JP6013321B2 - アリールスルファターゼの活性測定方法 - Google Patents
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Description
(1)アリールスルファターゼの存在が予測される検体を、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で適宜希釈し、サンプルとする。
(2)4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを2mM濃度で含有する水溶液を調製する。
(3)サンプルと4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、1:1(容量基準)で混合し、37℃にて3時間反応させる。
(4)反応液に、反応液と同量(容量基準)の0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
(5)励起波長360nm、蛍光波長450nmにて、蛍光強度を測定する。
(6)4−メチルウンベリフェロンを、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、(4)と同様に0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、(5)と同様の条件で蛍光強度を測定する。
(7)(6)より、検量線を作成する。
(8)(5)で測定された蛍光強度と(7)で作成された検量線から、測定用サンプルの4−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを3で割り、反応時間が1時間であった場合の4−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、1時間の反応中に生じた4−メチルウンベリフェロン量を算出する。
(9)こうして算出された4−メチルウンベリフェロン量は、(1)で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体1g当たりの4−メチルウンベリフェロン量に換算する。
(10)基質と酵素との反応時間1時間あたりの4−メチルウンベリフェロン生成量が1nmoleであった場合を1ユニット(U)とし、単位は、検体、即ち酵素製剤1g当たりのユニット量、即ち「ユニット(U)/g」で表す。
(2)4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを2mM濃度で含有する水溶液を調製する。
(3)サンプルと4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、1:1(容量基準)で混合し、37℃にて3時間反応させる。
(4)反応液に、反応液と同量(容量基準)の0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
(5)励起波長360nm、蛍光波長450nmにて、蛍光強度を測定する。
(6)4−メチルウンベリフェロンを、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、(4)と同様に0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、(5)と同様の条件で蛍光強度を測定する。
(7)(6)より、検量線を作成する。
(8)(5)で測定された蛍光強度と(7)で作成された検量線から、測定用サンプルの4−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを3で割り、反応時間が1時間であった場合の4−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、1時間の反応中に生じた4−メチルウンベリフェロン量を算出する。
(9)こうして算出された4−メチルウンベリフェロン量は、(1)で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体1g当たりの4−メチルウンベリフェロン量に換算する。
(10)基質と酵素との反応時間1時間あたりの4−メチルウンベリフェロン生成量が1nmoleであった場合を1ユニット(U)とし、単位は、検体、即ち酵素製剤1g当たりのユニット量、即ち「ユニット(U)/g」で表す。
GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を、0、0.2、0.5又は1.0Mの塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)にて5倍希釈した。これらの各液0.5mLに、p−ニトロフェニルスルフェイトの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。これに1.5N水酸化ナトリウム水溶液1.5mLを加えて反応を停止させ、410nmにおいて吸光度を測定した。塩化カリウムを含まない場合を100%として、相対値を表1に示す。
(1) GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を、0、125、250、500又は1,000mMの塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)にて100倍希釈した。これらの各液0.5mLに、2mM 4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。これに0.1N水酸化ナトリウム水溶液1.0mLを加えて反応を停止させ、励起波長360nm、蛍光波長450nmにて蛍光強度を測定した。塩化ナトリウムを含まない場合を100%として、相対値を表2に示す。
(1) GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を、100mM、125mM、250mM、500mM及び1,000mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)にて100倍希釈した。これらの各液0.5mLに、2mM 4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。これに0.1N水酸化ナトリウム水溶液(100mM、125mM、250mMリン酸カリウム緩衝液の場合)又は1.0N水酸化ナトリウム水溶液(500mM、1,000mMリン酸カリウム緩衝液の場合)1.0mLを加えて反応を停止させ、励起波長360nm、蛍光波長450nmにて蛍光強度を測定した。100mMリン酸カリウム緩衝液を使用した場合を100%として、相対値を表3に示す。
無機塩添加の効果が、酵素反応の亢進によるものであるか、蛍光団の蛍光強度の増強によるものであるのかを確認した。
GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を蒸留水で希釈し、1%(w/v)溶液を得た。これを、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を用いて希釈し、0.8%(w/v)、0.6%(w/v)、0.4%(w/v)及び0.2%(w/v)溶液を得た。各溶液0.5mLに20mM p−ニトロフェニルスルフェイトの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)溶液0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。これに1.5N水酸化ナトリウム水溶液1.5mLを加えて反応を停止させ、410nmにおける吸光度を測定した。
GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)にて希釈し、1%(w/v)溶液を得た。この1%溶液を、同緩衝液を用いて希釈し、0.8%(w/v)、0.6%(w/v)、0.4%(w/v)及び0.2%(w/v)溶液を得た。
アリールスルファターゼ活性測定における比色法と蛍光法との感度の相違を検討した。先ず、この実験で使用する精製ラクターゼを調製した。
GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)50kgを、限外ろ過膜(旭化成株式会社製ACP膜)を用いてその導電率が3mSv以下となるまで加水脱塩した。これに水を加えて全量125Lとした。次いで、あらかじめ10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7)にて平衡化しておいたイオン交換樹脂(トーソー株式会社製DEAEトヨパール650M、40cmφ、50L)に吸着させた。50mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7)40Lにて洗浄し、次いで100mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7)200Lでラクターゼを溶出させた。この際、フラクションを20Lずつに分画した。各フラクションのラクターゼ活性(FCC IV法による; Food Chemicals Codex 4th Edition, Effective July 1st, 1996, Committee on Food Chemicals Codex, p.p.801−802)及びアリールスルファターゼ活性(蛍光法による;詳細は下記のとおり)を測定し、アリールスルファターゼの低減した画分を回収、混合し、限外ろ過膜(旭化成株式会社製ACP膜)を用いて濃縮し、ラクターゼ濃縮液を得た。この濃縮液に50%(w/w)となるようグリセリンを加え、精製ラクターゼ製剤を得た。
上記のようにして調製した精製ラクターゼ製剤と、GODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を適宜混合して、様々なアリールスルファターゼ夾雑率のラクターゼ製剤を調製し、ラクターゼ活性(FCC IV法による)とアリールスルファターゼ活性(比色法及び蛍光法による)とを測定した。
ラクターゼ製剤0.5mLに20mM p−ニトロフェニルスルフェイトの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)溶液0.5mLを加え、37℃で3時間反応させた。これに1.5N水酸化ナトリウム水溶液1.5mLを加えて反応を停止させ、410nmにおける吸光度を測定した。
ラクターゼ製剤を0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で希釈し、1%(w/v)溶液を得た。この1%溶液0.5mLに2mM 4−メチルウンベリフェリルスルフェイトカリウム水溶液0.5mL加え、37℃で3時間反応させた。これに0.1N水酸化ナトリウム水溶液1mLを加えて反応を停止させ、励起波長360nm、蛍光波長450nmにて蛍光強度を測定した。
結果を表6に示す。比色法では、アリールスルファターゼの含有量が少なくなると、測定することができなかったが、蛍光法では、比色法の測定限界の約1/100の濃度域まで正確に測定することができた。
WO07/060247には、夾雑するアリールスルファターゼが19単位(WO07/060247において規定された単位)以下のラクターゼ製剤は、牛乳の滅菌後に乳糖を分解させるために添加された場合に異臭を生じさせない旨が記載されている。しかし、これは、ラクターゼの反応日数を2日間と限定して行った試験の結果に基づく見解である。一方、現実のロングライフミルクにラクターゼ製剤を添加した場合、1ヶ月以上の長期にわたって酵素反応が進行すると考えられる。そこで、様々な夾雑率でアリールスルファターゼを含有するラクターゼ製剤を調製し、それらを牛乳に添加し、所定の日数経過後に風味の確認を行った。
様々な夾雑率のアリールスルファターゼを含有するラクターゼ製剤A乃至Eは、実施例7で調製した精製ラクターゼ製剤と、選択されたアリールスルファターゼ活性を100単位(WO07/060247に記載の単位)含むGODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を適宜混合して調製した。
WO07/060247の実施例4を参照し、市販牛乳(加熱殺菌したもの;殺菌条件:130℃ 2秒)に、ラクターゼが20,000NLU/L−牛乳となるように、ラクターゼ製剤A〜Eの各々を加え、30℃に保存した。保存2日後、1ヶ月後及び3ヶ月後に、ラクターゼ製剤を添加していない牛乳とラクターゼ製剤を添加した牛乳の風味官能試験を行った。
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスG14−427株を、YPD培地(1%酵母エキス、1%グルコース、2%ペプトン)10mLに、1白金耳植菌し、この菌懸濁液を30℃に保存して培養し、対数増殖期となったらその培地を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を、600nmにおける吸光度が0.5となるように滅菌水に分散させた。この菌懸濁液に、紫外線を、UVランプにて15秒間照射した。遠心分離によって菌体を回収し、YPD培地に混合分散させた。菌体を含むYPD培地から適量を採り、YPD寒天平板培地に塗布した。37℃にて7日間、静置培養を行った。生育してきたコロニーを少量かきとり、これをザイモリエース(生化学バイオビジネス株式会社製)を1mg/mLで含有する溶液1mLに混合した。30℃にて2時間反応させ、細胞壁を破壊した。その後、遠心分離を行い、上清を回収した。
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスG14−427株を、YPD培地10mLに、1白金耳植菌し、30℃にて対数増殖期まで生育させた。培地を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を、600nmにおける吸光度が0.5となるように滅菌水に分散させた。この菌懸濁液に、紫外線を、UVランプにて15秒間照射した。遠心分離によって菌体を回収し、YPD培地に混合分散させた。菌体を含むYPD培地から適量を採り、YPD寒天平板培地に塗布した。37℃にて4日間、静置培養を行った。生育してきたコロニーをSD培地(0.67%アミノ酸を含まないイーストナイトロジェンベース、2%グルコース、2%寒天)にレプリカし、生育してこないものを選択した。
(宿主株の取得)
実施例10で取得したL−ヒスチジン、L−メチオニン二重栄養要求性変異株である8−23株について、それぞれの栄養要求性が、酢酸リチウム法にて導入したHIS4遺伝子及びMET6遺伝子により相補されることを確認した。
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスG14−427株をYPD培地にて培養した。得られた培養液より、GenとるくんTM(酵母用)(タカラバイオ株式会社製)を用いてゲノムDNAを調製した。操作は、GenとるくんTM(酵母用)の説明書の記載に従って行った。
アリールスルファターゼ遺伝子のオープン・リーディング・フレームが含まれた断片が取得されるように、プライマーSuC−F及びSuC−Rを設計した。これらを含む、使用したプライマーの配列は、表11に示すとおりであった。
Stage1(1サイクル) 94℃ 3分
Stage2(30サイクル) 94℃ 1分
54℃ 1分
72℃ 3分
Stage3(1サイクル) 72℃ 10分
4℃に保持
図5に、形質転換体構築の模式図を示す。プラスミドpdSuC1を、NcoI及びAatIIで処理して直鎖状にし、それを用いて8−23株を酢酸リチウム法により形質転換し、20μg/mlのメチオニンを添加したSD培地で生育する形質転換体SuCD株を取得した。
得られた形質転換体を、それぞれYPD培地にて培養し、その培養液よりGenとるくんTM(酵母用)(タカラバイオ株式会社製)を用いてゲノムDNAを調製した。得られたゲノムDNAをBamHIで消化後、サザン解析を行った。プローブはアリールスルファターゼ遺伝子のAatII−EcoRI断片を用い、核酸の標識と検出には、AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP−Star(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社製)を用い、使用法は添付文書に従った。
親株である二倍体菌株のクリベロマイセス・ラクティスG14−427株及び上記のようにして構築したSuCDD5−2株を、それぞれYPD培地に接種し、30℃、210rpmにて72時間、振とう培養した。培養液に2mg/mlとなるようにザイモリエース(生化学バイオビジネス株式会社製)を加え、30℃に2時間反応させ、細胞壁を破壊した。遠心分離により上清を回収し、FCC IV法によってラクターゼ活性を、そして実施例7に記載の方法でアリールスルファターゼ活性を測定した。結果を表12に示す。
実施例9で得たSF−81株(アリールスルファターゼ産生能が低減された二倍体変異株)及びCBS2359(一倍体菌株)を、それぞれ、7%コーンスチーブリカー、2%乳糖を含有するラクターゼ生産用培地に接種し、30℃、210rpmにて96時間、振とう培養し、その後、遠心分離により菌体を回収した。菌体に滅菌精製水を加え、ガラスビーズと超音波により、回収菌体の細胞壁を破壊した。このようにして得られた菌体と精製水等を含む混合物を遠心分離にかけ、上清を回収した。得られた上清中のラクターゼ活性を、実施例7に記載の蛍光法で測定した。その結果、SF−81株の活性を100%として、CBS2359株の相対活性は2%であった。
SF−81株を、7%コーンスチーブリカー、2%乳糖を含有するラクターゼ生産用培地に接種し、30℃、210rpmにて96時間、振とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。菌体に滅菌精製水を加え、ガラスビーズと超音波により、回収菌体の細胞壁を破壊し、遠心分離により上清を回収した。上清を硫安分画し、限外ろ過膜で濃縮することにより、ラクターゼ活性が約5,000NLU/gのラクターゼ製剤を得た。このラクターゼ製剤のアリールスルファターゼ活性は、本発明の測定法(蛍光法)によると、1U/g以下であった。
(様々なアリールスルファターゼ夾雑率のラクターゼ製剤の調製)
実施例13に記載の方法でSF−81株から製造したラクターゼ製剤そのもの、及びこれにGODO−YNL2(合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤;液体)を適宜混合して、実施例7に示した蛍光法で測定したアリールスルファターゼ活性が1乃至20U/gのラクターゼ製剤5種を調製した。また、各ラクターゼ製剤のラクターゼ活性を、FCC IV法によって測定した。
実施例8同様、市販牛乳に、ラクターゼが20,000NLU/L−牛乳となるように、上記ラクターゼ製剤5種の各々を加え、30℃に保存した。保存1ヶ月後に、ラクターゼ製剤を添加していない牛乳とラクターゼ製剤を添加した牛乳を比較する風味官能試験を、実施例8と同様の方法で行った。結果を表13に示す。
Claims (8)
- 酵母由来のアリールスルファターゼを、その基質であって、当該基質がアリールスルファターゼの作用を受けると蛍光団又は発色団を遊離するものとを、無機塩濃度が10乃至1000mMである水系反応系中で反応させることを特徴とする、水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- 水系反応系の無機塩濃度が50乃至500mMである、請求項1に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- 水系反応系が緩衝液系であり、且つ、緩衝液濃度が50乃至200mMである、請求項1又は2に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- 無機塩が、塩化カリウム、塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される一種以上である、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- 緩衝液がリン酸塩緩衝液である、請求項3又は4に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- 以下の工程(1)乃至(10)を含む、請求項1に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法:
(1)酵母由来のアリールスルファターゼの存在が予測される検体を、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で適宜希釈し、サンプルとする。
(2)4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを2mM濃度で含有する水溶液を調製する。
(3)サンプルと4−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、1:1(容量基準)で混合し、37℃にて3時間反応させる。
(4)反応液に、反応液と同量(容量基準)の0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
(5)励起波長360nm、蛍光波長450nmにて、蛍光強度を測定する。
(6)4−メチルウンベリフェロンを、0.5M塩化カリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、(4)と同様に0.1N水酸化ナトリウム水溶液を添加し、(5)と同様の条件で蛍光強度を測定する。
(7)(6)より、検量線を作成する。
(8)(5)で測定された蛍光強度と(7)で作成された検量線から、測定用サンプルの4−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを3で割り、反応時間が1時間であった場合の4−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、1時間の反応中に生じた4−メチルウンベリフェロン量を算出する。
(9)こうして算出された4−メチルウンベリフェロン量は、(1)で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体1g当たりの4−メチルウンベリフェロン量に換算する。
(10)基質と酵素との反応時間1時間あたりの4−メチルウンベリフェロン生成量が1nmoleであった場合を1ユニット(U)とし、単位は、検体、即ち酵素製剤1g当たりのユニット量、即ち「ユニット(U)/g」で表す。 - ラクターゼ製剤中のアリールスルファターゼの活性測定方法である、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法。
- ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物を培養し、細胞壁を破壊せずに菌体又は微生物体を回収するか、細胞壁を破壊して菌体又は微生物体と共に培養液を回収するか、あるいは、細胞壁を破壊せずに培養液を回収し、回収した菌体又は微生物体及び/又は培養液を原料として、アリールスルファターゼの除去工程なしに、FCC IV法によるラクターゼ活性が4,000NLU/g以上であり、且つ、当該ラクターゼ活性を基準として、請求項6に記載の方法で測定し、計算したアリールスルファターゼ活性(単位:U/g)が0.1%以下であるラクターゼ製剤を製造することを特徴とする、ラクターゼ製剤の製造方法。
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