CN101993864B

CN101993864B - 一种耐高温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101993864B
Application number: CN200910090497XA
Authority: CN
Inventors: 江正强; 张敏; 波丽特; 宋春雷; 李里特
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-08-13
Filing date: 2009-08-13
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2029-08-13
Also published as: CN101993864A

Abstract

本发明公开了一种β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。该蛋白是如下a)-c)中任一所述的蛋白质：a)由序列表中序列2的自氨基末端第1-656位氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)或b)的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码β-半乳糖苷酶的由a)或b)衍生的蛋白质。实验结果表明，本发明的β-半乳糖苷酶的最适反应温度为80℃，最适pH值为5.5；用本发明的β-半乳糖苷酶水解5％的乳糖得到的主要产物为半乳糖和葡萄糖，水解高浓度乳糖则可生成低聚半乳糖。本发明的β-半乳糖苷酶具有良好的耐热特性，可用于分解乳糖和生产功能性低聚半乳糖。

Description

一种耐高温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种耐高温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶又称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galacto-hydrose，EC 3.2.1.23)，商品名为乳糖酶。该酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解，有些种类的β-半乳糖苷酶具有构型保持酶的作用机制，在水解乳糖分子的同时，还具有转半乳糖基的作用，即以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，生成半乳糖苷键，被用于合成功能性低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶可广泛应用于食品、制药、免疫、疾病诊断及环境检测等方面。例如，在食品行业中，β-半乳糖苷酶可以用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖；在乳味面包制作中，添加β-半乳糖苷酶，能增加面包甜度，提高酵母产气量，使面包更加膨胀，而且水解乳中的半乳糖有利于褐变，可以改善面包的色泽。另外，β-半乳糖苷酶可以牛乳或乳清中的乳糖为底物，水解并转糖苷得到低聚半乳糖。在制药业中，β-半乳糖苷酶作为酶类药物，适用于婴儿的各种消化不良症。在环境检测方面，大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶活性检测可以用于快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄物污染的程度。

国内对β-半乳糖苷酶的研究起步较晚，是20世纪80年代以后才开始的。主要工作集中在β-半乳糖苷酶产生菌的筛选、发酵工艺的研究、酶的提取纯化和酶学性质研究等方面。近年来开始利用基因克隆等方法研究β-半乳糖苷酶的重组表达。例如，王元火等将环状芽孢杆菌中的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中表达后，Km比原始酶小285倍，Vmax比原始酶大5.4倍(王元火，姚斌，袁铁铮，操时树，张伟，王亚茹，范云六.环状芽孢杆菌乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析.农业生物技术学报，2003，11(1)：83-88.)。刘爱兵等将乳酸克鲁维酵母中的β-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中表达，胞内外均检测到酶活(刘爱兵，张伟，李名扬.乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达.西南农业大学学报(自然科学版)，2004，26(5)：636-639.)。张灏等将嗜热脂肪芽孢杆菌中的耐热β-半乳糖苷酶基因克隆到枯草芽孢杆菌穿梭质粒pMA5中，比酶活是原来的2倍(张灏，夏雨，傅晓燕，陈卫，丁霄霖.耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达.无锡轻工业大学学报，2003，22(6)：1-4.)。段文娟等以嗜热古细菌Pyrococcus furiosus的基因组DNA为模板，克隆获得乳糖酶基因celB，将celB基因插入到表达载体pET-30a(+)中并转化大肠杆菌BL21，celB基因在大肠杆菌中获得高效表达；乳糖酶基因celB表达的乳糖酶蛋白CELB的分子质量约为58kDa，CELB是耐高温酶(段文娟，杨娇艳，李卓夫，张伟，张志芳.来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析.中国农业科技导报，2008，10(02)76-81.)。龚月生等将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+))中，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；该重组耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃(龚月生，刘锦妮，王晶，杨明明，袁新宇.耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008，36(10)，59-66.)。张敏等研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(BgalB)(张敏，江正强，唐荦，丛倩千，李里特.海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达.微生物学通报，2008，35(4)，507-511.)。专利号为ZL95107176.9的专利中公开了一种分离自Pyrococcusfuriosus的耐SDS的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。专利号为200610001785.X的专利中公开了一种耐高温乳糖酶的制备方法，是将耐高温乳糖酶基因构建到杆状病毒运载载体上，得到重组杆状病毒运载载体；通过体内或体外重组，将耐高温乳糖酶基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组杆状病毒；用所得到的重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行耐高温乳糖酶的表达。

应用β-半乳糖苷酶的许多工业都是高温环境，所以，亟需一种耐高温的β-半乳糖苷酶来满足工业生产的需要。来源于嗜热微生物的β-半乳糖苷酶由于热稳定性好、抗有机溶剂，对于转糖苷反应的平衡是非常有利的，高温使酶的初始反应速率提高，底物的溶解性增加，从而使水分活度降低，与加入的有机溶剂一起，提高转糖苷反应的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-半乳糖苷酶及其编码基因。

本发明所提供的β-半乳糖苷酶，名称为BgalC，来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2的自氨基末端第1-656位氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)将a)或b)的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码β-半乳糖苷酶的由a)或b)衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由662个氨基酸残基组成，其分子量约为77kDa。为了使a)中的BgalC便于纯化，可在a)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a)中的β-半乳糖苷酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a)中的β-半乳糖苷酶的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′末端第3-1970位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述β-半乳糖苷酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述β-半乳糖苷酶的编码基因具体可为如下1)-5)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第3-1970位脱氧核糖核苷酸；

2)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第3-1988位脱氧核糖核苷酸；

3)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

4)在严格条件下可与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述β-半乳糖苷酶的DNA分子；

5)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述β-半乳糖苷酶的DNA分子。

所述步骤5)中的基因，与1)或2)或3)的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述β-半乳糖苷酶基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述β-半乳糖苷酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供一种制备β-半乳糖苷酶的方法。

本发明所提供的制备β-半乳糖苷酶的方法，是发酵培养上述含有β-半乳糖苷酶编码基因的重组菌，得到β-半乳糖苷酶。

上述方法还包括将所述β-半乳糖苷酶进行纯化的步骤。

所述纯化包括以下步骤：

1)将上述含有β-半乳糖苷酶编码基因的重组菌破壁，取上清液，用Ni-IDA或Ni-NTA进行纯化；

2)将经过步骤1)纯化的β-半乳糖苷酶用Sephacryl S-100过滤，得到β-半乳糖苷酶。

本发明的β-半乳糖苷酶可用于水解乳糖溶液或牛乳中的乳糖。

本发明从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8中扩增得到β-半乳糖苷酶编码基因，并将其转入大肠杆菌中，实验结果表明，本发明的β-半乳糖苷酶的最适反应温度为80℃，在温度不高于60℃条件下处理30min，几乎没有酶活损失；80℃时处理30min后还能残留75％以上的活力；其最适pH值为5.5；用本发明的β-半乳糖苷酶水解5％的乳糖得到的主要产物为半乳糖和葡萄糖，水解高浓度乳糖则可生成低聚半乳糖。本发明的β-半乳糖苷酶具有良好的耐热特性，可用于分解乳糖和生产功能性低聚半乳糖，适合于很多对温度要求高的工业环境，在生产中具有很大应用潜力。

附图说明

图1为β-半乳糖苷酶编码基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为经各步骤纯化后的β-半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳图。

图3为β-半乳糖苷酶的最适pH。

图4为β-半乳糖苷酶的最适温度。

图5为β-半乳糖苷酶水解乳糖的水解产物的TLC图。

图6为不同加酶量(A)和水解时间(B)对牛乳中乳糖水解率的影响。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、β-半乳糖苷酶编码基因BgalC的获得

以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(购自德国菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，保藏号DSM3109))的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：PT-BgalC-NcoI-FWD(正向引物)：5’-CCATGGTCGGCGTCTGTTACTATCCA-3’(含有NcoI酶切位点)，PT-BgalC-HindIII-Hi s-REV(反向引物)：5’-AAGCTTGCGTTCGTTTTCCTTCCATA-3’(含有HindIII酶切位点)。PCR反应体系为：水14.8μl、10×Ex Taq buffer 2μl、2.5mmol/L dNTP 1μl、100pmol/L正反向引物各0.5μl、模板1μl、Taq酶0.2μl；反应体系总体积为20μl。PCR反应的条件为：先94℃预变性5min；然后94℃30s，62℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，冷却至4℃备用。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光照射下，切下2000bp左右的目标DNA片段，然后采用QIAquick Gel Extration Kit(Qiagen)回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，将回收的DNA片段连入pMD18-T克隆载体中，将获得的重组载体命名为pMD-18T/BgalC。将重组载体pMD-18T/BgalC用限制性内切酶NcoI和HindIII进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。其中，M1为DNA分子Marker DL2000，M2为λ-EcoT 14I digest Marker，1为上述PCR扩增产物，2和5为用试剂盒回收的PCR扩增产物，3和4为重组载体pMD-18T/BgalC双酶切的产物。结果表明，上述PCR扩增产物的长度大小为2000bp左右，用试剂盒回收该基因片段，条带单一且浓度适当，可以用于接下来的连接实验。

将上述回收的DNA片段经NcoI和HindIII双酶切后与经过同样酶切的载体pET-28a(+)(购自Novagen公司)混合均匀，并加入T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)，16℃条件下连接4h，然后用热激法转入E.coli BL21(购自Novagen公司)的感受态细胞中，将100μl重组菌的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜，将生长出的单菌落标号，采用菌落PCR法筛选带有重组质粒的菌落。将获得的阳性重组质粒命名为pET28a/BgalC，将含有重组质粒pET28a/BgalC的重组菌命名为BL21-BgalC。将重组质粒pET28a/BgalC用NcoI和HindIII进行双酶切，测定酶切产物的DNA序列。测序结果表明，BgalC基因由1991对碱基组成，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的β-半乳糖苷酶BgalC由662个氨基酸组成，分子量约为77kDa，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

由于大肠杆菌的胞内蛋白较多，因此上述BgalC基因的3′末端含有6个His标签的编码序列，这样表达出的目标蛋白质上就带有6个His标签，利用His标签与Ni-NTA的亲和性，可将表达出的β-半乳糖苷酶进行亲和层析提纯，这样可以更方便快速地纯化β-半乳糖苷酶。

将上述得到的含有662个氨基酸残基的β-半乳糖苷酶与GenBank中已公布的不同来源的β-半乳糖苷酶进行同源性比对，结果表明，该序列与来源于T.petrophilaRKU-1和T.sp.RQ2的半乳糖苷酶(Genbank登录号为ABQ47564.1和ACB09959.1)同源性最高，达到94％，与来源于新阿波罗栖热袍菌DSM 4359的半乳糖苷酶(Genbank登录号AAC24217.1)的同源性为83％，而与其他来源的半乳糖苷酶的同源性小于59％。通过以上基因序列及其编码的蛋白质序列的同源性比较，得出来源于海栖热袍菌MSB8的BgalC蛋白属于42族β-半乳糖苷酶。

实施例2、β-半乳糖苷酶BgalC的制备及性质检测

一、β-半乳糖苷酶BgalC的制备

(一)酶的表达

取100μl上述实施例1获得的含有重组质粒pET28a/BgalC的重组大肠杆菌BL21-BgalC，接种于100ml含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h；再以10％的接种量转接到100ml含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，35℃振荡培养，当培养液的OD_600nm值达到0.5-0.6时，加入乳糖(诱导β-半乳糖苷酶的表达)，使其在培养液中的质量百分含量为1％，诱导培养24h后，离心收集细胞沉淀，再用超声波破碎仪破碎细菌细胞，离心收集上清即为β-半乳糖苷酶的粗酶液。同时以pET-28a(+)空载体作为对照。

(二)酶的纯化

1、热处理

将上述步骤(一)获得的粗酶液在70℃处理10min，然后冰水浴处理30min，再在4℃条件下12000rpm离心20min，取上清液，测定上清液中的酶活和蛋白含量。

2、Ni-IDA或Ni-NTA纯化

用平衡缓冲液(由50mmol/L pH8.0的磷酸缓冲液、0.3mol/L NaCl和20mmol/L咪唑组成)平衡Ni-IDA或Ni-NTA柱(1×7cm)；将上述步骤1的经70℃热处理过的粗酶液以1.0ml/min的速度过平衡好的Ni-IDA或Ni-NTA柱，用相同的平衡缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质；接着用50mmol/L咪唑洗至基线，有少量目标蛋白被洗下来，但从电泳图观察以杂蛋白为主，未收集；最后用200mmol/L的咪唑溶液洗脱，洗脱速度为1ml/min，收集洗脱的各管样品。

对上述收集的各管样品分别进行电泳，由于已知β-半乳糖苷酶的理论分子量，因此通过与低分子量标准蛋白的比较，即可判断目标蛋白在哪些管中存在，保留电泳图上含有目标蛋白的纯度类似的各管，超滤到1.0ml。

3、Sephacryl S-100过滤

用50mmol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液平衡Sephacryl S-100柱(购自美国GEHealthcare公司)，将上述步骤2获得的经Ni-IDA或Ni-NTA纯化后的1.0ml β-半乳糖苷酶样品上样于柱中，用50mmol/L、pH6.8的磷酸缓冲液以0.1ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱下来的液体。为确定蛋白的含量，测定洗脱下来的溶液的OD₂₈₀值(蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm，蛋白质OD₂₈₀值与其浓度成正比，故可测定蛋白质的含量)，并将峰值附近各管样品进行电泳，通过电泳确定经纯化后的β-半乳糖苷酶在哪些管中。

将以下各样品分别进行SDS-PAGE检测，样品包括：上述步骤(一)的粗酶液、步骤(二)的1中经热处理获得的酶液、步骤2中经Ni-IDA层析得到的酶液和步骤3中经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的酶液。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文献(Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature，1970，277：680-685)中所述进行。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4.5％，考马斯亮蓝染色显示蛋白带，低分子量标准蛋白与上述各样品在同一条件下电泳。结果如图2所示，其中，M为低分子量标准蛋白；1为步骤(一)的粗酶液，2为经热处理获得的酶液，3为经Ni-IDA层析得到的酶液，4为经SephacrylS-100凝胶过滤得到的酶液。结果表明，上述获得的蛋白与β-半乳糖苷酶的预期分子量相符(77kDa)。采用Edman化学降解法测定上述步骤(一)获得的蛋白N端的15个氨基酸序列，同时采用串联质谱法测定其C端的15个氨基酸序列，测序结果表明，测得的序列正确，证明上述步骤(一)获得的蛋白序列正确。

(三)酶活的测定

1、酶活的测定方法

参照文献(Miller JH.Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1972)中所述的方法进行酶活的测定，具体步骤如下：

向225μl含有pNP-β-半乳糖苷(pNPGal)(购自美国Sigma公司)的pH值7.0的50mmol/L的磷酸缓冲液(pNPGal在缓冲液中的终浓度为5mmol/L)中分别加入25μl上述步骤(一)得到的粗酶液或25μl上述步骤(二)的1中经热处理得到的酶液或25μl步骤(二)的2中经Ni-IDA层析得到的酶液或25μL步骤(二)中3的经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的酶液，70℃反应10min，然后加入750μl 2mol/LNa₂CO₃终止反应，冷却后410nm测定吸光值。

将1个酶活力单位(U)定义为：上述条件下每分钟释放出1μmol pNP所需的酶量。

2、蛋白含量的测定方法

采用Bradford法，如文献(Bradford MA.A rapid and sensitive method for thequantification of microgram quantities of protein using the principle of protein-dyebinding.Analytical Biochemistry，1976，72：48-254)中所述，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，绘制标准曲线。

按照上述文献中的方法分别测定粗酶液、经热处理获得的酶液、经Ni-IDA层析获得的酶液和经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的酶液中β-半乳糖苷酶的量、总酶活、比活，并计算回收率和纯化倍数。

其中，回收率＝各步骤的总酶活/粗酶的总酶活×100％；

纯化倍数＝各步骤比活/粗酶比活。

实验设三次重复，结果取平均数，结果如表2所示。

表2β-半乳糖苷酶的含量测定结果

蛋白含量以Bradford法测定，以BSA为标准。

酶活在70℃条件下测定，底物为5mmol/L pNPGal，缓冲液为50mmol/L pH7.0的磷酸。

三、β-半乳糖苷酶的酶学性质

(一)最适反应pH值的测定

将上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶，分别置于下述不同缓冲体系中，在70℃条件下，测定其酶活力。测定酶活的方法除了所用的缓冲体系不同外，其余步骤均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。

选择的pH值范围及缓冲体系如下：柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲体系(由终浓度为50mmol/L的柠檬酸三钠和终浓度为50mmol/L的柠檬酸组成)，pH 3-6；乙酸-乙酸钠缓冲体系(由终浓度为50mmol/L的乙酸钠和终浓度为50mmol/L的乙酸组成)，pH 4-5.5；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系(由终浓度为50mmol/L的磷酸氢二钠和终浓度为50mmol/L的磷酸二氢钠组成)，pH 6-8；MOPS(3-吗啉丙磺酸)缓冲体系(终浓度为50mmol/L)，pH 6.5-8.5；CHES(2-环己胺基乙磺酸)缓冲体系(终浓度为50mmol/L)，pH 8-11；CAPS(3-(环己胺)-1-丙磺酸)-缓冲体系(终浓度为50mmol/L)，pH 9-11。通过比较这些缓冲体系中β-半乳糖苷酶的活力差异，得出酶反应的最适pH值。

实验设三次重复，结果如图3所示。其中，“◆”为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲体系，“+”为乙酸-乙酸钠缓冲体系，“■”为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，“▲”为MOPS缓冲体系，“□”为CHES缓冲体系，“◇”为CAPS缓冲体系。

相对酶活的定义为：不同pH条件下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为5.5(柠檬酸-柠檬酸三钠)、70℃条件下，反应10min的酶活记作100％。结果表明，上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶的最适pH值为5.5。

(二)最适反应温度的测定

将上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶，在pH值为5.5的条件下，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃和100℃，测定各温度下的酶活力，比较得到酶的最适反应温度。测定酶活的方法除了温度和pH值不同外，其余步骤均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。

实验设三次重复，结果如图4所示。相对酶活的定义为：不同温度下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为5.5(柠檬酸-柠檬酸三钠)、80℃条件下，反应10min的酶活记作100％。结果表明，上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶的最适反应温度为80℃。

(三)pH值及温度稳定性测定

将上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶在不同温度下保温30min后，再于70℃、pH值为7.0(柠檬酸-柠檬酸三钠)的条件下测定残余酶活力。测定残余酶活力的方法除了pH值不同外，其余步骤均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。

实验设三次重复，结果表明，上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶在温度不高于60℃条件下处理30min后几乎没有酶活损失，80℃时保温30min后残留75％的活力，因此，该酶具有良好的温度稳定性。

将上述经Sephacryl S-100凝胶过滤得到的β-半乳糖苷酶在70℃的条件下对pH稳定性进行测定，结果表明，该酶在pH5.5-9.5的范围内能保持70％以上的酶活。

实施例3、利用β-半乳糖苷酶水解乳糖

以含有乳糖的50mM pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液做底物(该缓冲液中乳糖的终浓度为5％)，在其中加入上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶，酶的添加量为32U/ml底物溶液，将反应液于80℃水浴中保温8h，在不同时间(15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h)取样进行TLC分析。

TLC反应条件：硅胶板(60F 254，E.Merk，德国)在体积比为5∶3∶2的正丁醇-乙醇-水系统中展层2次后，在其表面均匀喷洒硫酸甲醇溶液(由硫酸和甲醇组成，二者的体积比为5∶95)，吹干后在100℃显色。标准品为葡萄糖、半乳糖和乳糖的混合物。

结果如图5a所示，其中，M表示葡萄糖、半乳糖和乳糖的混合物标准品。结果表明，上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶水解5％乳糖的终产物为半乳糖和葡萄糖，因此该酶可用于低乳糖牛奶的生产。

以含有不同浓度乳糖的50mM pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液做底物(缓冲液中乳糖的终浓度分别为2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％)，在上述缓冲液中分别加入上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶，酶的添加量为3.2U/ml底物溶液，将反应液于80℃水浴中保温4h，进行TLC分析。

结果如图5b所示，其中，M表示葡萄糖、半乳糖和乳糖的混合物标准品，1-7分别表示缓冲液中乳糖的终浓度为2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％的TLC反应结果。结果表明，上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶水解20％或更高浓度乳糖的终产物中有低聚半乳糖。

实施例4、利用β-半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖

取7.5ml牛乳(牛乳中乳糖的质量百分含量为4.56％)，在其中分别加入4U/ml、8U/ml、16U/ml、32U/ml、64U/ml和96U/ml的上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶，80℃水解4h后再加入无水乙醇，使乙醇在混合溶液中的终浓度为75％，终止水解反应。搅拌15min，再10000rpm离心10min，取上清液，HPLC测定乳糖的含量，计算乳糖水解率。乳糖水解率(％)＝(1-未水解乳糖/总乳糖)×100％。测定条件为：Sugar-D Waters色谱柱(4.6×250mm)，柱温40℃，流动相为乙腈∶水＝75∶25(体积比)，流速1ml/min。

实验设三次重复，不同加酶量对牛乳中乳糖水解效果的影响结果如图6a所示。结果表明，当加酶量为4U/ml时，乳糖水解率达56.51％；当加酶量为32U/ml时，乳糖水解率高达99.00％。

另外取7.5ml牛乳(牛乳中乳糖的质量百分含量为4.56％)，在其中加入64U/ml的上述实施例2获得的β-半乳糖苷酶，80℃分别水解0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h，然后再加入无水乙醇，使乙醇在混合溶液中的终浓度为75％，终止水解反应。搅拌15min，再10000rpm离心10min，取上清液，HPLC测定乳糖的含量，计算乳糖水解率。乳糖水解率(％)＝(1-未水解乳糖/总乳糖)×100％。测定条件同上。

实验设三次重复，不同水解时间对乳糖水解效果的影响结果如图6b所示。结果表明，在水解初期，上述实施例2制备的β-半乳糖苷酶具有很强的水解能力，在0.25h时乳糖水解率达56.71％，随着时间的延长，水解速度逐渐下降，可能是由于高温条件下酶活性逐渐降低，水解底物(乳糖)的含量不断减少，以及水解产物对酶的抑制作用逐渐加强造成的，在水解1.5h时，乳糖几乎完全被水解。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种耐高温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

<130>CGGNARZ92476

<160>2

<210>1

<211>1991

<212>DNA

<213>热袍属海栖热袍菌(Thermotoga maritima)

<400>1

ccatggtcgg cgtctgttac tatccagaac actggggaac agagaaagtt gaagaagact 60

tcagaaggat gaaagaactc gggatagagt acgtgaggat tggagagttc gcctggagca 120

ggatagagtc ggagcgtgga aagttcaact gggactggct cgacaaaaca cttgagctgg 180

cagagaagat ggggctcaag atcgtactgg gaactcccac agccacacct ccgaagtggc 240

tcatcgatga acacccggag atccttcccg ttgataaaga tggcagggtg aaaaattttg 300

gttccagaag acattattgc ttctccagcc ctgtttatag agaggaagtg aaaagaatcg 360

tcaccataat agtgaaaaga tacggaaaac acccggcagt cgcaggctgg cagacggaca 420

acgagtacgg ctgtcacgat acggtgaggt gctactgtcc gaggtgcaaa aaagccttcc 480

aaaaatggct ggaaagaaag tacgagggag acataaagaa attgaatgaa gcgtggggaa 540

cagtgttctg gagccaggag tatcgatcct tcgacgaaat agagcttccg aatctcaccc 600

ctgccgaccc gaacccgtcg catcttctcg actactacag gttagcctcc gaccaagtgg 660

tggaattcaa caagctccag gtggagataa taagggagta ttcgccggga agattcatca 720

cacacaattt catgtccggt ttcacagatt ttgatcatta caaactctcg aaagacctgg 780

atttcgcaac ctgggacaat tacccgctcg gacacaccct cgtttttctg agaatgaagg 840

gtgagacaaa aaatccgttc gacagagtgg gacacccgga catcatctca ttctcgcacg 900

atctgtaccg gggagtgggc agaggaagat tctgggtgat ggaacagcaa gcaggacctg 960

tgaactgggc tccttacaat ctctggcccg ccaagggagc ggtgagactc tggacgtggc 1020

aggcgttcgc acacggtgcg gaggtggtct cctacttcag atggagacag gcaccttttg 1080

cgcaggagca gatgcactct ggacttctgg caccggattc agcaccttac cctggatacc 1140

acgaggtaaa gcaggttttc gaggagctca aaaacatcga tatcaatgag cccgtggaaa 1200

gcgaagtggc acttgtcttc gattatgaaa cggcgtgggt cttctccata caaccgcacg 1260

gcgagggggt gaactacatc gatcttgtct tcagattcta cagtgccctc agaagactcg 1320

gtctgaacgt ggatatagta ccccctggat cttcactgga cggatacaaa atgatcgttg 1380

ttccaagcct tgccatcgtg aaggaggagg ttctggacac gttcaaaaaa tacgacggtc 1440

ttctcgtact tggcccaaga agcggaagca aaacagagac attccagata ccaccagaaa 1500

tgcccccagg tcttctcaag gagatcatac ccgttgaagt gagacaggtt gaaagccttg 1560

gagataatgt tgagacactt gtttggaacg gtaaggaata ccctgtctcg atatggagag 1620

aggatgtgga ccccaccatc acggaagtga tcgcaagatt caaagatggt tttggagcca 1680

tctttcgaaa ggaaaacgtc ttctaccttg ctttctggcc gaatggagac tttctcgtag 1740

atttctttga agcactttca aaagaatcag gaattgaaac gaaaaggatg ccagaaggag 1800

tacgcattca aaggagaggt gaatatgttt tttctttcaa tttcacctct gaggaggtag 1860

atttagaaat accaacgaaa gttcagatag ttctaggaga tcaaaagatt cctccctatg 1920

gactgctgat atggaaggaa aacgaacgca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc 1980

accaccactg a 1991

<210>2

<211>662

<212>PRT

<213>热袍属海栖热袍菌(Thermotoga maritima)

<400>2

Met Val Gly Val Cys Tyr Tyr Pro Glu His Trp Gly Thr Glu Lys Val

1 5 10 15

Glu Glu Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Leu Gly Ile Glu Tyr Val Arg

20 25 30

Ile Gly Glu Phe Ala Trp Ser Arg Ile Glu Ser Glu Arg Gly Lys Phe

35 40 45

Asn Trp Asp Trp Leu Asp Lys Thr Leu Glu Leu Ala Glu Lys Met Gly

50 55 60

Leu Lys Ile Val Leu Gly Thr Pro Thr Ala Thr Pro Pro Lys Trp Leu

65 70 75 80

Ile Asp Glu His Pro Glu Ile Leu Pro Val Asp Lys Asp Gly Arg Val

85 90 95

Lys Asn Phe Gly Ser Arg Arg His Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Val Tyr

100 105 110

Arg Glu Glu Val Lys Arg Ile Val Thr Ile Ile Val Lys Arg Tyr Gly

115 120 125

Lys His Pro Ala Val Ala Gly Trp Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Gly Cys

130 135 140

His Asp Thr Val Arg Cys Tyr Cys Pro Arg Cys Lys Lys Ala Phe Gln

145 150 155 160

Lys Trp Leu Glu Arg Lys Tyr Glu Gly Asp Ile Lys Lys Leu Asn Glu

165 170 175

Ala Trp Gly Thr Val Phe Trp Ser Gln Glu Tyr Arg Ser Phe Asp Glu

180 185 190

Ile Glu Leu Pro Asn Leu Thr Pro Ala Asp Pro Asn Pro Ser His Leu

195 200 205

Leu Asp Tyr Tyr Arg Leu Ala Ser Asp Gln Val Val Glu Phe Asn Lys

210 215 220

Leu Gln Val Glu Ile Ile Arg Glu Tyr Ser Pro Gly Arg Phe Ile Thr

225 230 235 240

His Asn Phe Met Ser Gly Phe Thr Asp Phe Asp His Tyr Lys Leu Ser

245 250 255

Lys Asp Leu Asp Phe Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Pro Leu Gly His Thr

260 265 270

Leu Val Phe Leu Arg Met Lys Gly Glu Thr Lys Asn Pro Phe Asp Arg

275 280 285

Val Gly His Pro Asp Ile Ile Ser Phe Ser His Asp Leu Tyr Arg Gly

290 295 300

Val Gly Arg Gly Arg Phe Trp Val Met Glu Gln Gln Ala Gly Pro Val

305 310 315 320

Asn Trp Ala Pro Tyr Asn Leu Trp Pro Ala Lys Gly Ala Val Arg Leu

325 330 335

Trp Thr Trp Gln Ala Phe Ala His Gly Ala Glu Val Val Ser Tyr Phe

340 345 350

Arg Trp Arg Gln Ala Pro Phe Ala Gln Glu Gln Met His Ser Gly Leu

355 360 365

Leu Ala Pro Asp Ser Ala Pro Tyr Pro Gly Tyr His Glu Val Lys Gln

370 375 380

Val Phe Glu Glu Leu Lys Asn Ile Asp Ile Asn Glu Pro Val Glu Ser

385 390 395 400

Glu Val Ala Leu Val Phe Asp Tyr Glu Thr Ala Trp Val Phe Ser Ile

405 410 415

Gln Pro His Gly Glu Gly Val Asn Tyr Ile Asp Leu Val Phe Arg Phe

420 425 430

Tyr Ser Ala Leu Arg Arg Leu Gly Leu Asn Val Asp Ile Val Pro Pro

435 440 445

Gly Ser Ser Leu Asp Gly Tyr Lys Met Ile Val Val Pro Ser Leu Ala

450 455 460

Ile Val Lys Glu Glu Val Leu Asp Thr Phe Lys Lys Tyr Asp Gly Leu

465 470 475 480

Leu Val Leu Gly Pro Arg Ser Gly Ser Lys Thr Glu Thr Phe Gln Ile

485 490 495

Pro Pro Glu Met Pro Pro Gly Leu Leu Lys Glu Ile Ile Pro Val Glu

500 505 510

Val Arg Gln Val Glu Ser Leu Gly Asp Asn Val Glu Thr Leu Val Trp

515 520 525

Asn Gly Lys Glu Tyr Pro Val Ser Ile Trp Arg Glu Asp Val Asp Pro

530 535 540

Thr Ile Thr Glu Val Ile Ala Arg Phe Lys Asp Gly Phe Gly Ala Ile

545 550 555 560

Phe Arg Lys Glu Asn Val Phe Tyr Leu Ala Phe Trp Pro Asn Gly Asp

565 570 575

Phe Leu Val Asp Phe Phe Glu Ala Leu Ser Lys Glu Ser Gly Ile Glu

580 585 590

Thr Lys Arg Met Pro Glu Gly Val Arg Ile Gln Arg Arg Gly Glu Tyr

595 600 605

Val Phe Ser Phe Asn Phe Thr Ser Glu Glu Val Asp Leu Glu Ile Pro

610 615 620

Thr Lys Val Gln Ile Val Leu Gly Asp Gln Lys Ile Pro Pro Tyr Gly

625 630 635 640

Leu Leu Ile Trp Lys Glu Asn Glu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

645 650 655

His His His His His His

660

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)所述的蛋白质：

b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

3)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.一种制备β-半乳糖苷酶的方法，是发酵培养权利要求7所述的重组菌，得到β-半乳糖苷酶。

9.权利要求1所述的蛋白在水解乳糖中的应用。