本发明的目的是分离具有改进的耐热性,良好的热稳定性和耐受表面活性剂的β-半乳糖苷酶的编码基因,及用上述基因生产高热稳定性β-半乳糖苷酶的工业方法。
概括起来讲,本发明的第一方面涉及源自Pyrococcus furiosus的分离的耐SDS高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。本发明的第二方面涉及根据本发明第一方面的基因,它编码具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其部分并具有高热稳定性β-半乳糖苷酶活性的片段。本发明的第三方面涉及根据本发明第一方面的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2中所示。本发明的第四方面涉及一种耐SDS的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因,它能与根据本发明第二方面的基因杂交。本发明的第五方面涉及一种克隆高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的方法,它包括根据本发明第1-4方面之一的基因或其部分用作探针或引物。本发明的第六方面涉及高热稳定性β-半乳糖苷酶的生产方法,它包括培养转化子,该转化子中已导入了含有根据本发明第一方面的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的重组质粒,然后从培养物中收获高热稳定性β-半乳糖苷酶。
含本发明中的编码高耐热β-半乳糖苷酶的分离DNA的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因,可通过使用粘性质粒载体的表达克隆方法筛选得到。表达克隆是一种可被用于在无靶酶一级结构的任何信息的情况下克隆某些酶的编码基因的方法。例如,用表达克隆方法克隆了Pyrococcus Woesei的支链淀粉酶基因(WO 92/02614)。但该方法不能应用于所有类型的酶,因为在质粒载体用于该方法时,需要非常适当的限制酶;它必须将靶基因切得足够小以插入质粒载体中,而又不在靶基因的内部切割。另外,因为需要几次克隆,这种方法很复杂。
因此,本发明者试图通过用Pyrococcus furiosus基因组DNA构建的粘性质粒文库中筛选β-半乳糖苷酶活性,来分离β-半乳糖苷酶基因,该粘性质粒载体中插入的DNA片断(35-50kbp)要比质粒载体中的大。通过使用粘性质粒载体,用限制酶切在编码酶的靶基因内部的危险性降低,并且需测试的克隆数减少。相反,产生了检测不到酶活性的危险,这是因为粘性质粒载体在宿主生物中的考贝数比质粒载体的少,因而酶的表达水平低。
本发明者的目标是热稳定性极高的靶酶,并使制备仅含热稳定蛋白的溶胞产物的方法和个别培养粘性质粒文库中的转化子的方法结合起来。将这组溶胞产物称为“粘性质粒蛋白文库”。使用该文库检测酶活性,比使用转化子的菌落检测敏感性提高,可消除如宿主蛋白或酶活性抑制的本底不良影响。
本发明者研究了源自Pyrococcus furiosus的粘性质粒蛋白文库,并得到一个在1%SDS存在下具有β-半乳糖苷酶活性(尽管弱)的粘性质粒克隆。
更进一步,本发明者充分利用各种基因工程技术从插入上述分离的克隆中的DNA片断中分离了编码高热稳定性β-半乳糖苷酶的基因,并测定了该基因的DNA序列。另外,本发明者还用该基因成功地表达了高热稳定性β-半乳糖苷酶,这样完成了本发明。
顺便讲,这里描述的使用粘性质粒载体的表达克隆方法不能应用于所有热稳定性酶,结果由靶酶的性质决定。例如,本发明者试图分离Pyrococcus furiosus的编码α-葡糖苷酶的基因[Journal ofBacteriology,172,3654-3660(1990)],但没有分离到该基因。
现在对本发明进行更详细的描述。
对用于本发明的微生物没有特别要它能产生高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。例如,属于P属的菌株,即高热稳定性细菌,如Pyrococcus furiocus DSM ′yrococcus woesei DSM3773适用于此,这两种菌株都可从Deutsche Sammalung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH得到。
例如,可按下述方式制备Pyrococcus furiosus基因的粘性质粒文库。首先,Pyrococcus furiosus DSM 3638的基因组基因用适当的限制酶如Sau 3AI(由Takara Shuzo公司生产)部分消化。按35-50Kbp的大小分离后,所得每个DNA片断与适当的粘性质粒载体如TripleHelix粘性质粒载体(由Stratagene生产)连结。通过体外包装方法先将Pyrococcus furiosus基因组DNA片段包装在λ-噬菌体颗粒中,然后用所得噬菌体溶液转化适当的大肠杆菌株如大肠杆菌DH 5αMCR(由BRL生产),从而得到目标粘性质粒文库。然后从转化子的几个菌落制备了粘性质粒DNA,这样证实了35-50Kbp的基因组DNA片段在转化子中的插入。一般地讲,可培养300-700个菌落。
每个菌落培养后,收集培养后的细胞。通过在100℃处理10分钟、超声、及在100℃再处理10分钟,将这些细胞加工成粘性质粒蛋白文库。然后在1%SDS存在下测定所得溶胞产物中的β-半乳糖苷酶活性,从而筛选到了在上述处理后还保持稳定的高热稳定性β-半乳糖苷酶的表达菌落。例如用邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或乳糖(均由Nacalai Tesque制造)作为底物在如95℃的反应温度下测定β-半乳糖苷酶活性。然后,分析显示活性的转化子的插入粘性质粒DNA中的片段。
由本发明者制备的500个转化子中一个转化子显示活性,插入其粘性质粒DNA中的片断用各种限制性酶裂解,将形成的片断插入适当的载体中。例如,从上述粘性质粒克隆制得的粘性质粒DNA用HindIII(由Takara Shuzo公司生产)消化,将所得DNA片断插入质粒载体pUC18(由Takara Shuzo公司生产)的HindIII位点。这样可得到重组质粒。
然后,将此重组质粒导入大肠杆菌JM 109(由Takara Shuzo公司生产)中,从而得到转化子,培养并收获转化子。检测β-半乳糖苷酶(细胞内表达蛋白)的活性。对细胞及在100℃进行热处理10分钟两次所得溶胞产物进行检测,用邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷作为底物在1%SDS存在下进行。在95℃下反应进行30分钟,来测定活性。
发现上述转化子的溶胞产物无活性。然后,用限制酶AccI、BglII、Eco RV、PstI和HincII(均由Takara Shuzo公司生产)中的每一种以相同方法进行活性研究,但没发现活性。
使用能够产生比使用上述限制酶更长的DNA片段的限制酶进行相同的研究,例如ClaI(由Takara shuzo公司生产)。但发现在向质粒插入阶段插入片段中有缺失,并发现无活性。后来用SmaI(由Takara Shzo公司生产)以相同方法进行研究。结果,在其中插入了约4Kbp的DNA片段的质粒中发现了活性。本发明者称此质粒为质粒pTG2S-112。用该质粒转化大肠杆菌JM109,可得到本发明者称为大肠杆菌JM 109/pTG2S-112的转化子。培养该转化子,培养后收集细胞。在这些细胞中表达的β-半乳糖苷酶在1%SDS存在下100℃下10分钟处理两次,仍保持稳定。因此,其中已表达了靶酶高热稳定性β-半乳糖苷酶。
质粒pTG2S-112进一步用各种限制酶消化,将形成的片断插入适当载体中。将形成的重组质粒导入大肠杆菌JM109中,培养并收获所得转化子。检测β-半乳糖苷酶(细胞内表达蛋白)的活性。这样可找出表达高热稳定性β-半乳糖苷酶的质粒。
例如,质粒pTG2S-112用限制酶Eco 81I(由Takara Shuzo公司生产)和SmaI消化。纯化所形成的约2.0Kbp的Eco 81I-SmaI DNA断片,并插入pUC18中,从而得到重组质粒。
另外,利用pTG2S-112的载体(pUC18)区的多克隆位点,用限制酶Eco 81I和KpnI(由Takara Shuzo公司生产)消化。纯化形成的约4.7Kbp的Eco81I-KpnI DNA片断,将末端钝化并自身连结。这样可得到含上述Eco 81I-SmaI DNA片断的重组质粒。
将此质粒导入大肠杆菌JM109中,检测所形成菌落的高热稳定β-半乳糖苷酶活性。从显示活性的菌落制备了一质粒,该质粒称为质粒pTG2ES-105。因此质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTG2ES-105。该菌株已于1994年4月20日保藏在Nation-al Institute of Bioscience和Human-Technology Agency of IndustrialScience and Technology L(1-3,Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken305,JAPAN),保藏号为FERM BP-5023,质粒pTG2ES-105的限制性酶切图谱示于图1中,其中粗实线代表插入质粒pUC18中的片断。
本申请的基因(DNA)可由第三者从已知的公开的商业上可得到的微生物菌株Pyrococcus furiosus和Pyrococcus woesei(请见1993年的DSM目录,特别是DSM3638和DSM3773)开始,并按照本申请说明书中所解释的步骤得到。因此,本发明的基因没有必要保藏。但为保全起见,申请人已于1995年6月7日将大肠杆菌JM109/pTG2ES-105保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC-M95030。
图2表示源自Pyrococcus furiosus并插入质粒pTG2ES-105中的DNA片断的限制性酶切图。即图2表示按照本发明所得高热稳定性β-半乳糖苷酶基因形式之一的限制性酶切图。通过培养称为大肠杆菌JM109/pTG2ES-105的转化子然后收集所得细胞,其中表达的β-半乳糖苷酶在1%SDS存在下100℃10分钟进行两次热处理后仍稳定。因此,其中已表达了靶酶高热稳定性β-半乳糖苷酶。
通过培养已导入了含高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的重组质粒的转化子,如大肠杆菌JM109/pTG2S-112或大肠杆菌JM109/pTG2ES-105,积累高热稳定性β-半乳糖苷酶。高热稳定性β-半乳糖苷酶从培养物中的纯化可这样进行,如超声破碎所收集细胞,离心溶胞产物,并将形成的上清液进行凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析等。
当在本发明中欲纯化高热稳定性β-半乳糖苷酶时,在超声处理之前或之后对细胞进行热处理有利,因为这样可使污染蛋白变性,从而可容易地进行纯化。
通过表达本发明的基因如整合在质粒pTG2ES-105中的基因,所得到的高热稳定性β-半乳糖苷酶具有如下理化性质。(1)作用:
它具有水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖的作用。另外,它具有水解邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷为邻硝基苯酚和半乳糖的作用。
更进一步,它在含1%SDS的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中具有水解邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷为邻硝基苯酚和半乳糖的作用。(2)测定酶活性的方法:[(2)-a]
在酶活性测定中,可通过分光光度法检测水解所形成的邻硝基苯酚来测定酶的邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷水解活性。即,将5μl本发明的酶溶液加到含112mM 2-巯基乙醇、1mM氯化镁和1%SDS的199μl100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。然后向其中加入含0.4M邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的1μl二甲基亚砜溶液。在95℃反应进行30分钟后,加入100μl0.1M碳酸钠终止反应,测定反应混合物在410nm处的吸光度,从而确定所形成的邻硝基苯酚的量。按照本发明所得高热稳定性β-半乳糖苷酶的一个单位表示在95℃1分钟内可使410nm处的吸光度增加1.0的酶量。本发明中所得酶在pH7.0、95℃下,1%SDS存在下具有分解邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的活性。[(2)-b]
β-半乳糖苷酶的邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷水解活性还可按下述方法测定。将含1M邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的15μl二甲亚砜溶液加到分光光度计的石英小池中的含酶的1485μlMcIlvaine缓冲液(pH5.0)中开始反应,使邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的终浓度达10mM。在分光光度计上监视410nm处的吸光度对时间的变化来检测反应。基于每分钟410nm处吸光度的变化,用前述测定的吸光系数计算每分钟所释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的量。
用蛋白检测试剂盒(由Bio-Rad Laboratories制造)进行酶蛋白检测。(3)热稳定性:
用与[(2)-b]中所述方法相符的下列步骤测定了热稳定性。将含酶的1.5ml McIlvaine缓冲液(pH5.0)在90℃加热一段给定时间,从中取出1485μl所形成的溶液的样品。将此样品在分光光度计小池中于90℃加热5分钟,向其中加入15μl含1M邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的二甲亚砜溶液,以开始反应。通过计算每分钟410nm处吸光度的变化并用上述所测邻硝基苯酚的消光系数确定每分钟所释放的邻硝基苯酚的量,以跟踪该反应。甚至在90℃热处理180分钟后,本发明酶的残余活性比为约100%,如图3所示。即图3显示酶的稳定性,纵轴表示残余活性比(%),横轴表示酶在90℃下处理的时间。(4)最佳pH:
按照[(2)-b]中所述方法测定最佳pH。将测定了给定范围内pH值(pH4-8)的、含10mM邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的2990μl McIlvaine缓冲液,在小池中90℃下培养,向小池中加入10μl含酶(150单位/ml)的McIlvaine缓冲液(pH5.0)开始反应。在分光光度计上监视410nm处吸光度对时间的变化来检测反应。测定每分钟410mm吸光度的变化,基于此变化用每一pH条件下测定的吸光系数计算出每分钟释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为一分钟内催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酚量。如图4所示,在pH4.5-5.5范围内,本发明的酶显示其最大活性。图4是显示酶的最佳pH的曲线,其中纵坐标为比活性(单位/mg蛋白),横坐标表示pH值。(5)最佳温度:
按照[(2)-b]中所述方法测定最佳温度。将2990μl含10mM邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的McIlvaine缓冲液,在指定温度下(45℃-90℃)在小池中培养,加入10μl酶(150单位/ml)开始反应。在分光光度计上监视410nm处吸光度对时间的变化来检测反应。测定每分钟410mm吸光度的变化,基于此值,用在每一温度下测得的吸光系数计算出每分钟所释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酶量。如图5所示,本发明的酶在95℃以上显示其最大活性。图5为显示酶的最佳温度的图,其中纵座标为比活性(单位/mg蛋白),横坐标为处理温度(℃)。(6)pH稳定性
按[(2)-b]中所述方法测定pH稳定性。将含150单位/ml酶的McIlvaine缓冲液(pH3.0-8.0)和含150单位/ml酶的甘氨酸缓冲液(pH8.0-11.0)在90℃孵育10分钟。为起动反应,向含10mM邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷并在90℃预培养的2990μl McIl-vaine缓冲液(pH5.0)中,加入10μl酶溶液。
在分光光度计上监视410nm处吸光度的变化来检测反应。测定410nm处吸光度每分钟内的变化,基于此值,用前述测定的吸光系数计算出每分钟所释放的邻硝基酚。一单位酶活性定义为每分钟内释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酶量。如图6所示,本发明的酶甚至在pH范围5.0-10.0范围内90℃下处理10分钟后仍保持其活性。图6为显示酶的pH稳定性的图,其中纵座标为残余活性比(%),横座标为处理pH。(7)各种表面活性剂的影响:
与[(2)-b]中所述方法相符,按下述步骤测定了各种表面活性剂存在下酶的热稳定性,十二烷基硫酸钠[由Nacalai Tesque生产]用作阴离子表面活性剂,溴化十六烷基三甲基铵(Nacalai Tesque生产)用作阳离子表面活性剂,聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(由Wako Pure Chemical Industries Ltd生产)作为非离子表面活性剂,胆酸钠(由Nacalai Tesque生产)用作两性表面活性剂。
将反应溶液中上述表面活性剂的浓度调至1%。将1.5ml含酶的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)在90℃加热一定时间,从中取出1485ml形成的溶液作为样品。样品在分光光度计小池中90℃下加热5分钟,向其中加入15μl含1M邻硝基苯基-β-D-吡喃半孔糖苷的二甲亚砜溶液,开始反应。通过计算每分钟410nm吸光度的变化并从前述测得的邻硝基苯酚的消光系数确定每分钟所释放的邻硝基苯酚的量,以跟踪该反应。如图7所示,除溴化十六烷基三甲基铵外,在表面活性剂存在下于90℃热处理120分钟后,本发明的酶的残余活性比为约80%。特别是,在十二烷基硫酸钠(常用于使蛋白质变性)存在下,于90℃热处理120分钟后,本发明的酶的残余活性比为约90%。图7是显示在每一表面活性剂存在下酶的热稳定性的图,其中纵轴表示残余活性比(%),横轴表示在90℃处理酶的时间。
图7中,空方块表示溴化十六烷基三甲基铵,实方块表示十二烷基硫酸钠,空圈表示聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯,实圈表示胆酸钠。(8)底物特异性:
底物特异性可以用表1中所示的对硝基苯酚衍生物测定。方法如下所示:
将1485μl含酶的150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)加入分光光度计的石英小池中。将15μl表1所示0.1M底物溶液加入酶溶液中并混合。在分光光度计上马上监视410nm处吸光度对时间的变化,检测反应。用不含酶的1485μl 150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)作为空白对照,如上所述进行测定。检测时,反应在90℃下进行。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μl对硝基苯酚所需酶量。
按照上述方法,测定了对于对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(Glcp-βNp)、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(Galp βNp)、对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(ManpβNp)、对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(XylpβNp)、对硝基苯基-β-D-吡喃果糖苷(FucpβNp)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(GalpαNp)(均由Nacalai Tesque生产)的水解活性。
结果示于表1中。表1表示对上述底物的比活性(单位/mg蛋白)和相对活性性(%)。
表1:酶的比活性底物 比活性 相对活性
(单位/mg) (%)GalpβNp 192 100GlcpβNp 512 267ManpβNp 12.8 6.7XylpβNp 51.2 26.7FucpβNp 0 0GalpαNp 0 0
另外,用下列天然底物测试了酶的酶解活性。具体地讲,乳糖、纤维二糖和麦芽糖(均由Nacalai Tesque生产)的每一种作为底物溶解在1ml 150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中,终浓度为50mM。将羧甲基纤维素(由Wako Paro Chemical Industries,Ltd.)、微晶纤维素Avicel(由Funakoshi Pharmaceutical co;Ltd制造)和昆布多糖(由Nacalai Tesque生产)的每一种溶解在此缓冲液中,终浓度为17g/l。将上述每种底物溶液加热至90℃,向其中加入15μl(约45mu)的含酶磷酸盐缓冲液,在90℃进行反应30分钟。用冰冷却终止反应。用Glucose B Test Wako(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd生产)测定反应液中所释放的葡萄糖的量。表2显示当以乳糖水解活性作为100%时所测的其它底物的相对活性(%)。
表2:酶的府物特异性底物 相对活性(%)乳糖 100纤维二糖 136甲基-β-D-葡糖苷 10.2水杨苷 69.6熊果苷 6.1蔗糖 1.9麦芽糖 1.9羧甲基纤维素 0微晶纤维素Avicel′ 0昆布多糖 1.3(9)氨基酸序列特征:对于质粒pTG2ES-105的β-半乳糖苷酶基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:1),用DNASIS的NBRF)PIR(由Hitachi Software Engl-neering制造)对氨基酸序列同源性进行研究。
将本发明酶和Pyrococcus furiosus产生的其它高热稳定性β-半乳糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)与Sulfolobus Solfataricus中存在的两类热稳定性β-半乳糖苷酶的序列(SEQ ID NO:4和SEQID NO:5)进行了对比,令人惊异地是第一次清楚显示此两类热稳定性酶之间的某些同源序列保留在此高热稳定性酶中。图8和图9是示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列与ESQ ID NO:3到SEQ IDNO:5的序列的对比图。如图8和图9中所示的十个不同的序列,本发明者均称之为“盒序列”(盒NO.1到盒NO.10),为上述的保留序列。基于上述这些序列可以克隆其它高热稳定性β-半乳糖苷酶基因,例如,使用从盒NO.7,8和10的氨基酸序列制备的引物或探针,其中氨基酸序列分别由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所定义。
图8和图9中的四排氨基酸序列,从上到下分别相当于SEQ IDNO:3(第一排)、SEQ ID NO:1(第二排)、SEQ ID NO:4(第三排)和SEQ ID NO:5(第四排)。
如上的详细说明,本发明提供编码高热稳定性β-半乳糖苷酶的基因,和用所述基因生产高热稳定性β-半乳糖苷酶的基因工程方法。该酶具有高热稳定性,并耐SDS,特别在高温下食品加工和制糖中有用。
另外,按照本发明分离的基因或其部分可用作筛选探针或引物。与本发明酶类似的所有酶的基因,将通过用所得基因作为探针在严格条件下进行杂交而得到,这些酶的序列与本发明的酶稍有不同,但预期具有相似的酶活性。此外所用术语“在严格条件下”指探针和其上固定了DNA的尼龙膜的杂交在含6×SSC(1×SSC为8.76g氯化钠和4.41g柠檬酸钠溶解在1升水中的溶液)、1%SDS、100μg/ml鲑鱼精子DNA和5×Denhardt′s(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和ficoll,均为0.1%)的溶液中,于65℃进行20小时。
其序列与本发明酶的序列稍有不同但预期具有相似酶活性的、与本发明酶相似的所有酶的基因,还可用以上所得基因作为引物进行扩增而得到。
另外,可用具有编码上述氨基酸序列-由热稳定性β-半乳糖苷酶和高热稳定性β-半乳糖苷酶共同保留的氨基酸序列-的核苷酸序列的寡聚物作为探针进行筛选。即,通过在具有如上所述的相同组成的杂交溶液中在低于Tm值5℃的温度下进行杂交,每个寡聚物在温度下与靶DNA形成互补链,可分别从嗜热和高嗜热细菌得到任何预期具有本发明酶相同的酶活性的与本发明酶类似的酶的热稳定性和高热稳定性基因。另一方面,可通过用上述寡聚物作为引物进行基因扩增来进行筛选。
可用下述方法确定上述筛选所得基团是否预期具有与本发明酶相同的酶活性的类似于本发明酶的酶。按常规步骤将所得基因连结在确保在适当宿主中表达的表达载体上,并导入宿主中,从而得到转化子。培养该转化子,用本文所述方法测定培养物或其无细胞提取物的β-半乳糖苷酶活性。这样,可确定该基因是否预期具有与本发明酶相同的酶活性的类似于本发明酶的酶的基因,本发明酶的酶活性指在SDS存在下90℃处理120分钟后,残余活性比为约90%。
经本发明的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的表达所得高热稳定性β-半乳糖苷酶,可通过在适当的生长培养基中培养Pyrococcus属的菌株如Pyrococcus furiosus DSM3638或Pyrococcus woesei DSM3773,并从细胞或培养液中纯化靶酶而得到。为了培养Pyrococcus属的细菌,可用通常用于培养高热稳定性细菌的方法。可向培养基中加入所用菌株可利用的任何营养物。例如,淀粉可用碳源,胰胨和蛋白胨可用作氮源。其它营养物,可使用醇母膏等。此培养基可含有金属盐如镁盐、钠盐或作为微量元素的铁盐。使用人工海水制备此培养基是有利的。此培养基优选为不含固体硫元素的透明培养基,因为这样的培养基易于通过测定培养物的光密度来监视细胞的生长。可进行静止培养或搅拌下培养。例如,可进行通气培养[WO 90/11352]或透析培养[Applied and Environmental Microbiology,55,2086-2088(1992)]。一般培养温度优选为95℃左右。通常在约16小时内培养物中集累相当大量的高热稳定性β-半乳糖苷酶。当然应根据所选菌株和培养基组成确定培养条件,以取得最大产率的高热稳定性β-半乳糖苷酶。
可通过例如离心或过滤从培养液中收集细胞、然后破碎细胞来收获本发明的高热稳定性β-半乳糖苷酶。可通过例如超声破碎、珠破碎或溶菌酶处理进行细胞破碎。使用这些技术,可从细胞中提取高热稳定性β-半乳糖苷酶。根据所选用的细菌,使用能够产生最好的提取效果的方法提取此酶,这样得到了粗酶溶液。结合纯化酶的通用技术,例如用硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析,可从所得粗酶溶液中分离高热稳定性β-半乳糖苷酶。
例如,从Pyrococcus furiosus DSM 3638的培养细胞制备的粗酶溶液用DEAE Toyopearl M650离子交换剂层析,从中流脱出活性流份。将所得活性流份倾入HIC-Cartridge柱(由Bio-Rad Laboratories生产)从中流脱出活性流份。将所得活性流分倾入羟磷灰石柱(由Bio-Rad Laboratories生产),从中洗出活性流份。这样就得到了高热稳定性β-半乳糖苷酶。
下列实施例将进一步说明本发明,但不构成任何限制。实施例1:[1]Pyrococcus furiosus基因组DNA的制备
按下列方式培养Pyrococcus furiosus DSM3638。
将包括1%胰胨、0.5%酵母膏、1%可溶性淀粉、3.5%JamarinS Solid(由Jamarin Laboratory生产)、0.5%Jamarin S Liquid(由Ja-marin Laboratory生产)、0.003%MgSO4、0.001%NaCl、0.0001%FeS-4·7H2O、0.0001%CoSO4、0.0001%CaCl2·7H2O、0.0001ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppmH3BO3、0.1ppmNa2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2升培养基装入2升培养基瓶中,120℃消毒20分钟。吹入氮气消除溶解氧以后,将上述菌株接种在此培养基中,在95℃静止温育16小时。温育后,离心收集细胞。
然后将所收集细胞悬浮在4ml含25%蔗糖的0.05M Tris-HCl(pH,8.0)中。向所得悬液中加入0.8ml溶菌酶[5mg/ml,0.25MTris-HCl(pH8.0)]和2ml0.2M EDTA。在20℃保持1小时后,加入24ml SET溶液[150mM NaCl,lmM EDTA、20mM Tris-HCl(pH8.0)]。再向其中加入4ml5%SDS和400μl蛋白激酶K(10mg/ml),在37℃反应1小时。反应完成后,用氯仿/苯酚萃取反应混合物,用乙醇沉淀。这样制得了约3.2mg基因组DNA。(2)粘性质粒蛋白文库的制备
将400μg Pyrococcus furiosus DSM 3638基因组DNA在Sau 3AI的缓冲液[5mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、lmM二硫苏糖醇(dithiothreitol DTT),100mM NaCl]中,用Sau 3AI部分消化,通过梯度离心按大小分级分离。将lμg Triple Helix粘性质粒载体用Bam HI裂解,与140μg上述分级分离所得35-50kbp的基因组DNA片段混合。用连结试剂合Ligation kit(由Takara Shuzo公司生产)连结后,用Gigapack II Gold(Stratagene生产)按体外包装方法将Pyro-coccus基因组DNA片段包装在λ-噬菌体颗粒中。用部分所得噬体溶液转化大肠杆菌DH5αMCR,从而形成粘性质粒文库。
从几个所得菌落制备了粘性质粒DNA,并证实它们都具有适当大小的插入片段。然后,将500个菌落悬浮在2ml含0.01%氨苄基霉素的L-液体培养基中,于37℃摇动培养16小时。离心培养物,收集沉淀的细胞。将这些细胞悬浮在20mM Tris-HCl(pH8.0)中,于100℃热处理10分钟。然后,将其超声处理,再于100℃热处理10分钟。离心后,收集上清液,称为粗酶溶液。这样制备了500个粘性质粒蛋白文库。(3)含β-半乳糖苷酶基因的粘性质粒的选择
测定实施例1-(2)中所得到的500个粘性质粒蛋白文库的粗酶溶液的β-半乳糖苷酶活性。具体讲,将10μl粗酶溶液加到含112mM 2-巯基乙醇、1mM氯化镁和1%SDS的99.5μ100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。然后加入含0.4M邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的0.5μl二甲亚砜溶液于95℃反应30分钟、加入0.1M碳酸钠终止反应。测定410nm处的吸光度,从而确定邻硝基苯酚的形成量。
从500个粘性质粒蛋白文库中选出了一个具有β-半乳糖苷酶活性的粘性质粒蛋白,相应地鉴别了一个粘性质粒DNA。(4)质粒pTG2S-112的制备和热稳定性β-半乳糖苷酶的生产
将实施例1-(3)中所得一个粘性质粒DNA用限制酶SmaI完全消化。另外,将载体pUC18在其SmaI位点裂解,然后未端脱磷酸化。用连结试剂盒将上述SmaI消化的DNA片段与载体质粒连结。用所形成的反应溶液转化大肠杆菌JM109。将转化子悬浮在含0.01%氨苄青霉素的L-液体培养基中,于37℃摇动培养16小时。离心所形成的培养物,回收的细胞悬浮在含1mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液中。将此悬液于100℃加热10分钟,超声处理,于100℃再加热10分钟,离心得到上清液作为粗酶溶液。用实施例1-(3)中相同的活性检测方法检测β-半乳糖苷酶活性,只是使用5μl该粗酶溶液。发现此粗酶溶液显示耐100℃20分钟的热处理的高热稳定性β-半乳糖苷酶活性。
将相应于该粗酶溶液的质粒称为质粒pTG2S-112。将质粒pTG2S-112转入大肠杆菌JM109中,得到一转化子,该转化子称为大肠杆菌JM109/pTG2S-112。(5)质粒pTG2ES-105的制备
实施例1-(4)中所得到的含约4kbp的SmaI DNA片断的质粒pTG2S-112,用限制酶Eco81I和KpnI完全消化。纯化形成的约4.7kbp的Eco81I-KpnI DNA片断,钝化未端并自连结。
所得质粒称为pTG2ES-105,将该质粒转入大肠杆菌JM109中,得到一转化子。该转化子称为大肠杆菌JM109/pTG2ES-105。该菌株已于1994年4月20日保藏在National Institute of Bioscienceand Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology(1-3,Higashi 1 Chome Tsukuba-Shi Ibaraki-ken 305,JAPAN),保藏号为FERM BP-5023。
图1显示质粒pTG2ES-105的限制性酶切图谱,图2显示按本发明从Pyrococcus furiosus得到的插入质粒pTG2ES-105中的约2.0kbp的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的限制性酶切图谱。实施例2:(高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列的测定)
用Deletion Kit for Kilo Sequence试剂盒(由Takara Shuzo公司生产),从上述含高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的插入质粒pTG2ES-105中的约2.0kbp片段,制备了缺失突变体,测定了所形成片段的核苷酸序列。
用双脱氧方法进行核苷酸序列的测定,其中使用了Bca BastDidexy Sequencing Kit试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)。
SEQ ID NO:2显示含高热稳定性β-半乳糖苷酶基因并插入质粒pTG2ES-105的DNA片段的核苷酸序列。SEQ ID NO:1显示由上述核苷酸序列编码的高热稳定性β-半乳糖苷酶的氨基酸序列。实施例3:(1)高热稳定性β-半乳糖苷酶的生产
实施例1中所得大肠杆菌JM109/pTG2ES-105(FERM MP-5023),其中已导入了含本发明的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的质粒pTG2ES-105,将其悬浮在含0.01%氨苄青霉素的5ml L-液体培养基中,于37℃摇动培养16小时。将培养物悬浮在1.21相同组成的培养基中,于37℃摇动培养16小时。离心所形成的培养物,将回收的细胞悬浮在含1mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将悬浮液于100℃加热10分钟,超声处理,再于100℃加热10分钟,离心得到上清液作为粗酶溶液。
pH5.0和90℃下,此粗酶溶液中的β-半乳糖苷酶的比活性为约740单位/mg。
利用本发明的高热稳定β-半乳糖苷酶基因可在商用规模有利地生产耐SDS的高热稳定性β-半乳糖苷酶。
另外,利用本发明的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因或其部分作为探针或引物,可得到各种生物衍生物的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。
序列表SEQ IN NO:1长度:491类型:氨基酸链型:单链形态:线性分子类型:肽序列描述:SEQ ID NO:1Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly1 5 10 15Phe Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp
20 25 30Trp Trp Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu
35 40 45Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu
50 55 60Tyr Lys Gln Asp His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys
65 70 75Ile Arg Gly Gly Ile Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr
80 85 90Phe Asp Val Lys Val Asp Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile
95 100 105Ile Ser Val Asp Val Pro Glu Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys
110 115 120Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser
125 130 135Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe Ile Leu Asn Leu Tyr His
140 145 150Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro Ile Ala Val Arg Lys
155 160 165Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp Glu Lys Thr
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185 190 195Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val
200 205 210Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro Pro
215 220 225Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu
230 235 240Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser
245 250 255Glu Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro
260 265 270Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys
275 280 285Asp Tyr Glu Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp
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305 310 315Asp Gly His Leu Val Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu
320 325 330Arg Gly Gly Phe Ala Lys Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly
335 340 345Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu
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365 370 375Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro His Tyr Leu Val Ser His
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395 400 405Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln
410 415 420Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp Phe Glu Thr
425 430 435Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg Glu Ile
440 445 450Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala Asp
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485 490SEQ ID NO:2长度:1476类型:核酸链型:双链形态:线性分子类型:基因组DNA序列描述:SEQ ID NO:2ATGAAGTTCC CAAAAAACTT CATGTTTGGA TATTCTTGGT CTGGTTTCCA GTTTGAGATG 60GGACTGCCAG GAAGTGAAGT GGAAAGCGAC TGGTGGGTGT GGGTTCACGA CAAGGAGAAC 120ATAGCATCAG GTCTAGTAAG TGGAGATCTA CCAGAGAACG GCCCAGGATA TTGGCACCTC 180TATAAGCAAG ATCATGACAT TGCAGAAAAG CTAGGAATGG ATTGTATTAG AGGTGGCATT 240GAGTGGGCAA GAATTTTTCC AAAGCCAACA TTTGACGTTA AAGTTGATGT GGAAAAGGAT 300GAAGAAGGCA ACATAATTTC CGTAGACGTT CCAGAGAGTA CAATAAAAGA GCTAGAGAAA 360ATTGCCAACA TGGAGGCCCT TGAACATTAT CGCAAGATTT ACTCAGACTG GAAGGAGAGG 420GGCAAAACCT TCATATTAAA CCTCTACCAC TGGCCTCTTC CATTATGGAT TCATGACCCA 480ATTGCAGTAA GGAAACTTGG CCCGGATAGG GCTCCTGCAG GATGGTTAGA TGAGAAGACA 540GTGGTAGAGT TTGTGAAGTT TGCCGCCTTC GTTGCTTATC ACCTTGATGA CCTCGTTGAC 600ATGTGGAGCA CAATGAACGA ACCAAACGTA GTCTACAATC AAGGTTACAT TAATCTACGT 660TCAGGATTTC CACCAGGATA TCTAAGCTTT GAAGCAGCAG AAAAGGCAAA ATTCAACTTA 720ATTCAGGCTC ACATCGGAGC ATATGATGCC ATAAAAGAGT ATTCAGAAAA ATCCGTGGGA 780GTGATATACG CCTTTGCTTG GCACGATCCT CTAGCGGAGG AGTATAAGGA TGAAGTAGAG 840GAAATCAGAA AGAAAGACTA TGAGTTTGTA ACAATTCTAC ACTCAAAAGG AAAGCTAGAC 900TGGATCGGCG TAAACTACTA CTCCAGGCTG GTATATGGAG CCAAAGATGG ACACCTAGTT 950CCTTTACCTG GATATGGATT TATGAGTGAG AGAGGAGGAT TTGCAAAGTC AGGAAGACCT 1020GCTAGTGACT TTGGATGGGA AATGTACCCA GAGGGCCTTG AGAACCTTCT TAAGTATTTA 1080AACAATGCCT ACGAGCTACC AATGATAATT ACAGAGAACG GTATGGCCGA TGCAGCAGAT 1140AGATACAGGC CACACTATCT CGTAAGCCAT CTAAAGGCAG TTTACAATGC TATGAAAGAA 1200GGTGCTGATG TTAGAGGGTA TCTCCACTGG TCTCTAACAG ACAACTACGA ATGGGCCCAA 1260GGGTTCAGGA TGAGATTTGG ATTGGTTTAC GTGGATTTCG AGACAAAGAA GAGATATTTA 1320AGGCCAAGCG CCCTGGTATT CAGAGAAATA GCCACTGAAA AAGAAATTCC AGAAGAATTA 1380GCTCACCTCG CAGACCTCAA ATTTGTTACC AAGAAAGTAG CCATTTCATT TTTTCTTTGT 1440TTTTTAACTC ATATTTTTGG GAAAATAAGA TCATAA 1476SEQ ID NO:3长度::510类型:氨基酸链型:单链形态:线性分子类型:肽序列描述:SEQ ID NO:3Met Phe Pro Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Gln Ser Gly Phe1 5 10 15Gln Phe Glu Met Gly Asp Lys Leu Arg Arg Asn Ile Asp Thr Asn
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20