 나이거의 글리셀알데히드-3-인산 탈수소효소(gpd)유전자 프로모터와 크리포넥트리아 파라시티카의 gpd유전자의 터미네이터를 갖는 pANGM-CSF발현 벡터를 도 1에서 보는 바와 같이 만들었다. 기능적인 GM-CSF가 부족한 것을 제외하곤 pANGM-CSF와 같은 재조합벡터를 가짜(mock) 형질전환으로 사용하였다. 형질전환 당 10-30개의 형질전환체를 얻었고, 더 분석하기 전의 각 형질전환체는 단일 포자였다. 각 형질전환체의 분열안정성은 선택배지와 비선택배지을 번갈아 연속적으로 트랜스퍼하여 확인하였다.
형질전환체의 RNA분석
전사 수준에서 mGM-CSF의 발현을 결정하기 위해서, 선택배지에서 잘 자라는 7개의 형질전환체를 선택하였다. 7개 형질전환체에서 온 총 RNA는 액체배지에서 3일 후에 모은 균사로부터 추출하여서 노던 블럿을 수행하였다. 도 2는 재조합 mGM-CSF의 노던 블럿을 나타낸다. 도 2 (A)의 레인 1은 양성 대조군으로 mGM-CSF의 0.5kb의 cDNA절편, 레인 2에서 10은 각각 야생균주, 가짜 형질전환체, G4-1, G6-1, G10-1, G7-1, G8-1, G9-1 및 G11-1에서 온 총 RNA를 갖는다. (B)는 에티디움 브로마이드로 젤을 염색한 것이다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 mGM-CSF 트랜스크립트는 pANGM-CSF형질전환체에서 발견되었지만, 야생균주나 가짜 형질전환체에서는 트랜스크립트가 없었다. mGM-CSF의 시간적 발현을 결정하기 위해서, 액체 배양을 시작한 후에 1, 3 및 5일 후에 G10-1의 균사를 모아서, 각 레인에 로딩한 RNA와 동량으로 노던 블럿을 수행하였다. 도 3은 재조합 mGM-CSF의 시간별 발현 양상을 결정하기 위한 노던 블럿을 나타낸다. (A)의 레인 1, 2 및 3은 각각 가짜 형질전환체의 1, 3 및 5일 배양으로부터 추출한 총 RNA이고, 레인 4, 5 및 6은 각각 형질전환체 G10-1의 각각 1, 3 및 5일 후에 추출한 총 RNA이다. (B)는 에티디움 브로마이드로 젤을 염색한 것이다. 도 3에서 보는 바와 같이, GM-CSF의 RNA축적이 1일 후 탐지되었고, 3일 후에 최대가 되었고, 그 후에 점차로 감소하였다. 그러나, 예상한 대로, 가짜 형질전환체에서는 트랜스크립트가 검출되지 않았다.
서던 블럿 분석
아스퍼질러스 나이거의 염색체로 트랜스포밍된 벡터의 통합과 그 카피 수를 탐지하기 위해서, 세 형질전환체(G4-1, G6-1 및 G10-1)의 서던 블럿을 수행하였고 노던 블럿에서 최고의 mGM-CSF 발현을 보였다. 도 4는 서던 블럿을 나타낸다. A, B, C 각각은 아스퍼질러스 나이거에서 분리한 XbaI과 BamHⅠ으로 처리하한 지노믹 DNA, HindⅢ로 처리한 지노믹 DNA 및 BamHⅠ으로 처리한 지노믹 DNA를 갖고, 레인 1과 2는 음성 대조군으로 각각 야생균주와 가짜 형질전환체를 나타낸다. 레인 3, 4 및 5는 각각 G4-1, G6-1 및 G10-1 형질전환체를 나타낸다. 각 패널의 오른편의 숫자는 밴드의 크기의 kb를 나타낸다. 세 형질전환체, 야생 균주 및 가짜 형질전환체의 지노믹 DNA를 XbaI과 BamHⅠ으로 처리하여 나일론 막에 트랜스퍼하였고, mGM-CSF의 동위원소가 표지된 cDNA프로브로 하이브리다이즈하였다. 야생균주와 가짜 형질전환체는 프로브와 하이브리다이즈하지 않았고, 세 형질전환체(G4-1, G6-1 및 G10-1)은 도 4A와 같은 450bp의 단일 밴드를 보였다. 도 4B나 C와 같이 HindⅢ나 BamHⅠ만으로 처리하여, 벡터 내에 단일 절단 자리를 갖는 각각은 각 형질전환체에서 단일 하이브리다이징 밴드를 보인다. 이것은 트랜스포밍 벡터가 여러 형질전환체 중에 유전자의 여러 자리에서 단일 카피로 들어갔다는 것을 보여주었다. 세 형질전환체 중에서, G10-1는 G4-1 및 G6-1에 비하여 독특한 하이브리다이징 밴드 패턴을 갖는다. 그러나 절편이 너무 커서 크기로 본 발명의 조건하에서 분리할 수 없기 때문에, G4-1과 G6-1이 유전적으로 다른지 여부를 구별할 만큼 G10-1이 확실하지 않다.
실험예
재조합 mGM-CSF의 활성의 결정
재조합 아스퍼질러스 나이거 배양여과액으로부터 재조합 mGM-CSF의 활성을 GM-CSF 의존 FDC-P1세포의 증식정도를 측정하여 평가하였다. 도 5는 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 온 배양여과액의 mGM-CSF를 측정한 것이다. G4-1, G6-1 및 G10-1은 24시간 성장한 형질전환체의 배양여과액으로부터 온 샘플을 나타낸다. 음성대조군으로 야생균주와 가짜 형질전환체의 24시간 배양액에서 온 샘플로 사용되었다. 양성 대조군으로 대장균에서 온 재조합 mGM-CSF를 사용하였다. ΔCPM값은 PBS처리와 비교한 샘플처리된 세포에 의한 [메틸-3H]타이미딘의 흡수의 차이를 나타낸다. 모든 균주들이 완전 또는 최소 배지에서 성장하였을 때, FDC-P1세포의 증식의 정도의 차이는 없었지만, 재조합균주가 단백질분해효소 억제배지에서 성장할 때만, 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 배양여과액을 첨가했을 때 FDC-P1세포의 증식이 크게 증대하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 야생균주와 가짜 형질전환체에서 온 배양여과액을 포함하는 양 음성 대조군은 FDC-P1세포의 증식을 일으키지 않았고, PBS도 세포증식에 영향이 없었다. 반면에, 양성 대조군인 재조합 아스퍼질러스 나이거의 배양여과액 뿐 아니라 구입한 재조합 mGM-CSF(Pharmingen)은 FDC-P1세포을 효과적으로 증식하였다. 재조합 아스퍼질러스 나이거의 세포내에서는 활성이 검출되지 않았다. 이 결과는 mGM-CSF가 발현되고 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 생물학적으로 활성을 가지고 분비된다는 것을 보여준다. 최대활성은 형질전환체 G10-1에서 관찰되었다. 그러나 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 온 mGM-CSF의 활성은 배양시간이 증가함에 따라 크게 감소하였다. 도 6은 아스퍼질러스 나이거에서 온 배양여과액의 시간에 따른 활성을 나타낸다. ΔCPM값은 PBS처리와 비교한 샘플처리된 세포에 의한 [메틸-3H]타이미딘의 흡수의 차이를 나타내고, A와 B는 각각 가짜 형질전환체와 mGM-CSF를 생산하는 G10-1 형질전환체에서 만들어진 샘플을 나타낸다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 3과 5일의 배양여과액의 활성은 가짜 형질전환체와 거의 같다. 흥미로운 것은 도 3에서 볼 수 있는 것처럼 mGM-CSF의 전사 수준이 그 시기에 여전히 높다는 것이다.
발현 숙주로 필라멘트 곰팡이를 사용하는 큰 문제 중 하나는 단백질 분해효소가 많다는 것으로 알려져 있기 때문에, 아스퍼질러스 나이거 배양여과액의 단백질 분해활성을 특정 아스퍼질로펩신(aspergillopepsin)의 저해제인 펩스타틴(pepstatin)을 사용하여 분석하였다. 0.7ug/ml의 펩스타틴과 10 ng/ml의 정제된 재조합 mGM-CSF를 아스퍼질러스 나이거 배양여과액에 첨가하고, 펩스타틴이 재조합 mGM-CSF가 분해되는 것을 저해하는 지 여부를 알기 위해서, 30 ℃에서 12시간 배양하였다. 펩스타틴 처리된 mGM-CSF는 FDC-P1세포의 증식을 크게 도왔지만, 펩스타틴없이 샘플에 의한 증식은 보이지 않았다. 이 결과는 성장배지 실험, 노던 블럿, 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 배양여과액의 시간적 활성과 종합하여 볼 때, 잡종적으로 발현된 GM-CSF는 단백질분해효소에 불안정하다는 것을 보여준다. 따라서 아스퍼질러스 나이거에 의해서 만들어진 단백질 분해효소에 의한 잡종단백질을 분해를 저해하는 방법들이 고안될 필요가 있다.
재조합 mGM-CSF의 정량 분석
재조합 아스퍼질러스 나이거에 의해 생산된 mGM-CSF의 양을 결정하기 위해서, 엘라이자를 수행하였다. 대조구로E.coli유도된 재조합 mGM-CSF를 사용하였다. 액체배양을 시작한 1일 후 형질전환체 G10-1은 640 ng/L의 활성을 가진 mGM-CSF를 생산하였다. 재조합 아스퍼질러스 나이거에서 mGM-CSF의 수율은 식물세포 배양을 제외하곤, 다른 발현 시스템에서보다 낮다. 그러나 도 3에서 보는 바와 같이 3일 배양 대 1일 배양의 재조합 mGM-CSF의 높은 전사 수준은 만약 재조합 단백질을 단백질 분해효소로부터 분해되는 것을 막을 수 있는 방법이 고안된다면, 필라멘트 곰팡이에서 사이토카인을 생산할 수 있는 큰 가능성을 가지게 된다. 도 7은 재조합 mGM-CSF의 특정 활성의 정량분석을 나타낸다. 아스퍼질러스 나이거 형질전환체에서 생성된 재조합 mGM-CSF를 ELISA로 측정하였다. G10-1에 의한 재조합 mGM-CSF의 수율은 약 640ng/L였다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 mGM-CSF의 ng 당 [메틸-3H]타이미딘 흡수의 정도에 의해 평가된 재조합 아스퍼질러스 나이거 균주의 특정 활성은 시판되는 GM-CSF의 활성보다 2.5배 높다.
상기한 구성의 본 발명에 따르면, 특이성이 큰 재조합 mGM-CSF를 대량으로 생산이 가능하여, GM-CSF 다량 투여시의 부작용을 극복하고 임상에 적용할 수 있는 효과가 있다.

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  4. 그래뉼로사이트-매크로파지 콜로니자극인자(Granulocute-macrophage colony stimulating factor)를 생산하는 재조합 아스퍼질러스 나이거(KCTC0661BP).
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