JPS63146790A - ペクチン酸リア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明はエルビニア・カロトポーラ・サブスピーシス・
カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　−ｃａｒｏｔｏｖｏｒ
ａ・５ｕｂｓｐ　　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）ＥＣ−１由
来のペクチン酸リアーゼ遺伝子を含むプラスミドにより
形質転換された大腸菌によるペクチン酸リアーゼの製造
法に関する。特に、当該酵素は当該酵素の有するペクチ
ン質分解活性により、緑色植物からの緑色飲料や緑色食
品素材への応用に適用される。

［従来の技術］ ペクチナーゼ類は食品分野においてジュースの清澄等に
用いられている。従来利用されてきたペクチナーゼ類は
糸状菌の生産するペクチンリアーゼやポリガラクッロナ
ーゼであり、細菌の生産するペクチン酸リアーゼを工業
的かつ効果的に生産する技術は未だ確立されていない。

また、ペクチナーゼを食品加工に用いる際、特に注意し
なければならない点は、植物体中に存在するペクチン質
が部分的にメチルエステルとなっている点である。

ペクチナーゼを生産する微生物はほとんどの場合、植物
病原菌であるが、これらの多くはメチルエステルに作用
してメチルアルコールを遊離するメチルエステラーゼを
有することが知られている。

従って、これらの粗抽出液をそのまま食品工業へ応用す
ることは大変危険である。また、各種精製操作を行うと
しても多大の労力を要し、工業的生産には大きな制約と
なる。

更に、ペクチナーゼ生産菌である植物病原菌をこれら酵
素の工業的生産菌として使用するには植物防疫上能しい
点が多い。特に、これらの菌の生産分泌する物質につい
ての安全性についてはほとんど知見が得られていない。

一方、遺伝子操作受容菌として広く用いられている大腸
菌は、古くからよく研究されており、各種有用物質の生
産に適していることが、種々の角度から報告されている
。

［発明の目的］ 本発明のペクチン酸リアーゼは主に食品加工への適用を
目的とする。さらに詳しくはペクチン酸リアーゼ遺伝子
を含む組換えプラスミドおよびこの組み換えプラスミド
を導入した大腸菌を使ってペクチン酸リアーゼを安価に
、かつ、食品加工用として安全なものを生産する方法を
提供するものである。

当該酵素は緑色植物のペクチン質の可溶化に適用される
。すなわち植物のペクチン質は主にＤ−ガラクツロン酸
のα１−４結合から成る酸性多糖である。当該酵素は、
二のペクチン質を分解する酵素であり、当該酵素の使用
により、緑色植物を従来の物理的、化学的手法による加
工よりもマイルドな条件で緑色飲料、緑色食品素材を提
供できる。

［発明の構成］ すなわち、本発明はペクチン酸リアーゼをコードする遺
伝子をプラスミドベクター上に持つ大腸菌を培養し、ペ
クチン酸リアーゼを採取することを特徴とするペクチン
酸リアーゼの製造法を提供するものである。本発明に用
いるペクチン酸リアーゼを生産する大腸菌は次の様にし
て創製することができる。

ペクチン酸リアーゼ遺伝子のＤＮＡドナーは軟腐性植物
病原菌で、より好ましくはエルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ
）属細菌を用いる。エルビニア属細菌はペクチン酸リア
ーゼを菌体外に分泌する細菌として知られている。該菌
体からＤＮＡを分離、調製し、これを制限酵素ＰＳｔ　
Ｉで分解する。一方、本発明に用いるベクターＤＮＡに
ついては特に限定しないが、大腸菌で複製可能なもので
あれば如何なるものでも使用可能である。

例えば市販のプラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｐｓｔ
ｌで完全分解し、これに先の染色体断片を混合し更に、
Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いる通常の方法で結合すること
ができる。この際、ベクターの自己環化を抑制するため
、ベクターの制限末端をアルカリ・ホスファターゼ処理
し、リン酸残基を除去することが好ましい。作成した組
換え体ＤＮＡは通常の形質転換処理で宿主大腸菌Ｃ６０
０内に導入する。形質転換株より、テトラサイタリン耐
性でかつ、ペクチン酸リアーゼを生産する形質転換体Ｐ
Ｏ１２を得た。更に、形質転換体Ｐ０１２よりプラスミ
ドを抽出し、制限酵素Ｐｓｔ　Ｔで完全分解することに
より、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２の断片の他に、
約２ｋｂと約７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この２つの断
片を文献ｌの方法に従い分離し、前記と同様の方法、す
なわち、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２に結合、形質
転換し各断片を持つ形質転換体を得た。活性測定により
、約７ｋｂのＤＮＡ断片上にペクチン酸リアーゼ遺伝子
があることを確認した。この断片を制限酵素１１ｉｎｄ
　ＩＩＩで完全分解、制限酵素５ａｕ３Ａ　ｌで部分分
解したものをベクタープラスミドｐＢＲ３２２に連結し
た。

作成した組換え体ＤＮＡを宿主大腸菌Ｃ６００に導入し
、形質転換した。

形質転換株より、アンピシリン耐性で、かつ、ペクチン
酸リアーゼを生産する形質転換体のうち最少のプラスミ
ドを有する形質転換体、１ＩＢＯ１２を得た。

１１ＢＯ１２より得られたプラスミドｐＨＢＯ１２の制
限酵素地図は第２図に示されるが、白ぬきの部分はベク
ターｐＢＲ３２２由来で黒点の部分は染色体断片部分で
ある。このクローン化された断片の大きさは約２．７ｋ
ｂである。ここで得られた形質転換体ＩＩ　Ｂ　０１２
はペクチン酸リアーゼを効率よく生産し、また菌体外に
分泌するというすぐれた大腸菌である。

本発明のペクチン酸リアーゼ生産法は上記形質転換体１
１ＢＯ１２を液体培養することにより行われる。

その場合、培地として、コーンプラン、コンスティープ
リカーを栄養源として用いた場合、特に、ペクチン酸リ
アーゼ活性がＤＮＡ供与菌であるエルビニア・カロトボ
ーラ・サプスピーシス・カロトボーラＥＣ−１より３．
５〜６倍高い。すなわち、本発明におけるＩＩＢＯ１２
はペクチン酸リアーゼを外分泌する特徴を有し、更に、
安価な栄養源で高生産する。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （１）エルビニア属細菌からの染色体ＤＮＡの調製細菌
種として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子を含むエルビニア
・力ロトポーラ・サブスピーシス・力ロトボーラＥＣ−
１株を供用した。この株を、ＬＢ壇地（ｌχ　トリプト
ン、０．５χ酵母エキス、１χ塩化ナトリウム）　８０
ｍ１で、２８℃−晩培養後、集菌した。以後文献２の方
法により、染色体ＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩで分解し
た。

（２）プラスミドＤＮＡの調製 ベクタープラスミドｐＢＲ３２２は、大腸菌Ｃ６００内
で複製した。アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び、テトラ
サイクリン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で培養したプ
ラスミド含有菌体を、文献３の方法に従い溶菌し、得ら
れたプラスミドＤＮＡをセシウムクロライド−エチジウ
ムブロマイド密度勾配平衡遠心により精製した。ベクタ
ーとして供するため、制限酵素　ＰｓｔＩで分解した後
、アルカリ・ホスファターゼ処理を施した。

（３）組換えＤＮＡ分子の作成 （１１で得たＤＮＡ断片０．５μｇ、（２）で得たベク
ター１．０　μｇを、ＩＵのＴ、ＤＮＡリガーゼと共に
、１００μｌの１０ｍＭ塩化マグネシウム、　１３ｍＭ
ジチオスレイトール、　　１ｍＭＡＴＰ、　　１ｍＭス
ペルミジン、　　１００ｐ　ｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ　、
　５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ（ｐＨ７，４）の中
で４°Ｃ−晩インキユヘートした後、６８℃で１０分間
加熱して反応を停止した。

（４）形質転換 大腸菌Ｃ６００を２０ｍ１のＬＢ培地で、６００ｎｍ吸
光度０．２２となるまで培養し、集菌後、１０ｍ１の水
冷５０ｍＭ塩化カルシウム溶液に懸濁し、１５分間水中
に放置する。再び集菌後、１ｍｌの水冷塩化カルシウム
溶液に懸濁し、この懸濁液０．２ｍｌに、（３）で得た
反応２ｉ１０Ｉｉｌを添加し、水中に１時間放置した。

３７°Ｃで５分間インキユヘートして、再度水冷後、Ｌ
Ｂ培地１ｍｌを添加して、３７°Ｃで３０分間培養して
、形質転換をおこなった。この形質転換体ミックスを、
テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含む、プレード
ア、セイ培地１（０，５χ　トリプトン、　０．２５χ
酵母エキス、０．５χ塩化ナトリウム、　０．７Ｘペク
チン。

１．５χ寒天）に塗抹し、３７℃で２日間培養した後、
１ｚ臭化セチルトリメチルアンモニウム溶液を培地表面
に流し込んだ。コロニー周辺が透明になった形質転換体
を、直ちにテトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃−晩培養後、シングルコ
ロニーについて、再度上記の性状を確認した。この形質
転換体は、テトラサイクリン耐性、アンピシリン惑受性
であった。さらに、文献４の方法に従ってプラスミドを
抽出し、これで、再度形質転換をおこなうと、上記と同
様の性質を持つ形質転換体が得られることを確認した。

この形質転換体をＰＯ１２と命名し、次項（５）の方法
でペクチン酸リアーゼ活性を調べた。

（５）活性の測定 （４）で得たＰ０１２をテトラサイクリン１２．５　ｐ
　（（／ｍｌを含むＬＢ培地２０ｍ　ｌで３７°Ｃ−晩
培養し、集菌した後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ＋　５
．５　）４ｍｌに懸、濁し、超音波破砕した。

遠心により菌体残香を除き、上澄を酵素液とした。この
酵素液１０μｌに、５ｍｇ／ｍ１ペクチン酸溶液（ｐｔ
１５．５）０．３ｍ１．１ｍＭＣａＣＩｚ　・０．１　
ＭＴｒｉｓ、ＨＣＩ（ｐｌ＋８．５）０．３ｍｌ　、蒸
留水９０μｍを添加し、光路長１０ｍｍの分光光度計用
マイクロセル中、室温で酵素反応をおこなった。反応液
の２３５ｎｍ吸光度を継時的に測定することにより、ペ
クチン酸リアーゼ活性を調べた。活性単位の定義は、１
分間に１ｍｌの反応液の２３５ｎｍ吸光度を０．１増加
させる活性をＩＵとした。

この時、ＰＯ１２のペクチン酸すアーゼ聡活性は、３４
Ｕであった。尚、宿主大腸菌Ｃ６００では、活性は検出
されなかった。

（６）再クローン化 Ｐ０１２から（２）と同様な方法で、プラスミドを抽出
し、制限酵素Ｐｓｔｌで完全分解し電気泳動法によりＤ
ＮＡ切断パターンを調べたところ、ベクタープラスミド
断片の他、約２ｋｂと約７ｋｂのＤＮＡ断片が存在した
。この２つのＤＮＡ断片を、アガロースゲルより、文献
１の方法に従い単離し、＋３１　＋４）と同様な方法を
用い、各断片を持つ形質転換体を得、ペクチン酸リアー
ゼ活性を調べた。その結果、約７ｋｂのＤＮＡ断片上に
、ペクチン酸り７−ゼ遺伝子があることが確認された。

つぎに、この断片を制限酵素ｔｌｉｎｄ　ｍで分解した
。更に、制限酵素５ａｕ３Ａ　Ｉを、ＤＮＡ　１／Ｊｇ
に対し０．ＩＵ加え、３７℃５分間反応した後、６８℃
１０分間加熱して反応を停止した。得られた５ａｕ３Ａ
　１部分分解ミックスを、ベクタープラスミドρＢＲ３
２２を制限酵素Ｈ４ｎｄ　Ｉ［Ｉ及びＢａｍＨＩで分解
したものと混合しく３）と同様にして組換えＤＮＡ分子
を作成した。形質転換をおこない、アンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃−晩培養
後、プレートアッセイ培地ＩＩ　　（１χペクチン酸、
１χ酵母エキス、１．５χ寒天）にレプリカした。３７
℃−晩培養後、プレートアッセイ培地Ｈの培地表面上に
、６Ｎ硫酸を流し込みコロニー周辺が透明なったものに
対応するＬＢ寒天培地上のコロニーを保存した。

文献３の方法に従い、プラスミドを抽出し、電気泳動に
より、その大きさを比較した。最小の大きさのものを、
ｐＨＢＯ１２と命名し、これを保持した大腸菌Ｃ６００
をＩＩ　Ｂ　０１２と命名した。ｐＨＢＯＬ２を、制限
酵素　ＥｃｏＲＩ、　Ｓａｌ　Ｔ　、　　Ｈｉｎｄ　ｍ
で分解し、１％アガロースゲルで電気泳動した。結果を
第１図に示す。図中１はλＤＮＡの１ｌｉｎｄ　ｍ分解
物を、２は　ｐＨＢＯ１２のＳａｔ　Ｉ分解物を、３は
ＥｃｏＲＩ分解物を、４はＳａｌ　Ｉ及び１ｌｉｎｄ　
ｍ分解物を、５はＥｃｏＲＩ及びｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ分
解物を、６はＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｔ分解物を各々し
めす。また、第２図にｐＨＢＯ１２の制限地図を示した
。

実施例２ （１）ペクチン酸リアーゼの生産 ＩＩ　８０１２を最少培地（０，１χ（Ｎｌ＋、、）！
３０４　、０．０１χＭｇＳＯ４・７Ｈ，０、０，７χ
にｚｔｌＰ０４，０．３χＫ　＋１　、　Ｐ　Ｏ４，、
１χグリセロール）で、３７℃−晩培養したちの１０ｍ
１に、最少培地１０ｍ１を加え、更に５時間培養した。

遠心分離により、菌体と培養濾過液を分離し、菌体は実
施例１（５）と同様の処理をおこない、培養濾液はその
まま酵素液として、ペクチン酸リアーゼ活性を測定した
。その結果を第１表に示した。

第１表　ペクチン酸リアーゼ活性 第１表に示すごと＜　、ＨＢＯ１２の培養濾液から酵素
を採取することが可能であることが明らかである。

次に、以下に示す各種培地で、３７℃−晩培養し、遠心
分離により得た培養濾液の、ペクチン酸リアーゼ活性を
測定した。

結果を第２表にしめす。

第２表　ペクチン酸リアーゼ活性 表中の培地成分を、１χ（Ｗ／いとなるよう蒸留水に加
え、１２１℃１５分間オートクレーブにかけたもの２０
ｍ１を培地とした。尚、コントロールとして、ＤＮＡ供
与菌エルビニア・カロトボーラ・サブスピーシス・カロ
トボーラＥＣ−１を、同培地で３０℃で培養した時の結
果も合わせて示した。特に注目すべきは、コーンプラン
及びコーンステイープリカーを培地成分とした場合、１
ＩＢＯ１２が、ＥＣ−１に対して、３．５倍〜６倍のペ
クチン酸リアーゼ活性を示したことである。これらの培
地成分は安価に入手でき、これにより、経済的にペクチ
ン酸リアーゼを生産することが可能となった。

（２）マセレーション試験 （１）で得られた、コーンプランを成分とする培地での
培養濾液２ｍｌに、大根、きゅうり、はうれん草、茶葉
、ニンジンの切片を加え、２８℃でインキュベートし、
切片の状態を観察した。各植物体により差異が見られた
が、いずれも−晩のインキュベートによりマセレーショ
ンが見られた。尚コントロールとして、使用した培地に
上記の各切片を加えたが、形状に変化は見られなかった
。更に各マセレーションを容液中のメチルアルコールモ
トロブ酸法により定量したが、検出されなかった。

［発明の効果］ 本発明により得られる組換え体プラスミドおよび、これ
により形質転換された大腸菌１１ＢＯ１２はペクチン酸
リアーゼ活性を発現する遺伝子を含有し、安価な培地で
培養が可能であるため、工業的に有利である。さらにペ
クチン酸リアーゼをコードする遺伝子を提供したことに
より、本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子を既存の強力な
発現が知られている発現ベクターにつなくことにより、
酵母、大腸菌、枯草菌等の既存の系によってさらに低コ
ストの大量生産が可能である。また、本発明の形質転換
大腸菌）Ｉ　８　０１２は大腸菌外膜外ヘペクチン酸リ
アーゼを分泌し、生産コスト低減に寄与する。

本発明における大腸菌クローンは大腸菌の生産物質とペ
クチン酸リアーゼを生産する。また、宿主である大腸菌
Ｃ６００は大腸菌毒素非生産菌として確認されており、
植物Ｕ織に害作用を有する植物病原菌特有の酵素等毒素
を生産しないため、植物組織のマセレーションを特異的
に行うことができる。特に、本発明により生産されるペ
クチン酸リアーゼは、粗酵素のまま緑色植物の加工に用
いても、メチルアルコールの発生はない。

本発明のペクチン酸リアーゼの生産法はまったく新規で
あり、工業生産上きわめて有利である。

参考文献 １　、　ＴＪｊａｎｉａｓｔｉｓ　　ら４９　；　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ八　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　　Ｐ２Ｓ５〜１６５（１９８２
）２、　Ｒ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらｍ　；　Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＴｅｃｈｉｑｕｅｓ；　　八ｎ　
　ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰ４５〜４６　（１９８３
） ３、　Ｔ、Ｍａｎｉａｓｔｉｓ　　らｆ４　；　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ八　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｍ、ａｎｕａｌ　　Ｐ２Ｏ〜９Ｈ１９Ｂ２　　）
４、　ＲｏＲｏｄｒｉｇｕｅｚらｋＪＡ　；　Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ＾Ｔｅｃｈｉｑｕｅｓ；　Ａｎ　
ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰ５０〜５１　（１９８３）

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたプラスミドｐＨＢＯ１２の
電気泳動の結果を示す。第２図はｐＨＢＯ１２の制限酵
素地図を示す。 第１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 蔬菜類軟腐病細菌であるエルビニア・カロトボーラ・サ
   プスピーシス・カロトボーラのペクチン酸リアーゼ遺伝
   子をＤＮＡ組換え法を用いてクローニングした大腸菌ク
   ローンを培養し、該大腸菌よりペクチン酸リアーゼを採
   取することを特徴とするペクチン酸リアーゼの製造法。