NO302899B1 - Rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form. Det er følgelig beskrevet nye DNA-molekyler omfattende DNA-sekvenser kodende for flere pektinlyaser av Aspergillus niger og/eller promotoren, signal og terminatorsekvensene derav. De nye DNA-molekylene er nyttige for overproduksjon av pektinlyasene i Aspergillus og/eller konstruksjonen av hybride vektorer som uttrykker fremmende gener i filamentøse og andre sopp. Det er nå mulig å produsere en enkelt pektinlyase som ikke er forurenset av andre pektinlyaser.

Til tross for at det innenfor teknikken for genetisk om-konstruering eksisterer flerfoldige polypeptidekspresjons-systemer for prokaryote og eukaryote verter er det fortsatt nødvendig med nye systemer som kan omfatte fordeler i forhold til kjente systemene.

Det prokaryote Escherichia coli-verten og den eukaryote gjaerverten, f.eks. Saccharomyces cerevisiae. er meget anvendt og for disse er det blitt utviklet et stort antall forskjellige ekspresjonshybridvektorer, for det meste plasmider. Ulempene med E. coli-verter er at de ikke kan glykosylere det dannede polypeptidet og pga. mangel på utskilling kan det fremmende peptidet akkumulere innenfor vertcellen og forhindre ytterligere vekst. Gjærvertene glykosylerer, men som E. coli utskiller de ikke polypeptidene, med unntakelse av de som er veldig små, inn i naeringsmediet. Gjær utskiller bare inn i periplasmaområdet. Høyere eukaryote verter omfatter pattedyrcanserceller som kan glykosylere og utskille inn i naeringsmediet, men virkningen derav er derimot veldig sakte og den er dyr og en fare eksisterer ved at de onkogene nukleinsyrene blir isolert sammen med det ønskede peptidet og dette kan føre til at peptidet ikke blir frigjort fra dette.

I mangel på andre verter har filamentære sopp, så som Neurospora crassa. Aspergillus nidulans og Aspergillus niger, blitt undersøkt. Slike sopp er allerede velkjent industrielt, men anvendelsen derav i teknikker for genetisk omkonstruer-ing, har vært liten hovedsakelig pga. mangel på et hensiktsmessig transformasjonssystem. I kontrast til Saccharomyces cerevisiae. inneholder filamentære sopp ikke plasmider som kunne ha blitt anvendt for innføring av fremmende gener og fenotypeseleksjon. Det er derimot mulig å transformere filamentære sopp med fremmende plasmider inneholdende en selekterbar markørgen. Alle til nå beskrevne vektorer for filamentære sopp replikerer ikke autonomt som de for gjær, men blir integrert inn i kromosomet til soppen. Dette skjer bare i veldig lav frekvens. Det er derimot fordelaktig at integrerende transformasjon gjør transformantene mitotisk veldig stabile, selv under ikke-selektive betingelser. Stabil integrasjon av mere enn ett hundre kopier er blitt rapportert .

Den første vektoren for filamentær sopp beskrevet inneholder qu-2-genen Neurospora crassa som selekterbar markør. Dette genet koder for enzymet katabol dehydrokinase og kan bli anvendt for funksjonell komplementasjon av aromutantene til N. crassa [Case, M.E., Schweizer, M. Kushner, S.R. og Giles, NH. (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263]. Aromutantene kan ikke vokse på minimalmedium uten et supple-ment av aromatiske aminosyrer. Transformasjon av N. crassa ved qa-2-vektoren oppstår ved integrasjon av en enkelt kopi av plasmidet inn i kromosomet. 30 % stabile Aro<+->integranter opprettholdt ved integrerte qa-2-genet knyttet til de bakterielle plasmidsekvensene [Case, M.E. (1982) i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander, A., DeMoss, D., Kaplan, S. , Konisky, J., Savage, D. og Wolfe, R.S. , eds), pp. 87-100, Plenum]. Denne observasjonen gjorde kotransformasjon av ikke-selektive DNA-sekvenser sammen med selektive mulig.

I Aspergillus nidulans. som har en seksuelle syklus og som dermed er mottakelig for klassiske genetiske manipulasjoner, er både negative og positive seleksjonssystemer blitt identifisert. Begge anvender heterologt DNA fra N. crassa, eller homologt DNA ble tilveiebrakt ved funksjonell kom-plementas jon av A. nidulans pyrG-mutanter ved transformasjon med plasmider inneholdende pyrG-genet (Ballance et al. BBRC 112. 284 1983; Tilburn et al. Gene 26, 205, 1983). I andre systemer ble mutasjoner ved trpC eller argB-locuset funk-sjonelt komplementert ved transformasjon med hensiktsmessige plasmider [Yelton et al. PNAS 81, 1470, 1984; Yelton et Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4, 1307, 1983].

Et dominant positivt seleksjonssystem som anvender amdS-genet isolert fra A. nidulans er blitt utviklet og dette muliggjør at A. niger transformert dermed blir dyrket på acetamid som eneste nitrogenkilde (Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983; Wernars et al., Curr.Genet. 9, 361, 1985; Kelly, J.M. et al., EMBO J. 4, 475, 1985).

Sammenlignet med N. crassa eller A. nidulans. er A. niger den mest viktige organismen. Den blir mye anvendt innenfor industriell produksjon av enzymer, f.eks. for anvendelse innen matvareindustrien. A. niger er forskjellig fra A. nidulans når det gjelder utskillingskapasiteten, den utskiller forskjellige hydrolytiske enzymer, f.eks. glukoamylase, a-amylase, pektinase, cullulase, e-glukanase, P-galaktosidase, naringinase, pentosanase, sur protease og lignase, glukoamylase og pektinasekomplekset er de viktigste.

A. niger har ingen kjent seksuell syklus. Mutasjoner kan derfor ikke bli innført ved meiotiske rekombinasjoner. Ved klassiske mutasjons- og seleksjonsprosedyrer er derimot omfattende forbedringer av stammer, når det gjelder utskilling av hydrolytiske enzymer, blitt oppnådd.

Når det gjelder genene til A. niger-enzvmene er bare de til glykoamylase (Boel et al. EMBO J. 3, 1581, 1984) og alkohol og aldehyd-dehydrogenase (WO 86/06097) sammen med deres promotorer og signalsekvenser, blittkarakterisertog anvendt i transformasjonseksperimenter med A. nidulans og A. niger, respektivt.

Som seleksjonsmarkører for A. niger er det heterologe amds-genet (Kelly and Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985 ) og argB-genet (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097), som begge ble tilveiebrakt fra A. nidulans. blitt anvendt.

A. niger er den viktigste organismen for industriell produksjon av pektinnedbrytende enzymer. Pektiner er poly-galakturonider med høy molekylvekt (20 000 - 40 000 D) bestående av a-1,4-glykosidbundne D-galakturonsyrepolymerer og oppstår i naturen som bestanddeler i høyere planteceller, hvor de er knyttet til cellulosemolekylene og hvor de hovedsakelig finnes i den primære celleveggen og midtre lamella. De rikeste pektinkildene er sitron og appelsinskall som inneholder omtrent 30 % av dette polysakkaridet. Pektin-enzymer nedbryter karbohydratpolymersubstratet enten ved hydrolyse av a-1,4-glykosidbindingen (polygalakturonase) eller ved transeliminasjon av a-4,5 umettet galakturon-residuet fra pektinmolekylet (forskjellig pektinlyase). Det systematiske navnet til pektinlyase er pektintranseliminase (EC 4.2.2.10).

I A. niger blir proteinene til det pektiske komplekset ikke uttrykt konstitutivt. Under induserende betingelser ved anvendelse av pektin eller nedbrytningsprodukter derav, uttrykker A. niger de ovenfornevnte enzymene, omfattende PLI, når andre karbonkilder, så som glykose eller sakkarose, er begrensende. I overflatekulturer forblir de pektiske enzymene assosiert med den ytre celleveggen. Økende pektin og Ca<2+->konsentrasjon i mediet fører til fullstendig utskilling. Pektinaser, så som PLI, blir anvendt i matvareindustrien hovedsakelig for klaring av fruktjuice.

Fra A. niger er to forskjellige pektinlyaser, PLI og PLII, blitt renset og delviskarakterisertav F.E.A. Van Houdenhoven (22). PLI inneholder fire residuer av mannose, mens PLII inneholder to residuer av mannose og glykose hver. Enzymene har forskjellige molekylvekter (PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). Aminosyresekvensen til PLI er blitt bestemt og beskrevet i EP 88 101 397.3. Denne oppfinnelsen var basert på en delvis strukturbestemming av pektinlyase I (PLI) som tillot syntese av DNA-prober kodende for relevante deler av proteinet. Ved hjelp av DNA-probene var det mulig å screene for og isolere DNA kodende for PLI, til slutt sammen med pre- og post-sekvenser derav, fra et A. niger-<g>enbibliotek.

Ved hybridisasjon av deler av PLI-genet til et genomisk bibliotek av A. niger ble ytterligere PL-gener påvist og disse er ifølge oppfinnelsen. Det strukturelle PLI-genet med den N-terminale endeflankerende regionen tilveiebrakt fra A. niger N756 er ved dets N-terminale ende identisk til PLD-genet tilveiebrakt fra A. niger N400. sistnevnte er derimot ikke del av foreliggende oppfinnelse. PLA ser ut til å være del av den tidligere rensede PL-blandingen betegnet PLII.

Nedenfor blir PLI også betegnet PLD og det PLI-strukturelle genet blir betegnet pelD.

De nye pektinlyaseekspresjonssystemene omfatter DNA-sekvenser kodende for promotorer, signalsekvenser, strukturelle gener og terminatorene til de nevnte nye pektinlyasegenene. De nye pektinlyasene er betegnet PLA, PLB, PLC, PLE og PLF.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig rekombinant DNA molekyl kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens kodende for pektinlyasene pelA (fig. 10; DSM4388); pektinlyase pelB (fig. 11; DSM4389); pektinlyase pelC (fig. 12; DSM4390); pelE oppnåelig ved ekspresjon av pelE innbefattet i pGW880 (fig. 5; DSM 4392) eller pelF oppnåelig ved ekspresjon av pelF innbefattet i pGW860 (fig. 6; DSM 4391) eller funksjonelle deler derav eller DNA sekvenser som er degenererte i henhold til den genetiske koden, eventuelt omfattende promotoren, signalsekvensen, det strukturelle genet eller terminatoren til et hvilke som helst av pektinlyase genene eller en hvilken som helst kombinasjon av disse fragmentene eller er en rekombinant hybridvektor omfattende et strukturelt gen heterologt med Aspergillus niger.

Det er videre beskrevet transformert vertcelle, kjennetegnet ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl som angitt ovenfor og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

Det er videre beskrevet anvendelse av en rekombinant DNA molekyl som angitt ovenfor for overproduksjonen av pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i Aspergillus-arter, kjennetegnet ved å dyrke en Aspergillusvert transformert med en ekspresjonshybridvektor for ekspresjon av nevnte pektinlyase .

Foreliggende oppfinnelse vedrører også pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF, i ren form ifølge fig.10, fig. 11, fig. 12, fig. 5 og fig. 6, kjennetegnet ved at de oppnås ved transformering av en vert som ikke har evne for å uttrykke noe pektinlyase med et rekombinant DNA molekyl ifølge krav 1 og isolering av nevnte pektinlyaser.

Hybride vektorer omfattende DNA-sekvenser kodende for promotorene PLA, PLB, PLC, PLE og PLF, eventuelt for signalsekvensen til disse proteinene, og eventuelt for terminatorene derav er følgelig beskrevet. Disse hybride vektorene blir anvendt for inkorporering av gener kodende for bestemte proteiner og for transformasjon av filamentære sopp, så som Aspergillus. Penicillium og Cephalosporium. Kotransformasjon av A. niger med 2 forskjellige plasmider kan utføres, hvorved en av plasmidene blir valgt fra gruppen av nye hybridvektorer ifølge oppfinnelsen, og den andre er et spesielt konstruert seleksjonsplasmid som virker sammen med en mutert stamme av en filamentær sopp.

De forskjellige hensiktene med oppfinnelsen vil fremgå av følgende detaljerte beskriving av oppfinnelsen.

Rekombinante DNA- molekyler

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt et rekombinant DNA-molekyl omfattende en DNA-sekvens kodende for ekspre-sjonssystemene til pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF, eller et derivat derav.

Betegnelsen "ekspresjonssystem" betyr en DNA-sekvens som kan uttrykke et polypeptid og omfatter promotoren, signalsekvensen, det strukturelle genet og terminatoren.

Betegnelsen "derivat" når det blir anvendt i sammenheng med nye DNA-sekvenser omfatter store derivater med flankerende sekvenser, fragmenter av nevnte DNA-sekvens, mutanter, spesielt naturlig forekommende mutanter, og DNA-sekvenser som er degenererte i henhold til den genetiske koden.

Store derivater av de nye rekombinante DNA-molekylene omfatter de som kan bli spaltet ut av A. niger-genomet og omfatter DNA-sekvensene tilveiebrakt i fig. 1 til 3, 5 og 6, slike som finnes i et genomisk bibliotek til A. niger N400 tilveiebrakt ved fragmentering av nukleinsyrene, behandling av fragmentene med et egnet restriksjonsenzym, f.eks. EcoRI, BamHI eller Hindlll, ligering inn i en egnet vektor, f.eks. lambdafag og plasmid pBR322, kloning f.eks. i E. coli. og deretter på ny spalting med samme restriksjonsenzym. Slike derivater er f.eks. innskuddene til plasmidene pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 og pGW880 vist i fig. 1, 2, 3, 4, 5 og 6.

Fragmentene til DNA-sekvensen med formel I (fig. 9) er de som rekker mellom to restriksjonsseter av disse plasmidene og har opprettholdt promotor-, signalfunksjonene og de strukturelle- eller terminatorfunksjonene.

Foretrukne fragmenter omfatter de som omfatter promotorsekvensen, signalsekvensen, det strukturelle genet til et nytt PL, eller terminatorsekvensen eller en hvilke som helst kombinasjon derav.

Fragmentene til DNA-sekvensen kan inneholde linkere som muliggjør vellykket binding til andre DNA-molekyler.

PL-promotorsekvensen er innbefattet i DNA-regionen før det strukturelle genet og omfatter opp til omtrent 2 000, fortrinnsvis opp til omtrent 1 000 til 1 400 nukleotider. I pGW820 er promotoren beliggende i sekvensen mellom Sali

(1240) og Pstl (2420) -restriksjonssete. For promotorsekvensen er TATAA-boksene viktige som RNA-polymerase-gjenkjenningsseter. På<p>elA er TATAA-boksen beliggende i posisjon 1221 (fig. 10), på<p>elB i posisjon 951 (fig. 11) og på pelC i posisjon 1261 (fig. 12). De korte promotorene fra rundt TATAA-boksene opp til starten av signalsekvensene er av spesiell interesse for ikke-indusert ekspresjon av polypeptider. Hvis pektinindusert ekspresjon er nødvendig er sekvensene oppstrøms for TATAA-boksene nødvendige for regulering av styrken til promotoren. Egnede linkere kan være knyttet til disse fragmentene.

Promotoren til PLI til A. niger er induserbar, dvs. ekspresjonen av det strukturelle genet knyttet dertil, f.eks. det strukturelle genet kodende for PL eller et hvilket som helst fremmed gen, blir indusert ved tilsetning av pektin eller pektin-degraderingsprodukter til mediet. I fravær av pektin og tilstedeværelse av tilstrekkelig glykose virker promotoren ikke. Hvis de regulatoriske sekvensene oppstrøms er fraværende blir promotoren konstitutiv.

DNA kodende for signalsekvensen rekker mellom enden av promotoren og begynnelsen av sekvensen kodende for det modne proteinet. I PLA og PLB inneholder signalsekvensen omtrent 20 aminosyrer, i pelC omtrent 18 aminosyrer. Den korresponderende kodende regionen rekker i pelA fra ATG-kodonet i posisjon 1361 ned til Pstl-spaltningssetet i posisjon 1420, i pelB fra posisjon 1134 til minst posisjon 1191, og i<p>elC fra posisjon 1368 til posisjon 1422.

Som det fremgår fra formlene I, II og III inneholder de strukturelle genene til PLA, PLB og PLC flere introner. Også de strukturelle genene kan inneholde egnede linkere.

Terminatorene begynner med stoppkodoner, f.eks. TAA, og kan rekke opp til en av restriksjonssetene innenfor nevnte sekvenser. Terminatorfragmentet inneholder minst 300 bp og kan inneholde egnede linkere.

Egnede linkere til fragmentene ovenfor har en DNA-sekvens som passer inn i restriksjonssetet til DNA'et som fragmentet skal forbli bundet til. De kan inneholde et forutbestemt restriksjonssete.

Fragmentene til DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen er også slike som er sammensatt av mindre fragmenter, f.eks. som inneholder promotoren, promotoren og signalet eller struktu-rell sekvens, signalet og den strukturelle sekvens, eller strukturelt gen uten introner og lignende.

Mutanter av DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. naturlig forekommende mutanter. Oppfinnelsen omfatter også naturlige eller syntetiske mutanter av signalsekvensen med en lignende eller identisk hydrofobisitetsprofil, f.eks. hvori kodonene for de polare aminosyrene lysin (K^<+>), tyrosin (Y^~) og arginin (R^<+>) blir byttet ut med kodoner for andre aminosyrer som har lignende ladninger, og de hydrofobe aminosyrene alanin (A), leucin (L) og treonin (T), blir erstattet med kodoner for andre hydrofobe aminosyrer. F.eks. kan kodonet for positivt ladet lysin bli erstattet med et kodon for arginin og vise versa, kodonet for negativt ladet tyrosin med et kodon for glutamat eller aspartat, og/eller kodonet for ikke-polar, hydrofob alanin med en hvilken som helst av kodonene for treonin, prolin, valin, isoleucin, leucin, metionin eller fenylalanin, og lignende. Andre mutanter er "stille mutasjoner" hvori en eller noen få andre nukleotider, f.eks. opp til omtrent 30, blir erstattet med en eller flere andre nukleotider, hvorved de nye kodonene koder for den samme aminosyren(e).

DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen som er degenererte er, så som stille mutasjoner, slike som blir degenererte innenfor betydningen av den genetiske koden idet et ubegrenset antall nukleotider blir erstattet med andre nukleotider uten forandring av aminosyresekvensen som de koder for. Slike degenererte DNA-sekvenser kan være nyttige pga. deres forskjellige restriksjonsseter.

Rekombinante DNA-molekyler som omfatter en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen eller et derivat derav omfatter spesielt rekombinante vektorer, alternativt kalt hybride vektorer, inneholdende slike DNA-sekvenser som innskudd. De kan anvendes for kloning i verter, så som bakterier, sopp eller dyreceller. Slike hybride vektorer er avledet fra en hvilken som helst vektor nyttig innenfor området genetisk omkon-struering, så som fra fag, kosmider, plasmider eller kromosomalt DNA, så som derivater av fag X, f.eks. NM 989, eller fag M13, f.eks. M13mp8 fag DNA (ref. 15) linjearisert ved spaltning med BamHI, bakterielle plasmider, f.eks. pBR 322, pUN121, pUC18, eller gjærplasmider, f.eks. gjær 2jj-plasmid, eller også kromosomalt DNA, avledet f.eks. fra Aspergillus. f.eks. A. niger, f.eks. de som blir tilveiebrakt av EP 184 438, eller defekte fag eller defekte plasmider i nærvær av en hjelperfag eller et hjelpeplasmid som muliggjør replikasjon av nevnte defekte fag eller plasmider, f.eks. M13(+)KS-vektor i nærvær av f.eks. M13K07-hjelperfag.

En hybridvektor ifølge oppfinnelsen kan inneholde i tillegg til DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen eller et derivat derav, et replikasjonssete og eventuelt, avhengig av typen av DNA-derivat, en ekspresjonskontrollsekvens så som en enhancer-sekvens, oppstrøms aktiveringssete, en promotor og signalsekvens, og/eller et strukturelt gen forskjellig fra de korresponderende A. niger-avledede sekvenser. Slike enhancer-sekvenser kan være avledet fra ekstrakromosomalt ribosomalt DNA fra Phvsarum polvcephalum (PCT/EP 8500278), eller det kan være aktiveringssetet oppstrøms fra sur fosfatase PH05-genet (EP søkn. nr. 86 111 820.6), eller PH05, trp, PH05-GAPDH-hybridet (EP Søkn. nr. 86 111 820.6), eller lignende promotor .

Strukturelle gener ligert til foreliggende promotor, signal og/eller terminatorsekvenser omfatter, bortsett fra de som koder for pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE og PLF med eller uten introner, også homologe andre pektinlyasegener, f.eks. PLD (eller PLI) -genet, eller andre Aspergillus-gener og heterologe strukturelle gener med opprinnelse fra viruser, prokaryote celler eller eukaryote celler og som kan være avledet fra genomisk DNA eller fra cDNA preparert via mRNA-veien eller som kan bli syntetisert kjemisk, kodende for forskjellige nyttige polypeptider, omfattende glykosylerte polypeptider, spesielt fra høyere eukaryot, spesielt patte-dyr, så som dyr eller spesielt human opprinnelse, så som enzymer som f.eks. kan bli anvendt for produksjon av nærings-stoffer og for utføring av enzymatiske reaksjoner i kjemi, eller polypeptider som er nyttige og verdifulle for behandling av sykdommer i mennesker og dyr eller for for-hindring derav, f.eks. hormoner, polypeptider med immunolog-isk modulerende, anti-virale og anti-tumoregenskaper, antistoffer, virale antigener, vaksiner, koagulasjonsfaktor-er, matvarer og lignende.

Eksempler på slike heterologe strukturelle gener er f.eks. de som koder for hormoner så som sekretin, tymosin, relaksin, kalsitonin, lutelniserende hormon, paratyroidhormon, adreno-kortisotropin, melanocytt-stlmulerende hormon, p-lipotropin, urogastron eller Insulin, vekstfaktorer, så som epidermal vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor (IGF), f.eks. IGF-I og IGF-II, mast cellevekstfaktor, nervevekstfaktor, gli-avledet nervecellevekstfaktor, eller transformerende vekstfaktor (TGF), så som TGFe, veksthormoner, så som humane eller bovine veksthormoner, interleukin så som interleukin-1 eller -2, human makrofagmigrerende hemmende faktor (MIF), interferoner så som human a-interferoner, f.eks. interferon-aA, ocB, cxD eller aF, p-interferon, X-interferon eller et hybridinterferon, f.eks. et aA-aD- eller et aB-aD-hybridinterferon, spesielt hybridinterferonet BDBB, proteinasehemmere så som a^-antitrypsin, SLPI og lignende, hepatittvirusantigener, så som hepatitt B-virusoverflate eller kjerneantigen eller hepatitt A-virusantigen, eller hepatitt ikkeA-ikkeB-antigen; plasminogenaktivatorer, så som vevsplasminogenaktivator eller urokinase, tumornekrosefaktor, somatostatin, renin, e-endorfin; immunoglobuliner, så som lett og/eller tunge kjeder av immunoglobulin D, E eller G, eller humane-musehybrid-immunoglobuliner; immunoglobulinbindende faktorer, så som immunoglobulin E bindende faktor, kalsitonin, human kalsitonin-relatert peptid; blodkoagulerende faktorer, så som faktor IX eller VIIIc, erytropoietin, eglin, så som eglin C, hirudin, desulfathirudin, så som desulfathirudinvariant HVI, HV2 eller PA, human superoksyd-dismutase, viral tymidin-kinase, P-laktamase, glukose isomerase. Foretrukne gener omfatter de som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, human vevsplasminogenaktivator (t-PA), hepatitt B-virusoverflateantigen (HBVsAg), insulinlignende vekstfaktor I og II, eglin C og desulfathirudin, f.eks. variant HVI. I de hybride vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er foreliggende promotor og/eller signalsekvens operabelt bundet til den polypeptidkodende regionen for å forsikre effektivt ekspresjon av polypeptidet. DNA-molekylene Ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde selektive markører avhengig av verten som blir transformert, selektert og klonet. Et hvilket som helst markørgen som letter seleksjonen av transformanter forårsaket av fenotypisk ekspresjon av markøren kan bli anvendt. Egnede markører omfatter spesielt de som uttrykker antibiotikaresistens, f.eks. ovenfor tetracyklin eller ampicillin, eller når det gjelder auksotrofe gjærmutanter, gener som komplementerer vertslesjoner. Korresponderende gener tilveiebringer f.eks. resistens ovenfor antibiotika cykloheksimid, eller tilveiebringer prototrofi i en auksotrof gjærmutant, f.eks. ura3. Ieu2. his3 eller trpl-genet. Det er også mulig å anvende strukturelle gener som er knyttet til et autonomt replikerende segment som markører, forutsatt at verten som blir transformert er auksotrof for produktet uttrykt ved markøren.

Av spesiell viktighet er markørgener som komplementerer A. niger-vertslesjoner, så som argB-genet kodende for ornitin-karbamoyltransferase, f.eks. avledet fra A. niger eller A. nidulans (EP 184 438), eller A. nidulans DNA-fragmenter homologe med N. crassa pyr4-genet (26).

I hybride vektorer kan det strukturelle genet, spesielt det heterologe strukturelle genet være operabelt bundet til promotoren og signalsekvensene. Slike hybride vektorer omfatter f.eks. pUC19/pelA-IFN AM119. Andre hybridvektorer omfatter f.eks. M13(+)KS/pelA-IFN AM119.

I en annen foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er det strukturelle genet, spesielt det heterologe strukturelle genet operabelt bundet direkte til pro-motorsekvensene ifølge oppfinnelsen. En slik foretrukket hybridvektor er f.eks. M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen og derivatene derav omfatter fragmenter som kan bli anvendt for screening av DNA- genbanker eller mRNA for ytterligere lignende DNA'er eller mRNA'er.

Fremgangsmåte for preparering av rekombinante DNA- molekyler Et rekombinant DNA-molekyl kodende for pektinlyase PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF uttrykkende system eller et derivat derav, kan fremstilles. Dette omfatter dyrking av en vert transformert med et DNA-molekyl inneholdende en DNA-sekvens kodende for pektinlyaseekspresjonssystemet eller et derivat derav og isolering av det ønskede rekombinante DNA-molekylet eller derivatet derav, eller preparering av dette ved en in vitro syntese.

Dyrking av verten utføres i et konvensjonelt næringsmedium som kan bli supplementert med eller utelatt kjemiske forbindelser som tillater negativ eller positiv seleksjon av transformantene, dvs. slike verter inneholdende det ønskede DNA-molekylet sammen med en seleksjonsmarkør fra ikke-transformantene, dvs. slike verter som mangler det ønskede DNA-molekylet.

Hvilke som helst transformerbare verter nyttige innenfor området kan bli anvendt, f.eks. bakterier, så som E. coli; sopp, så som Saccharom<y>ces cerevisiae. eller spesielt filamentære sopp, så som Aspergillus. f.eks. A. nidulans. A. oryzae. A. carbonarius. A. awamori og spesielt A. niger. En foretrukket vert er A. niger An8. en ny mutant manglende pyrA-genet, som beskrevet ytterligere nedenfor. Transformasjon av vertene blir utført ved bruk av konvensjonelle metoder.

DNA-sekvensen kodende for PL-ekspresjonssystemet blir tilveiebrakt fra en filamentær sopp inneholdende slikt system, spesielt fra et genomisk bibliotek derav eller også via mRNA.

Nedenfor blir preparering av foreliggende PL-ekspresjonssystemer beskrevet i mere detalj.

Et genomisk bibliotek kan bli preparert f.eks. ved delvis spaltning av genomisk DNA til A. niger-stammen. f.eks. N756 eller N400, med f.eks. Sau3AI eller Mbol, og kloning av de høymolekylvekt-DNA-fragmentene i en egnet vertsvektor, f.eks. E. coli-plasmid pUN121 eller en lambdavektor, f.eks. EMBL4.

En hvilken som helst annen A. niger-stamme som produserer de ønskede PL'ene kan virke som kilde for genombiblioteket og på lignende måte kan andre egnede vektorer anvendes som mottaker for fragmentene.

For å screene det genome biblioteket for DNA-sekvenser kodende for PL'er på en vellykket måte er en hybridiserende DNA-probe nødvendig. Den kan utgjøre den syntetisk DNA-probe hvis sekvensen til ønsket PL er kjent eller den kan utgjøre et kjent PL-gen eller en del derav. Den første metoden ble anvendt for å finne PLI-genet som beskrevet i EP 88 101 397.3. Den andre metoden ble anvendt i foreliggende oppfinnelse. Pga. at den totale DNA-sekvensen til PLI-genet ble tilgjengelig kan hvilke som helst av DNA-probene inneholdende hele genet eller hvilke som helst del derav som har minst omtrent 14 bp nå bli anvendt for screening, og dette omfatter også screening for mRNA kodende for PL-systemet.

For screeningen blir DNA-probene 5' radioaktivt merket ved hjelp av kjente metoder innenfor området ved anvendelse avX<32>P-ATP og T4-kinase. Vertsmikro-organismer inneholdende nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse som et innskudd, blir identifisert ved hybridisasjon med den merkede DNA-proben på filter-replikaer av genbiblioteket.

Kloner som utviser en hybridisasjonsrespons til en eller flere DNA-prober blir isolerte og amplifiserte.

De anvendte hybridisasjonsbetingelsene kan være mer eller mindre stringente, f.eks. ved bare å velge forskjellige temperaturer, og i kombinasjon med anvendelse av forskjellige DNA-prober avledet fra PLI (eller PLD)-genet, f.eks. ved måling av de forskjellige hybridisasjonsresponsene til hele 1,6 kbp BamHI/PstI-fragmentet, 649 bp BamHI/XhoI-fragmentet (det N-terminale fragmentet) og 244 bp XhoI/Pstl-fragmentet (det C-terminale fragmentet) fra pCG3Bll eller pGW840 (fig. 4), klonene kan bli delt inn i forskjellige klasser basert på grad av homologi (tabell II eller IV). Fem X-vektorer (X-PL113, X-PL122, X-PL109, X-PL102 og X-PL116) ble til slutt identifisert, spaltet og subklonene av deres pel-gener preparert i pBR322 som førte til plasmidene pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 og pGW880, (fig. 1 til 3, 5 og 6). De fem genene til disse klonene blir betegnet pelA, pelB. pelC. pelE og<p>elF respektivt.

Genene kan bli sekvensert. Hele sekvensene til pelA. pelB og pelC er representert i formlene I, II og III (fig. 10, 11 og 12).

En databasert søking for consensus-sekvenser av ekson/intron-spleisegrenser samt for indre intronsekv.enser (Boel E. et el. (24) og Mount S.M. (25)) fører til postulater, så som i pelD. tilstedeværelse av fire introner i pelA og pelB (fig. 10 og

11), og til tre introner i pelC (fig. 12).

Plasmidene pGW820, pGW830, pGW850, pGW860, og pGW880 blir anvendt for å preparere andre rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Slike andre DNA-molekyler blir preparert på konvensjonell måte ved å anvende konvensjonelle re-striksjonsenzymer, linkere, ligeringsprosesser, amplifika-sjonsprosesser og isolasjonsprosesser.

F.eks. blir plasmid pGW820 spaltet med Hindlll. 3,9 kbp HindiII-fragmentet blir subklonet inn i Hindlll-setet til pBR322. 3,3 kbp BamHI-HindiII-fragmentet til tilveiebrakt plasmid pGW822 inneholdende pelA-genet blir subklonet inn i BamHI og Hindlll-setet til vektoren pUC19 for å tilveiebringe en vektor betegnet pUC19/pelA. Det strukturelle genet til pelA blir tatt ut ved spaltning med Sali og Pstl. Inn i det gjenværende fragmentet inneholdende pelA-promotoren. blir signal- og terminatorsekvenser ligert inn i et gen kodende for interferonhybrid BDBB ved hjelp av en egnet linker. Det tilveiebrakte plasmidet blir betegnet pUC/19pelA-IFN AM119 (fig. 11) og inneholder promotor og signalsekvensen til pelA. IFN BDBB-genet og pelA-terminatoren knyttet til Hindlll-BamHI-fragmentet til pUC19. Dette plasmidet blir kotransformert med pCG59D7 inn i den uridinauksotrofe A. niger-mutanten An8 (DSM 3917). Transformanter blir selektert i minimalmediet inneholdende arginin og Bacto-Agar og analysert for interferonekspresjon.

I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan signalsekvensen til pelA bli deletert. Det tilveiebrakte plasmidet blir betegnet M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 og inneholder promotorsekvensen til pelA. IFN BDBB-genet og pelA-terminator bundet til HindiII-BamHI-fragmentet til Bluescript M13(+)KS-vektoren. Dette plasmidet blir kotransformert med pCG59D7 inn i den uridinauksotrofe A. niger-mutanten An8 (DSM 3917). Transformanter blir selektert i minimalmedium inneholdende arginin og Bacto-Agar og analysert for interferonekspresjon.

Mutanter inneholdende nye restriksjonsseter kan f.eks. bli preparert in vitro ved sete-rettet mutagenese ifølge konvensjonelle metoder [se oversiktsartikkelen til M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D.Shortle, Science 229, 1193 (1985) eller K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11, 5103 (1983)].

For høyere ekspresjonshastighet kan en hvilke som helst eukaryot terminatorsekvens bli ligert til enden av det strukturelle genet.

Bakterie blir transformert ved en konvensjonell metode og transformantene identifisert ved deres resistens overfor f.eks. tetracyklin.

De beskrevne ekspresjonsvektorene blir spesielt amplifisert i egnede E. coli-vertsstammer. så som HB101, transformert og selektert ved kjente metoder. Amplifisert plasmid-DNA blir isolert fra bakteriene ved kjente metoder, spesielt som beskrevet av Birnboim & Doly (23).

På lignende måte kan andre plasmider med andre homologe eller heterologe gener bli konstruert.

DNA-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli preparert ved in vitro syntese ifølge konvensjonelle metoder. In vitro syntese kan spesielt anvendes for preparering av mindre fragmenter av Pl-ekspresjonssystemet, f.eks. av DNA-sekvensene kodende for promotoren og signalsekvensen til PL'er, eller mutanter derav.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen omfatter en PL-promotor og eventuelt en PL-signalsekvens, et PL strukturelt gen, et hvilket som helst annet heterologt strukturelt gen og/eller en PL-terminator kan også bli anvendt for å transformere filamentære sopp, så som Aspergillus. Penicillium eller Cephalosporium. f.eks. A. nidulans. A. orvzae. A. carbonarius, A. awamori og spesielt A. niger.

For å muliggjøre seleksjon av transformert fra ikke-transformert sopp, inneholder DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen en seleksjonsmarkør, eller alternativt blir sopp kotransformert med en annen vektor inneholdende en slik markør. Som i andre systemer er slike seleksjonsmarkører et uttrykkbart, strukturelt gen, idet det uttrykte polypeptidet derav (et enzym) tilveiebringer resistens ovenfor forbindelser toksiske for transformanten eller som fullfører enzymsystemet til en mutant som mangler et slikt essensielt polypeptid. Slike markørgener er f.eks. de kjente ga- 2. pyrG. pyr4. trpC. amdS eller ar<g>B-<g>enene.

Som beskrevet i EP 88 101 397.3 ble et nytt markørgen, betegnet pyrA. isolert fra det genome biblioteket til A. niger. som er relatert til og som har lignende funksjon som pyrG til A. nidulans og pyr4 til N. crassa. dvs. produsering av enzymet ornitin 5'-fosfatdekarboksylase. Dette enzymet katalyserer dekarboksylering av ornitin 5'-fosfat til uridylsyre (uridin 5'-fosfat) og også av fluor-orotinsyre til toksisk fluor-uridin. En E. coli-klon inneholdende p yrA-genet ble identifisert ved hybridisasjon med 1,1 kb Hind III-fragmentet til pDJB2 (24) inneholdende del av pyr4-genet, derimot kan DNA'et til et hvilket som helst annet pyr-gen kodende for orotidin-5'-fosfatdekarboksylase bli anvendt. Fra en positiv klon betegnet E. coli B75183/pCG59D7, ble plasmidet pCG59D7, omfattende pyrA-genet. isolert og anvendt for kotransformasjon av en A. niger pyrA~-mutant. En slik pyrA-mutant er defekt i ornitin 5'-fosfatdekarboksylasegenet og kan derfor ikke produsere det korresponderende enzym. En slik mutant ble preparert ved behandling av konidiosporer av A. niger N756 under muterende UV-bestråling og kolonier som overlevde i nærvær av fluor-orotinsyre og uridin ble selektert. Kolonier som overlevde i nærvær av fluororotinsyre og fravær av uridin ble eliminert. De gjenværende uridin-krevende mutantene hører, i henhold til deres evne til å være transformerbare, til de to komplementeringsgruppene pyrA og pyrB, representert ved mutantene An8 og AnlO, respektivt. De blir behandlet i form av protoplaster derav under transformerende betingelser med pyrA inneholdende plasmid pCG59D7. Bare An8-koloniene ble funnet å være transformert og å inneholde pyrA-genet. og dette fremkom av den hybridiserende evnen til spaltet DNA derav med DNA av pUN 121.

Oppfinnelsen vedrører videre verter transformert med hybrid-vektorene. Slike transformanter utgjør f.eks. bakterier, så som E. coli. eller filamentære sopp, så som Aspergillus. Penicillium eller Cephalosporium. og spesielt A. nidulans. A. orvzae. A. carbonarius. A. awamorl eller fortrinnsvis A. niger, f.eks. A. niger An8. Slike transformanter kan fremstilles ved omfattende behandling av en vert under transformerende betingelser med et rekombinant DNA-molekyl, spesielt en hybridvektor, eventuelt sammen med et selek-sjonsmarkøren og selektering av transformantene.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av de rekombinante DNA'ene eller et derivat derav for preparering av hybride vektorer som uttrykker nyttige homologe eller heterologe polypeptider. Eksempler på gener som koder for slike nyttige polypeptider er angitt ovenfor.

Det er videre mulig å fremstille polypeptidene ved at man uttrykker en hybrid vektor i en egnet vert. Hvis det er nødvendig blir polypeptid isolert på konvensjonell måte. Avhengig av konstruksjonen av vektoren blir produktene enten uttrykt eller, hvis en signalsekvens er tilstede, uttrykt og utskilt.

Denne fremgangsmåten omfatter produksjon av nyttige homologe eller heterologe proteiner i en egnet vert, f.eks. Aspergillus-arter, ved dyrking av en vert transformert med en ekspresjonshybridvektor. Eksempler på gener kodende for slike proteiner er angitt ovenfor.

Det er nå også mulig å produsere de enkelte polypeptidene PLA, PLB, PLC, PLD, PLE eller PLF, det betyr i ren form og ikke forurenset av et hvilket som helst annet PL, og til dette kan forskjellige metoder bli anvendt. En metode omfatter f.eks. produksjon av et enkelt polypeptid valgt fra gruppen bestående av PLA, PLB, PLC, PLD, PLE og PLF og er kjennetegnet ved at man transformerer en vert som ikke kan uttrykke pektinlyase PL med en DNA-ekspresjonsvektor som uttrykker produktet av PLA, PLB, PLC, PLD, PLE eller PLF.

En vert som ikke kan uttrykke pektinlyase PL er enten en mikroorganisme uten et korresponderende gen, f.eks. en PL~ Aspergillus-stamme. en annen ikke-Aspergillussopp eller en hvilken som helst annen eukaryot eller prokaryot mikroorganisme, eller en Aspergillus-stamme hvor produksjonen av PL er hemmet i et uriktig kondisjonert vekstmedium. F.eks. kan et enkelt PL-gen bli uttrykt under kontroll av gluko-amylasepromotoren i A. niger eller A. awamori. under kontroll av PH05-promotoren i S. cerevisiae eller under kontroll av en PL-promotor i en PL" A. niger-stamme. Fig. 1 viser restriksjonskartet til pGW820 inneholdende<p>elA-genet. Fig. 2 viser restriksjonskartet til pGW830 inneholdende pelB-genet. Fig. 3 viser restriksjonskartet til pGW850 inneholdende pelC-genet. Fig. 4 viser restriksjonskartet til pGW840 inneholdende pelD-genet. Fig. 5 viser restriksjonskartet til pGW880 inneholdende pelE-genet. Fig. 6 viser restriksjonskartet til pGW860 inneholdende pelF-genet. Fig. 7 viser strategien for sekvenseringen av pelA-genet. Fig. 8 viser strategien for sekvenseringen av pelB-genet. Fig. 9 viser strategien for sekvenseringen av pelC-genet. Fig. 10 viser sekvensen til DNA-molekylet pelA. med formel I, inneholdende genet kodende for PLA. Fig. 11 viser sekvensen av DNA-molekylet<p>elB. med formel II, inneholdende genet kodende for PLB. Fig. 12 viser sekvensen til DNA-molekylet<p>elC. med formel III, inneholdende genet kodende for PLC. Fig. 13 viser homologien ved aminosyresekvensnivået mellom PLD, PLA og PLC. Fig. 14 viser konstruksjonen av vektoren pUC19/pelA-IFN AM119, inneholdende genet kodende for hybridinterferon BDBB. Fig. 15 viser den ikke-kodende tråden til del av pelA-IFN-fusjonen på plasmid<p>elA-IFN AM119 med "looped out" signalsekvens stilt opp sammen med oligonukleotid-primeren anvendt for delesjonsmutagenese av pelA-signalsekvensen.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Forkortelsene har følgende betydninger:

Amp ampicillin

ATP adenosintrifosfat

BSA bovinserumalbumin

CIP kalvetarm alkalisk fosfatase

DNA deoksyribonukleinsyre

DTT 1,4-ditiotreitol

EDTA etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt EGTA bis-(aminoetyl)-glykoleter)N,N,N',N'-tetraeddiksyre kbp kilobasepar

LMP lavt smeltepunkt

mOsm milliosmol

PEG polyetylenglykol

RNA ribonukleinsyre

rpm rotasjoner pr. minutt

SDS natriumdodesylsulfat

Tc tetracyklin

Tris tris(hydroksymetyl)-aminometan U enheter

V volt

Buffere, media, reagenser:

For plater ble alle media stivnet ved tilsetting av 1,5 % agar (BBL), for topagar(ose) 0,7 5é agar (BBL) eller agarose (Seakem) anvendt.

Følgende stammer blir anvendt:

Følgende vektorer blir anvendt:

EMBL4

EMBL4 er en lambda erstatningsvektor med en kloningskapasitet på 9-23 kbp (Frischauf et al.. ref. 2). Det inneholder en multippel kloningsregion mellom lambdaarmene og den ikke-essensielle fyllregionen. Dette gjør at multiple restrik-sjonsenzymspaltinger kan bli utført på en slik måte at religering av fyllet til vektorarmene blir redusert når fremmed DNA av interesse blir skutt inn. Vektoren anvender også Spi-fenotypen for å tilveiebringe direkte seleksjon for rekombinanter (Zissler et al.. ref. 20).

PCG3B11

Dette plasmidet er blitt beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 88 101 397.3, det inneholder p_el_D(PLI)-genet til A. niger N756 klonet i pBR322.

PPL29- 5

Dette plasmidet er blitt beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 88 101 397.3, det inneholder det N-terminale EcoRI-fragmentet til<p>elDfPLI)-<g>enet.

PPL35- 5

Dette plasmidet er blitt beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 88 101 397.3, det inneholder det C-terminale EcoRI-fragmentet til<p>elD(PLI)-<g>enet.

PBR322

Plasmid pBR322 inneholder gener for resistens overfor antibiotikaene ampicillin (amp<R>) og tetracyklin (tet<R>). Plasmidet inneholder flere unike kloningsseter, og flere av disse er beliggende i enten amp- eller tet-genet slik at innskudd av klonet DNA fører til antibiotika-følsomme bakterier.

DEMBL18 ogPEMBL19

Disse plasmidene er blitt beskrevet av Dente et al. (refs. 7,8).

PGW613

Dette plasmidet er blitt beskrevet av Goosen et al. (ref. 12).

M13mp- fag

M13mpl8 og M13mpl9-vektorene (Norrander et al.. ref. 21) er derivater av enkelt-tråders DNA bakteriofag M13 og er konstruert for å lette sekvensering av DNA ved å muliggjøre kloning av DNA-fragmenter ved et allsidig polylinkersete og kloning av det samme restriksjonsfragmentet i begge mulige orienteringer. Sekvenser klonet inn i disse vektorene kan lett anvendes som templater for sekvenseringsreaksjoner eller produksjon av enkelt-trådede prober ved anvendelse av standard oligodeoksyribonukleotid-primer og Klenow-fragmentet til E. coli DNA-polymerase I. Vektoren DNA inneholder E. coli lac-operon-promotoren og den genetiske informasjonen til de første 145 aminosyrene til p<->galaktosidase. Polylinker-sekvensene inneholdende multiple restriksjonsseter blir satt inn i lacZ-sekvensen. Polylinkeren opprettholder lacZ-leserammen og vektoren tilveiebringer allelisk komplementasjon av en lac-Za-vertsstamme, som tilveiebringer blå plakk på plater inneholdende IPTG og X-gal. Rekombinante fag inneholdende innskudd som ødelegger leserammen eller på annen måte virker inn på ekspresjonen av lacZa-peptidet observeres som fargeløse plakk.

<p>CG 59D7

Dette plasmidet er beskrevet i EP 88 101 397.3 og kan bli tilveiebrakt fra Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968). Plasmidet omfatter pyrA-genet og ble anvendt for kotransformasjon av A. niger pyrA"-mutanter.

M13,( + ) KS ( Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA) dsDNA-vektor omfattende replikasjonsorigo til fag M13. I nærvær av en hjelperfag, f.eks. M13K07 (ref. 29) eller R408 (ref. 9), blir (+)-tråden til vektoren replikert, pakket og frigjort inn i mediet.

M13 K07

Hjelper M13-fag for M13(+)KS. Beskrevet i Mead et al. (ref. 29).

R408

Hjelper M13-fag for M13(+)KS. Beskrevet i Russell et al.

(ref. 9).

Eksempel 1.: Konstruksjon av et genomisk bibliotek for

Aspergillus niger

Eksempel 1. 1.: Isolasjon av høymolekylvekt DNA fra

A. niger

Konidiosporer fra Aspergillus niger-stamme N400 blir inokulert i 200 ml minimalmedium ved en finalsporetetthet på IO<6>sporer/ml og ristet ill Erlenmeyer-kolber i 24 t ved 28°C ved 300 rpm ved anvendelse av et New Brunswick roterende risteapparat. Myceliet blir høstet ved filtrering ved anvendelse av en Biichner-trakt med myraklede, vasket med kaldt sterilt saltvann, frosset i flytende nitrogen og enten lagret ved -60"C eller anvendt direkte. Metoden anvendt for isolasjon av DNA for å preparere det genomiske biblioteket er baser på fremgangsmåten beskrevet av Yelton et al. (ref. 1). DNA-utbyttet er omtrent 50-100 pg/g mycelium ved bruk av denne metoden.

For bibliotekkonstruksjon blir 10 g mycelium malt i flytende nitrogen i 1 g porsjoner i en Braun mikro-dismembrator. Det malte myceliet blir overført til en 1 1 steril erlenmeyer-kolbe inneholdende 200 ml ekstraksjonsbuf f er (50 mM EDTA pH 8,5, 0,2 1o SDS) og 200 pl dietylpyrokarbonat. Blandingen ble sakte oppvarmet ved romtemperatur og deretter oppvarmet i 20 min til 68" C med leilighetsvis risting. Suspensjonen blir avkjølt ved romtemperatur og sentrifugert i 15 min. ved 12 000 x g 1/16 volum av en 8 M kaliumacetatoppløsning pH 4,2 blir satt til supernatanten og blandingen blir latt stå på is ilt. Bunnfallet blir fjernet ved sentrifugering (20 min.; 16 000 x g; 4°C). Nukleinsyrene blir utfelt fra supernatanten ved inkubasjon med 0,6 volum isopropanol på is i 15 min. Pelleten blir samlet ved sentrifugering (10 min.; 6 000 x g; 4°C), vasket med 70 % etanol og tørket. Pelleten blir suspendert i 10 ml TE inneholdende 20 jjg/ml RNase A (Boehringer, Mannheim) og inkubert i 15 min ved 37°C. DNA'et blir behandlet med nukleasefri pronase (1 mg/ml finalkonsentrasjon) (Kochlight, Coinbrook) ilt ved 37"C. Pronasestokk-oppløsningen i TE-buffer inneholder 20 mg/ml enzym som blir inkubert ilt ved 37<*>C for å spalte nukleasene. 8,5 g CsCl blir løst opp i 9 ml DNA-oppløsning, 0,2 ml 10 mg/ml etidiumbromid blir tilsatt og denne oppløsningen blir enten sentrifugert i en Beckman SW41-rotor i 60 t ved 33 000 rpm, eller i en Beckman 50Ti-rotor med hurtigfor-seglede rør i 40 t ved 45 000 rpm. DNA-båndet blir samlet ved side-punktering av røret. Etidiumbromid blir fjernet ved flere ekstraksjoner med vann- og NaCl mettet isopropanol. 5 volumer TE blir tilsatt, og DNA'et ekstrahert med TE mettet fenol, f enol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1 og kloroform/isoamylalkohol 24:1. DNA'et blir utfelt ved tilsetting av 0,1 volum 3 M natriumacetat oE 5,2, 2,5 volum etanol og inkubasjon over natten ved -20°C. Bunnfallet blir samlet ved sentrifugering (1 t; 30 000 x g; 4<,C), vasket med 70 % etanol, tørket og løst opp i 400 pl lav TE.

Eksempel 1. 2.: Delvis spalting av A. niger DNA med Mbol og

isolasjon av fragmentene.

For å undersøke hvilken Mbol-konsentrasjon som tilveiebringer det største antall fragmenter mellom 13,6 og 23 kbp, blir ljjg porsjoner av A. niger N400 DNA spaltet i hensiktsmessig buffer med reduserende mengder Mbol (0,5-0,001 U) i 1 t ved 37° C i et volum på 10 pl. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av 1 pl 0,25 M EDTA, og prøvene applisert på en 0,6 % agarosegel i TBE, inneholdende 1 pg/ml etidiumbromid. Hensiktsmessige markører er en blanding av lambda DNA og lambda DNA spaltet med Bglll, som tilveiebringer bånd ved 49, 22,8, 13,6, 9,8, 2,3 kbp og et ikke-visuelt fragment på 0,45 kbp. Mbo I konsentrasjonen som er nødvendig for å tilveiebringe et høyt utbytte av de ønskede 13,6-23 kbp-fragmentene er 0,02 TJ/pg DNA. Dermed blir 200 pg DNA i et totalt volum på 2 ml spaltet og oppdelt i 20 porsjoner med lik størrelse rett etter tilsetting av enzymet. Etter 1 t ved 37° C blir det spaltede materialet plassert på is, og en 1 pg prøve blir kjørt på en gel for å undersøke om spaltingen ble utført riktig. Idet resultatet var positivt ble EDTA satt til i en finalkonsentrasjon på 25 mM for å stoppe reaksjonen, enzymet ble varme-inaktivert ved 65°C i 10 min., prøvene ble slått sammen og DNA'et utfelt, vasket, tørket og løst opp i 400 pl

TE.

Fragmentert DNA blir separert over natt på en 0,4 % preparativ agarosegel (midtre brønn 120 x 1,5 mm). Lambda DNA spaltet med Bgl II blir anvendt som markør for å bestemme størrelsen på de delvis spaltede DNA-fragmentene ved elektro-forese ved 4°C og 40 V (3 V/cm). Gelregionen inneholdende fragmenter med riktig størrelse blir kuttet ut av gelen og DNA'et blir elektroeluert fra gelen i en steril dialysepose i 2 ml TBE i løpet av 2-3 t ved 100 V. Strømmen blir reversert i 30 s, og bufferen inneholdende DNA'et blir oppsamlet. Fragmentene blir deretter konsentrert ved etanolutfelling og løst opp i 10 pl lav TE.

Eksempel 1. 3.: Preparering av vektor- DNA og kloning av DNA- fragmenter med høv molekvlvekt til A. niger inn i EMBL 4.

Genomisk bibliotek til Å. niger-stamme N400 blir konstruert inn i lambdavektor EMBL4. Vektoren som har en kloningskapasitet på 9-23 kbp, er beskrevet av Frischauf et al. (ref. 2) og Karn et al. (ref. 3) og er blitt forhandlet fra Promega Biotech. Inc. For å unngå doble innskudd med opprinnelse fra forskjellige deler av genomet, ble en minimal fragmentlengde på 13,6 kbp anvendt for kloning. 10 pg lambda EMBL4 DNA ble spaltet fullstendig med 50 enheter BamHI i hensiktsmessig buffer i et volum på 100 pl i 2 t ved 37°C. Enzymet blir inaktivert i 10 min. ved 65°C. NaCl-konsentrasjonen blir øket til 150 mM og 50 enheter Sali blir tilsatt og inkubasjon ved 37°C fortsetter i ytterligere 2 t. Etter tilsetting av EDTA til 25 mM og inaktivering av enzymet (10 min. 65°C) blir oppløsningen ekstrahert med like volumer fenol (TE-mettet), fenol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1, kloroform/isoamylalkohol. For å eliminere de små BamHI/Sall-polylinkerfragmentene blir DNA'et utfelt med 0,6 volum isopropanol etter tilsetting av 0,1 vol. 3M natriumacetat pH 5,2. Etter 15 min. på is og 15 min. sentrifugering ved 12 000 x g og 4°C, blir utfellingen grundig vasket med 70 # etanol, tørket og løst opp i 40 pl lav TE.

Eksempel 1. 4.: Ligering og in vitro pakking av genom

A. niger DNA- fragmenter

Det er viktig at cos-setene til vektoren preparert ifølge eksempel 1,3 blir sammensmeltet før ligeringsreaksjonen. Vektoren i 100 mM Tris-HCl pH 7,5 og 10 mM MgCl2blir oppvarmet i 10 min. ved 65°C og deretter sammensmeltet ilt ved 42°C. Fra testligeringer ble et forhold mellom vektor og fragmenter på omtrent 1:1 (i vekt) funnet å tilveiebringe maksimale rekombinanter. Ligering foregår i 50 mM Tris HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP ved anvendelse av 9,5 pg vektor og 10 pg DNA-f ragmenter i et totalt volum på 100 pl. Deretter blir DNA-ligase (BRL) tilsatt i en konsentrasjon på 0,5 U/pg DNA og ligeringsblandingen blir inkubert over natt ved 14°C. For å undersøke ligeringen blir en prøve av ligert DNA kjørt på en agarosegel. En mengden på 0,5<p>g vektor blir også ligert uten tilsetning av fragmenter i et 5 pl volum.

Ligeringsblandingen i stort volum blir konsentrert ved etanolutf elling og løst opp i 20 pl lav TE før in vitro pakking. In vitro pakkingen blir utført med promega pakka-gene-ekstrakter ifølge instruksjonene til forhandlerne ved anvendelse av 10 pl porsjoner for å pakke 1 pg DNA. Av høymolekylvekt-lambda cI857 Sam 7, tilført med ekstraktene, blir 1 pg pakket separat for å tilveiebringe en kontroll. Etter pakking blir 500 pl fagoppløsningsbuffer (PSB) tilsatt og 5 pl kloroform. De rekombinante fagstokkene kan bli lagret ved 4°C. Det tilveiebrakte biblioteket er blitt konstruert fra to separate ligeringseksperimenter.

Eksempel 1. 5.: Titrering og amplif ikas. ion av det genome

biblioteket til A. niger- stammen N400.

E. coli NM539-celler blir dyrket på LC medium inneholdende 0,2 % maltose, 10 mM MgS04 og 1 mM CaCl2til en optisk tetthet (600 nm) på 1,0. Deretter blir aliquoter av 0,2 ml av denne kulturen satt til 0,1 ml av en fagfortynningsserie i PSB. Etter adsorpsjon av fagene i 20 min ved 37°C, blir 3 ml 0,6 # LC topp-agar ved 45 °C tilsatt, og blandingen blir sådd ut på LC agar-skåler og disse blir inkubert over natt ved 37° C. Titrering av resultatene uttrykt som antall plakk-dannende enheter (pfu) pr. ml fagsuspensjon er 12xl0<5>og4,2xl0<5>pfu/ml for de to fagstokkene preparert ifølge eksempel 1.4. Etter subtrahering av bakgrunnen som blir beregnet fra kontroll-1 igeringene uten fragmentene (17 5é og 40 % respektivt) er det absolutte antallet rekombinanter 6x10^ som er over 200 ganger genomlengden.

For å amplifisere biblioteket blir porsjoner på 80 pl av begge fagstokkene anvendt for å infisere E. coli NM539-celler som er sådd ut i LC topp-agar på LC agar-skåler og deretter inkubert over natt ved 37°C. Fagene blir eluert fra agarosen ved forsiktig risting av skålene med 5 ml PSB pr. skål ilt ved romtemperatur. PSB blir oppsamlet, sentrifugert (10 min ved 6 000 xg) for å fjerne bakteriene, og kloroform blir tilsatt (0,5 # finalkonsentrasjon). Begge fagstokkene, som omtrent er amplifisert i samme grad, blir deretter blandet (40 ml stokk), titrert (8xl0<9>pfu/ml) og lagret ved 4°C.

Eksempel 2.: Screening av det genome biblioteket til A. niger N400 for pektinlyase D- genet ( pelD) og isolasjon av genen.

Eksempel 2. 1.: Screenin<g>av biblioteket

For isolasjon av pelD-genet fra det genome lambda-biblioteket tilveiebrakt som beskrevet i eksempel 1, blir 2,5 x 10^ fag blandet med flytende LC topp-agar og sådd ut på 5 LC agar-skåler. Skålene blir inkubert over natt ved 37°C og avkjølt i 2 t ved 4°C. Fra hver plate blir 2 replikaer fremstilt ifølge plakk-hybridisasjonsmetoden til Benton og Davis (ref. 4). Det første filteret (Schleicher og Schull BA85 eller Millipore HATF 085) blir plassert på toppen av skålen i 1 min, den andre replika i 2 min og posisjonen til replikaene blir markert ved anvendelse av Indiablekk.

Etter fjerning av filtrene blir de plassert i en skål inneholdende 100 ml av en denaturert oppløsning (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) i 1 min, og i 1 min i 100 ml renaturerings-oppløsning (0,5 M Tris/HCL pH 7,5, 1,5 M NaCl). Filtrene blir deretter overført til en skål inneholdende 3 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat pH 7,0). Filtrene blir deretter forsiktig skrubbet med en behansket hånd for å fjerne bakterielt debris, og overført til en frisk skål inneholdende 3 x SSC og forsiktig ristet i 20 min ved romtemperatur. Filtrene er blottet på Whatman 3 MM papir og tørket i 10 min ved romtemperatur. Filtrene blir bakt på 3 Whatman MM papir i en ovn ved 80° C i 2 t. Deretter blir de vasket i 0,5 t i 6 x SSC ved romtemperatur og deretter overført til 50 ml av den forvarmede (56°C) prehybridisa-sjonsblandingen som inneholder 50 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS, 0 ,1 % natr iumpyrof osf at, 10 % Denhardfs (50 x Denhardfs = 1 i BSA, Boehringer-fraksjon V;

1 % polyvinylpyrrolidon -40; 1 % Ficoll 400). Til pre-hybridisasjonsblandingen tilsetter man nylaget: 0,1 mg/ml denaturert laksesperm DNA (Maniatis, et al. s. 327; ref. 5) og 0,01 mg/ml poly rA. Prehybridisasjonen blir utført i 4 t ved 56°C med forsiktig risting. Proben anvendt for hybridisasjon er nikk-translatert 3,5 kbp Eco RI-fragmentet til pPL35-5, som inneholder den C-terminale regionen av pelD-genet til A. niger N756-stammen (tilgjengelig fra E. coli BJ5183/pCG3Bll, DSM 3916, EP 88 101 397.3). Fragmentet er tidligere isolert fra en lavtsmeltende agarosegel og 0,3 pg av fragmentet er nikk-translatert (Maniatis, et al. s. 109-112; ref. 5). Det nikk-translaterte DNA'et blir denaturert i 10 min i et kokende vannbad, avkjølt på is og satt til 50 ml forvarmet prehybridisasjonsblanding. De prehybridiserte filtrene blir en for en overført til hybridisasjonsblanding-en. Hybridisasjonen utføres ved 56°C over natt med forsiktig risting. Filtrene ble vasket ved 56°C: 2 x 30 min med 0,5 1 4 c SSC, 0,1 % SDS, og 2 x 30 min med 2 x SSC, 0,1 4 SDS. Filtrene blir blottet på 3 MM papir og tørket i luft ilt. Etter festing av disse til 3 MM papir og skikkelig merking med radioaktivt merket blekk, blir filtrene dekket med Saran-belegg og autoradiografert over natt ved -70°C ved anvendelse av Konica røntgenfilmer og Kodak X-Omatic kassetter med regulær intensiverende skjermer. På denne måten ble 44 positive signaler tilveiebrakt fra de 5 screenede skålene. Positive plakk blir plukket med en steril Pasteur-pipette ved forsiktig plassering av skålene på autoradiogrammet på riktig måte ved anvendelse av blekkmarkører. Agardelene inneholdende de positive plakkene blir dispergert i 1 ml PSB. Fagene blir dif fundert fra agaren i løpet av 1 t ved romtemperatur med leilighetsvis risting. Agaren og det bakterielle celledebris blir fjernet ved sentrifugering i 5 min, 10 pl kloroform blir tilsatt og fagstokken blir lagret ved 4°C. De positive klonene blir betegnet X-PLI til X-PL44. Pga. at fagene blir sådd ut i høy tetthet, må de positive plakkene bli renset to ganger ved utsåing av disse ved lav tetthet (±100 fag/plater;0,1 ml 10<3->fortynning av fagstokken) og ved gjentakelse av hele prosedyren for replikaplating, hybridisasjon og plukking av positive plakk.

Eksempel 2. 2.: Isolas. ion av lambda DNA

For å isolere DNA fra rekombinante kloner, blir fagene først amplifisert ved infisering av E. coli NM539 med 0,1 ml fagstokk fra rensede kloner som beskrevet i eksempel 1.5., og utsåing av cellene i LC topp-agarose på LC agarskåler. Dette tilveiebringer skåler med konfluent lyses av indikator-bakteriene. 5 ml PSB blir spredt over skålene og fagene blir eluert i løpet av 2 t med forsiktig risting. De eluerte fagene blir høstet og de cellulære debris blir fjernet ved sentrifugering og kloroform blir tilsatt til 1 ia. Det resulterende skållysatet blir lagret ved 4°C. Det er vanlig-vis en titer på omtrent IO<**>pfu/ml.

Pga. at isoleringsprosedyrer i liten skala fra platelysat-forråder og fra flytende kulturer i liten skala (Maniatis et al., s. 65-68; ref. 5) ikke alltid resulterer i spaltbart DNA, blir fagene isolert fra 250 ml lysater. Disse blir preparert ved dyrking av verten, E. coli NM539, til en 0.<D.>600 på 0,3 i LC + 0,2 % maltose 10 mM MgS04, 1 mM CaCl2og deretter tilsetning av omtrent 10<10>pfu av platelysatet. En ytterligere vekst lyserer bakteriene i løpet av 4 timer. RNase og DNase blir satt til lysatene til en finalkonsentrasjon av 2 pg/ml, og lysatet blir latt stå ved romtemperatur ilt. Cellulært debris blir fjernet ved sentrifugering (20 min, romtemperatur 10 000 x g). 14,8 g NaCl og 25 g PEG6000 blir løst opp i supernatanten for å tilveiebringe de finale konsentrasjonene på 1 M NaCl og 25 % (w/v) PEG. Fagene blir utfelt i 1 t på is eller over natt ved 4°C, og harvestert ved sentrifugering (20 min; 10 000 x g; 4°C). Pelletene blir suspendert i 3 ml lambda fortynningsbuffer (LDB; = 10 mM Tris/ECl pH 7,5, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl). 2,5 g CsCl blir løst opp i 4 ml fagsuspensjon og blandingen blir pipettert i 5 ml Beckman hurtigforseglende rør som deretter blir fylt opp med den sammen konsentrasjon CsCl i LDB. Rørene blir forseglet og sentrifugert over natt i en Beckman VTi 65,2-rotor ved 50 000 rpm og 4°C. Det turbide fagbåndet som er synlig under en normal lampe, bli punktert fra siden av røret. CsCl blir fjernet ved dialyse i steril pose mot 2 1 10 mM tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl ved 4°C i 4 t. Bufferen blir skiftet en gang. Fagene blir samlet i sterile Greiner-rør, og volumet blir justert til 1 ml med dialyse-buffer, 50 pl 10 % SDS, 50 pl 0,5 M EDTA pH 8,0 og 25 pl 20 mg/ml nukleasefri pronase blir tilsatt, og rørene blir inkubert ilt ved 37°C. Volumet blir øket til 3 ml med TE, og denne oppløsningen blir ekstrahert med like volumer TE-mettet fenol, fenol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1 og kloroform-/isoamylalkohol 24:1. Etter tilsetning av 0,1 volum 3 M natriumacetat pH 5,2 og 2,5 volumer etanol, blir DNA'et felt ut over natt ved -20°C og samlet ved sentrifugering (1 t 20 000 x g ved 4°C). Pelleten blir vasket med 70 # etanol, tørket og løst opp i 200 pl lav TE. Utbyttet av fag-DNA er omtrent 200 pgs/250 ml lysat.

Eksempel 2. 3.: Restriksjonsanalvse av pelD- klonene

Ut i fra de positive fagene ble 10 tilfeldige utvalgt for ytterligere analyser. 1 pg fag-DNA blir spaltet med 10 enheter EcoRI eller Bglll i et volum på 20 pl i 2 t ved 37°C i buffere foreslått av forhandlerne. Prøvene blir separert på en 0,6 # agarosegel ved anvendelse av 1 pg lambda cI857 Sam 7 DNA spaltet med Eindlll (lambda x Hindlll) som markører og EMBL4 DNA og pCG3Bll DNA spaltet med EcoRI som kontroller. Gelen blir fotografert på en UV-transilluminator ved anvendelse av Polaroid 667-filmer (4s, diafragma 8). DNA'et blir overført til Schleicher og Schull BA85 nitrocellulosefiltre ifølge metoden til Southern (1975) som beskrevet i Maniatis s. 383-386; (ref. 5). Filtrene blir hybridisert med en blanding av 32P merkede (nikk-translaterte) fragmenter av pelD-genet som dekker hele genet. Disse fragmentene er 2,9 kbp EcoRI-fragmentet til pPL29-5 og 3,5 kbp EcoRI-fragmentet til pPL35-5. Hybridisasjon og vaskingsbetingelsene er identiske med de som er beskrevet i eksempel 2.1.

Båndlengden blir beregnet fra fotografiet og autoradiogrammene ved grafisk sammenligning på semilogaritmisk papir med kjente markørbånd. Restriksjonskart av klonene er angitt i fig. 1. Klonene X-PL4, -14, og -40 inneholder både 2,9 og 3,5 kbp EcoRI hybridiseringsfragmentene som funnet i pCG3Bll. X-PL5, -6, -10 og -33 inneholder 3,5 kbp EcoRI-f ragmentet sammen med et annet hybridiserende EcRI-fragment. Klonene X-PL26 og -28 inneholder 2,9 kbp EcoRI-fragmentet sammen med et annet hybridiserende fragment, mens X-PL9 bare inneholder et lite 1,2 kbp hybridiserende EcoRI-f ragment. Hele 5,0 kbp Bgl11-fragmentet til pCG3Bll, inneholdende hele det strukturelle pelD-genet. er bare tilstede i klonene X-PL4, -14 og-40. Det 3,7 kbp hybridiserende båndet tilstede i klonene X-PL5, -6, -10, -14, -33 og -44, men ikke i pCG3Bll, er beliggende nedstrøms for pelD-genet i 5,0 kbp fragmentet. Noen hybridiserende Bglll fragmenter inneholder ennå 1,2 kbp av høyre armen til vektoren. Alle klonene inneholder også ikke-hybridiserende fragmenter som er identiske. Pga. at det derfor ser ut som om restriksjonsmønstre til både det strukturelle genet og gen-omgivelsene er identiske i alle kloner, blir det konkludert at de kommer fra samme genet viz pelD-genet til A. niger-stamme N400. Ut i fra antall kloner som blir sådd ut og antatt genomlengde på 3xl0<7>bp, venter man å finne 12 pelD-kloner for 25 000 kloner med en gjennom-snittlig innskuddslengde på 15 kbp. Pga. at bare 2 ut i fra de 10 analyserte klonene er identiske, er kompleksitet til biblioteket enda høyere enn antatt (jf. eksempel 3).

Eksempel 2. 4.: Subkloning av pelD- fragmentene

5,0 kbp BglII-fragmentene til X-PL4 og pCG3Bll inneholdende pelD-genene til A. niger N400 og N756 respektivt, blir subklonet inn i BamEI-setet til plasmid pBR322 (se klonings-vektorene). 4 pg X-PL4 og 2 pg pCG3Bll blir fullstendig spaltet i 20 pl med 10 U Bglll i 2 t ved 37" C. Fragmentene blir separert på en 1 # lavt smeltepunkt LBP agarose (BRL) gel i TBE + 1 pg/ml etidiumbromid ved 50 V. 5,0 kbp fragmentet blir kuttet ut fra gelen, fortynnet med 0,4 ml TE, og et likt volum fenol ble tilsatt og blandingen oppvarmet til 65"C i 10 min for å smelte agarosen. Etter sentrifugering i 5 min ved 12 000 rpm i en Eppendorf 5414S bordsentrifuge, blir den vandige fasen ekstrahert med fenol/kloroform og kloroform, etanol utfelt, vasket, tørket og til slutt løst opp i 10 pl lav TE. 1 pg pBR322 DNA, preparert ved plasmidprepareringsmetoden i stor skala (Maniatis, et al. s. 86; ref. 5) og renset ved CsCl-gradientsentrifugering, blir spaltet med 5 U BamHI i 2 t ved 37°C i et volum på 20 pl. 2 pl 10 x CIP-buffer og 0,02 enheter CIP blir tilsatt og inkubasjonen blir fortsatt i ytterligere 30 min. EDTA blir tilsatt til en finalkonsentrasjon på 25 mM, og blandingen blir oppvarmet i 10 min ved 65°C. Oppløsningen blir fortynnet i 200 pl med TE og ekstrahert tre ganger med TE-mettet fenol, en gang med fenol/kloroform og en gang med kloroform. Etter etanolpresipitasjonen blir DNA'et løst opp i 50 pl lav TE.

100 ng fragment-DNA blir ligert med 20 ng vektor-DNA i et volum på 20 pl under betingelsene beskrevet i eksempel 1.4.

Halvparten av ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere E. coli MHl-kompetente celler, preparert ved CaCl2-metoden (Maniatis, et al. s. 250; ref. 5). Cellene blir sådd ut på LC-agarskåler inneholdende 50 pg/ml ampicillin og inkubert over natt ved 37°C. Transformantene blir testet for tetracyklinfølsomhet ved utstreking av kolonier først på LC-skåler inneholdende 20 pg/ml Tc, og deretter på LC + amp-skåler. Transformantene blir dyrket over natt i 5 ml LC + amp ved 37° C, og DNA blir isolert fra 1,5 ml av kulturen ved anvendelse av miniprepmetoden med alkalisk lysering (Maniatis, et al. s. 368; ref. 5).

Miniprep DNA'ene blir spaltet med BamHI og Pstl og fragmentene analysert på en 1 % agarosegel. To plasmider med opprinnelse fra X-PL4, inneholdende 5,0 kbp BglII-fragmentet i motsatte orienteringer, blir betegnet pGW840 og pGW841. Ytterligere plasmider med opprinnelse fra pCG3Bll blir betegnet pGW870 og pGW871. MHl-cellene inneholdende disse blir holdt på glyserol ved -70°C. Plasmid-DNA fra 0,5 1 kulturer fra disse klonene blir isolert i stor skala (Maniatis, et al. s. 86; ref. 5), renset ved CsCl-sentrifugering, fenolbehandlet, etanolutfelt og løst opp i 400 pl lav TE. Utbyttet utgjør omtrent 500 pG. Plasmidene blir utsatt for restriksjonskartlegging. Kartet for plasmid pGW840 er vist i fig. 2 og kan ikke skjelnes i forhold til pGW870. Plasmidene pGW841 og pGW871 som inneholder fragmentet i motsatt orientering kan heller ikke skjelnes, og dette indikerer identitet av pelD-genene fra A. niger-stamme N400 og N756.

Eksempel 3.: Screening for, isolasjon og karakterisering

av gener knyttet til pelD

Eksempel 3. 1.: Etablering av hybridisasjonsbetingelser ved analyse av genome blott til A. niger N400

DNA

2 pg DNA-prøver fra A. niger-stamme N400, isolert som beskrevet i eksempel 1.1., blir spaltet i et volum på 20 pl i4t ved 37°C ved anvendelse av BamHI (BRL) eller Hindlll (BRL) i HHA B/g-buffer. De spaltede prøvene blir separert elektroforetisk på 0,6 % agarose-geler ved 40 V i 18 t. DNA'et blir overført til nitrocellulosefiltrene og bakt som beskrevet i eksempel 2.3. (Pre )-hybridisasjonsoppløsningene er identiske med de som er beskrevet i eksempel 2.1.

Temperaturen anvendt for prehybridisasjon er alltid den samme som hybridisasjonstemperaturen. Det nikk-translaterte 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet til pGW840 som inneholder den kodende sekvensen til<p>elD-<g>enet. er blitt anvendt som en probe. Hybridisasjonen blir utført ved forskjellige temperaturer (52, 60 og 68°C) i 16 t og 40 t. Følgende to vaskebetingelser blir anvendt ved de tre forskjellige temperaturene: 2 x 30 min 5 x SSC, 0,1 % SDS etterfulgt av 2 x 30 min 3 x SSC, 0,1 # SDS sammenlignet med 4 x 30 min 5 x SSC, 0,1 5é SDS. For 68° C, vasking to ganger med 2 x SSC, 0,1 % SDS og to ganger med 0,2 x SSC, 0,1 # SDS blir også tilsatt. Ved 68° C, ved anvendelse av 0,2 x SSC vaskinger, oppstår bare homolog hybridisasjon. Anvendelse av høyere saltkonsentrasjoner tilveiebringer at noen andre svake signaler fremkommer. Ved 52° C er bakgrunnen høy og hybridisasjonen svak. De beste betingelsene for "heterolog"-hybridisasjon er 60°C i 40 t ved anvendelse av vaskekombinasjonen 5 x SSC og 3 x SSC. Dette kan til og med bli ytterligere optimalisert ved anvendelse av 4 x SSC i kombinasjon med 2 x SSC istedenfor 5 x SSC i kombinasjon med 3 x SSC. Signalene som fremkommer i disse genome blottene til A. niger N400 når de ble probet med 1,6 kbp BamHI/PstI-fragmentet til pGW840 er oppsummert i tabell

I.

Eksempel 3. 2.: Screening av biblioteket

2,5 x IO<4>fag fra N400 lambda-biblioteket blir plassert på 5 skåler og 3 nitrocellulosereplikaer blir laget fra hver skål som beskrevet i eksempel 2.1. (pre)hybridisasjonsbufferen er også beskrevet i eksempel 2.1. Første replika fra hver skål blir hybridisert ved 60°C i 40 t med 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet til pGW840 og vasket to ganger ved den temperaturen i 30 min med 4 x SSC, 0,1 <& SDS og to ganger i 30 min med 2 x SSC, 0,1 % SDS som beskrevet i eksempel 3.1. Disse betingelsene blir betegnet som heterologe betingelser. Det andre replika for hver skål blir hybridisert ved 68°C med det samme fragmentet, vasket to ganger i 30 min med 2 x SSC, 0,1 5é SDS og to ganger i 30 min med 0,2 x SSC, 0,1 # SDS ved denne temperaturen. Disse betingelsene blir betegnet som homologe betingelser. Tredje replika fra hver skål blir hybridisert homologt med 0,35 kbp BamHI-fragmentet til pGW840, som er beliggende i promotorregionen til pelD rett ved siden av 1,6 kbp BamHI/Pstl-f ragmentet. 29 plakk som

hybridiserer heterologt, men ikke (eller veldig svakt) homologt, blir tilveiebrakt. Disse blir betegnet X-PL101 til X-PL129. 19 plakk, som hybridiserer sterkt homologt og heterologt med BamHI/Pstl-proben, blir tilveiebrakt. Disse blir betegnet X-PL130 til X-PL148 og blir betegnet som<p>elD-kloner. To av disse hybridiserer bare svakt med 0,35 BamHI-proben X-PL145 og X-PL146, og inneholder dermed sannsynligvis bare en del av promotorregionen. De andre hybridiserer sterkt. Bare 1 klon, som hybridiserer bare med 0,35 kbp BamHI-proben (X-PL149), blir tilveiebrakt.

Alle klonene blir plukket og renset to ganger ved utsåing og hybridisering av disse heterologt med 1,6 kbp BamHI/Pstl-proben. I et annet screeningseksperiment er 23 pelD-kloner og 25 andre kloner ytterligere blitt tilveiebrakt (X-PL151 til X-PL198).

Eksempel 3. 3.: Karakterisering av lambdakloner ved plakkhybridisasjonssignaler med forskjellige prober avledet fra pelD

I dette eksperimentet blir en klassifikasjon av de isolerte klonene beskrevet ved anvendelse av forskjellige deler av den kodende regionen til pelD som probe. X-PL101 til -130, -145 er innbefattet, mens X-PL4 blir anvendt som en positiv kontroll. Klonene blir sådd ut og bare et replika som er delt inn i 6 deler blir laget. Dette skal forhindre forskjeller i hybridisasjonssignal mellom replikaene. Separate deler av replikaene blir hybridisert både homologt og heterologt med følgende 32P-merkede prober:

1: hele 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet fra pGW840

2: 649 bp BamHI/Xhol-fragmentet fra pGW840 (den N-terminal-kodende delen av pelD)

3: 244 bp XhoI/Pstl-fragmentet fra pGW840 (den C-terminal-kodende delen til pelD).

X-PL4, -130 og -145, samt X-PL101, hybridiserer sterkt til disse probene under homologe og heterologe betingelser, og dette er ventet for pelD-klonene. Den sistnevnte klonen, X-PL101, er beliggende ved enden av filteret i eksempel 3,2 og blir derfor ikke registrert som pelD i den første screeningen. De nevnte klonene blir klassifisert som klasse I (p_elD) kloner. X-PL112, -126 og -127 ser ut til å være negative i dette eksperimentet. Alle de andre klonene kan bli delt inn i to andre klasser: klasse II hybridiserer sterkt, ikke bare til hele proben, men også til den N-terminale proben. Homolog hybridisasjon er bare svak når det gjelder hele pelD-genet som en probe. Klasse III-kloner hybridiserer ikke til den N-terminale proben idet hele tatt, og heller ikke homologt med hele proben. Den C-terminale proben hybridiserer ikke med både klasse II og klasse III-kloner. Ut i fra disse eksperi-mentene kan vi konkludere at det er minst to relaterte gener blant de isolerte klonene.

Til klasse II-klonene hører: X-PL104, -105, -109, -113, -114,

-115, -119, -122, -124, -125, -128 og -129. Klasse III-klonene utgjør: X-PL102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 og -123.

Eksempel 3. 4.: Restriksjonsanalyse av de isolerte lambda-klonene ( klasse I. II)

Skållysatforråd, 250 ml væskelysater og fag-DNA-preparering i stor skala fra disse lysatene, ble preparert som beskrevet i eksempel 2.2. Dette blir utført for 24 kloner, idet 3 av dem er<p>elD-klonene (X-PL4, -130, -145). Et klon-DNA ble tapt i løpet av DNA-isolasjonen (X-PL124). DNA'et isolert fra disse klonene blir spaltet i 1 pg prøver i totalt 20 pl med 10 enheter enzym. Alle klonene blir spaltet med EcoRI, BamHI, Hindlll, EcoRI/Bam, HI, BamHI/HindiII, EcoRI/Hindlll og EcoRI/BamHI/Hindlll. Fragmentene blir separert på en 0,6 % agarose-gel og overført til nitrocellulosefiltre som beskrevet i eksempel 2.3. Blottene blir hybridisert heterologt med 1,6 kbp BamHI/PstI-fragmentet til pGW840 som beskrevet i eksempel 3.1. To kloner hybridiserte ikke (X-P1112 og X-PL129). Båndlengder fra både fotografiene og autoradiogrammene blir beregnet. Med unntakelse av X-PL113-klonen, inneholder alle klonene for mange fragmenter for å tilveiebringe et fullstendig kart.

Det er derimot mulig å tilveiebringe et kart av den hybridiserende regionen og, ved kombinering av data angående andre ikke-hybridiserende bånd, avgjøre hvilke kloner som blir avledet fra det samme genet. Det er klart at blant de gjenværende 18 klasse II og III-klonene som er analysert, er 5 gener tilstede. Disse blir betegnet pelA, pelB. pelC, pelE og<p>elF. Oppføring av kloner til disse genene er oppsummert i tabell II. En sammenligning av lengdene på hybridiseringsfragmentet til de isolerte genene og lengdene på hybridiseringsfragmentet fra genome DNA-blott er vist i tabell III. Det blir konkludert fra disse data at alle båndene som hybridiserer i genome blott, er tilstede i klonene som er isolert og at under disse hybridisasjonsbetingelsene kan ingen andre relaterte gener bli isolert. Plakk-hybridisasjonsresultatene (eksempel 3.3.) viser at, uten å ta delvise kloner med i betraktning, hvert gen har et spesifikt hybridisasjonsmønster med probene testet. Dette er oppsummert i tabell IV.

Tabell IV

Sammenligning av signalstyrken til forskjellige gener ved homolog og heterolog plakkhybridisasjon med forskjellige pelD-prober ifølge eksperimentet beskrevet i eksempel 3.3. Grad av hybridisasjon blir uttrykt ved antall +tegn. Det homologe pelD-genet hybridiserer med minst 10 + tegn; ±, veldig dårlig hybridisasjon; -, ingen hybridisasjon.

Eksempel 3. 5.: Subkloning av pelD- relaterte gener inn i

PBR322

Subkloner av de hybridiserende fragmentene som blir tilveiebrakt fra X-klonene beskrevet i eksempel 3.3. blir laget i vektor pBR322 som blir spaltet med EcoRI, BamHI eller Hindlll og deretter defosforylert. Fragmentisolasjon fra LMP-agarose-geler, vektorpreparering, ligering, transformering av E. coli MH1, miniprep DNA-isolering og plasmidisolering i stor skala blir alle utført ved anvendelse av standardprosedyrer som er blitt beskrevet i eksempel 2.4.

Fragmenter blir ligert inn i det riktige vektoren som beskrevet i eksempel 2.4. Transformerte E. coli MHl-celler blir sådd ut på LC + 50 pg/ml Amp. Transformanter blir undersøkt for tetracyklinfølsomhet. EcoRI-kloner er alle resistente. Miniprep DNA'er blir deretter spaltet med hensiktsmessige enzymer for å lete etter de riktige innskuddene og for å bestemme orienteringen av fragmentene. De valgte plasmidene er oppsummert i tabell V. Celler som inneholder disse blir lagret på glyserol ved -70°C.

Plasmidene pGW820, -830, -850, -860 og -880 er blitt isolert i stor skala og utsatt for restriksjonskartlegging. Kart av disse plasmidene er angitt i fig. 1 til 6.

For å bestemme genbeliggenheten og orienteringen, blir Southern blott av hybridspaltinger hybridisert heterologt med 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet til pGW840, og identiske blott blir hybridisert heterologt med et N-terminalt fragment av det samme plasmidet, som er 649 bp BamHI/Xhol-fragmentet for kartlegging av pGW820 og -830, og 766 bp BamHI/EcoRI-fragmentet for pGW850 og -860.

Plasmidene pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 og pGW880 ble klonet i E. coli EB101 og deponert 1. februar 1988 til Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, 3400 Gottingen. De har DSM-nr. 4 388, 4 389, 4 390 og 4 392 respektivt.

Eksempel 4.: Sekvensbestemming av pelD.pelA.pelB og

pelC- genet

Eksempel 4. 1.; Partiell sekvens av pelD- genet fra A.

niger- stamme N400 og identiteten derav med pel I fra A. niger- stamme N756

Egnede restriksjonsfragmenter blir isolert fra pGV/840 etter LMP-agarosegelelektroforese som beskrevet i eksempel 2.4. Disse blir ligert inn i M13mpl8RF og M13mpl9RF-vektorer ifølge BRL M13 kloning/dideoksy-sekvenseringsinstruksjons-manual (s. 26, 27; ref. 6). Transformasjon av E. coli JM103, utsåing på minimal X-gal-indikatorskåler og isolasjon av enkelttrådet DNA fra rekombinante fag blir utført ifølge instruksjonen i samme manual (s. 29-34). Noen få kloner blir sekvensert ved anvendelse av Stranger dideoksykjedeterminer-ingsmetoden beskrevet på s. 38-74 i BRL-manualen.

Sekvensene bestemt mellom nukleotidene -457 og +100 er identiske med den korresponderende sekvensen til PLI-genet avledet fra A. niger N756 og tilstede i plasmid pCG3Bll (EP 88 101 397.3). Sekvensen bestemt fra BamHI i posisjon -457 opp til posisjon +100 omfatter 457 nukleotider av promotorsekvensen, idet 57 nukleotider koder for signalsekvensen og 43 nukleotider koder for de første 13 N-terminale aminosyrene av det modne PLD-proteinet.

Ut i fra identiske restriksjonskart av N400 pelD-genet i pGW840 og av N756<p>elD i pCG3Bll og de nøyaktig identiske N-terminale sekvensdata antas det at begge genene er identiske. Det antas dermed at PLD-proteinet er identisk med det tidligere PLI-proteinet.

Eksempel 4. 2.: Sekvensbestemming av pelA. pelB og pelC-genet

Fragmentene av pGW820, pGW830 og pGW850 blir subklonet inn i M13 mpl8RF og M13 mpl9RF (se eksempel 4.1.) eller inn i plasmidene pEMBL18 og pEMBL19 (Dente et al. ref. 7,8). Enkelttrådede DNA'er fra plasmidklonene blir tilveiebrakt ved infeksjon med hjelperfag R408 (Russell et al. ref. 9).

Eksonuklease III delesjonskloner ble preparert fra pGW850 ved metoden til Henikoff (ref. 28). 3,0 kb SmaI-BgIII-fragmentet fra pGW850, som pelC-genet er beliggende på, blir subklonet inn i pEMBL19. 50 pg av denne klonen blir spaltet med Smal og SacI, og etter fenol/kloroformekstraksjon og etanolpresi-pitasjon spaltet med exonuklease III. Prøver blir tatt ut ved forskjellige tidsintervaller, og eksonuklease III inaktivert ved tilsetting av NaCl og EDTA og inkubasjon ved 70° C i 10 min. Utragende ssDNA-ender blir fjernet ved Sl nuklease og de klebrige endene blir gjort butte med T4 DNA-polymerase. Etter selvligering og transformasjon av E. coli JM103 med disse delesjonsklonene blir enkelttrådede DNA'er tilveiebrakt ved infeksjon med hjelperfag R408, pGW820 blir sekvensert fra PvuII-setet i posisjon 1 000 til Clal-setet i posisjon 4 175 (se fig. 1). Når det gjelder pGW830 blir 2 774 bp Xhol-fragmentet sekvensert (se fig. 2). pGW850 blir sekvensert fra EcoRI-setet i posisjon 0 til posisjon 3 168 (se fig. 3).

Sekvensstrategiene for disse genene er identiske i fig. 7, 8 og 9. Flere oligonukleotider blir syntetisert ved anvendelse av fosforamiditmetoden til Caruthers (ref. 10) ved anvendelse av en Applied Biosystem (modell 380B) oligonukleotidsyntese-apparatur. Disse blir anvendt som sekvenseringsprimere og deres posisjon er angitt i fig. 7 og 8.

Hele sekvensen til pelA-genet er angitt i fig. 9 i 5'->3'-retningen. 3175 bp-sekvensen begynner med det første nukleotidet til PvuII-setet i posisjon 1 000 i pGW820 og slutter ved de siste nukleotidene til Clal-setet i posisjon 4175 i pGw820.

PelA-sekvensen omfatter 1 360 nukleotider av promotorregionen, 1 355 residuer av den strukturelle delen og 360 nukleotider av terminatorregionen.

Foran aminosyresekvensen til PLA (se eksempel 6.3.) er en signalsekvens på 20 aminosyrer, som det fremgår av nukleotidsekvensen.

Homologien med signalsekvensen til pelD-genet er angitt med en stjerne. De første 5 residuene til det modne proteinet har også den samme aminosyresekvensen i pelA og pelD.

Hele sekvensen til<p>elB-<g>enet er angitt i fig. 10, også i 5 '-»3 '.-retningen. 2 774 bp-sekvensen begynner med det første nukleotidet til Xhol-setet i pGW830 og slutter ved siste nukleotid til det andre Xhol-setet.

pelB-sekvensen omfatter 1 133 nukleotider av promotorregionen, 1 373 residuer av den strukturelle delen og 268 av terminatorregionen. pelB-<g>enet koder for en signalsekvens på minst 20 aminosyrer.

pelC-sekvensen omfatter 1 367 nukleotider av promotorregionen, 1 340 residuer av den strukturelle delen og 461 av terminatorregionen. PelC-<g>enet koder for en signalsekvens på 18 aminosyrer.

Homologien med signalsekvensen til pelA, pelB og pelD-genet er angitt i hver posisjon med en stjerne. X'ene er innbefattet for oppstilling av sekvensene.

Søken etter consensus-sekvenser for sopp ekson/intron-spleisegrenser og intron indre sekvenser (Ballance, ref. 11) fører til postulering av tilstedeværelse av fire introner i pelA-. B- og C-genet. Posisjonene hvor intronene er beliggende innenfor de kodende regionene til disse pel-<g>enene er bevart idet at det er hovedsakelig fem intronposisjoner, men i hvert gen mangler et annet intron. For pelC-genet er derimot bare tre introner postulert. Av disse finnes bare en i en posisjon korresponderende med posisjonen til intron i pelD og pelA (intron 5). Posisjonene til disse intronene og deres respektive lengder er oppsummert i tabell Via. Lengdene av eksonene mellom intronene blant de fire pel-gene. er de samme i disse tilfellene. I fig. 13 er de oppstilte avledede aminosyresekvensene til PLA, PLB, PLC og PLD vist. I den N-terminale delen av de kodende områdene til pelA,<p>elB og pelD er omtrent 80 % homologi observert på basis av nukleotidsekvenshomologien og over 80 % på basis av amino-syresekvenshomologien. Denne prosentandelen er mye lavere med pelC. I den C-terminale delen av pelA. pelB og pelD etter residuet 285 til det modne proteinet (korresponderende med residuet 305 i fig. 13) er homologien i stor grad tapt og vender bare tilbake nær ved den C-terminale enden.

Med unntakelse av consensus-sekvensene til spleisesignalet og til 5'- og 3-spleisesetene (tabell VIb) blir ingen homologi funnet i intronene.

De avledede amlnosyresekvensene for proteinene PLA, PLB, PLC og PLD indikerer totalt 359 residuer for de første to proteinene, 360 for PLC og 354 for PLD. Med hensyn på N-glykosylering er et potensielt glykosyleringssete tilstede i alle fire proteinene ved posisjon 109 (i moden protein) (for PLC korresponderer dette med posisjon 105 i den ikke-oppstilte sekvensen). I PLB er det et annet potensielt sete tilstede i posisjon 232, mens i PLD er to andre potensielle glykosyleringsseter tilstede ved residuene 255 og 329.

Eksempel 5: Kotransformasjon av A. niger ved anvendelse av A. niger PyrA- genet som seleksjonsmarkør og de forskjellige A. nigerpelgenene som kotransformerende plasmider

Eksempel 5. 1.; Propagering og rensing av plasmider anvendt

for å transformere A. niger

Alle plasmidene blir propagert i E. coli-stamme MH1 og plasmid DNA blir fjernet fra 500 ml overnatt-kulturer som beskrevet av Maniatis et al. s. 90-91; ref. 5). Til 2,5 ml DNA-oppløsning i TE, inneholdende opp til 1 mg DNA, blir 2,2 g CsCl og 1 ml etidiumbromid (10 mg/ml i vann) tilsatt. Oppløsningen blir applisert i hurtigforseglende rør, som blir fylt og forseglet som angitt av forhandleren (Beckman). Sentrifugering foregår i en VTi 65,2 rotor ved 20° C i 16 t ved 45 000 rpm. Ut i fra de to fluoriserende båndene synlig under ultrafiolett lys, blir det nederste som inneholder plasmid DNA isolert ved sidepunktering av røret. DNA-opp-løsningen (omtrent 1 ml) blir ekstrahert 5 ganger med vann-mettet butanol for å fjerne etidiumbromid. Deretter blir DNA'et utfelt med etanol, resuspendert i TE, ekstrahert en gang med fenol/kloroform og kloroform, utfelt på ny og lagret ved -20°C.

pGW613-plasmidet som inneholder OMP-dekarboksylasegenet ( pyrA) på et 5 kbp A. niger DNA-fragment blir anvendt for å selektere transformanter (Goosen et al.; ref 12). Plasmidene pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 og pGW880 som er beskrevet i eksempel 3.5. blir anvendt som ko-transformerende plasmider.

Eksempel 5. 2.: Preparering av protoplaster og transformasjon av uridinauxotroft mutant A. niger- stamme N593.

A. niger-stammen N593 ( cspA. pyrA) som er et derivat av foreldrestammen N400 er blitt tilveiebrakt ved positiv seleksjon mot toksisk analog 5-fluor orotinsyre som i gjær (Boeke et al. : ref. 13) i nærvær av uridin som beskrevet av Goosen et al.: (ref. 12).

Flytende minimalmedium supplementert med 0,5 % gjærekstrakt, 0,2 kasaminosyrer, 10 mM-uridin (Janssen Chimica) og 50 mM glukose blir inokulert med 10^ konidiosporer fra A. niger N593 pr. ml og inkubert i 20 t ved 30°C i en New Brunswick orbitalrister. Mycelium blir høstet ved filtrering gjennom Miracloth, vasket med iso-osmotisk (STS) minimalmedium (STC) med følgende sammensetning: 1,33 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaClg justert til 1,7 mOsm. En mengde på 1 g mycelium blir resuspendert i 20 ml STC. Protoplaster blir frigjort fra myceliet i løpet av 2 t ved tilsetning av 250 mg filter-sterilisert Novozym 234 (Novo Industries, Danmark) og blandingen blir inkubert ved 30° C i en rister ved 95 rpm. Protoplastene blir separert fra gjenværende mycelium ved filtrering ved anvendelse av en trakt med en glassullplugg og renset ved sentrifugering (10 min, 2 500 rpm) ved pelletering og resuspendering i STC.

For transformering blir 5 x 10^ protoplaster tatt opp i 200 pl som deretter blir inkubert sammen med 1 pg pG¥613 og 10 pg av en av de følgende plasmidene pGW820, pGW830, pG¥850, pGW860 eller pGW880 (volum på mindre enn 20 pl). For pGW840 blir et forhold på 1:3 anvendt med 6 pg pGW613. Etter tilsetning av plasmid DNA til protoplastene blir 50 pl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG6000) tilsatt og inkubasjonsblandingen blir holdt på is i 20 min.

Deretter blir ytterligere 2 ml PCT tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min ved romtemperatur. Deretter blir 4 ml STC tilsatt og blandet. Aliquoter på 1 ml av denne endelige transformasjonsoppløsningen blir blandet med 4 ml flytende iso-osmotisk MM top-agar-stabilisert med 0,95 M sakkarose (justert til 1,7 mOsm). Protoplastblandingen blir med en gang sådd ut på agarskåler inneholdende det samme iso-osmotiske minimalmediet og disse blir inkubert ved 30° C. Hensiktsmessige kontrolleksperimenter omfatter protoplaster behandlet på lignende måte uten plasmid DNA og på et ikke-stabilisert minimalmedium med 2,5 mM uridin.

Etter 3 dagers vekst ved 30<0>C oppstår voksende transformanter som sporulerer (50-150 transformanter/jjg pGW613). Et stort antall tilsynelatende aborterende transformanter fremkom også. Sporer av individuelle transformanter blir deretter tatt ut og sådd ut separat på 50 mM glukose minimalmedium for å tilveiebringe enkelte kolonier som blir anvendt for å propagere sporer for videre transformantanalyser.

I hvert tilfelle blir minst ti transformanter dyrket på flytende minimalmedium, DNA'et ekstrahert og analysert for tilstedeværelse av ko-transformerende plasmid DNA. Sopp DNA blir isolert med noe modifisert prosedyre anvendt for å isolere plante RNA (Slater, ref. 14). Myceliet blir vasket med saltvann, frosset i flytende nitrogen og 0,5 g blir ødelagt med et mikrodismembrator (Braun). Mycelpulveret blir ekstrahert med friskt preparert ekstraksjonsbuffer. Ekstrak-sjonsbufferen blir preparert som følger: 1 ml tri-isopropyl-naftalensulfonsyre (TNS) 20 mg/ml blir blandet med 1 ml p-aminosalisylsyre (PAS) (120 mg/ml) og 0,5 ml 5 x RNB-buffer (5 x RNB inneholder 121,1 g Tris, 73,04 g NaCl og 95,1 EGTA i 1 1, pH 8,5). Etter tilsetning av 1,5 ml fenol, blir ekstrak-sjonsbufferen ekvilibrert i 10 min ved 55 °C. Den varme bufferen blir deretter satt til mycelpulveret og suspensjonen blir grundig blandet i 1 min ved anvendelse av en vortex- blander. Deretter blir 1 ml kloroform tilsatt og blandet i 1 min.

Ved sentrifugering (10 min, 10 000 x g) blir den vandige fasen separert og ekstrahert en gang til et likt volum fenol/kloroform (1:1) og deretter to ganger med kloroform.

Den vandige fasen inneholder både RNA og DNA. DNA'et blir utfelt med 2 vol etanol ved romtemperatur og samlet ved sentrifugering (10 min, 10 000 x g), vasket to ganger ved oppløsning i destillert sterilt vann og utfelt på ny med etanol. RNA blir fjernet ved tilsetning av RNase A (20 pg/ml) til den endelige oppløsningen. Prosedyren resulterer i DNA med høy molekylvekt (100-200 kbp) med et utbytte på omtrent 300 pg DNA/g mycelium som blir ytterligere renset ved CsCl/etidiumbromid-tetthetsgradientsentrifugering hovedsakelig ifølge Maniatis et al. s. 93; (ref. 5).

Spalting av kromosomalt DNA (2 pg) blir utført ved inkubering i 2 t ved 37°C med EcoRI for pelA (pGW820) og<p>elC (pGW850) transformanter, Hind III for pelB (pGW830) transformanter, EcoRI eller Bgl II for pelD-transformanter. I alle tilfellene ble 20 U restriksjonsenzym anvendt og inkubasjonen ble forlenget i ytterligere 2 t ved tilsetning av ytterligere 20 U restriksjonsenzym. Spaltingene blir utført i hensiktsmessige reaksjonsbuffere fra BRL.

Deretter blir DNA'et fraksjonert på 0,6 56 agarose, blottet på nitrocellulose og hybridisert hovedsakelig som beskrevet av Maniatis et al. (ref. 5), s. 382-386 ved anvendelse av korresponderende [a-<32>p] merkede prober.

Følgende kotransformasjonsfrekvenser blir funnet: pG¥820 (pelA) 70 g; pGW830 (p_elB), 70 %\pGW840 (<p>elD) 15 *; pGW850 (pelC) 60

Masseforholdet mellom pGW613 og kotransformerende plasmid pGW820, pGW830, pGW850 (1:10) og pGW840 (1:3) fører i de fleste tilfellene til multikopikromosomal integrasjon av de kotransformerende plasmidene.

Eksempel 5. 3.: Genomisk analyse av pelA- transformert

A. niger- stamme A15

Et antall multikopitransformanter beskrevet i 5.2. er blitt analysert og analysen av<p>elA-transformant A15 er angitt som et detaljert eksempel.

DNA til A. niger-stammen N593 og av multikopitransformant pelA-stamme A15 blir isolert og analysert ved hybridisasjon av Southern blott som beskrevet i eksempel 3.1. Som en pelA-probe blir 7,5 kbp EcoRI-f ragmentet anvendt (se fig. 3a). I det genomiske blottet blir et intenst bånd på 7,4 kbp funnet i den transformerte stammen A15 som er et resultat av type I og/eller type II integrasjonshendelsen (jf. Hinnen et al., ref. 14a) Også noen mindre bånd med forskjellige lengder blir funnet som representerer grensefragmenter fra type II integrasjonshendelser til re-arrangementene.

De optiske tetthetene til 7,4 kbp EcoRI-båndene i A. niger pelA-transformantene A15 og A. niger N593 autoradiogrammene blir scannet ved anvendelse av Ultroscan XL (LKB). Verdiene blir korrigert for små forskjeller i DNA-konsentrasjonen mellom N593 og transformant A15 ved scanning av tetthetene tilveiebrakt med en annen probe som hybridiserer med pyruvat-kinasegenet, tilstede som enkeltkopi i begge stammer. Ut i fra disse data er det beregnet at i pel A-transf ormant en A15 er det omtrent 19 intakte kopier av pelA-genet tilstede.

Ved anvendelse av Hindlll-innskuddet til pGW830 (fig. 3b) som en probe, indikerer analyse av Southern blott til transformert stamme A15 at integrasjon av pelA-sekvensene ikke er oppstått i pelB-locuset. Analyser av transformert pelB-stamme B13, pjelC-stamme C16 og pelD-stamme D12 med de hensiktsmessige korresponderende probene tilveiebringer kopitall på omtrent 15, 50 og 10.

Eksempel 5. 4.: Northern blott- analyse av indusert og ikke-indusert mvcelia til pelA- transformert A. niger- stamme A15 og A. niger N400

Minimalmedium (250 ml) inneholdende 50 mM glukose eller 1 %

(w/v) eplepektin (Brown Ritibon, dvs. 72,8 <$ >, obipektin AG, Bischofszell) blir inokulert i en sporetetthet på 10^ sporer/ml med sporer fra transformant A15 eller sporer fra vi 11 types tamme N400 blir høstet etter 30 t ved vekst ved 30°C. Prøver av kulturmediet (2 ml) blir også samlet, dialysert mot 2 1 10 mM natriumf osf atbuf f er pH 7,0 ved 4 °C og lagret ved -20°C.

Nukleinsyrer blir isolert fra myceliet som beskrevet i eksempel 5.2. RNA blir utfelt fra den vandige fasen etter kloroformekstraksjon ved tilsetning 1/3 volum 8 M LiCl. Oppløsningen blir grundig blandet og inkubert overnatt ved 0°C. RNA blir oppsamlet ved sentrifugering (300 rpm i 30 min) ved anvendelse av en MSE Super-MInor-sentrifuge og deretter vasket en gang med kald (-20°C) 2M LiCl og en gang med kald (-20°C) 96 % etanol. Til slutt blir RNA'et løst opp i destillert vann i en konsentrasjon på omtrent 1 mg/ml. Prepareringene er vesentlig uten DNA med et utbytte på 1-2 mg RNA pr. g mycelium. Mengder på omtrent 10 pg RNA blir kjørt på denaturerende formaldehyd 1 % agarosegeler ifølge Maniatis et al. s. 202-203; ref. 5 ved anvendelse av Hind III-spaltet lambda DNA eller RNA-stigen fra BRL som molekylvektsmarkører. Gelene blir blottet og bakt på Nytran (Schleicher og Schuell) som foreslått av forhandleren og hybridisert ved 68°C i 16 t med 7,4 kbp EcoRI pelA DNA-proben. Hybridisasjon og vaske-prosedyrene er som beskrevet for DNA-hybridisasjon under homologe betingelser ifølge eksempel 3.2.

Begge A. niger-stammene produserer pektin-induserbart mRNA med en lengde på omtrent 1,6 kbp. Scanning av de optiske tetthetene til de to autoradiogrammene angitt en 15-20 gangers forskjell i intensitet mellom A15-transformanten og vi11typestammen som korrelerer med økningen i kopitallet beregnet fra Southern blott-analysene.

Eksempel 5. 5.: Pektinlyaseproduksjon av transformert A.

niger- stamme D12

A. niger pelD-transformant D12 tilveiebrakt ifølge eksempel 5.2. blir dyrket i en 2-trinns dyrkingsprosedyre som ligner prosedyren beskrevet av Eermersdorfer et al (27) for produksjon av polygalakturonase. Et myceliumlag blir dannet på toppen av en flytende kultur ved modulering av 10^ sporer pr. ml pre kultiveringsmedium (PCM) bestående av sukkerbønnemasse (4 %) og NH4NO3(1 #) pH 4,5. Etter en 5 dagers vekstperiode ved 30° C blir myceliet dyrket i 30 ml medium vasket med saltvann og overført til 50 ml hovedkultiveringsmedium (MCM). Denne kulturen blir dyrket ved 30° C i en orbitalrister ved 100 rpm. Sammensetningen av MCM er pr. liter medium, glukose (5 %), pektin (72,8 *; 0,156), NH4N03(0,75 *), KH2P04(0,5 FeS047H20 (0,03 %) , MgS047H20 (0,03 %), CaC03(0,03 K>), NaN03(0,03<g>) pH 4,5. Prøver er blitt tatt ut i løpet av 24 timer ved forskjellige tidsintervaller og analysert ved SDS polyakrylamidgelelektroforese. Ekspresjon av pelD er allerede maksimal i løpet av de første 7 timene av dyrkingen. Proteinet vandrer identisk med PLI anvendt som en referanse.

Eksempel 5. 6.: Pektinlyase A- produks. ion ved transformert

A. niger- stamme A15 og ved A. niger N400

De dialyserte kulturfiltratene (eksempel 5.4.) blir lyofilisert, resuspendert i 0,2 ml destillert vann og utsatt for SDS-polyakrylamidgelelektroforese (10 % geler) ved anvendelse av standardmetoder (Laemmli, ref. 15). De separerte protein ene blir overført til nitrocellulose (Towbin et al.. ref 16). Blottene blir mettet i 5 timer ved romtemperatur med en 1 % BSA-oppløsning i 10 mM-Tris-HCl-buf f er pH 7,5 med 0,35 M NaCl. Dette blir etterfulgt av en inkubasjon i 16 t ved romtemperatur med polyklonalt antistoff (0,1 %) fremstilt mot to pektinlyaser renset ifølge van Houdehoven (1975) i 50 ml av den samme bufferen inneholdende 150 mM NaCl, 0,5 % BSAm 1 % Tri ton X100, 0,5 % deoksykolat og 0,1 % SDS. Blottene blir deretter skylt 5 ganger med 200 ml PBS før inkubasjon med 30 pl geit anti-kanin IgG-HRP (Sigma) som 2. antistoff pr. 50 ml og vasket på ny 5 ganger med PBS. Blottene blir til slutt farget ved anvendelse av 4-klor-l-naftol som et substrat. 40 mg av substratet blir løst i 0,5 ml 96 # etanol og blandet med 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5 og 30 pl 30 % hydrogenperoksyd og deretter satt til blottene.

Eksempel 5. 7.: Screening av pelA- transformerte stammer ved ring- dannelse på pektin- inneholdende fast media

Konidier av pelA-transformerte stammer blir inokulert ved en sporetetthet på omtrent 40 kolonier pr. petriskål på sterile papirfiltre (Schleicher og Schuell) som blir puttet på toppen av 1 % agar-stivnet minimalmedium inneholdende 0,01 % Triton-X100 og eplepektin (1 %, 72,8 # obipektin) som karbonkilde. Inkubasjonsperioden er 72 t ved 30°C resulterende i individuelle kolonier (2-4 mm). Papirfilteret blir overført til en annen steril petriskål og den mediuminneholdende skålen blir farget med minst 5 ml av en rutheniumrød (0,1 % w/v) opp-løsning i destillert vann, inkubert i 2 t og deretter vasket flere ganger med destillert vann for å fjerne ikke-adsorbert fargemateriale, ifølge en prosedyre beskrevet av Ried og Collmer (ref. 17) for polygalakturonat for å karakterisere bakterielle pektatlyaseenzymaktiviteter.

Transformanter som overproduserer PL A-protein blir påvist ved en økning i ring-diameter rundt de individuelle koloniene sammenlignet med foreldrestamme N400.

Eksempel 6.: Isolasjon, rensing og karakterisering av pektinlyase A ( PLA) fra A. niger pelA-transformant A15

Eksempel 6. 1.: Dyrkingsbetingelser for å preparere

pektinlyase A

A. niger Pel A-transformant A15 beskrevet i eksempel 5 blir dyrket på fullstendig medium i Petri-skåler i 3 dager ved 28°C for å produsere konidier. Konidier blir høstet fra disse skålene ved suspendering av sporene i 5 ml sterilt saltvann inneholdende 0,005 % Tween 80. Suspensjonen blir betraktelig ristet på en Griffin-rister i 20 min. Minimalmedium (ref. 21) inneholdende 1 % (w/v) eplepektin (Brown Ribbon, 72,8 %>; Obipektin AG, Bischofzell) blir inokulert ved en sporetetthet på 10^ sporer/ml ved anvendelse av 250 ml medium ill silikoniserte Erlenmeyer-kolber. Myceliet blir dyrket i 40 t ved 30° C ved anvendelse av en Gallenkamp orbitalrister ved 200 rpm. Etter dyrking blir myceliet fjernet ved filtrering over Miracloth ved anvendelse av en Biichner-trakt. Kulturfiltratet (ref. 21) blir fortynnet med destillert vann (ref. 21), pH til filtratet (pH 3,7) blir satt til pH 6,0 ved anvendelse av 1 N NaOH og deretter filtrert på nytt ved anvendelse av Whatman 1 filterpapir.

Eksempel 6. 2.: Rensing av PLA

Det fortynnede kulturfiltratet (4 1) blir applisert på en DEAE-sefarose Fast Flow-(Pharmacia)kolonne (10 cm x 2,6 cm), pre-ekvilibrert med 20 mM natriumfosfatbuffer pH 6,0. Kolonnen blir eluert med samme buffer helt til absorbansen ved 280 nm når en verdi på <0,1 O.D. Pektinlyaseaktiviteten blir deretter eluert fra kolonnen ved påføring av en lineær gradient bestående av 20 mM natriumfosfatbuffer (150 ml) og 20 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 1 M NaCl (150 ml).

Fraksjoner blir analysert for tilstedeværelse av aktivt pektinlyase ifølge prosedyren beskrevet av van Houdenhoven (ref. 18 s. 11) ved anvendelse av Brown Ribbon pektin (72,8 %) som et substrat. Aktiviteten fremkommer rundt en konsentrasjon på 0,43 M NaCl i saltgradienten. Aktive fraksjoner blir deretter slått sammen og dialysert to ganger mot 1 1 20 mM piperazin HCl-buffer pH 5,5 (prøvestørrelse: 45,5 ml).

I det neste trinnet blir den dialyserte prøven fordelt i 3 porsjoner med lik størrelse og utsatt for anionbyttekromato-grafi i tre separate kjøringer ved anvendelse av en standard Pharmacia MONO Q-kolonne i kombinasjon med Pharmacia FPLC-systemet. Kolonnen blir pre-ekvilibrert med 20 mM piperazin-HCl-buffer pH 5,5. Etter applisering av enzymprøven blir kolonnen eluert med samme buffer med en strømningshastighet på 1 ml/min helt til base-linjeabsorbans blir igjen oppnådd. Deretter blir en lineær saltgradient anvendt. I løpet av 22 ml av elueringsbufferen påført kolonnen blir en finalkonsentrasjon på 0,6 M NaCl oppnådd.

Den aktive fraksjonen (4,4 ml) blir samlet, fortynnet til 25 ml ved anvendelse av ekvilibreringsbuffer og den samme kromatografiprosedyren blir gjentatt.

To fraksjoner inneholdende det aktive enzymet (totalt volum 3 ml) blir deretter dialysert mot en 25 mM piperazinbuf f er pH 5,0 og injisert i 1 ml porsjoner på en MONO P-kolonne (Pharmacia), pre-ekvilibrert med samme buffer. Etter in-jeksjonene blir en pH-gradient dannet ved anvendelse av en 5 % oppløsning av polybuffer TM 74 (i destillert vann innsett på pH 3,0 ved anvendelse av 4 N HC1). Det aktive enzymet (3,2 ml) fremkommer rundt pH 3,2. Prepareringen blir omfattende dialysert mot 50 mM natriumfosfatbuffer pH 6,0 og lagret ved

-20°C. Rensingsresultåtene er oppsummert i tabell Vila og blir sammenlignet med dataene fra en lignende rensing for pektinlyase produsert av A. niger-stamme N400 (tabell VIIb).

Proteinkonsentrasjoner er blitt bestemt ved anvendelse av BCA-proteinanalysereagens (Pierce) ifølge instruksjoner til fremstilleren.

Sammenlignet med villtypetotalaktiviteten har totalaktivitet-en til A. niger N592 transformert med pGW820 øket etter rensingen omtrent 10 ganger og den spesifikke aktiviteten omtrent 3 ganger.

Eksempel 6. 3.: Aminosvresekvensbestemming av den N-terminale delen av pektinlyase A

500 pg pektinlyase (PLA), renset ifølge eksempel 6.2. blir dialysert tre ganger mot 1 1 millipor filtrert destillert vann og lyofilisert. Aminosyresekvenser blir bestemt med en Applied Biosystems model 470A proteinsekvensator, on-line koblet til en 120 A PTH-analysator, ifølge metoden beskrevet av Hunkapiller (ref. 17).

Følgende N-terminale aminosyresekvens ble bestemt for enzymet: VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLY-PHE-ALA-GLU-7-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA.

Aminosyresekvensen bestemt på denne måten korresponderer nøyaktig med den som er basert på nukleotidsekvensen til pelA-genet (se eksempel 4.2.).

Eksempel 6. 4.: Pektinlyase A- egenskaper

Både A. niger-stammen N400 og pel A-tr ans f ormant A15 blir dyrket som beskrevet i eksempel 6.1. og enzymet blir renset fra kulturfiltratet ifølge fremgangsmåten i eksempel 6.2. De to enzympreparatene tilveiebrakt på denne måten er blitt sammenlignet med pektinlyase II som er blitt renset ifølge van Houdenhoven (ref. 18).

SDS-polyakrylamid gelelektroforese, ved anvendelse av 10 % geler, resulterer i et enkelt bånd med identisk molekylvekt i alle tre tilfeller ved applisering i hvert tilfelle av 2-5 pg protein.

Isoelektrisk fokusering er blitt utført ved anvendelse av standardprosedyrer (se f.eks. instruksjonshefte til Pharmacia, Isoelectric Focussing, 1982). En FSBE-300 apparatur og korresponderende elektrisitetstilføreren ECPS 3000/150 (Pharmacia) er blitt anvendt. Tilveiebrakt PLA er homogen ved isoelektrisk fokusering og har et lavere isoelektrisk punkt (0,2 pH enheter) enn PLII rapportert til å være 3,75 ifølge van Eoudenhoven (ref. 18). PLII renset fra N400-kulturfiltratet er heterogen ved isoelektrisk fokusering. Eoved-båndet korresponderer i posisjon med PLA-proteinet. To mindre bånd er blitt skiftet noe mot katoden. I A. niger multikopitransformant A15 mangler de mindre enzymformene som sees i N400.

En direkte sammenligning av de kinetiske parametrene til PLA og PLII, som i det sistnevnte tilfelle ble bestemt av van Eoudenhoven (ref. 18), ved anvendelse av 95 % forestret eplepektin som substrat indikerer identiske Km og Vmax-verdier for begge enzymer.

Eksempel 7.: Isolasjon, rensing og karakterisering av pektinlyase D ( PLD) fra A. Niger pelD-transformant D12

Eksempel 7. 1.: Dyrkingsbetingelser for å preparere

pektinlyase D

A. niger pelD-transformant D12 tilveiebrakt ifølge eksempel 5.2. blir opprinnelig dyrket ifølge eksempel 5.5., i 300 ml aliquoter. Etter en 5 dagers vekstperiode i PCM ved 30°C, blir den mycelholdige maten overført til 20 mM natriumfosfatbuffer (pE 6,0), inneholdende 0,1 M natriumklorid. Ved risting av myceliet i 150 ml på en orbitalrister ved 200 rpm i 2 t, blir det meste av pektinlyasen frigjort i mediet.

Eksempel 7. 2.: Rensing av PLD

Etter fjerning av myceliet ved filtrering, blir enzym-oppløsningen applisert på en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)-kolonne (25 cm x 1,25 cm) preekvilibrert med 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0), inneholdende 0,2 M natriumklorid. Kolonnen blir eluert med samme buffer helt til absorbansen ved 280 nm når en verdi på <0,1. Pektinlyaseaktiviteten blir eluert fra kolonnen ved påføring av en lineær natriumkloridgradient (0,2 til 0,7 M) i 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0) (800 ml totalt volum). Fraksjonene blir screenet for tilstedeværelse av pektinlyase D ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese og Western blotting (Towbin et al., ref. 16) som beskrevet i eksempel 5.6. Fraksjoner inneholdende pektinlyase D blir slått sammen og dialysert mot 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0,15 M natriumklorid, og utsatt for anion-byttekromatografi ved anvendelse av en standard Pharmacia MONO Q-kolonne i kombinasjon med FPLC-systemet. Etter applisering blir kolonnen vasket med samme buffer før påføring av en 50 ml lineær natriumkloridgradient i 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0). Aktive fraksjoner blir samlet og aliquoter på 1 ml ble applisert på en 100 ml Superose-12 gel permeasjonskolonne, ekvilibrert i 20 mM natriumfosfat (pH 6,0) inneholdende 0,2 M natriumklorid og koblet til FPLC-systemet. Aktive enzym-fraksjoner (1 ml hver) tilveiebrakt fra GPC-kolonnen blir analysert ved SDS polyakrylamid gelelektroforese for å undersøke renheten av tilveiebrakt pektinlyase.

Eksempel 7. 3.: Aminosyresekvensbestemmelse av den N-terminale delen av pektinlyase D

500 pg pektinlyase D, renset ifølge eksempel 6.2. blir dialysert tre ganger mot 1 1 millipor filtrert destillert vann og lyofilisert. Aminosyresekvensene blir bestemt med en Applied Biosystems model 470A proteinsekvensator, on-line-koblet til 120A PTH-analysator, ifølge metoden beskrevet av Hunkapillar (ref. 19).

Følgende N-terminale aminosyresekvens ble bestemt for enzymet: VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PEE-ALA-SER-SER-ALA-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA-THR

Aminosyresekvensen som ble bestemt korresponderer nøyaktig med den som er basert på nukleotidsekvensen til pelD-genet.

Eksempel 8. : Isolasjon, rensing og karakterisering av pektinlyase B ( PLB) fra A. niger- transformant B13

Eksempel 8. 1.: Dyrkingsbetingelser for å preparere

pektinlyase B

A. niger pelB-transformant B13, tilveiebrakt ifølge eksempel 5.2., blir analysert for multikopikarakter ifølge 5.3. Northern blot-analyse, ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5.4., viser at et pektininduserbart mRNA med en lengde på omtrent 1,6 kb blir produsert. Veksten i 35 t ved 30"C i minimalmedium inneholdende 1 # (w/v) citruspektin (72,8 %) og 1 % hvetekli blir anvendt for å produsere enzymet som beskrevet i eksempel 5.4. Enzymet blir også produsert ved anvendelse av et medium bestående av 4 % (w/v) sukkerbønne-masse og 1 % NH4HO3.

Eksempel 8 . 2 . : Rensing av PLB

Kulturfiltratet blir fortynnet to ganger med destillert vann og pH'en blir innstilt på 6,0 ved anvendelse av 1 N NaOE og deretter filtrert på nytt ved anvendelse av Whatman 1 filterpapir. Det fortynnede filtratet (2 1) blir deretter applisert på en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)-kolonne (9 cm x 3,2 cm) som er preekvilibrert med 50 mM natriumacetatbuffer pH 5,0. En del av pektinlyaseaktiviteten er tilstede i eluatet som kan bli analysert ved fremgangsmåten beskrevet av van Eoudenhoven (ref. 18, s. 11) ved anvendelse av Brown Ribbon-pektin (72,8 %) eller meget forestret pektin (94 %). Hovedmengden av pektinlyaseaktiviteten kan elueres ved påføring av en saltgradient. Denne aktiviteten fremkommer i saltgradienten og har vist seg å være identisk med PLA på basis av elueringsatferden og tilsynelatende molekylvekt på SDS-polyakrylamid gelelektroforese, som beskrevet i eksempel 6.

Eluatet fra DEAE Fast Flow-kolonnen blir dialysert mot destillert vann og applisert på en MONO S-kolonne (Pharmacia), som tidligere er blitt ekvilibrert med en 20 mM natriumacetatbuffer pE 4,5. Enzymet blir eluert fra kolonnen ved påføring av en 0 - 1,0 M natriumkloridsaltgradient i samme buffer. Enzymet blir eluert nesten med en gang fra kolonnen. Aktive fraksjoner blir slått sammen og deretter fortynnet 4 ganger med destillert vann. Rekromatografi av enzymoppløsningen resulterer i fraksjoner som på basis av SDS-polyakrylamid gelelektroforese inneholder det rene PLB-proteinet.

Eksempel 8. 3.: Egenskaper til pektinlyase B

Egenskapene til enzymet renset fra pelB-transformant B13 ifølge eksempel 8.2. blir bestemt og sammenlignet med pektinlyase A og D.

SDS polyakrylamid gelelektroforese ved anvendelse av 10 56 geler, resulterer i et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 39,7 kDa. Under de samme betingelsene er de tilsynelatende molekylvektene til PLA og PLD 49,1 kDa og 52,3 kDa respektivt.

Isoelektrisk fokusering blir utført som beskrevet i eksempel 6.4. De isoelektriske punkt til PLB er 6,0 ved anvendelse av en pH-gradient mellom pH 3 og 7. Prøven blir omtrent applisert i en posisjon korresponderende med en pl på 5,0.

Det rensede enzymet PLB er også reaktivt med polyklonale antistoffer dannet mot PLI og PLII som undersøkt ved Western blot-analyser. PLD, A og B, kan med letthet diskrimineres på denne måten ved deres tilsynelatende molekylvektverdier.

Eksempel 8. 4.: Kinetiske egenskaper til PLB

Enzymet renset ifølge eksempel 8.2. blirkarakterisertkinetisk. Enzymet katalyserer en pektinlyasereaksjon og er aktivt over et vidt pE-område (pH 5 - 9,5) som undersøkt i Mc Ilvaine-buf f er (jj = 0,5) med forskjellige pH-verdier (van Eoudenhoven, ref. 18). Den optimale pE-verdien er vid (pE 7,5 - 8,5). Ved pE 6,0 er aktiviteten omtrent 55 56; ved pE 9,5 er dette enda 85 % av aktiviteten ved pH 8,0. Både meget forestret pektin (94 56) samt pektiner med lavere grad av forestring så som Brown Ribbon eplepektin (72 ,8 56; obipektin AG Bischoffzell) kan anvendes som substrat. Den høyeste aktiviteten blir tilveiebrakt med meget forestret pektin. Enzymet reagerer ikke med polygalakturonat.

Pektinlyasereaksjonen katalysert av PLB kan hemmes ved tilsetning av EDTA til reaksjonsblandingen (3 mM finalkonsentrasjon blir anvendt); enzymet blir reaktivert ved tilsetning av overskudd Ca<2+->ioner. pelB koder dermed for en Ca<2+->avhengig pektinlyase. Ved 25°C har enzymet et omtrentlig "turn-over"-tall på 6 500 og en Km-verdi på 2,5 mM ved anvendelse av et meget forestret pektin som et substrat. Disse verdiene blir bestemt ifølge fremgangsmåten til van Houdenhoven (ref. 18) ved anvendelse av en Mc Ilvaine-buffer ved pE 8,0 (p = 0,5).

Eksempel 9: Ekspresjon og utskilling av fremmede gener

under kontroll av pelA- promotoren

3,9 kb HindiII-fragmentet til plasmidet pGW820 blir subklonet inn i Eindlll-setet til pBR322. Plasmidet DNA til ampicillin-resistente transformanter blir analysert ved Eindlll og Sall-restriksjonsspaltninger. En klon som inneholder pelA-innskuddet i klokkeretning orientering blir betegnet pGW822. Den induserbare promotoren til pelA blir anvendt for å uttrykke fremmede gener i A. niger. Eele pelA-genet er tilstede i plasmid pGW822. Promotoren og pelA-signalsekvensen er på et 1 kb BamEI-Pstl-fragment. Pstl-spaltningssete ved nukleotidposisjon 1420 (fig. 10) faller sammen med 3'-enden av signalsekvensen og kan anvendes for i rammefusjonen til den kodende sekvensen til et fremmed protein. Transkripsjons-termineringssignalene til pelA er på et 1,3 kb Sall-Eindlll-fragment.

Eksempel 9. 1: Subkloning av pelA- genet i vektor pUC19

3,3 kb BamEI-EindIII-fragmentet til plasmid pGW822 inneholder pelA-genet. Dette fragmentet blir klonet i vektoren pUC19 (Pharmacia) kuttet med BamEI og Hindlll. De rensede fragmentene blir ligert. En aliquot av ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere Ca<2+->behandlede, kompetente JM109-celler. Vellykket kloning av 3,3 kb BamHI-EindIII-fragmentet inn i pUC19 blir selektert for på ampicillinskåler i nærvær av X-Gal og IPTG (T. Maniatis et al. i "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 52). Hvite, ampicillin-resistente transformanter blir plukket. Plasmid DNA fra disse koloniene blir analysert ved

BamHI/Hindlll-dobbeltspaltning. En transformant med et korrekt innskudd blir betegnet pTJC19/pelA. En analog konstruksjon med pUC18 resulterer i pUC18/pelA.

Eksempel 9. 2: Ekspresjon av humant hybridinterferon BDBB

under kontroll av pelA- promotoren

Eksempel 9. 2. 1: Konstruksjon av plasmid pUC19/ pelA- IFN

AM119 ( se fig. 14)

Plasmid pUC19/pelA blir spaltet med Sali. De klebrige endene til det lineære fragmentet blir ifylt i en reaksjon med Klenow DNA polymerase I (BRL) i nærvær av 0,1 mM av hver av dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 60 mM Tris'HCl pE 7,5, 10 mM MgCl2i 30 min ved romtemperatur. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av EDTA til en f inalkonsentrasjon på 12,5 mM. DNA'et blir utfelt med etanol. Det lineære DNA-fragmentet blir spaltet med Pstl. Etter fenol/kloroform-ekstraksjon blir DNA'et utfelt med etanol.

En oligodesoksynukleotidlinker med formel

blir ligert til Pstl-setet i et linearisert plasmid. Linkeren fyller i den 3' tilbaketrukne enden til Pstl-setet som faller sammen med enden til<p>elA-signalsekvensen og som danner i rammefusjonen til den kodende sekvensen til interferon BDBB. (I) representerer den 5'-terminale nukleotidsekvensen til interferon BDBB-genet opp til Ddel-restriksjonssetet. 200 pmol av hver av oligonukleotidene (I) og (II) blir fosforylert og smeltet sammen. Pstl kuttet pUC19/pelA-plasmid og et 100-ganger molart overskudd av dobbelt-trådet linker DNA blir ligert i 60 mM Tris'HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT og 400 enheter T4 DNA-ligase i 16 timer ved 15°C. DNA-ligase blir inaktivert ved 10 min ved 85°C. Linkere i overskudd blir fjernet ved utfelling i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 volum isopropanol.

Det store, 5 kb-fragmentet blir isolert på en preparativ 0,6 % agarosegel. Fragmentet omfatter pelA-promotoren og signalsekvensen (BamHI-[Pstl]/linker) og pelA-terminatoren ([SalI]butt-HindIII) i vektoren pUC19.

Plasmid pJDB207/PH05-IFN AM119 (EP 205404) inneholder genet for hybrid a-interferon BDBB under kontrollen av den regu-lerte promotoren til gjærsyrefosfatase ( PH05). Plasmidet DNA blir spaltet med BamHI og Hindlll. Det 1,3 kb BamHI-HindiII-fragmentet blir isolert, og inneholder PH05-promotoren, den kodende sekvensen til IFN BDBB og PH05 transkripsjons-termineringssekvenser. Fragmentet blir renset ved DE52-kromatografi og etanolutfelling og blir ytterligere spaltet med Taql. De klebrige endene til Taql-restriksjonsfragmentene blir ifylt i en reaksjon med Klenow DNA polymerase I (BRL) i nærvær av 0,1 mM av hver av dCTP og dGTP, 60 mM Tris*HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2i 30 min ved romtemperatur. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av EDTA til en finalkonsentrasjon på 12,5 mM. DNA-fragmentene blir utfelt med etanol og ytterligere spaltet med Ddel. DNA-fragmentene blir separert på en preparativ 0,8 g agarosegel. Det 549 bp Ddel-[Taql]-butte fragmentet blir elektroeluert fra gelen, renset ved DE52 ionebyttekromatografi og etanolutfelling. DNA-fragmentet blir resuspendert i H20 i en konsentrasjon på omtrent 0,1 pmol/pl.

0,2 pmol av 549 bp DdeI-[TaqI]buttende fragmentet og 0,1 pmol av 5 kb vektorfragmentet blir ligert i 10 pl 60 mM Tris*HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 200 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) i 16 timer ved 15°C. En 1 pl aliquot av ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere Ca<2+->behandlede kompetente HBlOl-celler.

Plasmid DNA blir preparert fra 12 ampicillin-resistente transformerte kolonier og analysert ved EcoRI, PvuII, Clal og EcoRI/Hindlll-spaltning. En klon med det ventede restrik-sjonsmønsteret blir valgt. Den korrekte i rammefusjonen av peIA-signalsekvensen og den modne kodende sekvensen til interferon BDBB blir verifisert ved DNA-sekvensering. Plasmid DNA fra den selekterte klonen blir betegnet pUC19/pelA-IFN AM119.

En analog konstruksjon med pUC18/pelA resulterer i plasmid pUC18/pelA-IFN AM119.

Eksempel 9. 2. 2: Kotransformasjon av Aspergillus niger mutant An8 medPCG59D7og pUC19/ pelA- IFN AM119

Uridinanxotroft mutant An8 ( = DSM 3917, beskrevet i EP 88 101 397.3) blir transformert med plasmid pCG59D7 for å tilveiebringe uridinprototrofer. Sammen med det transformerende plasmidet blir ikke-selektivt plasmid pUC19/pelA-IFN AM119 tilsatt for å tilveiebringe tilfeldige kointegranter ved kotransformasjon.

Konidiale sporer fra A. niger An8 blir dyrket i 4 dager ved 28°C i fullstendig medium inntil fullstendig sporulering. 2'10^ konidiespore blir anvendt for å inokulere 200 ml minimalmedium supplementert med lg/l arginin og uridin.

Etter 20 timers vekst ved 28° C og 180 rpm. blir myceliet høstet ved filtrering gjennom Miracloth, vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2og resuspendert i 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et ristende vannbad (30°C, 50 rpm) helt til maksimalt protoplastfrigjøring kan bli påvist mikroskopisk (90 - 120 min). Protoplastsuspensjonen blir filtrert gjennom en glassullplugg i en trakt for å fjerne mycelialt debris. Protoplastene blir pelletert ved svak sentrifugering (10 min, 2 000 r.p.m.) ved romtemperatur og vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2. Protoplastene blir til slutt resuspendert i 200-500 pl 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2for å tilveiebringe en konsentrasjon på 1 x 10<8>/ml.

For transformasjon blir en 200 pl aliquot av protoplast-dispersjonen inkubert med 5 pg pCG59D7 og 10 pg pUC19/pelA-IFN AM119 DNA, 50 pl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 # PEG 6000). Inkubasjonsblandingen blir holdt på is i 20 min, ytterligere 2 ml PCT blir tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min ved romtemperatur. 4 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2blir tilsatt og 1 ml aliquoter av den endelige trans-formasjonsoppløsningen blir blandet med lignifisert minimal agarmedium (minimalmedium + 1 g/l arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)), stabilisert med 0,8 M KC1. Blandingene blir med en gang helt på agarskåler med samme medium og inkubert med 28°C.

Etter 2-3 dagers vekst ved 28°C, fremkommer stabile transformanter som hurtigvoksende og sporulerende kolonier på en bakgrunnsvekst av mange hundre små antatte aborterende transformanter.

Eksempel 9. 2. 3: Ekspresjon av det hvbride- interferon BDBB-genet under kontroll av pelA- promotoren 37 transformanter fra kotransformasjonseksperimentet (eksempel 9.2.2) blir plukket og analysert for interferonekspresjon. Interferonaktiviteten blir bestemt ifølge fremgangsmåten til Armstrong. (J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 2_1, 732 (1971)) ved anvendelse av humane CCL-23-celler og vesikuløs stomatitisvirus (VSV) som utfordrende virus.

Konidiale sporer fra transformanter blir individuelt fordyrket inn i 50 ml av et fordyrket medium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH4C1 2 g/l, KH2P040,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg2S04x 7 H20 0,5 g/l, Ca2S04x 2 H20 0,5 g/l, pH 7,0). Forkulturen blir inkubert i 72 timer ved 250 rpm og 28° C. 10 i av forkulturen blir anvendt for å inokulere 50 ml hovedkulturmedium (Soyabønnemel 20 g/l, pektin Slow Set 5 g/l). Kulturen blir dyrket opp til 72-96 timer ved 250 rpm og 28"C.

Ved forskjellige tidspunkter (hver 20. time) blir prøver tatt ut, cellene pelletert ved sentrifugering og ødelagt ved ultrasonisk desintegrasjon. Supernatanten og celleekstraktene blir begge undersøkt for interferonaktivitet som beskrevet ovenfor. Hovedvekten av interferonaktivitet blir utskilt i mediet.

Eksempel 10: Konstruksjon av plasmid M13(+) KS/ pelAAss-IFN AM119

2,8 kb ekspresjonskassetten til plasmid M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 omfatter den induserbare pelA-promotoren. den kodende sekvensen til hybridinterferon BDBB og pelA-transkripsjons-terminatoren på Bluescript M13(+)KS-vektoren. Hybridinterferon BDBB vil bli uttrykt og beliggende i vertscellen. Plasmid M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 er avledet fra pUC18/pelA-IFN AM119 (se eksempel 9.2.1). pelA-signalsekvensen (ss) blir "looped out" ved sete-rettet mutagenese (se fig. 15). Hybridinterferon uttrykt fra konstruksjonen uten signalsekvens ventes å være beliggende i cytosolen.

Eksempel 10. 1: Subkloning av pelA- IFN AMI19- kassetten inn

i Bluescript M13(+) KS- vektoren

Plasmid pUC18/pelA-IFN AM119 (se eksempel 9.2.1) blir spaltet med BamHI og Hindlll. 2,8 kb BamHI-HindiII-fragmentet inneholder pelA-promotoren. signalsekvensen, IFN BDBB-kodende sekvensen og pelA-terminatoren. BamHI-HindiII-fragmentet blir isolert og ligert til Bluescript M13(+)KS (Stratagene)-vektorene, kuttet med BamHI og Hindlll. En aliquot av ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere Ca<2+->behandlede, kompetente JM109-celler. Vellykket kloning av 2,8 kb BamHI-HindiII-fragmentet inn i M13(+)KS blir selektert for på ampicillinskåler i nærvær av X-Gal og IPTG. 12 hvite, ampicillinresistente kolonier blir plukket. Plasmid DNA fra disse koloniene blir analysert ved BamHI/Bglll-dobbeltspaltning. En transformant med riktig innskudd blir betegnet M13(+)KS/pelA-IFN AM119.

Eksempel 10. 2: Isolering av enkelttrådet DNA fra celler

inneholdende Bluescript M13(+) KS- plasmidet

Plasmid M13(+)KS/pelA-IFN AM119 blir anvendt for å transformere kompetent E. coli-stamme CJ236 (dut-1, ung-1. thi-1, relA-1;pCJ105(Cm<r>): BIO-RAD Muta-gen M13 in vitro mutagenese-kit). Denne stammen tillater inkorporering av uracil inn i DNA'et. CJ236 blir dyrket i 10 ml LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. Ved en OD^qq på 0,5 blir cellene super-infisert med fag M13K07 (Mead et al. ref. 29) ved en in-feksjonsmultiplisitet på 50. Etter en time ved 37°C blir kanamycin (50 mg/l) tilsatt og kulturen inkubert ved 37°C på en rister i 5 til 6 timer. Den ikke-kodende tråden med hensyn til<p>elA-IFN AMI19-innskuddet av plasmid M13( + )KS/pelA-IFN AM119 blir syntetisert, pakket og frigjort i mediet. Enkelttrådet DNA blir preparert fra kultursupernatanten ifølge Kunkel et al. (ref. 30).

Eksempel 10. 3: Sete- rettet oligonukleotidmutagenese på

enkelttrådet DNA- template

Sete-rettet delesjonsmutagenese blir utført på ikke-kodende enkelttrådet pelA-IFN AM119-templat for å "loop out" pelA-signalsekvensen (fig. 15).

Den mutagene primeren omfatter en del av pelA-promotorsekvensen omfattende ATG (nukleotidposisjon 1343 til 1363 i fig. 10) og 21 nukleotider kodende for aminosyrene 1 til 7 av modent IFN BDBB.

For mutagenesen blir 200 pmol av den mutagene primeren fosforylert i 20 pl 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 0,5 mM ATP ved anvendelse av 8 enheter T4-poly-nukleotidkinase (Boehringer). Etter en time ved 37"C blir reaksjonen stoppet ved oppvarming til 65°C i 10 min.

0,2 pmol av enkelttrådet templat blir inkubert med 10 pmol fosforylert mutagent oligodeoksyribonukleotid-primer og 10 pmol universal M13 sekvenseringsprimer i 30 pl 20 mM Tris"HCl pH 7,5, 10 mM MgClg, 50 mM NaCl, 1 mM DTT ved 80°C i 5 min. Oppløsningen blir sakte avkjølt til romtemperatur over en periode på 30 min. Til den sammensmeltede blandingen blir 10 pl enzym-dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) -oppløsning tilsatt, inneholdende 1 pl buffer [0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2], 5 pl 2 mM dNtp-blanding, 0,5 ml 20 mM ATP, 1 pl 0,2 M DTT, 0,5 pl T4DNA-ligase (Biolabs, 400 U/pl) og 1,2 pl Klenow DNA-polymerase (BRL, 5 U/pl). Blandingen blir inkubert ved 15°C i 16 timer. Reaksjonen stoppes ved inkubasjon ved 65°C i 10 min. 1 pl og 3 pl av ligeringsblandingen blir anvendt for å transformere 0,2 ml kompetente celler av reparer-minus-stammen E. coli MV1190 [a( lac- proAB). thi.supE.a(srl-recA)306: :Tnl0(tetr) (F':traD36,<p>roAB. lac I<<>lZAM15)]. Stammen MV1190 er beskrevet i manualen for BIO-RAD MUTA-GEN M13 in vitro-mutågenesekit. 12 ampicillinresistente kolonier blir plukket. Plasmid DNA blir preparert og analysert ved Scal-spaltning. Vellykket "loop-out" av<p>elA-si<g>nalsekvensen fjernet Scal-setet. Korrekte plasmider blir linearisert ved Scal-setet i Bluescript-vektoren. Et plasmid blir ytterligere analysert. Den riktige grensen mellom pelA-promotoren og den kodende sekvensen for hybrid IFN BDBB med ATG innbefattet, blir bekreftet ved DNA-sekvensering. En korrekt konstruksjon blir betegnet M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119.

Eksempel 10. 4: Kotransformasjon av A. niger og ekspresjon

av hybridinterferon

Plasmider M13( + )KS/pelAAss-IFN AM119 og pCG59D7 blir anvendt for å kotransformere A. niger-mutant An8 ifølge eksempel 8.2.2. Transformanter blir dyrket som beskrevet i eksempel 8.2.3. Forskjellige tidspunkter (hver 20. time) blir prøver tatt ut, cellene pelletert ved sentrifugering og knust ved ultrasonisk desintegrasjon. Celleekstraktene blir testet for interferonaktivitet (ovenfor). Hovedvekten av interferonaktiviteten finnes intracellulært.

Deponering av mikroorganismer

Følgende mikroorganismer ble deponert under Budapest Treaty til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig:

Referanser

1. Yelton, M.M., Hamer, J.E. and Timberlake, W.E. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1470-1474. 2. Frischauf, A.M., Lehrach, H. , Poustra, A. and Murray, N. (1983) J.Moi. Biol. 170, 827-842. 3. Karn, J., Brenner, S. , Barneff, L. and Cesareni, G.

(1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5172-5176. 4. Benton, W.D. and Davis, R."W. (1977) Science 196, 180-182. 5. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) i: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Harbor, New York. 6. BRL. M13 cloning/dideoxy sequencing instruction manual. 7. Dente, L. , Casareni, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 1645-1655. 8. Dente, L. , Sollazzo, M. , Baldari, C, G. Cesareni and R. Cortese i: DNA Cloning vol. 1. a practical approach ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford 1985. 9. Russell, M., Kidd, S. and Kelley, M.R. (1986) Gene 45, 333-338. 10. Caruther, M.H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).

11. Ballance, D.J. (1986) Yeast 2, 229-236.

12. Goosen, T. , Bloemheuvel, G. , Gysler, Ch. , de Bier, D.A., van den Broek, H.W.J, and Swart, K. (1987) Current Genetlcs 11, 499-503. 13. Boeke, J.D., Lacroute, F. and Fink, G.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 191, 345-346. 14. Slater, R.J. (1984) i: Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J.M. Walker, The Humana Press Inc.

14a. Hinnen A., Hicks J.B. & Fink G.R. (1978) Proe. Nati.

Acad. Sei. USA 75, 1929-1933.

15. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227. 681-682.

16. Towbin, H. , Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 4350-4354. 17. Ried, J.L. and Collmer, A. (1985) Applied and Environm. Microbiol. 50» 615-622. 18. van Houdenhoven, F.E.A. (1975) Ph.D. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands. 19. Hunkapiller, M.W. (1985) PTH Amino Acid Analysis, User Bulletin no. 14 Applied Biosystems. 20. Zissler, J. et al. (1971) i: The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Labs, New York, A.D. Hersley editor. 21. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106. 22. F.E.A. von Houdenhoven. Ph.D. Thesius Agricultural University, Wageningen in Communications Agricultural University Wageningen, The Netherlands 75-13 (1975). 23. Birnboim H.C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523. 24. Boel E. , Hansen M.T. , Hjort I., Hoegh I., Fiil N.P.

(1984). EMBO J. 3, 1581-1585.

25. Mount S.M. (1982). Nucleic Acids Res. 10. 459-472.

26. Ballance D.J. and Turner G. (1985), Gene 36, 321-331. 27. Hermersdorfer H, Leuchtenberger A, Wardsack Ch and Ruttloff H (1907). Influence of culture conditions on mycelial structure and polygalacturonase synthesis of A. niger. J. Basic Microbiol. 27, 309-315.

28. Henikoff, S. (1984) Gerne 28, 351-359.

29. Mead et al., (1986) Protein Engeneering 1, 67.

30. Kunkel et al., (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 485.

Claims (33)

1. Rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens kodende for pektinlyasene pelA (fig. 10; DSM4388); pektinlyase pelB (fig. 11; DSM4389); pektinlyase pelC (fig. 12; DSM4390); pelE oppnåelig ved ekspresjon av pelE innbefattet i pGW880 (fig. 5; DSM 4392) eller pelF oppnåelig ved ekspresjon av pelF innbefattet i pGW860 (fig. 6; DSM 4391) eller funksjonelle deler derav eller DNA sekvenser som er degenererte i henhold til den genetiske koden, eventuelt omfattende promotoren, signalsekvensen, det strukturelle genet eller terminatoren til et hvilke som helst av pektinlyase genene eller en hvilken som helst kombinasjon av disse fragmentene eller er en rekombinant hybridvektor omfattende et strukturelt gen heterologt med Aspergillus niger.

2. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens som angitt i figur 10 eller funksjonelle deler derav som definert i krav 1.

3. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens som angitt i figur 11 eller funksjonelle deler derav som definert i krav 1.

4. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens som angitt i figur 12 eller funksjonelle deler derav som definert i krav 1.

5. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pGW820 (DSM 4388).

6. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pGW830 (DSM 4389).

7. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pGW850 (DSM 4390).

8. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pGW880 (DSM 4392).

9. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er pGW860 (DSM 4391).

10. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter et fragment utgående mellom to restriksjonsseter til plasmid pGW820 (DSM 4388), pGW820 (DSM 4389), pGW850 (DSM 4390), pGW880 (DSM 4392) eller pGW860 (DSM 4391) og med beholdt promoter, signal, strukturelle eller terminatorfunksjoner eller en kombinasjon av slike fragmenter.

11. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter promotorsekvensen til pelA.

12. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter promotorsekvensen til pelA. pelB.pelC. pelE eller pelF.

13. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter signalsekvensen til pelA. pelB.pelC.pelE eller pelF.

14. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter det strukturelle genet til pelA. pelB. pelC. pelE eller pelF.

15. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter de strukturelle genet pelA. pelB. pelC. pelE eller pelF uten introner.

16. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter terminatoren til pelA. pelB. pelC.pelE eller pelF.

17. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er en hybrid vektor omfattende det heterologe strukturelle genet kodende for hybridinterferon BDBB.

18. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er den rekombinante hybride vektoren pUC19/pelA-IFN AM119.

19. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er den rekombinante hybride vektoren M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119.

20. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det er den rekombinante hybride vektoren M13(+)KS/pelA-IFN AM119.

21. Transformert vertscelle,karakterisert vedat den inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

22. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Escherichia coli HB 101/pGW820 (DSM 4388).

23. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Escherichia coli HB 101/pGW830 (DSM 4389).

24. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisert vedat den er Escherichia coli HB 101/pGW850 (DSM 4390).

25. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Escherichia coli HB 101/pGW860 (DSM 4391).

26. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisert vedat den er Escherichia coli HB 101/pGW880 (DSM 4392).

27. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1 og seleksjonsmarkørplasmidet pCG59D7 (DSM 3968).

28. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisert vedat den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med pUC19/pelA-IFN AM119 og seleksjonsmarkør-plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

29. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med M13( +)KS/pelAAss-IFN AM119 og seleksjonsmarkør-plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

30. Transformert vert ifølge krav 21,karakterisertved at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformert med M13(+)KS/pelA-IFN AM119 og seleksjonsmarkørplasmid pCG59D7 (DSM 3968).

31. Anvendelse av rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, for overproduksjonen av pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i Aspergillus-arter ved å dyrke en Aspergillusvert transformert med en ekspresjonshybridvektor for ekspresjon av nevnte pektinlyaser.

32. Anvendelse av hybridvektor ifølge krav 1, for produksjonen av hybridinterferon BDBB i Aspergillus-arter, ved å dyrke en Aspergillusvert transformert med en ekspresjonshybridvektor for ekspresjon av nevnte hybridinterferon.

33. Pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF, i ren form ifølge fig.10, fig. 11, fig. 12, fig. 5 og fig. 6,karakterisert vedat de oppnås ved transformering av en vert som ikke har evne for å uttrykke noe pektinlyase med en vert som ikke har evne for å uttrykke noe pektinlyase med et rekombinant DNA molekyl ifølge krav 1 og isolering av nevnte pektinlyaser.