JP2016208998A - ラクターゼ製剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】 ラクターゼ製剤中の夾雑アリールスルファターゼは、ラクターゼ製剤が添加された食品に、違和感のある好ましくない味と臭いを発生させる。この問題の解決のため、アリールスルファターゼの高感度な測定方法の確立と、アリールスルファターゼが完全に除去された又はその量が極限まで低減されたラクターゼ製剤の開発が必要である。
【解決手段】 ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上であり、ラクターゼ活性を基準として、本明細書で定める特定の蛍光法による水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法で測定したアリールスルファターゼ活性が０．１％以下であるラクターゼ製剤を用いる。
【選択図】 図２

Description

本発明は、アリールスルファターゼの高感度な活性測定方法、活性の高いラクターゼ製剤であって、本発明のアリールスルファターゼの高感度な活性測定方法により、アリールスルファターゼが夾雑しないか又は夾雑しても極く微量であることが確認されたラクターゼ製剤、そのようなラクターゼ製剤の製造方法、及びそのようなラクターゼ製剤を用いて製造された乳製品に関する。
古来より、牛乳は栄養豊かな有用食品として長く利用されてきた。牛乳には、糖の一種である乳糖が含まれている。乳糖はラクターゼによって腸内で分解されるが、ヒトの一部においては、成長するに従ってラクターゼの腸内への分泌量が減少するため、牛乳や乳加工製品（以下、まとめて「乳製品」という）を多量に摂取したときに、腹痛や下痢などのいわゆる乳糖不耐症を引き起こす。このことが、この栄養豊かな食品の幅広い摂取を妨げる一因となっていた。
近年になり、乳糖が前もって低減あるいは除去された乳製品が提供されるようになってきた。このような乳製品であれば、乳糖不耐症のヒトでも問題なく摂取できる。
乳糖の低減あるいは除去は種々の方法で実施されているが、最も一般的なのは、乳製品をラクターゼ製剤で処理して乳糖を加水分解する方法である。
ところで、これまでは、ラクターゼによって乳糖が分解された乳製品は、殺菌工程を経て流通されることが一般的であった。しかし、最近になり、殺菌後の牛乳に無菌的にラクターゼ製剤を添加し、流通中に乳糖を分解する手法が広まってきている。これは使用するラクターゼ製剤の量を減少せしめ、コスト減少に寄与すると考えられている。
一方、殺菌後の牛乳に無菌的にラクターゼ製剤を添加する方法の採用により、新たな問題が生じてきた。それは、ラクターゼ製剤中に微量に含まれる夾雑酵素（プロテアーゼやアリールスルファターゼ）が失活していないため、乳成分に化学変化をもたらすことに起因する問題である。実際、プロテアーゼが凝乳や苦味の発生を引き起こすことが知られており、また、非特許文献１には、アリールスルファターゼが違和感のある好ましくない味と臭いの発生を引き起こすことが報告されている。
特許文献１には、アリールスルファターゼの夾雑量を減少させたラクターゼ製剤とその製造方法が記載されている。しかしながら、特許文献１に記載のアリールスルファターゼ活性の測定方法では、８単位（ラクターゼ活性体１ＮＬＵ当たりのアリールスルファターゼ活性、以下同様）以下の微量領域ではアリールスルファターゼ活性が測定されず、検出限界以下と記載されているのみである。また、特許文献１の表１には、夾雑するアリールスルファターゼの活性が１９単位以下であれば、乳製品に異臭を生じさせないと記載されている。しかし、これは、反応日数が２日間という短期間の試験における結果に基づく判断である。乳製品における異臭の発生原因が、アリールスルファターゼという酵素による乳成分の化学変化であることから推察すると、用途としてロングライフミルクを想定した場合、２乃至３ヶ月間あるいはそれ以上の長期間の反応期間が想定される。そうであれば、特許文献１に記載の方法で測定したアリールスルファターゼ活性が１９単位以下であれば乳製品に異臭を生じさせない、とはいえない。アリールスルファターゼの夾雑量に関し、さらに厳密なコントロールが必要であることは、また、アリールスルファターゼの夾雑量をコントロールするために、より精度の高いアリールスルファターゼ活性測定方法の採用が必要であることは、言を待たない。
酵素製剤に夾雑するアリールスルファターゼを極限まで除去するには、一般的な精製方法を組み合わせて実施すればよい。あるいは、目的の酵素を生産する微生物であって、アリールスルファターゼ生産能を欠失したものを選別、育種すればよい。また、もともとアリールスルファターゼを産生しない宿主を、目的酵素を生産するように形質転換した微生物を使用することもできる。
特許文献１には、変異処理によるアリールスルファターゼ生産能を減じた微生物の取得方法と、遺伝子工学的手法によってアリールスルファターゼ遺伝子を欠失させた微生物に関する記載がある。ただし、変異処理によってアリールスルファターゼ生産能を減じた微生物の取得方法について、記載はされているが、実際の取得例の記載はなく、その可能性が示されているだけである。即ち、特許文献１に記載の方法により、変異処理によってアリールスルファターゼ生産能を減じた微生物の工業レベルでの生産が可能であるか否かは不明である。ラクターゼ製剤の工業レベルでの生産に有用な酵母の二倍体菌株において、突然変異によってアリールスルファターゼ遺伝子を破壊するには二重変異体を得ることが必要であり、そのような二重変異体の取得は、実際には困難であると考えられた。
また、遺伝子工学的手法によるアリールスルファターゼ遺伝子の欠失については、特許文献１には、ＣＢＳ２３５９株という一倍体菌株での実施例が記載されているのみである。換言すると、特許文献１に記載の方法では、ラクターゼ製剤の製造に有用な酵母の二倍体菌株において遺伝子を効果的に破壊することが困難であり、従って、酵母の二倍体菌株であるアリールスルファターゼ非生産株を作製することはできない。
なお、特許文献１の実施例に記載されたラクターゼ製剤のラクターゼ活性は、Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標） ＬＧ５０００（ＤＳＭ社製）が５，０００乃至５，５００ＮＬＵ／ｇ程度、ＧＯＤＯ ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製）が５，０００乃至５，５００ＮＬＵ／ｇ程度であり、また、特許文献１の実施例に記載されている変異処理によってアリールスルファターゼ生産能を減じた微生物が産生するラクターゼから製造されたラクターゼ製剤のラクターゼ活性は不明であるが、充分なラクターゼ活性を得るために乳製品に対するラクターゼ製剤の添加量を増やせば、当然のことながら、夾雑するアリールスルファターゼの絶対量も増えるので、ロングライフミルク等の乳製品において、異臭を発生させる可能性が高まる。
特表２００９−５１７０６１
Ｖ． Ｌｏｐｅｚ， Ｒ．Ｃ．， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（１９９３）， ４１， ｐ．ｐ．４４６−４５４
ラクターゼ製剤中のアリールスルファターゼ夾雑量が微量であっても、そのラクターゼ製剤を乳あるいは乳製品に添加して使用した際に、その作用時間や温度条件などによって、違和感のある好ましくない味と臭いが発生され得る。そのような不都合を生じないためには、アリールスルファターゼの夾雑量が極限まで低減された、好ましくはアリールスルファターゼが完全に除去されたラクターゼ製剤であって、且つラクターゼ活性がより高い製剤が求められている。このためには、ラクターゼ製剤中のアリールスルファターゼ夾雑量が極限まで低減されていることを確認することができる、アリールスルファターゼの活性測定方法を開発する必要がある。
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意努力し、水系におけるアリールスルファターゼ活性の測定方法として、従来法よりも高感度の方法を開発した。また、そのような従来法よりも高感度のアリールスルファターゼ活性の測定方法であって且つ蛍光法によって、従来は検出限度以下とされていた領域において、ラクターゼ製剤中に夾雑するアリールスルファターゼの活性を測定し、乳や乳製品に好ましくない味や臭いを発生させないためのアリールスルファターゼ夾雑量を特定し、本発明を完成させた。
即ち本発明は、アリールスルファターゼを、その基質であって、当該基質がアリールスルファターゼの作用を受けると蛍光団又は発色団を遊離するものとを、イオン強度の高い水系反応系中で反応させることを特徴とする、水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法に関する。
イオン強度の高い水系反応系中で反応させる手段の好ましい例は、無機塩が添加されてなる水系反応系中で酵素と基質と反応させることであるか、及び／又は、酵素蛋白を変性させない緩衝液系中で酵素と基質とを反応させることである。
水系反応系中の無機塩濃度の好ましい範囲は１０乃至１０００ｍＭであり、より好ましい範囲は５０乃至５００ｍＭであり、緩衝液濃度の好ましい範囲は１０乃至２００ｍＭであり、より好ましい範囲は５０乃至２００ｍＭである。
前記無機塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される一種以上であることが好ましい。また、前記緩衝液は、リン酸塩緩衝液であることが好ましい。
上記本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法は、以下の工程（１）乃至（１０）を含む方法であることが特に好ましい：
（１）アリールスルファターゼの存在が予測される検体を、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で適宜希釈し、サンプルとする。
（２）４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを２ｍＭ濃度で含有する水溶液を調製する。
（３）サンプルと４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、１：１（容量基準）で混合し、３７℃にて３時間反応させる。
（４）反応液に、反応液と同量（容量基準）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
（５）励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて、蛍光強度を測定する。
（６）４−メチルウンベリフェロンを、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、（４）と同様に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、（５）と同様の条件で蛍光強度を測定する。
（７）（６）より、検量線を作成する。
（８）（５）で測定された蛍光強度と（７）で作成された検量線から、測定用サンプルの４−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを３で割り、反応時間が１時間であった場合の４−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、１時間の反応中に生じた４−メチルウンベリフェロン量を算出する。
（９）こうして算出された４−メチルウンベリフェロン量は、（１）で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体１ｇ当たりの４−メチルウンベリフェロン量に換算する。
（１０）基質と酵素との反応時間１時間あたりの４−メチルウンベリフェロン生成量が１ｎｍｏｌｅであった場合を１ユニット（Ｕ）とし、単位は、検体、即ち酵素製剤１ｇ当たりのユニット量、即ち「ユニット（Ｕ）／ｇ」で表す。
工程（１０）における「基質」とは４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムであり、「酵素」とはアリールスルファターゼである。
上記本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法は、ラクターゼ製剤中のアリールスルファターゼの活性の測定に適用できる。
また、本発明は、ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物の培養後の菌体又は微生物体及び／又は培養液を原料として製造されたラクターゼ製剤であって、当該ラクターゼ製剤は、ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上であり、且つ、当該ラクターゼ活性を基準として、上記工程（１）乃至（１０）を含む本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法で測定し、計算したアリールスルファターゼ活性（単位：Ｕ／ｇ）が０．１％以下であることを特徴とするラクターゼ製剤に関する。
上記した本発明のラクターゼ製剤は、夾雑するアリールスルファターゼの除去工程なしに製造することもできる。ここで、「アリールスルファターゼの除去工程」とは、この技術分野で実施される分取や精製方法の中、例えば目的酵素を含む水溶液からの硫安分画のような、目的酵素であるラクターゼ蛋白と共にアリールスルファターゼ蛋白が精製されてくる工程は含まない。目的酵素であるラクターゼ蛋白が、アリールスルファターゼ蛋白と分離される工程をいう。
上記の本発明において、「アリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている」とは、例えば、アリールスルファターゼ遺伝子（構造遺伝子）が破壊されていたり、アリールスルファターゼ遺伝子にアリールスルファターゼ蛋白を発現させるように働く発現調節遺伝子が破壊されていたり、あるいはアリールスルファターゼ遺伝子及び／又はアリールスルファターゼ蛋白発現調節遺伝子を有さないために、アリールスルファターゼ蛋白が生成されないか又はその生成量が低減されていることをいう。アリールスルファターゼ蛋白の発現がない、すなわち生成量がゼロであることが好ましいが、アリールスルファターゼ活性（単位：Ｕ／ｇ）／ラクターゼ活性（単位：ＮＬＵ／ｇ）が０．１％以下となるように、好ましくは０．０２％以下となるように、アリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されていればよい。
また、本発明に係るラクターゼ製剤は、そのラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上であるが、４，５００ＮＬＵ／ｇ以上であることが好ましく、５，０００ＮＬＵ／ｇ以上であることがさらに好ましい。
ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株は、酵母の二倍体菌株の変異処理によって取得された変異株であってもよいし、酵母の二倍体菌株にアリールスルファターゼ遺伝子又はアリールスルファターゼ蛋白発現調節遺伝子の欠失操作を施して得られた変異株であってもよい。ラクターゼ蛋白の産生量が多い酵母の二倍体菌株を親株とする変異株が好ましい。
酵母の二倍体菌株は、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）又はその近縁種であるクリベロマイセス・マリキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の二倍体菌株であることが好ましい。また、酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物は、クリベロマイセス・ラクティス又はクリベロマイセス・マリキシアヌスのラクターゼ遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物であることが好ましい。
本発明は、ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物を培養し、細胞壁を破壊せずに菌体又は微生物体を回収するか、細胞壁を破壊して菌体又は微生物体と共に培養液を回収するか、あるいは、細胞壁を破壊せずに培養液を回収し、回収した菌体又は微生物体及び／又は培養液を原料として、アリールスルファターゼの除去工程なしに、本発明のラクターゼ製剤（即ち、ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上であり、且つ、当該ラクターゼ活性を基準として、上記工程（１）乃至（１０）を含む本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法で測定し、計算したアリールスルファターゼ活性（単位：Ｕ／ｇ）が０．１％以下であるラクターゼ製剤）を調製することを特徴とするラクターゼ製剤の製造方法にも関する。なお、細胞壁を破壊せずに培養液を回収する場合とは、遺伝子組換え微生物がラクターゼを分泌する場合である。
ラクターゼ製剤の調製工程には、ラクターゼ蛋白の濃縮等の、当技術分野で行われている精製工程が包含され得る。但し、本発明のラクターゼ製剤の製造方法においては、アリールスルファターゼの除去工程を実施しない。高活性のラクターゼ蛋白を生成し、夾雑アリールスルファターゼ蛋白の生成は、あったとしても極く微量である酵母の二倍体菌株又は遺伝子組換え微生物を使用するので、生成されたラクターゼ蛋白の濃縮倍率が大きくなくても、ラクターゼ活性の高いラクターゼ製剤が得られ、且つ、濃縮倍率が大きくないため、夾雑アリールスルファターゼ蛋白は、濃縮されても高活性とはならない。
さらに、本発明は、本発明に係るラクターゼ製剤を用いて製造されたことを特徴とする乳製品に関する。
本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法では、従来に比べて微量のアリールスルファターゼを、その活性を指標として測定することができる。本発明により、高感度なアリールスルファターゼ活性測定方法が確立されたため、ラクターゼ製剤中のアリールスルファターゼ量を、その活性を指標として正確に把握することが可能となった。
また、ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ遺伝子蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物の培養後の菌体又は微生物体及び／又は培養液を原料として、アリールスルファターゼ夾雑量がごく微量であるか又はアリールスルファターゼを含有しない、高ラクターゼ活性のラクターゼ製剤を提供することが可能となった。本発明のラクターゼ製剤は、ラクターゼ活性が高いために、その使用量を少なくすることができ、よって、当該製剤中に安定剤等の添加剤や不純物が含まれている場合に、使用対象に対するそれらの持ち込み量が少なくなるという効果が得られる。
酵母の二倍体菌株を使用する場合には、一倍体菌株と比べて、継代培養を継続しても、その性質が変化し難く、また、一般的に培養液量あたりの蛋白質生産量が多いという利点がある。
本発明のラクターゼ製剤を使用すれば、ロングライフミルク等において、違和感のある好ましくない味や臭いの発生が抑制されるという効果が得られる。
本発明のラクターゼ製剤の製造方法では、夾雑するアリールスルファターゼの除去工程なしに、高ラクターゼ活性のラクターゼ製剤を製造する。この方法は、「アリールスルファターゼの除去工程」がないため、製造効率が高く、且つ、アリールスルファターゼの除去のための精製工程におけるラクターゼ活性の低下もない。
比色法によるアリールスルファターゼ活性の測定結果を示すグラフである。 蛍光法によるアリールスルファターゼ活性の測定結果を示すグラフである。 アリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターｐｄＳｕＣ１の構築方法を示す模式図である。 アリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターｐｄＳｕＣＭ６の構築方法を示す模式図である。 二つのアリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターの導入方法を示す模式図である。 アリールスルファターゼ遺伝子二つを含む株、一つのアリールスルファターゼ遺伝子が破壊された株、及び二つのアリールスルファターゼ遺伝子が破壊された株のサザン・ブロッティングの結果を示す写真である。
初めに、アリールスルファターゼの活性測定方法について説明する。
アリールスルファターゼの活性測定方法として従来から知られている方法は、ｐ−ニトロフェノールのような発色団に硫酸基が結合した化合物を基質として使用する比色法である。この方法では、基質とアリールスルファターゼとの反応によって基質から硫酸基が外れて遊離する発色団の量を、吸光度により測定する。ただし、ｐ−ニトロフェノール等の発色団の遊離量が少ない場合には、吸光度の変化は少なく、明確な測定値を得ることが困難である。
アリールスルファターゼの活性測定方法として、また、蛍光団に硫酸基を結合させた化合物、例えば４−メチルウンベリフェリル硫酸を基質として用いる蛍光法も知られている（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １１／２１）。蛍光法の感度は、一般的に比色法の感度の１００倍以上であるといわれている。
本発明者らは、水系でアリールスルファターゼ活性を測定する方法として、従来の比色法や蛍光法よりも感度を高くすることができる測定条件を検討した。そして、酵素と基質との反応系のイオン強度を高めることにより、アリールスルファターゼ活性を高感度で測定できることに想到し、本発明のアリールスルファターゼ活性の測定方法を確立した。アリールスルファターゼをその基質と反応させる際に、その水系反応系のイオン強度を高めることにより、酵素反応が顕著に活性化され、その結果、より多くの発色団や蛍光団が遊離されることは、これまでに全く知られていない。この本発明に係る水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法を蛍光法にて実施することにより、ラクターゼ製剤中に夾雑するアリールスルファターゼの量を正確に把握することができるようになった。その結果として、アリールスルファターゼ含有量がゼロ又は極く微量のラクターゼ製剤を提供することが可能となった。
本発明の水系でのアリールスルファターゼの活性測定方法は、アリールスルファターゼを、その基質（ただし、当該基質がアリールスルファターゼの作用を受けると、蛍光団又は発色団を遊離する）と反応させる際に、反応系のイオン強度を高めることを特徴とする。反応系のイオン強度を高めるための具体的手段は、反応系に無機塩を共存させたり、緩衝液系にて酵素反応を行わしめることである。
反応系に添加すべき無機塩の例としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。このような無機塩の濃度は、反応系中において、例えば１０乃至１０００ｍＭであり、好ましくは５０乃至５００ｍＭである。また、緩衝液系の例としては、酵素蛋白を変性させない、リン酸−リン酸カリウム緩衝液（リン酸カリウムの概念には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウムを含む）、リン酸−リン酸ナトリウム緩衝液（リン酸ナトリウムの概念には、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウムを含む）、リン酸緩衝生理食塩水等のリン酸塩緩衝液が挙げられる。このような緩衝液の反応系中における濃度は、例えば１０乃至２００ｍＭであり、好ましくは５０乃至２００ｍＭである。反応系に無機塩を共存させるためには、例えば、アリールスルファターゼの存在が予測される検体の水系溶液（例えば、検体を水や緩衝液に溶解させたもの）に無機塩を添加してもよいし、基質の水系溶液に無機塩を添加してもよい。
本発明に係るアリールスルファターゼの活性測定方法の典型例は、次の通りである。
（１）アリールスルファターゼの存在が予測される検体を、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で適宜希釈し、サンプルとする。
（２）４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを２ｍＭ濃度で含有する水溶液を調製する。
（３）サンプルと４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、１：１（容量基準）で混合し、３７℃にて３時間反応させる。
（４）反応液に、反応液と同量（容量基準）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
（５）励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて、蛍光強度を測定する。
（６）４−メチルウンベリフェロンを、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、（４）と同様に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、（５）と同様の条件で蛍光強度を測定する。
（７）（６）より、検量線を作成する。
（８）（５）で測定された蛍光強度と（７）で作成された検量線から、測定用サンプルの４−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを３で割り、反応時間が１時間であった場合の４−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、１時間の反応中に生じた４−メチルウンベリフェロン量を算出する。
（９）こうして算出された４−メチルウンベリフェロン量は、（１）で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体１ｇ当たりの４−メチルウンベリフェロン量に換算する。
（１０）基質と酵素との反応時間１時間あたりの４−メチルウンベリフェロン生成量が１ｎｍｏｌｅであった場合を１ユニット（Ｕ）とし、単位は、検体、即ち酵素製剤１ｇ当たりのユニット量、即ち「ユニット（Ｕ）／ｇ」で表す。
本発明に係るラクターゼ製剤は、ＦＣＣ ＩＶ法（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｄｅｘ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｊｕｌｙ １， １９９６， Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｏｄｅｘ ｐ．ｐ．８０１−８０２）によるラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上（好ましくは４，５００ＮＬＵ／ｇ以上、さらに好ましくは５，０００ＮＬＵ／ｇ以上）であり、且つ、本発明に係るアリールスルファターゼの活性測定方法の典型例として上記した方法で測定し、計算したアリールスルファターゼ活性が、ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性（単位：ＮＬＵ／ｇ）を基準として、０．１％以下（好ましくは０．０２％以下）である。
本発明のラクターゼ製剤の製造には、ラクターゼ蛋白を生成する、ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株を用いる。また、本発明において使用する酵母の二倍体菌株は、そのままで又は濃縮することによって４，０００ＮＬＵ／ｇ以上のラクターゼ製剤を提供できる、高活性のラクターゼ蛋白を生成するものである。このような酵母の二倍体菌株は、例えば、微生物の変異処理によって取得された変異株である。このような変異株は、例えば、紫外線照射や化学的突然変異誘発物質に、高活性のラクターゼ蛋白を生成する酵母の二倍体菌株を暴露させて変異処理を行い、二倍体の両遺伝子について、アリールスルファターゼ遺伝子やアリールスルファターゼ蛋白の発現調節遺伝子を破壊又は欠失させる方法や、二倍体の両遺伝子について、アリールスルファターゼ遺伝子やアリールスルファターゼ蛋白の発現調節遺伝子を遺伝子工学的手法により欠失させる方法等によって得ることが出来る。なお、所望の変異株が得られたか否かは、本発明に係るアリールスルファターゼ活性測定方法（蛍光法）で、変異後の酵母の培養液のアリールスルファターゼ活性を測定すればよい。
紫外線による突然変異の誘発は、例えば二倍体酵母の懸濁液に、紫外線を照射することによって行う。また、化学的突然変異の誘発は、例えば二倍体酵母の懸濁液に、化学的突然変異誘発物質を添加することによって行う。なお、化学的突然変異誘発物質の例としては、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、アクリフラビン、メタンスルホン酸化合物、ニトロソグアニジン等が挙げられる。
アリールスルファターゼ遺伝子又はアリールスルファターゼ蛋白の発現調節遺伝子を遺伝子工学的手法により欠失させるには、欠失させるべき遺伝子の相同配列を有する遺伝子断片を取得し、その断片をベクターにサブクローニングして欠失させるべき遺伝子の破壊ベクターを構築し、そしてそのベクターを用いて酵母の二倍体菌株の形質転換を行う等の、通常の遺伝子工学的手法を適用すればよい。
本発明のラクターゼ製剤の製造には、酵母のラクターゼ遺伝子がラクターゼ蛋白を発現するように導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物であって、高活性のラクターゼ蛋白を生成するものも用いることが出来る。前記したように、「アリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている」とは、例えば、アリールスルファターゼ蛋白の生成に関わる遺伝子が制限されているために、より具体的には、アリールスルファターゼ遺伝子及び／又はアリールスルファターゼ蛋白発現調節遺伝子を有さないために、あるいはアリールスルファターゼ遺伝子（構造遺伝子）が破壊されていたり、アリールスルファターゼ遺伝子にアリールスルファターゼ蛋白を発現させるように働く発現調節遺伝子が破壊されているために、アリールスルファターゼ蛋白が生成されないか又はその生成量が低減されていることをいう。
酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物は、公知の方法により調製することが出来る。例えば、薬剤Ａに耐性を持つプラスミドにラクターゼ遺伝子を、必要な場合にはラクターゼ遺伝子の発現調節遺伝子も同時に、組み込む。このようにして調製されたラクターゼ発現プラスミドを用い、宿主となる微生物の形質転換を行う。形質転換後の微生物を、薬剤Ａを含む培地で培養し、出現したコロニーを選択する。
酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物を得るための宿主としては、大腸菌、酵母、枯草菌等を使用することが出来る。
酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物を得るための宿主として、アリールスルファターゼ遺伝子やアリールスルファターゼ蛋白の発現調節遺伝子をもとより有しない宿主、もしくは、アリールスルファターゼ遺伝子やアリールスルファターゼ蛋白の発現調節遺伝子を破壊または欠失させた宿主が望ましい。
ラクターゼ製剤用のラクターゼは、ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物であって、高活性のラクターゼ蛋白を生成するものを培養し、細胞壁を破壊せずに菌体又は微生物体を回収するか、細胞壁を破壊して菌体又は微生物体と共に培養液を回収するか、あるいは、細胞壁を破壊せずに培養液を回収し、回収した菌体又は微生物体及び／又は培養液を原料として、アリールスルファターゼの除去工程なしに製造する。なお、「培養液」の概念には培養上清も含まれる。
酵母等の微生物の培養には、フラスコ、ジャー、タンク等の培養器を用いることができ、培養条件としては、当該微生物による酵素生産に適する温度、ｐＨ、攪拌数等を選択する。
培養終了後、通常は細胞壁を破壊することによってラクターゼが溶解した培養液を得る。なお、培養に供された微生物がラクターゼを分泌する場合には、細胞壁の破壊を行わなくてもよい。また、培養液は使用せずに、菌体（又は微生物体）のみを回収した場合には、その後、蒸留水中で菌体（又は微生物体）の細胞壁が破壊され、細胞内部の成分が蒸留水に溶解されて、菌体又は微生物体を含む水溶液となる。
菌体又は微生物体を含む又は含まない培養液や水溶液は、通常、遠心分離、ろ過その他の本技術分野で通常行われている適切な方法をもって、上清と残渣とに分離される。上清は、そのまま酵素液として使用してもよいし、限外ろ過膜等を用いて濃縮した後、酵素液として使用してもよい。酵素液は、噴霧乾燥、凍結乾燥等の方法によって粉体化されてもよい。このようにして得られた酵素液そのものを、ラクターゼ製剤として使用することも出来る。
なお、本発明のラクターゼ製剤は、活性の高いラクターゼ蛋白を生成し、アリールスルファターゼ蛋白は生成しないか又は極く微量しか生成しない、酵母の二倍体菌株又は微生物を使用して製造されるので、通常は、アリールスルファターゼのみの除去のために、培養液等を、吸着、クロマトグラフィー、結晶化等の精製操作の中の一つ以上に供する必要はない。また、本発明のラクターゼ製剤の製造方法は、アリールスルファターゼの除去工程を含まないものである。なお、前記したように、溶剤分画や硫安分画等の、ラクターゼ蛋白とアリールスルファターゼ蛋白とが分離されない精製方法は、「アリールスルファターゼの除去工程」の定義に包含されない。
本発明に係るラクターゼ製剤の必須構成成分は、ラクターゼである。ラクターゼ製剤には、ラクターゼの活性を阻害しないような物質であり且つ活性を阻害しないような量であれば、又は、ラクターゼ製剤の使用対象に対して望ましくない作用をしない限りは、その他の成分が存在していてもよい。存在していてもよい物質の例を挙げると、ラクターゼの安定化に寄与する金属塩類、各種糖類、アスコルビン酸、グリセリン等、使い勝手をよくするための賦形剤である澱粉、デキストリン、緩衝作用を有する無機塩類等である。ラクターゼ製剤の性状は特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、溶液等であってよい。
本発明は、本発明に係るラクターゼ製剤を用いて製造された乳製品にも関する。乳製品とは、ロングライフ牛乳等の牛乳類、ヨーグルト、生クリーム、サワークリーム、チーズ等をいう。ラクターゼ製剤は、本技術分野における通常の方法や使用量（但し、ラクターゼ活性に基づいて計算される使用量）で使用される。
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
［実施例１］アリールスルファターゼ活性の測定方法の検討（その１）
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を、０、０．２、０．５又は１．０Ｍの塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて５倍希釈した。これらの各液０．５ｍＬに、ｐ−ニトロフェニルスルフェイトの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍＬを加え、３７℃で３時間反応させた。これに１．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍにおいて吸光度を測定した。塩化カリウムを含まない場合を１００％として、相対値を表１に示す。
表１に示したように、塩化カリウムの添加により、アリールスルファターゼ活性の測定値は増加した。すなわち、塩化カリウムの添加により、より高感度で測定することができた。
［実施例２］アリールスルファターゼ活性の測定方法の検討（その２）
（１） ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を、０、１２５、２５０、５００又は１，０００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて１００倍希釈した。これらの各液０．５ｍＬに、２ｍＭ ４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液０．５ｍＬを加え、３７℃で３時間反応させた。これに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えて反応を停止させ、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。塩化ナトリウムを含まない場合を１００％として、相対値を表２に示す。
（２） 酵素を希釈する液体として、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は、（１）と同様に反応及び蛍光測定を行った。結果を表２に示す。
（３） 酵素を希釈する液体に、塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウムを添加した以外は、（１）と同様に反応及び蛍光測定を行った。結果を表２に示す。
（４） 酵素を希釈する液体として、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、且つ、酵素を希釈する液体に、塩化ナトリウムの代わりに塩化カリウムを添加した以外は、（１）と同様に反応及び蛍光測定を行った。結果を表２に示す。
表２に示したように、無機塩として塩化ナトリウム又は塩化カリウムを添加し、リン酸カリウム又はリン酸ナトリウム緩衝液中で反応及び測定を行うと、アリールスルファターゼ活性の測定値はほぼ同様の割合で増加した。
［実施例３］アリールスルファターゼ活性の測定方法の検討（その３）
（１） ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１，０００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて１００倍希釈した。これらの各液０．５ｍＬに、２ｍＭ ４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液０．５ｍＬを加え、３７℃で３時間反応させた。これに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液の場合）又は１．０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５００ｍＭ、１，０００ｍＭリン酸カリウム緩衝液の場合）１．０ｍＬを加えて反応を停止させ、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した場合を１００％として、相対値を表３に示す。
（２） 酵素を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて希釈するとともに、０、１２５、２５０、５００又は１０００ｍＭの硫酸アンモニウムを添加した以外は（１）と同様に反応を行った。１０００ｍＭの硫酸アンモニウムを添加した系については、１．０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えて反応を停止させ、それ以外の系については、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えて反応を停止させた。励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。硫酸アンモニウム無添加系の活性測定値を１００％として、相対値を表４に示す。
（３） 酵素を希釈する液体に、硫酸アンモニウムの代わりに０、１２５、２５０、５００又は１０００ｍＭのグルコースを添加した以外は、（２）と同様に反応及び蛍光測定を行った。結果を表４に示す。
表３に示すように、緩衝液濃度の上昇も、アリールスルファターゼ活性の測定値の上昇に寄与したが、その効果は小さかった。また、表４に示すように、硫酸アンモニウムの添加は、アリールスルファターゼ活性の測定値を増加させたが、グルコースは、アリールスルファターゼ活性の測定値の上昇効果は小さかった。
［実施例４］無機塩添加の効果が発現される工程の確認
無機塩添加の効果が、酵素反応の亢進によるものであるか、蛍光団の蛍光強度の増強によるものであるのかを確認した。
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて１００倍希釈した。また、別途、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて１００倍希釈した。これらの各液０．５ｍＬに、２ｍＭ ４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液０．５ｍＬを加え、３７℃で１時間反応させた。これに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えて反応を停止させた。反応停止後の各液２００μＬに、塩化カリウムを０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ又は１，０００ｍＭ濃度で含有する水溶液２００μＬを添加し、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。なお、各ブランクとして、酵素の希釈液に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて失活させた後、４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムの水溶液を添加したものを用いた。
ラクターゼ製剤を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて１００倍希釈したものを用いて反応させ、且つ、反応停止後には塩化カリウムを添加しなかった（塩化カリウム濃度が０ｍＭの蒸留水２００μＬを添加した）場合を１００％として、相対値を表５に示す。
表５に示すように、反応開始前に無機塩を添加した場合、即ち無機塩の存在下で酵素反応を行わせた場合には、蛍光強度が高まったが、酵素反応終了後に無機塩を添加しても、蛍光強度は高まらなかった。以上より、無機塩が酵素反応を亢進させ、これによって遊離される蛍光団の絶対量が増えるために、蛍光強度が高まることが明らかとなった。
［実施例５］従来より知られている比色法でのアリールスルファターゼ活性の測定
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を蒸留水で希釈し、１％（ｗ／ｖ）溶液を得た。これを、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて希釈し、０．８％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）及び０．２％（ｗ／ｖ）溶液を得た。各溶液０．５ｍＬに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルスルフェイトの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）溶液０．５ｍＬを加え、３７℃で３時間反応させた。これに１．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果を図１に示す。比色法では、酵素製剤の１％（ｗ／ｖ）溶液では、アリールスルファターゼ活性はまったく測定できなかった。
［実施例６］蛍光法でのアリールスルファターゼ活性の測定
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にて希釈し、１％（ｗ／ｖ）溶液を得た。この１％溶液を、同緩衝液を用いて希釈し、０．８％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）及び０．２％（ｗ／ｖ）溶液を得た。
各溶液０．５ｍＬに２ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルスルフェイトカリウム水溶液０．５ｍＬ加え、３７℃で３時間反応させた。これに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えて反応を停止させ、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。
結果を図２に示す。蛍光法では、比色法とは異なり、濃度が１％（ｗ／ｖ）以下の酵素製剤溶液でも、良好な定量性を示した。
［実施例７］アリールスルファターゼ活性測定における比色法と蛍光法との比較
アリールスルファターゼ活性測定における比色法と蛍光法との感度の相違を検討した。先ず、この実験で使用する精製ラクターゼを調製した。
（精製ラクターゼの調製）
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）５０ｋｇを、限外ろ過膜（旭化成株式会社製ＡＣＰ膜）を用いてその導電率が３ｍＳｖ以下となるまで加水脱塩した。これに水を加えて全量１２５Ｌとした。次いで、あらかじめ１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）にて平衡化しておいたイオン交換樹脂（トーソー株式会社製ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ、４０ｃｍφ、５０Ｌ）に吸着させた。５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）４０Ｌにて洗浄し、次いで１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００Ｌでラクターゼを溶出させた。この際、フラクションを２０Ｌずつに分画した。各フラクションのラクターゼ活性（ＦＣＣ ＩＶ法による； Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｄｅｘ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｊｕｌｙ １ｓｔ， １９９６， Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｄｅｘ， ｐ．ｐ．８０１−８０２）及びアリールスルファターゼ活性（蛍光法による；詳細は下記のとおり）を測定し、アリールスルファターゼの低減した画分を回収、混合し、限外ろ過膜（旭化成株式会社製ＡＣＰ膜）を用いて濃縮し、ラクターゼ濃縮液を得た。この濃縮液に５０％（ｗ／ｗ）となるようグリセリンを加え、精製ラクターゼ製剤を得た。
ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）と、上記のようにして調製された精製ラクターゼ製剤であっていずれもＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が５，０００乃至５，５００ＮＬＵ／ｇであるものについて、アリールスルファターゼ活性（蛍光法；詳細は下記のとおり）を測定したところ、精製ラクターゼ製剤のアリールスルファターゼ活性は、精製前の１／８４０であった（後記表６を参照のこと）。
（様々なアリールスルファターゼ夾雑率の酵素製剤の調製）
上記のようにして調製した精製ラクターゼ製剤と、ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を適宜混合して、様々なアリールスルファターゼ夾雑率のラクターゼ製剤を調製し、ラクターゼ活性（ＦＣＣ ＩＶ法による）とアリールスルファターゼ活性（比色法及び蛍光法による）とを測定した。
（比色法でのアリールスルファターゼ活性の測定）
ラクターゼ製剤０．５ｍＬに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルスルフェイトの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）溶液０．５ｍＬを加え、３７℃で３時間反応させた。これに１．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
別途、ｐ−ニトロフェノールを０乃至０．５ｍＭの濃度で含有する水溶液を用意した。これらの各溶液０．５ｍＬに１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）溶液０．５ｍＬを加え、さらに１．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えて測定用サンプルを得た。４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
検量線から、反応液１ｍＬ中に含有されているｐ−ニトロフェノールの濃度を求め、さらに３で割り（反応時間が３時間であるため）、反応時間が１時間である場合のｐ−ニトロフェノールの濃度を算出した。次いで、この濃度から、反応液１ｍＬ中に含有されているｐ−ニトロフェノールの量を算出（単位：ｎｍｏｌｅ）し、さらに２倍（ラクターゼ製剤使用量は０．５ｇであり、これを１ｇ当たりに換算するため）することにより、アリールスルファターゼ活性を算出した。１Ｕは、１時間に１ｎｍｏｌｅのｐ−ニトロフェノールを生成させる活性であり、アリールスルファターゼ活性は、単位「Ｕ／ｇ−酵素製剤」で表される。
（蛍光法でのアリールスルファターゼ活性の測定）
ラクターゼ製剤を０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、１％（ｗ／ｖ）溶液を得た。この１％溶液０．５ｍＬに２ｍＭ ４−メチルウンベリフェリルスルフェイトカリウム水溶液０．５ｍＬ加え、３７℃で３時間反応させた。これに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えて反応を停止させ、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定した。
別途、４−メチルウンベリフェロンを０乃至４μＭの濃度で含有する０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用意した。これらの各溶液１．０ｍＬに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えて測定用サンプルを得た。励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて蛍光強度を測定し、検量線を作成した。
検量線から、反応液１ｍＬ中に含有されている４−メチルウンベリフェロンの濃度を求め、さらに３で割り（反応時間が３時間であるため）、反応液の容量から反応中に生成した４−メチルウンベリフェロンの絶対量を算出した。さらに２００倍（ラクターゼ製剤使用量は０．５×０．０１＝０．００５ｇであり、これを検体（ラクターゼ製剤）１ｇ当たりに換算するため）することにより、アリールスルファターゼ活性を算出した。１Ｕは、１時間に１ｎｍｏｌｅの４−メチルウンベリフェロンを生成させる活性であり、アリールスルファターゼ活性は、単位「Ｕ／ｇ−酵素製剤」で表される。
（結果）
結果を表６に示す。比色法では、アリールスルファターゼの含有量が少なくなると、測定することができなかったが、蛍光法では、比色法の測定限界の約１／１００の濃度域まで正確に測定することができた。
［実施例８］アリールスルファターゼ活性測定における蛍光法とＷＯ０７／０６０２４７（特表２００９−５１７０６１）に記載の方法との比較と、風味官能試験（その１）
ＷＯ０７／０６０２４７には、夾雑するアリールスルファターゼが１９単位（ＷＯ０７／０６０２４７において規定された単位）以下のラクターゼ製剤は、牛乳の滅菌後に乳糖を分解させるために添加された場合に異臭を生じさせない旨が記載されている。しかし、これは、ラクターゼの反応日数を２日間と限定して行った試験の結果に基づく見解である。一方、現実のロングライフミルクにラクターゼ製剤を添加した場合、１ヶ月以上の長期にわたって酵素反応が進行すると考えられる。そこで、様々な夾雑率でアリールスルファターゼを含有するラクターゼ製剤を調製し、それらを牛乳に添加し、所定の日数経過後に風味の確認を行った。
（様々なアリールスルファターゼ夾雑率のラクターゼ製剤の調製）
様々な夾雑率のアリールスルファターゼを含有するラクターゼ製剤Ａ乃至Ｅは、実施例７で調製した精製ラクターゼ製剤と、選択されたアリールスルファターゼ活性を１００単位（ＷＯ０７／０６０２４７に記載の単位）含むＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を適宜混合して調製した。
調製されたラクターゼ製剤Ａ〜Ｅのアリールスルファターゼ活性を、ＷＯ０７／０６０２４７に記載の方法と、上記実施例７に示した蛍光法で測定した。また、ラクターゼ活性をＦＣＣ ＩＶ法で測定した。結果を表７に示す。ここで、ＷＯ０７／０６０２４７に記載の単位とは、△ＯＤ４１０×１０６／時間／ＮＬＵのことである。
（風味官能試験）
ＷＯ０７／０６０２４７の実施例４を参照し、市販牛乳（加熱殺菌したもの；殺菌条件：１３０℃ ２秒）に、ラクターゼが２０，０００ＮＬＵ／Ｌ−牛乳となるように、ラクターゼ製剤Ａ〜Ｅの各々を加え、３０℃に保存した。保存２日後、１ヶ月後及び３ヶ月後に、ラクターゼ製剤を添加していない牛乳とラクターゼ製剤を添加した牛乳の風味官能試験を行った。
風味官能試験は、盲検試験で実施した。１１〜１３人のパネラーが、一定期間保存後の牛乳の臭いを嗅ぎ、さらには口に含み、違和感のある臭いの有無を判断した。臭いを感じないものを０点（−）、感じるものを１点（＋）、強く感じるものを２点（＋＋）として採点して評価を行った。まとめた結果を表８に示す。
ラクターゼ製剤による反応期間（即ち、牛乳の保存期間）２日間では、製剤Ｅのみが明確な異臭を示した。これはＷＯ０７／０６０２４７の記載と一致した。しかしながら、反応期間が１ヶ月以上となると、製剤Ｃ及びＤにおいても異臭が感知された。このことは、ラクターゼ製剤のロングライフミルク等における使用を考えた場合、アリールスルファターゼ活性をＷＯ０７／０６０２４７に記載の単位で検出限界の８単位としても、十分に異味、異臭をコントロールできないことを示すものである。
一方、製剤Ａ及びＢでは、反応期間が１ヶ月でも３ヶ月でも異臭は感知されなかった。ラクターゼ製剤のロングライフミルクへの使用を考えた場合、１ヶ月以上の反応期間を想定する必要がある。よって、そのような用途では、ラクターゼ製剤Ａ又はＢ（すなわち、本発明の方法によるアリールスルファターゼ活性／ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が０．０２％以下のもの）を使用することが好ましく、ラクターゼ製剤Ａの使用がさらに好ましいことが明らかとなった。また、ラクターゼ製剤ＡやＢと同程度のアリールスルファターゼ活性値は、本明細書に記載した蛍光分析法又はそれと同等以上の感度を示す分析法で測定することが必要であることも明らかとなった。
［実施例９］アリールスルファターゼ産生能が低減された変異株の取得
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株を、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、１％グルコース、２％ペプトン）１０ｍＬに、１白金耳植菌し、この菌懸濁液を３０℃に保存して培養し、対数増殖期となったらその培地を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を、６００ｎｍにおける吸光度が０．５となるように滅菌水に分散させた。この菌懸濁液に、紫外線を、ＵＶランプにて１５秒間照射した。遠心分離によって菌体を回収し、ＹＰＤ培地に混合分散させた。菌体を含むＹＰＤ培地から適量を採り、ＹＰＤ寒天平板培地に塗布した。３７℃にて７日間、静置培養を行った。生育してきたコロニーを少量かきとり、これをザイモリエース（生化学バイオビジネス株式会社製）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液１ｍＬに混合した。３０℃にて２時間反応させ、細胞壁を破壊した。その後、遠心分離を行い、上清を回収した。
上清のラクターゼ活性（ＦＣＣ ＩＶ法）及びアリールスルファターゼ活性（実施例７に記載の蛍光法による）を測定した。アリールスルファターゼ活性／ラクターゼ活性を算出し、その値が小さいもの選択した。
選択された株について、上記の変異処理と選別を繰り返すことにより、二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株に存在する二つのアリールスルファターゼ遺伝子の中の一つが機能不全となった変異株を取得することができた（ＳＭ１１８２株）。なお、「二つのアリールスルファターゼ遺伝子の中の一つが機能不全となった」との判断は、ＳＭ１１８２株の培養上清のアリールスルファターゼ活性値が、親株であるＧ１４−４２７株の培養上清のアリールスルファターゼ活性値の約１／２であったことによる。
さらに、得られた変異株（ＳＭ１１８２株）を親株として変異処理を行い、もう一方のアリールスルファターゼ遺伝子についても機能不全となった、すなわちアリールスルファターゼ活性が０の変異株を取得した（ＳＦ−８１株）。
親株であるクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株と、上記のようにして得られた変異株２種を、それぞれ、ＹＰＤ培地（７０ｍＬ／フラスコ）にて、２６℃で４日間振とう培養した。
その後、培養液に２ｍｇ／ｍＬとなるようザイモリエース（生化学バイオビジネス株式会社製）を加え、３０℃にて２時間反応させ、細胞壁を破壊した。遠心分離により上清を回収し、ＦＣＣ ＩＶ法によりラクターゼ活性を、また、実施例７に記載の方法でアリールスルファターゼ活性を測定した。結果を表９に示す。
［実施例１０］宿主株の取得
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株を、ＹＰＤ培地１０ｍＬに、１白金耳植菌し、３０℃にて対数増殖期まで生育させた。培地を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を、６００ｎｍにおける吸光度が０．５となるように滅菌水に分散させた。この菌懸濁液に、紫外線を、ＵＶランプにて１５秒間照射した。遠心分離によって菌体を回収し、ＹＰＤ培地に混合分散させた。菌体を含むＹＰＤ培地から適量を採り、ＹＰＤ寒天平板培地に塗布した。３７℃にて４日間、静置培養を行った。生育してきたコロニーをＳＤ培地（０．６７％アミノ酸を含まないイーストナイトロジェンベース、２％グルコース、２％寒天）にレプリカし、生育してこないものを選択した。
これらのＳＤ培地では生育しない株を、もとのＹＰＤ寒天平板培地より２０ｍｇ／Ｌ Ｌ−メチオニンを含むＳＤ培地に塗布し、生育してくるものをＬ−メチオニン要求株（７−１９株）とした。
７−１９株を、ＹＰＤ培地１０ｍＬに、１白金耳植菌し、３０℃にて対数増殖期まで生育させた。培地を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を、６００ｎｍにおける吸光度が０．５となるように滅菌水に分散させた。この菌懸濁液に、紫外線を、ＵＶランプにて１５秒間照射した。遠心分離によって菌体を回収し、ＹＰＤ培地に混合分散させた。菌体を含むＹＰＤ培地から適量を採り、ＹＰＤ寒天平板培地に塗布した。３７℃にて４日間、静置培養を行った。生育してきたコロニーを２０ｍｇ／Ｌ Ｌ−メチオニンを含むＳＤ培地にレプリカし、生育してこないものを選択した。
これらのＬ−メチオニンを含むＳＤ培地で生育しない株を、もとのＹＰＤ寒天平板培地より、２０ｍｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジン及び２０ｍｇ／Ｌ Ｌ−メチオニンを含むＳＤ培地に塗布し、生育してくるものをＬ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン二重栄養要求株（８−２３株）とした。取得された栄養要求変異株の生育について、表１０に示す。
［実施例１１］アリールスルファターゼを産生しない遺伝子二重破壊株の取得
（宿主株の取得）
実施例１０で取得したＬ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン二重栄養要求性変異株である８−２３株について、それぞれの栄養要求性が、酢酸リチウム法にて導入したＨＩＳ４遺伝子及びＭＥＴ６遺伝子により相補されることを確認した。
（ゲノムＤＮＡの取得）
二倍体菌株であるクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株をＹＰＤ培地にて培養した。得られた培養液より、ＧｅｎとるくんＴＭ（酵母用）（タカラバイオ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。操作は、ＧｅｎとるくんＴＭ（酵母用）の説明書の記載に従って行った。
（アリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターの構築）
アリールスルファターゼ遺伝子のオープン・リーディング・フレームが含まれた断片が取得されるように、プライマーＳｕＣ−Ｆ及びＳｕＣ−Ｒを設計した。これらを含む、使用したプライマーの配列は、表１１に示すとおりであった。
先に調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いて次に示す条件によりＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を取得した。なお、ポリメラーゼとして、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標；タカラバイオ株式会社製）を用い、操作はその添付文書に従って行った。
（ＰＣＲ条件）
Ｓｔａｇｅ１（１サイクル） ９４℃ ３分
Ｓｔａｇｅ２（３０サイクル） ９４℃ １分
５４℃ １分
７２℃ ３分
Ｓｔａｇｅ３（１サイクル） ７２℃ １０分
４℃に保持
得られた断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＴＭ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡株式会社製）にて精製し、その後ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とライゲーション反応を行わせた。ライゲーション反応には、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いた。使用法はそれぞれの添付文書に従った。その後、ハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７（１９８３））にて調製したＥ．ＣｏｌｉＤＨ５α株のコンピテントセルを形質転換し、得られた形質転換体の培養液より、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒＴＭ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡株式会社製）を用いてプラスミドを抽出した。使用法は添付文書に従った。その結果、目的の断片がサブクローニングされたプラスミドｐＧＳｕＣが得られた。
さらに、プライマーＢＧＬＨＩＳ４−Ｆ及びＨＩＳ４−Ｒを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＨＩＳ４遺伝子を含む断片を取得した。ＰＣＲ反応については、前述の方法に従った。図３に示すように、得られたＨＩＳ４遺伝子を含む断片をＢｇｌ ＩＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、ｐＧＳｕＣのＢｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このようにして構築したプラスミドを、ｐｄＳｕＣ１と名付けた。構築時の各種方法は、前述の方法と同様であった。
また、ＭＥＴ６遺伝子をマーカーとしたアリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターを構築するために、５’側にアリールスルファターゼ遺伝子の相同配列を４０塩基付加したプライマーＳｕＣｄ−Ｍ６Ｆ及びＳｕＣｄ−Ｍ６Ｒを設計した。アリールスルファターゼ遺伝子の相同配列は、オープン・リーディング・フレーム上に２ヶ所存在する制限酵素ＣｌａＩ部位付近とした。図４に示すように、これらのプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＭＥＴ６遺伝子の両端にアリールスルファターゼの相同配列を持つ断片を取得した。得られた断片をｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、ｐｄＳｕＣＭ６を得た。構築時の各種方法は、前述の方法と同様であった。
（アリールスルファターゼ遺伝子破壊ベクターを用いたＬ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン二重栄養要求性８−２３株の形質転換）
図５に、形質転換体構築の模式図を示す。プラスミドｐｄＳｕＣ１を、ＮｃｏＩ及びＡａｔＩＩで処理して直鎖状にし、それを用いて８−２３株を酢酸リチウム法により形質転換し、２０μｇ／ｍｌのメチオニンを添加したＳＤ培地で生育する形質転換体ＳｕＣＤ株を取得した。
次に、プラスミドｐｄＳｕＣＭ６をＣｌａＩで処理して直鎖状にし、それを用いてＳｕＣＤ株を酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＤ培地で生育する形質転換体ＳｕＣＤＤ５−２株を得た。
（親株及び形質転換株のＤＮＡのサザン・ブロッティング）
得られた形質転換体を、それぞれＹＰＤ培地にて培養し、その培養液よりＧｅｎとるくんＴＭ（酵母用）（タカラバイオ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化後、サザン解析を行った。プローブはアリールスルファターゼ遺伝子のＡａｔＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を用い、核酸の標識と検出には、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）を用い、使用法は添付文書に従った。
サザン・ブロッティングの結果を図６に示す。レーン１が親株Ｇ１４−４２７株、レーン２が形質転換体ＳｕＣＤＤ５−２株、レーン３が形質転換体ＳｕＣＤ株である。レーン３には、アリールスルファターゼ遺伝子とＨＩＳ４遺伝子を含む断片のバンド（１２．１ｋｂ）とともに、レーン１と同じ位置（７．８ｋｂ）にもバンドが検出され、アリールスルファターゼ遺伝子の一方のみが破壊されていることが確認された。一方、レーン２では、７．８ｋｂのバンドが５．３ｋｂにシフトしており、アリールスルファターゼ遺伝子二重破壊株であることが確認された。
（アリールスルファターゼ遺伝子二重破壊株のアリールスルファターゼ活性の検出）
親株である二倍体菌株のクリベロマイセス・ラクティスＧ１４−４２７株及び上記のようにして構築したＳｕＣＤＤ５−２株を、それぞれＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２１０ｒｐｍにて７２時間、振とう培養した。培養液に２ｍｇ／ｍｌとなるようにザイモリエース（生化学バイオビジネス株式会社製）を加え、３０℃に２時間反応させ、細胞壁を破壊した。遠心分離により上清を回収し、ＦＣＣ ＩＶ法によってラクターゼ活性を、そして実施例７に記載の方法でアリールスルファターゼ活性を測定した。結果を表１２に示す。
ＳｕＣＤＤ５−２株の培養液には、ラクターゼは含まれているが、アリールスルファターゼは含まれていないか、含まれていたとしてもその活性が蛍光法による測定において検出されないような微量であることが明らかとなった。即ち、ＳｕＣＤＤ５−２株は、ラクターゼの生産性は維持しているが、アリールスルファターゼの生産性は０であるか又は殆どないことが確認された。
［実施例１２］ＳＦ−８１株及びＣＢＳ２３５９株を用いた酵素製剤の調製
実施例９で得たＳＦ−８１株（アリールスルファターゼ産生能が低減された二倍体変異株）及びＣＢＳ２３５９（一倍体菌株）を、それぞれ、７％コーンスチーブリカー、２％乳糖を含有するラクターゼ生産用培地に接種し、３０℃、２１０ｒｐｍにて９６時間、振とう培養し、その後、遠心分離により菌体を回収した。菌体に滅菌精製水を加え、ガラスビーズと超音波により、回収菌体の細胞壁を破壊した。このようにして得られた菌体と精製水等を含む混合物を遠心分離にかけ、上清を回収した。得られた上清中のラクターゼ活性を、実施例７に記載の蛍光法で測定した。その結果、ＳＦ−８１株の活性を１００％として、ＣＢＳ２３５９株の相対活性は２％であった。
前記上清を硫安分画し、限外ろ過膜で濃縮した。その結果、ＳＦ−８１株菌体からは、濃縮の程度により、ラクターゼ活性がそれぞれ、約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００ＮＬＵ／ｇのラクターゼ製剤が得られた。一方、同様の方法で濃縮を行ったが、ＣＢＳ２３５９株からは、１，０００ＮＬＵ／ｇ以上のラクターゼ活性を示す製剤は得られなかった。
［実施例１３］ 酵素製剤の調製
ＳＦ−８１株を、７％コーンスチーブリカー、２％乳糖を含有するラクターゼ生産用培地に接種し、３０℃、２１０ｒｐｍにて９６時間、振とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。菌体に滅菌精製水を加え、ガラスビーズと超音波により、回収菌体の細胞壁を破壊し、遠心分離により上清を回収した。上清を硫安分画し、限外ろ過膜で濃縮することにより、ラクターゼ活性が約５，０００ＮＬＵ／ｇのラクターゼ製剤を得た。このラクターゼ製剤のアリールスルファターゼ活性は、本発明の測定法（蛍光法）によると、１Ｕ／ｇ以下であった。
［実施例１４］風味官能試験（その２）
（様々なアリールスルファターゼ夾雑率のラクターゼ製剤の調製）
実施例１３に記載の方法でＳＦ−８１株から製造したラクターゼ製剤そのもの、及びこれにＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（合同酒精株式会社製ラクターゼ製剤；液体）を適宜混合して、実施例７に示した蛍光法で測定したアリールスルファターゼ活性が１乃至２０Ｕ／ｇのラクターゼ製剤５種を調製した。また、各ラクターゼ製剤のラクターゼ活性を、ＦＣＣ ＩＶ法によって測定した。
（風味官能試験）
実施例８同様、市販牛乳に、ラクターゼが２０，０００ＮＬＵ／Ｌ−牛乳となるように、上記ラクターゼ製剤５種の各々を加え、３０℃に保存した。保存１ヶ月後に、ラクターゼ製剤を添加していない牛乳とラクターゼ製剤を添加した牛乳を比較する風味官能試験を、実施例８と同様の方法で行った。結果を表１３に示す。
表１３に示された結果より、本発明に係る方法で測定したアリールスルファターゼ活性は、５Ｕ／ｇ以下であることが好ましいことがわかった。また、ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性（単位：ＮＬＵ／ｇ）を基準として、本発明に係る方法で測定したアリールスルファターゼ活性（単位：Ｕ／ｇ）の割合は、０．１％以下であることが好ましいことも明らかとなった。

Claims (1)

  1. ラクターゼ遺伝子を有し且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている酵母の二倍体菌株又は酵母のラクターゼ遺伝子が導入され且つアリールスルファターゼ蛋白の発現が制限されている遺伝子組換え微生物の培養後の菌体又は微生物体及び／又は培養液を原料として製造されたラクターゼ製剤であって、当該ラクターゼ製剤は、ＦＣＣ ＩＶ法によるラクターゼ活性が４，０００ＮＬＵ／ｇ以上であり、且つ、当該ラクターゼ活性を基準として、工程（１）乃至（１０）を含む下記の方法で測定し、計算したアリールスルファターゼ活性（単位：Ｕ／ｇ）が０．１％以下であることを特徴とするラクターゼ製剤：
    アリールスルファターゼの活性測定方法：
    （１）アリールスルファターゼの存在が予測される検体を、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で適宜希釈し、サンプルとする。
    （２）４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウムを２ｍＭ濃度で含有する水溶液を調製する。
    （３）サンプルと４−メチルウンベリフェロンスルフェイトカリウム水溶液とを、１：１（容量基準）で混合し、３７℃にて３時間反応させる。
    （４）反応液に、反応液と同量（容量基準）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させ、測定用サンプルとする。
    （５）励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて、蛍光強度を測定する。
    （６）４−メチルウンベリフェロンを、０．５Ｍ塩化カリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させ、適切な濃度の溶液とし、（４）と同様に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、（５）と同様の条件で蛍光強度を測定する。
    （７）（６）より、検量線を作成する。
    （８）（５）で測定された蛍光強度と（７）で作成された検量線から、測定用サンプルの４−メチルウンベリフェロン濃度を算出し、それを３で割り、反応時間が１時間であった場合の４−メチルウンベリフェロン濃度を求める。さらに、反応液の容量から、１時間の反応中に生じた４−メチルウンベリフェロン量を算出する。
    （９）こうして算出された４−メチルウンベリフェロン量は、（１）で調製したサンプルに含有されていた検体量に基づくものであるので、検体１ｇ当たりの４−メチルウンベリフェロン量に換算する。
    （１０）基質と酵素との反応時間１時間あたりの４−メチルウンベリフェロン生成量が１ｎｍｏｌｅであった場合を１ユニット（Ｕ）とし、単位は、検体、即ち酵素製剤１ｇ当たりのユニット量、即ち「ユニット（Ｕ）／ｇ」で表す。
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