KR100545010B1 - 트리펩티딜 아미노펩티다제 생산의 감소 또는 제거 방법 - Google Patents

Abstract

다음을 포함하는 DNA 구조체에 의해 코딩되는 트리펩티딜 아미노펩티다제 (TPAP).

i) SEQ ID No. 1, 2 또는 3에서 보인 DNA 서열, 또는 ii) 부분적 TPAP를 코딩하는 DSM 9570의 DNA 서열, 또는 iii) SEQ ID NO. 1, 2 또는 3에서 보인 DNA 서열에 기초하여 또는 SEQ ID NO. 4 내지 14에서 보인 아미노산 서열에 기초하여 제조된 올리고누클레오티드 프로브에 혼성화하며, TPAP를 코딩하는 누클레오티드 서열. TPAP는 재조합 DNA 기술에 의하여 얻어진다. TPAP-결핍 생산균주는 TPAP-코딩 DNA 서열의 불활성화 또는 변형으로 제조된다.

트리펩티딜 아미노펩티다제, TPAP 결핍 균주

Description

트리펩티딜 아미노펩티다제 생산의 감소 또는 제거방법{METHOD FOR REDUCING OR ELIMINATING TRIPEPTIDYL AMINOPEPTIDASE PRODUCTION}

도 1은 pH에 따른 트리펩티다제의 상대 활성도를 나타내는 그래프이다.

트리펩티딜 아미노펩티다제는 펩티드, 올리고펩티드, 또는 단백질의 치환되지 않은 N-말단으로부터 단편을 절단능력할 수 있는 효소이다. 트리펩티딜 아미노펩티다제는 비특이적, 즉 치환되지 않은 N-말단으로부터 모든 트리펩티드 서열을 절단하거나, 또는 특이적, 즉 트리펩티드서열의 특이적 형태를 절단할 수 있다.

동물 기원의 트리펩티딜 아미노펩티다제는 과거에 보고되어왔다. 예를 들어, Doebber 등(1978), Endocrinology 103: 1794-1804는 소 뇌하수체로부터 분리된 트리펩티딜 아미노펩티다제를 개시하고 있는데 이것은 소 성장호르몬의 N-말단으로부터 트리펩티드를 절단하는 것으로 밝혀졌다. Mammalian Proteases Vol. 2, Exopeptidases (AP 1986, eds. J.K. McDonald 및 A.J. Barrett)에는 각각 육우 뇌하수체, 수태한 돼지 난소 및 돼지 비장으로부터 분리된 트리펩티딜 아미노펩티다제가 개시되어 있다.

Streptomyces lividans 66으로부터 분리된 세균성 트리펩티딜 아미노펩티다제가 Krieger 등, Febs Letters Vol. 352, No. 3, pp 385-388, 1994 에 의해 기술되어 있다. Applied and Environmental Microbiology, 1995년 8월, p. 3145-3150의 Butler 등은 상기 펩티다제를 코딩하는 유전자 및 추론된 아미노산 서열을 개시하고 있다. 이 펩티다제는 7.5 내지 8.5의 최적 pH를 가지는 세린 프로테아제로서 특징지워진다.

효소 또는 기타 단백질과 같은, 미생물적으로 생산된 산물의 안정성은 특히, 산물이 생산되는 방법 및/또는 산물의 기원 또는 미생물생산자의 함수로서 변한다는 것은 주지이다. 미생물적으로 생산된 산물의 감소된 안정성은, 예를 들면, 열, 광 또는 기타 외부조건에 대한 감소된 저항성에서 기인하거나, 산물 자체의 조성에서 기인한다. 이와 관련하여, 단백질 산물 내에 프로테아제 활성의 미량이 존재할지라도 상기 산물의 안정성의 상당한 감소를 초래한다. 그러나, 종종, 변하는 안정성의 원인을 정확히 동정하는 것이 불가능하다.

(발명의 개요)

본 발명자들은 현재 놀랍게도 다양한 균종이 TPAP를 생산하며 이들 생물에 의해 생산된 단백질 산물이 어떤 경우에는 이들 산물의 감소된 안정성을 유발하는 것으로 밝혀진 TPAP의 소량을 함유하는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 TPAP의 분리 및 특성규명에 성공하였다. TPAP는 단백질 산물의 치환되지 않은 N-말단으로부터 트리펩티드를 비특이적으로 절단할 수 있는데, 이 절단은 어떤 경우에는 바 람직하고 기타 경우(예를 들면, TPAP를 포함하는 단백질 산물의 감소된 안정성을 초래하는 경우)에는 매우 바람직하지 못함이 입증되었다.

따라서, 본 발명의 한 목적은 펩티드 또는 단백질서열의 절단에 사용할 실질적으로 순수한 트리펩티딜펩티다제를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 TPAP가 본질적으로 없는 단백질 산물, 특히 TPAP의 기질이고 TPAP의 존재시 감소된 안정성을 가지는 산물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

첫번째 일반적 관점에서 본 발명은 균류 기원의 분리된 TPAP에 관한 것이다. 구체적으로, TPAP는 균종 아스퍼질러스 (Aspergillus)의 균주로부터 얻을 수 있다. 부가적 관점에서 본 발명은 아미노산 및/또는 DNA 서열정보에 의해 그리고/또는 효소 단백질 특성에 의해 동정된 TPAP, TPAP를 코딩하는 DNA 구조체 및 상기 서열에 혼성화함으로써 주어진 숙주세포의 TPAP 생산능을 제거할 수 있도록, TPAP를 코딩하는 DNA 서열의 충분한 부분에 상보적인 누클레오티드서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것이다.

보다 중요한 관점에서 본 발명은 TPAP 생산세포로부터의 TPAP 생산의 감소방법인데, 이 방법에서는 상기 세포로부터의 감소된 TPAP 생산을 유발하도록 상기 세포내에 존재하고 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 불활성화시킨다.

(정의)

본문에서 용어 "TPAP"는, 예를 들면 호르몬전구체 또는 효소전구체에서 발견되며, 예를 들면 신장된 단백질 서열과 같은 펩티드 또는 단백질 서열의 N-말단으 로부터 트리펩티드를 절단하는 아미노펩티다제를 가리키기 위한 것이다. 일반적인 방식으로 표현해서 TPAP는 펩티드 또는 단백질의 치환되지 않은 N-말단 아미노기로부터 트리펩티드 XYZ를 절단하는 능력이 있으며, 여기서 X, Y, Z는 어떤 아미노산잔기(즉 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val로 부터 선택되는)를 나타낸다. TPAP 기질에 있어서 X, Y 및 Z는 모두 다르거나 같거나 또는 X, Y 및 Z중의 둘이 같다. 본 발명의 TPAP는 절단되는 트리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 비특이적임을 이해할 것이다. 실시예 7에서 자연 발생 펩티드 및 단백질의 절단으로부터 얻어지는 트리펩티드 산물의 특정예를 보였다.

본 발명의 DNA 구조체의 부분을 구성하는 DNA 서열의 기원에 관하여 사용되는 용어 "얻을 수 있는"이란 당해 DNA 서열이 관련생물의 핵산(DNA 또는 RNA)물질로부터 분리되는 것 또는 그러한 물질에 기초하여 제조되는 것을 가리키기 위한 것이다. 예를 들면, DNA 서열은 본 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 생물로부터 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리되거나, 또는 그러한 물질에 기초하여 제조된다.

유사하게, 본 발명의 TPAP와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "얻을 수 있는"이란 TPAP가 당해 생물로부터 회수되는 것 또는 상기 생물로부터 얻을 수 있는 DNA 서열에 의해 코딩되고 상기 DNA 서열을 발현하는 생물로부터 회수되는 것을 가리키기 위한 것이다.

(본 발명의 TPAP)

본 발명으로 이어진 연구의 과정에서 A. niger 균주 및 A. oryzae 균주로부터의 두 다른 TPAP를 분리 및 특성규명를 하였다. 이 두 TPAP는 트리펩티딜 아미노펩티다제의 일반적으로 신규한 군의 대표적인 예로 고려된다.

따라서, 한 관점에서 본 발명은 다음과 같은 것을 포함하는 DNA 구조체에 의해 코딩되는 TPAP에 관한 것이다.

i) SEQ ID No. 1, 2 및 3에서 보인 적어도 하나의, 그러나 바람직하게는 둘 이상의 부분적 DNA 서열, 또는

ii) DSM 9570내에 존재하는 성숙 TPAP의 N-말단 부분을 코딩하는 부분적 DNA 서열, 또는

iii) SEQ ID No. 1, 2 또는 3에서 보인 DNA 서열에 기초하여 또는 SEQ ID No. 4 내지 14에서 보인 아미노산 서열에 기초하여 제조된 올리고누클레오티드에 혼성화하고 TPAP를 코딩하는 누클레오티드 서열.

누클레오티드 서열 iii)의 좀더 상세한 설명은 "본 발명의 DNA 구조체 및 벡 터"로 명칭된 항에 더 하기한다.

또다른 관점에서 본 발명은 하기 특성의 하나 이상을 가지는 실질적으로 순수한 TPAP에 관한 것이다.

- 기질 Phe-Pro-Ala-pNA의 절단 능력

- 약 65 kDa의 분자량( Laemmli, U.K., 1970, "박테리오파지 T4의 머리부의 조합 동안의 구조단백질의 절단"., Nature, 227, p. 680-685에 기술된 바와 같이 본질적으로 측정되는)

- 4 내지 6 범위의 pI

- 약 5.0 내지 7.5 범위의 최적 pH

- 정제된 A. niger TPAP 또는 정제된 A. oryzae TPAP와 면역적으로 교차반응한다.

- 이하의 N-말단 서열을 포함한다.

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6) (SEQ ID No. 15)

여기서 Xaa(1), Xaa(2), Xaa(3), Xaa(4), Xaa(5) 및 Xaa(6)중의 어떤 하나는 다르거나 같고 자연 발생 아미노산 잔기중의 어떤 것으로부터 선택된다. 바람직하게는, Xaa(1)은 Lys 또는 Gln, Xaa(2)는 Ile 또는 Thr, Xaa(3)은 Pro 또는 His, Xaa(4)는 Glu 또는 Gln, Xaa(5)는 Pro 또는 Ala 그리고/또는 Xaa(6)은 Lys 또는 Asn이다.

면역적 교차반응성의 결정에서 사용되는 항체는 정제된 TPAP를 사용하여 제조된다. 좀더 구체적으로는, 본 발명의 효소에 대한 항혈청은 N. Axelsen 등,in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 또는 A. Johnstone 및 R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Pubilications, 1982 (좀더 구체적으로는 pp. 27-31)에 기술된 방법에 따라서 토끼(또는 기타 설치류)를 면역이 되게 하는 것에 의해 생성된다. 정제된 면역글로불린은 항혈청으로부터, 예를 들면 염침전((NH4)2SO4)에 이어서 투석 및, 예를 들면 DEAE-SephadexTM의 이온교환 크로마토그래피에 의해 얻어진다. 단백질의 면역화학적 특성규명은 Outcherlony 이중-확산 분석(O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706), 교차 면역전기영동(N. Axelsen 등, 상기 참조, Chapter 3 및 4), 또는 로켓 면역전기영동(N. Axelsen 등, supra, Chapter 2)의 어느 것에 의해 행하여진다.

한 구체예에서 본 발명의 TPAP는 SEQ ID No. 4 내지 9에서 보인 부분적 아미노산 서열중의 적어도 하나를 포함하고 그리고/또는 약 5.0 내지 5.5의 최적 pH 및/또는 약 5.1 또는 5.2의 pI를 가진다.

또 다른 구체예에서 본 발명의 TPAP는 SEQ ID No. 10 내지 14의 부분적 아미노산 서열중의 적어도 하나를 포함하고 그리고/또는 약 5.5 내지 7.5의 최적 pH 및/또는 약 4.5의 pI를 가진다.

SEQ ID No. 1, 2 및 3에서 보인 서열중의 적어도 하나를 포함하는 DNA 서열 또는 DSM 9570에 포함된 것에 의해 코딩되거나 또는 SEQ ID No. 4 내지 9에서 보인 펩티드를 포함하는 TPAP는 A. niger 균주로부터 생산되는 단백질 산물로부터 분리되었다(하기 실시예 1 참조). SEQ ID No. 10 내지 14의 펩티드를 포함하는 TPAP는 A. oryzae 균주로부터 분리되었다(하기 실시예 2 참조).

현재로서는, 여기서 정의된 트리펩티딜 아미노펩티드의 일반적으로 신규한 군에 속하는 TPAP는 동물 또는 식물 기원을 포함하는 어떤 기원의 것도 좋으나, 미생물, 즉 세균류 또는 균류 기원의 것이 바람직한 것으로 여겨진다. 본 발명자들이 알고 있는 한, 본 명세서가 균류 기원의 TPAP에 관하여서는 최초보고이다. 본 발명의 TPAP는 천연 TPAP 생산자인 균주로부터 정제되거나 더욱 간편하게는 하기에 추가적으로 설명되는 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 동형 또는 이형 유전자 산물로서 생산된다.

특히, 본 발명의 TPAP는 A. oryzae, A. niger, A. japonicus, A. aculeatus, A. nidulans 또는 A. foetiduc의 균주와 같은 Aspergillus의 균주 또는, 예를 들면 T. viride, T. reesei, T. longibrachiatum 또는 T. harzianum과 같은 Trichoderma의 균주 또는, 예를 들면 F. oxysporum, F. graminearum 또는 F. solani와 같은 Fusarium의 종 또는, 예를 들면 T. lanuginosus 또는 T. insolens와 같은 Thermomyces의 균주로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 TPAP는 분리되고 실질적으로 순수한 형태, 예를 들면 적어도 95% 순도와 같이 적어도 90% 순도로 제공하는 것이 바람직하다.

단백질 산물내의 TPAP의 존재는 상기 산물의 안정성을 감소시키므로 바람직 하지 않은 것으로 고려되지만, 단백질 산물의 조절된 불안정화를 위한 본 발명의 정제된 TPAP의 사용은 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 정제된 TPAP는 원하는 효과를 발휘한 후의 효소의 불활성화를 위해 사용되며, 따라서 "사멸효소(killer enzyme)"로서 작용한다. 이러한 불활성화는 통상적으로 열불활성화 (thremoinactivation)에 의해 수행된다 (또는 다른 방법으로는, 목적외의 효소활성은 정제에 의해 제거된다). 호열성 효소의 불안정화를 위한 TPAP의 사용은 특히 바람직하다.

이 사용의 일례로서 전분액화를 위하여 사용되는 AMG의 불활성화는, 본 발명에서를 들 수 있는데 이것은 현재 반응혼합물을 고온(80 내지 85℃)으로 가열하여 수행하고 있다. 이 불활성화는 AMG가 덱스트린을 글루코스로 가수분해한 후 바람직하게는 회분공정에서, 예를 들면, TPAP를 첨가함으로써 행하여 질 수 있다. AMG의 열불활성화는 이어서 짧은 시간 동안 온도를 단지 약 66℃로 증가시키는 것에 의해 가능하다.

또다른 예는 저칼로리 맥주와 같은 맥주의 발효에서 사용되는 AMG의 비활성화이다. 일반적 맥주 발효공정에서 AMG는 저온살균(pasteurization)에 의해 비활성화된다. TPAP의 첨가는 사용된 AMG의 열안정성을 감소시키며 따라서 저온살균을 위한 온도를 감소시킨다. 이 처리에 의해 관능적 특성이 개선된다.

더욱이, 본 발명의 정제된 TPAP는 트리펩티드 서열의 특이적 절단이 바람직한 많은 목적에 대해 유용하다. 예를 들면, 몇몇 단백질 또는 펩티드는 사용될 단백질에 대해 바람직하지 않은 많은 수의 추가적인 아미노산 잔기를 N-말단 아미노 산 잔기상에 포함하는 전구체의 형태로 합성된다. 이것은, 예를 들면, 전구체 단백질로서 보호된 형태로 합성되는 단백질 또는 펩티드의 가공에서 일어난다.

(본 발명의 DNA 구조체 및 벡터)

또 다른 추가적인 관점에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 TPAP을 코딩하는 DNA 구조체에 관한 것이다.

i) 적어도 하나의, 그러나 바람직하게는 둘 또는 모든 SEQ ID No. 1, 2 및 3에서 보인 부분적 DNA 서열, 또는

ii) TPAP의 N-말단 부분을 코팅하며 DSM 9570내에 존재하는 부분적 DNA 서열, 또는

iii) SEQ ID No. 1, 2 또는 3에서 보인 DNA 서열에 기초하여 또는 SEQ ID No. 4 내지 14에서 보인 아미노산 서열에 기초하여 제조된 올리고누틀레오티드에 혼성화하고, TPAP를 코딩하는 누클레오티드 서열, 또는

iv) i), ii) 또는 iii)의 DNA/누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열.

본 발명의 DNA 구조체는 TPAP의 재조합 생산이든지(DNA/누클레오티드 서열 i) 내지 iii)) 상기 생산을 원하지 않는, 세포의 TPAP 생산능의 감소이든지(누클레오티드 서열 iv)를 위해 사용될 수 있다.

누클레오티드 서열 iii)은, 예를 들면, SEQ ID No. 1 내지 14에서 보인 부분적 DNA 또는 부분적 아미노산 서열에 기초한 TPAP 또는 DSM 9570의 부분적 TPAP를 코딩하는 DNA 서열을 생산하는 것으로 알려지거나 고려되는, 또 다른 또는 관련된( 예를 들면, 동일한) 생물로부터, 예를 들면, 여기서 기술된 방법을 사용하여 분리되며, 또한 상기 DNA 또는 아미노산 서열의 어떠한 것에 기초하여, 예를 들면 DNA 서열에 의해 코딩되는 TPAP의 또 다른 아미노산 서열을 형성하지 않으며, 그러나 TPAP의 생산을 위한 숙주생물의 코돈용례(usage)에 상응하는 누클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 다른 아미노산 서열 및 따라서, 아마도, 천연 TPAP와는 다른 특성을 가지나, 원래의 TPAP 활성은 유지하는 TPAP 돌연변이체에서 형성하는, 다른 단백질 구조를 형성하는 누클레오티드 치환의 도입에 의해서 구성된다. 가능한 변형의 기타 실시예는 서열내로 하나 이상의 누클레오티드의 삽입, 서열의 어느 한끝 또는 양끝에서 하나 이상의 누클레오티드의 추가, 또는 어느 한끝이나 서열내부에서 하나 이상의 누클레오티드의 결실이다.

SEQ ID No. 1 내지 3에서 보인 DNA 서열 및 DSM 9570의 DNA 서열은 전체 TPAP를 코딩하는 DNA 서열에 포함되며 이들의 분리에 사용되는 부분적 서열인 것을 보일 것이다. 이것은 본 분야에서 공지된 방법에 의해 쉽게 행하여 질 수 있다. 본 발명에 있어서는, 누클레오티드 서열 iii)은 상기 전체 DNA 서열을 포함할 것이다.

상기 혼성화는 누클레오티드 서열 iii)이 동일한 프로브에(또는 TPAP를 코딩하는 상기 DNA 서열에) TPAP를 코딩하는 DNA 서열로서 이후 상세하게 기술된 재료 및 방법란의 특정화한 조건하에서 혼성화하는 것을 보이기 위한 것이다. 일반적으로, 누클레오티드 서열 iii)은 SEQ ID No. 1, 2 또는 3에서 보인 DNA 서열 또는 DSM 9570의 TPAP를 코딩하는 DNA 서열과(여기에서 개시된 부분적 DNA 서열(들)에 상응하는 누클레오티드 서열 iii)의 부분과 비교할 경우) 매우 상동하며, 그 정도 는 적어도 65%, 예를 들면 적어도 70%가 상기 DNA 서열과 상동하며, 예를 들면 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%까지도 어떤 또는 모든 상기 서열과 상동하다. 따라서, 본 발명의 TPAP는 상기 DNA 서열(들)에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해(당해 DNA 서열에 의해 코딩된 부분에 상응하는 TPAP 아미노산 서열의 부분간의 비교에 기초하여 평가하여)적어도 65%, 예를 들면 적어도 70% , 예를 들면 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%까지도 상동한 것으로 예상된다.

누클레오티드 서열 iii)은 DNA 또는 RNA 서열이다.

본 발명의 DNA 구조체의 DNA 서열 i) 내지 iii)은 주지의 방법에 의해 제조된다. 따라서, 관련된 DNA 서열은, 예를 들면, 그 서열을 가지는 것으로 기대되는 생물, 예컨대 상기에 기술된 세포, 로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 구성하는 것과 종래 방법에 의한 양성 클론 스크리닝에 의해 분리될 수 있다. 이러한 방법의 예는 표준기술(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York 1989 참조)에 따른 적합한 올리고누클레오티드 프로브에의 혼성화, 및/또는 관련 활성을 발현하는 클론의 선택, 및/또는 관련 효소에 대해 발생되는 항체와 반응하는 단백질을 생산하는 클론의 선택이다.

cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 DNA 서열을 분리하는 바람직한 방법은 축퇴(degenerate) 올리고누클레오티드 프로브를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 방법이다. 예를 들면, PCR은 PCR Protocols 1993, ed. Bruce A. White 및 The polymerase chain reaction, 1994, ed. Kary B. Mullis에 기술된 기술을 사용 하여 행하여진다.

다른 방법으로는, DNA 서열 i) 및 ii)는 DSM 9570으로부터 간단히 분리된다.

더욱이, 본 발명의 DNA 구조체의 DNA 서열, 예를 들면, DNA/누클레오티드 서열 i), ii) 또는 iii)에 상보적인 누클레오티드 서열 iv)는 예를 들면 Narang, SA, 1983, Tetrahedron 39:3 및 Itakura 등, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323에 의해 기술된 원리에 기초한 확립된 기술에 의해 합성된다.

본 DNA 구조체는 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적절하도록)의 단편, 즉 전체 재조합 DNA 분자의 다양한 부분에 상응하는 단편, 을 표준기술에 따라 연결하는 것에 의해 제조되는 게놈 및 합성의 혼합기원, 합성 및 cDNA의 혼합기원 또는 게놈 및 cDNA의 혼합기원으로 되어 있다.

DNA 서열 i), ii) 또는 iii)은 재조합 TPAP의 제조에 있어서 사용하는 것이 바람직한 데 반하여, DNA 서열 iv)는 TPAP에 민감한 단백질 산물의 생산에서의 사용을 위한 세포의 TPAP 생산능의 감소를 위하여 사용하는 것이 바람직하다.

비록 DNA 서열 iv)는 전체 TPAP를 코딩하는 서열에 대해 상보적이지만, 일반적으로 DNA 서열 iv)는 단지 상기 서열의 부분에 대해서만 상보적이면 충분하다. 기능적인 방식으로 표현하면, DNA 서열 iv)는 TPAP를 코딩하는 DNA로의 혼성화에 있어서 상기 mRNA의 전사의 감소 또는 저해가 가능하도록 TPAP를 코딩하는 DNA 서열의 충분한 길이에 대하여 상보적이어야 한다. 전형적으로, DNA 서열 iv)가 적어도 300 누클레오티드와 같은 적어도 17 누클레오티드의 DNA 단편을 포함하면 충분하다.

본 발명의 DNA 구조체를 포함하는 벡터, 바람직하게는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 방법에서 간편하게 사용되는 모든 벡터이며, 또한 발현 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주세포에 좌우될 것이다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외 물질로서 존재하는 벡터로서, 그 복제가 염색체 복제와 독립적인, 예를 들면 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 것이다. 다르게는, 벡터는, 숙주세포로 도입될 때, 숙주세포 게놈속으로 통합되고, 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것이다.

DNA 구조체 또는 벡터에서, DNA 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 결합되어야 한다. 프로모터는 선택된 숙주세포내에서 전사 활성을 보이는 어떤 DNA 서열이며 또한 숙주세포에 동종 또는 이종이든간의 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유도된다. 프로모터는, 아밀라제, 글루코아밀라제, 프로테아제, 리파제, 셀룰라제 및 당분해효소와 같은 세포외 및 세포내 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유도된다. 본 발명의 DNA 구조체의 전사를 지시하기위한 적합한 프로모터의 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트산 프로테이나제, A. niger 글루코아밀라제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산안정성 α-아밀라제, 및 Rhizomucor miehei 리파제에 대한 유전자로부터 유도된 촉진유전자이다. 당분해효소에 대한 유전자로부터 유도되는 프로모터의 예는 TPI, ADH, 및 PGK이다. 프로모터는 동종 프로모터, 즉 사용된 숙주 균주 자신의 유전자일 수도 있다.

프로모터 서열은 선택된 유전자와 또는 선택된 신호 펩티드 또는 프리리젼(preregion)과 프로모터 서열의 연결을 촉진하는 특정 제한위치를 도입하 기위한 목적으로 링커를 가진다.

본 발명의 DNA 구조체 및/또는 발현 벡터는 TPAP을 코딩하는 DNA 서열 및/또는 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 결합된 적합한 터미네이터를 포함한다. 터미네이터 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 같은 기원으로부터 유도된다. 인헨서(enhancer) 서열도 구조체내로 삽입된다.

또한 본 DNA 구조체 및/또한 벡터는 벡터가 당해 숙주세포내에서 복제가 가능하도록하는 DNA 서열을 더욱 포함한다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제원점이다.

또한 본 DNA 구조체 및/또는 벡터는 선택 마커(selectable marker)를 포함한다. 선택 마커의 예는 amdS 또는 argB, trpC 또는 pyrG(예를 들면 A. nidulans 또는 A. niger로부터의 후자의 세 마커)를 포함한다.

상기 언급한 DNA 서열, 프로모터, 터미네이터 및 기타 요소를 각각 연결하는 것을 포함하는 본 발명의 DNA 구조체를 제조하고 그것을 복제에 필요한 정보를 가지는 적합한 벡터로 삽입하는데 사용하는 방법은 본 분야의 당업자에게 공지이다(예를 들면, 앞에서 인용된 Sambrook 등, 참조).

(본 발명의 세포 및 TPAP 생산의 방법)

한 구체예에서 본 발명의 상기한 바와 같은 DNA 구조체든지 발현벡터든지를 포함하는 본 발명의 세포는 본 발명의 TPAP의 재조합 생산에서 숙주세포로 사용된다. 이 경우에 DNA 구조체 또는 발현벡터는 TPAP를 코딩하는 DNA 서열 i) 내지 iii) 또는 상기 DSM 9570의 삽입체 중의 어떤것을 포함한다. 세포는, 비록 DNA 구 조체는 염색체외 물질로서 존재할 수도 있지만, DNA 구조체를 숙주 염색체내로 통합시키는 것에 의해 간편하게 DNA 구조체로 형질전환된다. 그러나, 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포내에서 안정적으로 유지될 수 있을 때 유리한 것으로 고려된다. 숙주 염색체내로의 DNA 구조체의 통합은 종래 방법에 따라, 예를 들면 동종 재조합에 의해 행하여진다. 다르게는, 세포는 숙주세포의 다른 형태와 관련하여 하기한 바와 같은 발현벡터로 형질전환된다.

본 발명의 세포는 포유류 또는 곤충과 같은 고등생물의 세포이나, 바람직하게는 미생물 세포, 예를 들면 세균류 또는 균류(효모를 포함) 세포이다.

적합한 세균의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus와 같은 그람양성세균, 또는 E. coli와 같은 그람음성세균이다. 세균의 형질전환은 예를 들면 본질적으로 공지된 방법에 의해 원형질체 형질전환에 의해 또는 콤피텐트(competent) 세포를 사용하는 것에 의해 행해질 수 있다.

효모는 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 종, 예를 들면 Saccharomyces cerevisiae로부터 선택하는 것이 유리하다. 사상균류는 Aspergillus종, 예를 들면 Aspergillus oryzae, A. nidulans, A. foetidus, A. aculeatus, A. japonicus 또는 A. niger 또는 Trichoderma종, 예를 들면 T. reesei, T. longibrachiatum 또는 T. harzianum, 또는 Fusarium종, 예를 들면 F. oxysporum, F. graminearum 또는 F. solani에 속하는 것이 바람직하다. 균류 세포는 원형질체 형성 및 원형질체 형질전환에 이은 세포벽의 재형성을 포함하는 본질적으로 공지된 방식에 의한 방법에 의해 형질전환된다.

본 발명의 추가의 관점에서 본 발명은 TPAP의 생산방법에 관한 것이며, 이 방법은

i) 상기한 바와 같은 본 발명의 세포를 적합한 배양 배지내에서 TPAP의 발현이 가능한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터의 TPAP를 회수하는 것으로 이루어진다.

세포를 배양하기위해 사용되는 배지는 당해 숙주세포의 성장을 위해 적합한 어떤 종래의 배지여도 된다. 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 구입하거나 공개된 제조법(예를 들면 American Type Culture Collection의 카탈로그에서)에 의하여 제조할 수 있다. 배지내의 단백질의 존재가 TPAP 생산의 증가를 가져올 수 있는 것으로 믿어진다.

TPAP는 원심분리 또는 여과에 의해 세포를 배지로부터 분리하고, 필요하다면 세포파쇄 후, 예를 들면 황산암모늄과 같은 염을 이용하여 상징액 또는 여과액의 단백질성 성분을 침전시키고, 이어서 예를 들면 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제하는 것을 포함하는 종래 방법에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.

(TPAP 활성의 제거 또는 감소)

미생물적으로 생산된 단백질 산물에 있어서 불안정화 인자로서 TRAP의 동정 은 많은 수의 다른 단백질 산물의 생산에 대하여 중요한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명에 의해 제시된 바와 같이, 단백질 산물에 TPAP가 소량으로 존재할 지라도 상기 산물의 열안정성이 감소하는 결과를 초래한다. 따라서, 본 발명에 의해 감소된 TPAP생산능을 가지는 생산균주를 제조하는 것이 가능하다.

TPAP 생산세포로부터 TPAP 생산의 감소는 상기 세포내에 존재하며 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 불활성화시킴으로써 상기세포로부터 TPAP 생산을 감소시켜 간편하게 이루어진다.

변형되는 DNA 서열은, 예를 들면, TPAP를 코딩하는 DNA 서열 또는 이것의 TPAP 활성을 발현하는데 필수적인 부분 또는 TPAP를 코딩하는 DNA 서열로부터의 TPAP의 발현에 필요한 조절 서열이다.

예로서 조절 서열은 프로모터 서열 또는 이것의 기능적 부분, 즉 TPAP의 발현에 영향을 미치기에 충분한 부분일 수 있다.

DNA 서열의 변형 또는 불활성화는 TPAP 생산 세포의 돌연변이 유발 및 TPAP 생산능력이 감소한 세포의 선택에 의해 이루어진다. 특이적 또는 무작위의 돌연변이는, 예를 들면 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발물질의 사용에 의해, 적합한 올리고누클레오티드의 사용에 의해, 또는 DNA 서열의 PCR 생성 돌연변이유발에 의해 이루어진다. 더욱이, 돌연변이유발은 이들 돌연변이 유발물질의 어떤 조합의 사용에 의해서도 이루어진다.

본 목적에 대해 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발물질의 예는 자외선(UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트(EMS), 이황화나트륨, 포름산, 및 누클레오티드 유사체를 포함한다.

이러한 물질을 사용하는 경우 돌연변이유발은 전형적으로 돌연변이를 유발시킬 세포를 선택된 돌연변이 유발물질의 존재하에 돌연변이가 일어나기위한 적합한 조건하에서 항온처리하고, 감소된 TPAP 생산능을 가지는 돌연변이 세포를 선택함으로써 이루어진다.

변형 또는 불활성화가 TPAP를 코딩하는 서열 또는 그것의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소내의 하나 이상의 누클레오티드의 도입, 치환 또는 제거에 의해 이루어질 때, 누클레오티드는, 예를 들면, 삽입 또는 제거됨으로써 정지코돈의 도입, 개시코돈의 제거 또는 오픈리딩프레임의 변화의 결과를 가져온다. TPAP를 코딩하는 서열 또는 조절요소의 변형 또는 불활성화는 본 기술분야에 알려진 방법에 따라 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 PCR 생성 돌연변이 유발에 의해 이루어진다. 비록 원칙적으로는, 변형이 생체내에서, 즉 변형될 TPAP 유전자를 가지는 세포상에서 직접 행하여지나, 이하에 예시된 바와 같이 시험관내에서 변형을 수행하는 것이 현재 바람직하다.

선택한 숙주세포의 TPAP 생산을 불활성화 또는 감소시키기위한 간편한 방법의 예는 유전자 교체 또는 유전자 방해의 원리에 기초한다. 예를 들면, 유전자 방해 방법은 파괴하기를 원하는 내재성유전자 또는 유전자단편에 상응하는 DNA 서열의 사용을 포함한다. 상기 DNA 서열은 시험관내에서 결함유전자로 돌연변이되고 숙주세포내로 형질전환된다. 동종 재조합에 의해 결함유전자는 내재성유전자 또는 유 전자단편을 교체한다. 결함유전자 또는 유전자단편은 TPAP 유전자가 변형되거나 파괴된 형질전환체의 선택에 사용되는 마커를 코딩하는 것이 바람직하다.

다르게는, DNA 서열의 변형 또는 불활성화는 예를 들면, 상기 누클레오티드 서열 iv)와 같이 TPAP를 코딩하는 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 사용하는 정립된 안티 센스(anti-sense)기술의 사용에 의해 행하여 진다. 보다 구체적으로는, 누클레오티드 서열이 TPAP mRNA로 혼성화하고 따라서 상기 mRNA로부터 번역된 TPAP의 양을 감소시키거나 그러한 번역을 제거하도록 할 수 있는 조건하에서 TPAP를 코딩하는 서열에 상보적이어서 누클레오티드 서열이 세포내에서 전사되는 방식으로 세포내에서 생산된 TPAP mRNA로의 혼성화가 가능한 누클레오티드 서열을 세포에 도입함으로써 TPAP 생산세포로부터의 TPAP 생산은 감소되거나 제거된다.

이렇게 제조된 TPAP-결함 돌연변이체는 이종 단백질의 발현에 특히 유용하다. 본 명세서에서 용어 "이종 단백질"이란 숙주 세포 원래의 것이 아닌 단백질, 원래 서열을 바꾸기 위해 변형이 가해진 원래 단백질, 재조합 DNA 기술에 의해 숙주세포의 조작의 결과로서 발현이 양적으로 변한 원래의 단백질을 의미한다.

본 발명에 따라 변형시킬 TPAP 생산세포는 세포에 동종이든지 이종이든지, 원하는 단백질 산물의 생산에 적합한 균주이면 바람직하다. 예를 들면, 균류속 Aspergillus, Trichoderma 및 Fusarium의 세포는 생산 세포의 바람직한 예이다. 따라서, 본 발명에 따라 변형시킬 세포는 Aspergillus 종의 세포, 구체적으로는 A. niger, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus 또는 A. nidulans의 세포, 또는 Trichoderma 종의 세포, 예를 들면 T. reesei, T. longibrachiatum 또는 T. harzianum, 또는 Fusarium 종, 예를 들면 F. oxysporum, F. graminearum 또는 F. solani의 세포가 바람직하다.

본 발명의 특정 구체예에서 변형시킬 세포는 AMG와 같은 효소의 생산을 위해 사용되는 A. niger 또는 A. oryzae의 세포이다.

부가적 관점에서 본 발명은 TPAP 활성이 본질적으로 없는 산물의 제조 방법에 관한 것인데, 이 방법은 TPAP 생산능이 감소된 또는 없는 상기한 바와 같은 숙주 세포를 산물을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키는 것, 산물의 발현을 위한 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 것, 및 배양물로부터 산물을 회수하는 것을 포함한다.

다른 관점에서 본 발명은 TPAP 활성이 본질적으로 없는 산물의 제조 방법에 관한 것인데, 상기 산물은 TPAP를 발현하는 세포내에 존재하는 DNA 서열에 의해 코딩되며, 상기 방법은 상기 세포내에 존재하며 상기된 바와 같은 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 비활성화시키는 것, 및 이어서 산물의 발현을 위한 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 것, 및 배양물로부터 산물을 회수하는 것을 포함한다.

더욱 부가적인 관점에서 본 발명은 산물 역시 생산하는 TPAP-생산 세포의 발효에 의해 TPAP가 본질적으로 없는 산물의 제조 방법에 관한 것인데, 이 방법은 발효 동안이든지 또는 발효가 완료한 후이든지 발효 육즙에 TPAP 활성 저해가 가능한 저해제의 유효량을 첨가하는 것, 발효 육즙으로부터 원하는 산물을 회수하는 것, 그리고 선택적으로 회수한 산물을 추가로 정제하는 것을 포함한다. 이 방법은 하기 실시예에서 더 설명된다.

더욱 부가적인 다른 관점에서 본 발명은 TPAP 활성이 본질적으로 없는 산물의 제조 방법에 관한 것인데, 상기 산물은 TPAP 발현 세포내에 존재하는 DNA 서열에 의해 코딩되며, 상기 방법은 산물의 발현이 가능한 조건하에서 산물을 코딩하는 TPAP 발현 세포를 배양하는 것, 결과의 배양 육즙을 TPAP 활성을 실질적으로 감소시키도록 조합된 pH 및 온도 처리를 행하는 것, 그리고 배양 육즙으로부터 산물을 회수하는 것을 포함한다. 다른 방법으로는, 조합된 pH 및 온도 처리는 배양 육즙으로부터 회수된 효소를 제제에 대해 실행한다. 조합된 pH 및 온도 처리는 TPAP 저해제에 의한 처리와 조합하여 선택적으로 사용된다.

본 발명의 이 관점에 따르면 TPAP 활성의 적어도 60%, 예를 들면 활성의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 활성의 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 활성의 적어도 95%, 가장 바람직하게는 본질적으로 TPAP 활성의 적어도 99%를 제거하는 것이 가능하다. TPAP 활성의 완전한 제거가 이 방법의 사용에 의해 얻어지는 것으로 고려된다.

조합된 pH 및 온도 처리는 원하는 효과를 얻기에 충분한 시간 동안 6.5 내지 7의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도 범위에서 바람직하게 행하여진다. 전형적으로, 0.5 내지 1시간이 원하는 효과를 얻기위해 충분하다.

원하는 산물의 배양 및 정제를 위해 사용되는 방법은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들면 여기서 상기한 바와 같이 행하여진다.

본질적으로 TPAP가 없는 산물의 생산을 위한 본 발명의 방법은 진핵성 단백 질, 구체적으로는 효소와 같은 균류 단백질의 생산에서 특히 관심을 끈다. 효소 산물은, 예를 들면, 녹말 분해성 효소, 지방 분해성 효소, 단백질 분해성 효소, 셀룰로스 분해성 효소, 산화환원 효소, 또는 식물 세포벽 분해 효소 중에서 선택된다. 이 효소들의 예는 AMG, 아밀라제, 리파제, 큐티나제, 에스테라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 프로테아제, 퍼옥다제, 라카제, 페놀옥시다제, 카탈라제, 글루코스 산화효소, 피타제, 리아제, 펙티나제, 글루코시다제, 만시다제, 이성화효소, 전화효소, 트랜스퍼라제, 리보뉴클레아제, 갈락토시다제, 트랜스글루타미나제 및 키티나제이다. TPAP-결핍 세포는 또한 호르몬, 성장인자, 수용체 등과 같은 제약 관련의 이종 단백질의 발현을 위해 사용된다.

용어 "진핵성 단백질"이란 원래의 단백질 뿐만이 아니라, 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 활성, 열안정성, pH 내성 등과 같은 성질을 증진시키기 위하여 행해지는 기타 변형에 의해 변형된 단백질(예를 들면 효소)도 포함하기 위한 것으로 이해될 것이다.

부가적 관점에서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 본질적으로 TPAP 활성이 없는 단백질 산물에 관한 것이다.

[실시예]

(실시예 1)

(A. niger TPAP의 정제 및 특성규명)

재료 및 방법

Phe-Pro-Ala-pNA 기질(스위스, Bachem으로부터 입수가능)

프로테아제 저해제

Ala-Ala-Phe-클로로메틸케톤

벤질옥시카르보닐-Ala-Pro-Phe-클로로메틸케톤

벤질옥시카르보닐-Gly-Gly-Phe-클로로메틸-케톤.

TPAP의 정제

TPAP는 시판의 A. niger AMG 제제(덴마크, Novo Nordisk A/S로부터 구입)로부터 정제하였다. 조제된 AMG 제품 300 ml의 시료를 3 kDa 컷오프(cutoff) 막이 장치된 Filtron 농축기로 4℃에서 전도율이 1.5 mS/cm 미만이 될 때까지 반복적으로 희석하고 농축하였다. 모든 기타 정제 단계는 주위의 온도에서 수행하였다.

NaCl 구배를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피

농축물(600 ml)을 pH 4.0, 20 mM 아세트산나트륨로 평형화시킨 200 ml(2.6 x 37 cm) S-Sepharose 칼럼에 가하기 전에 pH 4.0으로 맞추고 여과하였다. 10 ml/min의 흐름을 사용하였다. TPAP를 0 내지 0.2 M의 선형 NaCl 구배로 10 칼럼 부피를 써서 용리시켰다. 펩티다제 활성의 최대 부분을 포함하는 한 풀(pool)을 제조하였다. 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5로의 완충액 변경은 10 kDa 컷오프의 Diaflo 막이 장치된 Amicon 셀에서 행하였다.

음이온 교환 크로마토그래피

S-Shepharose 칼럼으로부터의 풀을 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5로 평형화시킨 HiLoad Q-Sepharose HP 칼럼(50 ml, 2.6 X 10 cm)상에서 부가적으로 정제하였다. TPAP의 용리는 0 내지 0.5 M의 선형 NaCl 구배로 15 칼럼 부피를 써서 수행하 였다. 단백질을 8.0 ml/min의 흐름에 가하였고 5.0 ml/min으로 용리하였다. TPAP의 최대 부분을 포함하는 풀을 제조하였다. 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.0으로의 완충액 변경은 상기한 바와 같이 Amicon 셀에서 행하였다.

pH 구배를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피

HiLoad Q-Sepharose HP 칼럼으로부터의 풀을 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.0으로 평형화한 Mono S 칼럼(5/5)상에서 최종적으로 정제하였다. 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.0 및 20 mM 아세트산나트륨, pH 6.0을 이용하여 pH 4.0 내지 pH 6.0의 구배를 30 칼럼 부피로 제조하였다. 흐름은 1.0 ml/min이었다. TPAP의 두 동위효소가 각각 pH 5.1 및 5.2에서 용리되었다.

AMG의 정제

AMG G1은 Q-Sepharose를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 시판의 AMG 제제(Novo Nordisk A/S)로부터 정제하였다. 50 ml 칼럼을 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5로 평형화하였고, G1 형태를 0 내지 0.6 M NaCl의 선형 NaCl 구배로 8 칼럼 부피를 써서 용리시켰다. 흐름은 8.0 ml/min이었다.

AMGtrunc는 AMG G1의 TPAP 처리후에 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.3으로 평형화된 Mono Q 칼럼상에서 정제하였다. 0 내지 1.0 M의 선형 NaCl 구배를 30 칼럼 부피로 용리를 위해 사용하였다. 흐름은 1.0 ml/min이었다.

불안정화 분석

정제된 AMG G1의 일부를 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.3으로 수주동안 37℃에서 TPAP 및 완충액의 다른 혼합물과 함께 배양하였다. 최종부피는 10 AGU/ml의 AMG G1의 농도로 1 또는 2 ml이었다. 배양 혼합물 100 μl를 취하여 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.3으로 2 AGU/ml로 희석하였다. 65℃에서 30분간 희석된 시료를 열처리하였다. 시료를 주위의 온도로 냉각시킨 후, 비처리 및 열처리된 시료의 활성을 발색기질 p-니트로페닐-α-D-글리코피라노시드(pNPG) (Merck, Art. 6792)를 사용하는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)로 측정하였다. 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.3 중의 50 μl 3 mM pNPG를 25 μl 시료와 30분간 주위의 온도에서 항온처리하였다. 반응을 75 μl 0.1 M 사붕산나트륨의 첨가에 의해 정지시켰다. 405 nm에서의 흡광도를 UV-맥스 키네틱 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. T30을 열처리 후의 잔존 활성의 백분율로서 계산하였다. 모든 측정은 2회로 하였다.

TPAP 분석

이 분석은 0.1 M 아세트산나트륨 완충액, pH 4.3중의 0.2 mM Phe-Pro-Ala-pNA의 기질 농도를 사용하여 마이크로타이터 플레이트 판독기 또는 분광광도계로 수행하였다. Phe-Pro-Ala-pNA의 5 mM 저장 용액을 DMSO로 제조하였고 사용전에 희석하였다. 이어서 4분간 405 nm에서 UV-맥스 키네틱 미크로플레이트 판독기든지 또는 분광광도계든지로 반응시켰고 절단의 초기속도를 계산하였다.

TPAP의 저해

4 μg TPAP를 함유하는 분취액을 여러 프로테아제 저해제: 1 mM Ala-Ala-Phe-클로로메틸케톤, 1 mM 벤질옥시카르보닐-Ala-Pro-Phe-클로로메틸케톤 및 1 mM 벤질옥시카르보닐-Gly-Gly-Phe-클로로메틸-케톤과 함께 배양하였다. 30분의 배양 후 잔존 활성를 측정하였다.

여과된 발효 육즙의 저장 안정성

배양 육즙을 원심분리하고 0.22 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.육즙을 소르브산칼륨 및 벤조산나트륨에 대하여 0.1%로 제조하였으며 pH를 4.3으로 맞추었다. 2 ml의 분취액을 10 mM Ala-Ala-Phe-클로로메틸케톤 200 μl 또는 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.3 200 μl에 첨가하였다. 시료를 취하고 하기한 바와 같이 T30 측정전에 2 AGU/ml로 희석하였다.

AMG 활성(AGU)의 측정

AMG 활성을 K.A. Holm, 1980, Anal. Chem. Acta., 117, pp 359-362에 기술된 바와 같이 측정하였다. 간략하게는, 이 방법은 알파-D-글루코스의 형성하의 AMG에 의한 말토스의 가수분해에 기초한 것이다. 짧고, 연속적인 투석 방법 후에 글루코스의 농도를 글루코스 탈수소효소(GlucDH) 반응(pH 7.6에서 수행)에 의해 측정하였다. 자동화된 자동-분석기 방법을 위한 표준 조건은:

기질: 말토스 28 mM

배양 완충액: 아세테이트 0.1 M, pH 4.3

배양 온도: 37℃

배양 시간: 5분이다.

방법의 효소-작용 범위는 0.5 내지 4 AGU/ml이다.

결과

TPAP를 시판의 AMG 제제(Novo Nordisk A/S)로부터 표 1에 보인 정제 방법에 따라 동질로 정제하였다. 최종 양이온 교환 칼럼으로부터의 용리 프로필은 각각 pI 5.1 및 5.2를 가지는, TPAP의 두 동위효소(TPAP-I 및 TPAP-II)의 존재를 보였다. 두 동위형은 SDS-PAGE 및 N-말단 서열화에 의해 판단할 때 순수하였으나, 효소의 비활성은 달랐다(표 1 참조). TPAP-II가 TPAP-I 보다 20% 높은 비활성을 가졌다.

발효 육즙내에서든지 또는 정제동안이든지 간에 하나 또는 몇개의 Asn- 또는 Gln-잔기의 탈아미드화는 TPAP의 두 동위형간의 pI의 작은 차이를 설명할 수 있다.

시판의 AMG 제제로부터의 TPAP정제

	풀	부피(ml)	총단백질 mg#	총/활성· μmol/min	비활성 μmol/min	수율%	정제배수
UF-농축물		600	117,000	1,900	0.016	100	-
S-sepharose		250	410	1,100	2.7	58	170
HPQ-sepharose		45	27	390	14	20	880
Mono S	TPAP-I	8.5	6.0	132	22	7	1380
	TPAP-II	8	4.9	132	27	7	1680
#: 1 mg/ml 일 때 A280 = 1 인 가정에 기준 ·: TPAG 분석시 pNA 의 방출로 측정

최적 pH

TPAP의 최적 pH는 상기 TPAP 분석에서와 같은 방법을 사용하여 측정하였다. pH를 조절하기위해 0.1 M 아세테이트 완충액을 사용하였다. 결과의 최적 pH 곡선을 도 1에 보인다. TPAP는 5.0 내지 5.5의 pH 범위, 특히 5.25에서 최적으로 기능함을 알 수 있다.

TPAP에 대한 최적 온도 측정

TPAP의 온도/활성 관계를 상기 TPAP 분석을 사용하여 0.1 M 아세트산나트륨 완충액, pH 5.5로 측정하였다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이 TPAP는 온도 범위 45 내지 55℃에서 최대 활성을 가진다.

온도(℃)	25	30	35	40	45	50	55	60	65
상대활성도(%)	42	52	63	78	100	99	98	51	8

질량 분석

A. niger로부터 정제된 TPAP의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 이동 시보 질량 분석은 TPAP가 글리코실화된 것을 의미하는 넓은 신호를 보였다. 평균 질량은 54.5 kDa인 것으로 나타났다.

(실시예 2)

A. oryzae TPAP의 정제 및 특성규명

재료 및 방법

정제를 위한 출발물질로서, pH 5에서 대두 함유의 배지로 발효된 A. oryzae IFO 4177의 상징액을 사용하였다. 발효후, 배양 육즙은 대부분의 세포를 제거하기 위해 원심분리하였다.

정제

약 4 L 상징액을 Seitz EKS 플레이트상에서 세균여과하였다. EKS-여과액을 3 k 컷오프 Filtron 카세트(Minisette)상에서 최소 부피로 한외여과하였다. 한외여과액 = 240 ml. 한외여과액 170 ml를 약 90%의 고체 황산암모늄(AMS) 포화를 일으키도록 AMS로 침전시켰다. 적어도 30분간 교반 후, AMS침전물을 Sorvall RC3B 원심분리기로 원심분리(4500 rpm, 15분, 실온)하여 회수하였다. 100 ml 탈이온수를 단백질을 용해시키기 위해 AMS 침전물에 첨가하고 색을 제거하기위해 1%(w/v) FGV120 활성탄을 첨가하였다. 약 1시간 동안 교반 후 현탁물에서 탄(및 색)을 제거하기 위해 Seitz EK1 플레이트상에서 여과하였다. EK1-여과물을 1) 100 mM H3BO3, 10 mM 디메틸글루타르산, 2 mM CaCl2, pH 5 및 2) 탈이온수에 대하여 투석시켰다. EK1-여과 후 투석물(260 ml)을 분취액으로 냉각하였다.

투석물의 120 ml 분취액을 해동시키고 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5.0으로 평형화한 1.4 L G25 Sephadex 칼럼에 가하였다. 색 및 매우 산성인 단백질을 제거하기 위해, G25-여과물을 같은 완충액(CH3COOH/NaOH, pH 5.0)으로 평형화한 40 ml Q-sepharose FF 칼럼에 가하였다. 칼럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 선형 NaCl 구배(0 -> 200 mM)로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 분석하였다. 대부분의 TPAP 활성은 용출물(run-through)에서 보인 반면(70%), 대부분의 단백질은 칼럼에 부착되었다.

Q-sepharose 칼럼으로부터의 용출물을 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5.0으로 평형화한 50 ml S-sepharose HP 칼럼에 가하였다. 칼럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 선형 NaCl 구배(0 -> 200 mM)로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 분석하였다. TPAP 활성의 대부분이 역시 용출물에서 보였다(75%). TPAP 활성의 나머지는 NaCl 구배의 시작부에 있었다. 용출물 + 단편 1 내지 11을 풀링시켰고 50 mM H3BO3, 5 mM 디메틸글루타르산, 1 mM CaCl2, pH 6.0에 대하여 투석시켰다.

투석시킨 풀의 pH를 pH 7.0으로 맞춘 후 효소를 50 mM H3BO3, 5 mM 디메틸글루타르산, 1 mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화한 23 ml SOURCE Q 칼럼에 가하였다. 칼 럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 선형 NaCl 구배(0 -> 500 mM)로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 분석하였다. 모든 TPAP 활성은 용출물에서 보였다(95%). 이 이유는, 칼럼이 단백질로 과부하되었기 때문이다. 전 구간을 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4.0에 대하여 투석시켰다.

투석된 효소를 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4.0으로 평형화한 50ml S-sepharose HP 칼럼에 가하였다. 칼럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 NaCl 구배(0 -> 200 mM)로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 분석하였다. TPAP 활성을 100 mM NaCl로 용리시켰다. TPAP 활성을 풀링시키고 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4.0에 대하여 투석시켰다. S-sepharose 칼럼에 의한 것 보다 나은 분해도를 얻기위해, 투석된 풀을 같은 완충액(20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4.0)으로 평형화한 8 ml SOURCE S 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 NaCl 구배(0 -> 200 mM)로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 분석하였다. TPAP 활성을 60 mM NaCl로 용리시켰다. TPAP 활성을 풀링시키고 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5.5에 대하여 투석시켰다.

투석된 효소를 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5.5로 평형화한 23 ml SOURCE Q 칼럼에 가하였다. 칼럼을 세척한 후, 부착된 단백질을 NaCl 구배(0 -> 200 mM)로 용리시켰다. TPAP 활성을 30 mM NaCl로 용리시켰다. 칼럼으로부터의 단편을 TPAP 활성에 대하여 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE겔은 TPAP 활성을 포함하는 단편이 두 주된 밴드: 65 kDa 밴드(TPAP) 및 30 kDa 밴드를 포함하는 것을 보였다. 30 kDa 밴드가 날카로운데 비하여 TPAP 밴드는 넓게 퍼져, 30 kDa 밴드가 글리코실화되지 않은데 비하여 TPAP는 글리코실화되어 있음을 나타낸다.

TPAP 함유 단편을 한외여과에 의해 1 ml로 농축시키고 20 mM 트리스-아세테이드, 100 ml NaCl, pH 5.5로 평형화한 150 ml Sephacryl S-100 칼럼에 가하였다. 1.0 ml/min 유량으로 두 밴드가 분리되었다. TPAP 함유 단편은 A. oryzae TPAP로서 풀링되었다.

질량 분석

A. oryzae로부터 정제된 TPAP의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 이동 시보 질량 분석은 TPAP가 글리코실화된 것을 의미하는 넓은 신호를 보였다. 평균 질량은 55.0 kDa인 것으로 나타났다.

A. oryzae TPAP의 pH 프로필

A. oryzae로부터의 TPAP의 활성의 pH 의존도를 발색기질 Phe-Pro-Ala-pNA를 사용하여 구하였다. 50 μl Phe-Pro-Ala-pNA와의 배양 전에 효소 50 μl에 지시된 pH에서 150 μl Britton-Robinson 완충액을 0.2 mM의 최종 기질 농도로 첨가하였다. 분석을 UV-맥스 키네틱 마이크로타이터 플레이트 판독기로 수행하였고 이어서 3.5분간 405 nm에서 반응시켰다. 상대 활성(RA)을 하기 표 3에 보인다.

pH	4.0	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0	8.5	9.0
RA	13	11	14	26	61	100	74	29	1	0	0

(실시예 3)

A. niger TPAP의 펩티드 서열

TPAP I 형으로부터 유래된 펩티드의 서열결정뿐만 아니라 원래의 A. niger TPAP I 및 II 형의 N-말단 아미노산 서열결정은 제품설명서에 따라 작동시키는 Applied Biosystems 473A 시퀀서로 행하여진다.

원래의 TPAP I 및 II 형의 N-말단 아미노산 서열은 30 잔기에 대해 결정되었다. 두 서열은 동일하였고 다음과 같았다.

(서열 4)

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys- (SEQ ID No. 4)

이 서열은 다른 단백질에 대해서 어떤 상동성도 보이지 않았다.

변성, 환원 및 S-카르복시메틸화에 이어서, 펩티드를 Achromobacter로부터의 리실(lysyl)-특이적 프로테아제를 사용한 단백질분해성 절단에 의해 TPAP I 형으로부터 유도하였다. 결과된 펩티드를 역상 HPLC를 사용하여 분별 및 재정제하였다. 펩티드의 순도 및 질량을 제품설명서에 따라 작동시키는 VG Analytical TofSpec을 사용한 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 이동 시보 질량 분석을 사용하여 평가하였다. 하기의 일곱개의 펩티드를 서열결정하였다.

펩티드 1:

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys

Asn3은 질량 분석 및 아미노산 서열결정에 의해 보인 바와 같이 글리코실화된다. 펩티드 1은 원래의 TPAP의 아미노산 잔기 1 내지 17과 동일하며 따라서 SEQ ID No. 4에 보인 서열이다.

펩티드 2:

Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys

펩티드 2는 원래의 TPAP의 아미노산 잔기 18 내지 30과 동일하다(따라서 SEQ ID No. 4에 보인 서열이다). 펩티드 2는 질량 분석 및 아미노산 잔기 서열결정에 의해 보인 바와 같이 두 형으로 회수된다. N-말단 Gln 잔기를 가지는 한 형 및 이 Gln 잔기가 피로글루타메이트 잔기로 변환된 한 형.

펩티드 3:

Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His- (SEQ ID No. 5)

펩티드 4:

Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys (SEQ ID No. 6)

Asn6은 질량 분석 및 아미노산 서열결정에 의해 보인 바와 같이 글리코실화되어있다.

펩티드 5:

Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu- (SEQ ID No. 7)

Asx15가 Asp 또는 Asn 잔기인지 구별하는 것은 불가능하였다.

펩티드 6:

Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro- (SEQ ID No. 8)

Asx3이 Asp 또는 Asn 잔기인지 구별하는 것은 불가능하였다. Xaa1은 동정되지 않았다.

펩티드 7:

Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser- (SEQ ID No.9)

Asx4가 Asp 또는 Asn 잔기인지 구별하는 것은 불가능하였다. Asn25는 N-글리코실화를 위한 콘센서스(consensus) 서열내에서 발견되나 글리코실화되어 있지 않음을 주목하라.

A. oryzae TPAP의 펩티드 서열

TPAP로부터 유도된 펩티드와 함께 원래의 TPAP의 N-말단 아미노산 서열화를 제품설명서에 따라 Applied Biosystems 473A 단백질 시퀀서로 수행하였다.

원래의 TPAP의 N-말단 아미노산 잔기 서열을 SDS-PAGE 및 표준 방법을 사용하여 PVDF-막상으로의 일렉트로블라팅에 따라 결정하였다. 하기 23 잔기 아미노산 서열이 발견되었다:

Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly- (SEQ ID No. 14)

이 서열은 A. niger로부터의 TPAP의 N-말단 아미노산 서열과 명백하게 상동이다. 이 상동에 기초하여 Xaa는 글리코실화된 Asn-잔기일 것이며 Yaa는 아마 Cys-잔기를 나타낼 것이다.

변성, 환원 및 S-카르복시메틸화에 이어서, 펩티드는 Achromobacter로부터의 리실-특이적 프로테아제를 사용한 단백질분해성 절단에 의해 TPAP로부터 유도되었다. 결과된 펩티드를 역상 HPLC를 사용하여 분별하고 재정제하였다. 펩티드의 순도 및 질량을 제품설명서에 따라 작동시키는 VG Analytical TofSpec을 사용하는 매트릭스 보조 탈착 이온화 이동 시보 질량 분석을 사용하여 평가하였다. 하기 네개의 펩티드가 서열결정되었다.

펩티드 8:

Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-Ser-Lys (SEQ ID No. 10)

이 펩티드는 원래의 TPAP의 N-말단 서열결정에 의해 결정된 6 개의 마지막 아미노산 잔기와 겹쳐지며 따라서 N-말단 서열을 34 잔기로 연장한다.

펩티드 9:

Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-Tyr-Leu- (SEQ ID No. 11)

이 펩티드는 A. niger TPAP로부터의 펩티드 3과 상동이다.

펩티드 10:

Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys (SEQ ID No. 12)

펩티드 11:

Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Gly-Xaa- Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser- (SEQ ID No. 13)

Xaa는 동정되지 않은 잔기를 나타낸다.

(실시예 4)

A. niger TPAP I 및 II 형의 아미노산 조성을 결정하였다. TPAP I 및 II 형의 동결건조시킨 분취액의 여벌을 0.1% 페놀을 포함하는 6 N HCl로 110℃에서 진공으로 16시간 동안 가수분해하였다. 3 M 메탄술폰산에 의한 가수분해에 이어서 트립토판을 측정하였다. 가수분해에 이어서 제품설명서에 따라 작동시키는 Applied biosystems 420A 아미노산 분석 시스템을 사용하여 아미노산 조성을 결정하였다. 그 결과로 실험적 오차의 범위 안에서 TPAP I 및 II 형이 하기 표 4에서 보이는 바와 같이 동일한 아미노산 조성을 가짐을 알 수 있다.

A. niger TPAP I 및 II 형의 아미노산 조성

	TPAP I (몰%)	TPAP II (몰%)
Asx	13.1	13.4
Glx	8.2	7.9
Ser	10.5	10.7
Gly	13.7	13.1
His	0.5	0.5
Arg	3.1	3.1
Thr	5.7	5.6
Ala	8.0	7.9
Pro	7.2	7.3
Tyr	3.7	3.8
Val	6.0	5.9
Met	0.3	0.5
Cys	0.6	0.7
Ile	2.5	2.5
Leu	8.4	8.4
Phe	4.5	4.8
Lys	3.1	3.0
Trp	0.9	1.0

(실시예 5)

A. niger TPAP I 및 II 형의 단당류 조성을 결정하였다. TPAP I 및 II 형의 동결건조시킨 일부의 여벌을 2 M TFA로 100℃에서 진공으로 1시간, 2시간 및 4시간동안 가수분해하였다. 가수분해에 이어서 단당류 조성을 16 mM NaOH로 용리되는 CarboPacTM PA1 칼럼을 사용하는 고성능 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 단당류를 맥동 전류식 검출(pulsed amperometric detection)에 의해 검출하였

다. 2 M TFA에서의 단당류의 다른 안정성 및 방출에 의해 갈락토스의 양을 1시간 가수분해 후에, 만노스의 양을 2시간 가수분해 후에 그리고 글루코스아민의 양을 4시간 가수분해 후에 결정하였다. 얻어진 결과는 하기 표에서 보이는 바와 같이 TPAP I 및 II 형의 만노스 함량에서의 매우 작은 차이를 보인다.

TPAP I 및 II의 단당류 조성. 결과는 아미노산 분석으로부터 결정된 바와 같이 pmol 단당류/pmol 단백질로 주어졌다.

	TPAP I 형 (pmol/pmol)	TPAP II 형 (pmol/pmol)
글루코스아민	4	4
갈락토스	12	11
만노스	52	47

(실시예 6)

A. niger TPAP에 의한 절단

AMG G1 형을 불안정화시키는 A. niger TPAP의 능력을 정제된 AMG 및 TPAP(실시예 1의 재료 및 방법에서 기술된 바와 같이 얻음)를 사용하여 조제된 제물에서와 같은 TPAP/AMG 비율로 조사하였다. 불안정화시킨 제제의 아미노산 서열화는 AMG의 촉매부위의 N-말단에서 변형을 보였다. 최초 세 아미노산 잔기(Ala-Thr-Leu)를 포함하는 트리펩티드가 펩티다제에 의해 절단되었는데 이것은 효소가 트리펩티딜 아미노펩티다제임을 암시한다. 발색기질 Phe-Pro-Ala-pNA 뿐만 아닌 AMG의 절단에 기초한, 트리펩티딜 아미노펩티다제로의 분류는 또다른 발색기질 숙시닐-Ala-Ala-Ala-pNA에 대한 활성의 결여에 의해 더욱 지지되었다. 이 기질에서 N-말단에서의 유리아미노기는 숙시닐화되었고 따라서 기질을 TPAP에 의한 절단에 대해 어렵도록 만들었다. 원래의 그리고 원래의 AMG와 끝을 자른 AMG(AMGtrunc)의 혼합물을 아미노산 서열결정에 의해 검출할 때, AMG 배치의 TPAP 절단은 3주 저장후 완결되지 않았다.

다른 온도에서 TPAP의 다양한 첨가량으로 얻어진 AMG G1의 불안정화를 조사 하였다. 3 내지 10 μg/ml 범위의 TPAP 첨가량은 AMG의 심한 불안정화 및 몇몇의 발효에서 측정된 것과 유사한 TPAP/AMG 비율을 나타내었다. 비활성화 효과는 37℃ 뿐 아니라 25℃에서도 가장 뚜렷하였다. 열안정성에 대한 명백한 효과가 27일의 저장후에 관찰되었다. 4℃에서의 저장은 AMG의 열안정성에 영향을 주지 않았다.

(실시예 7)

A. niger TPAP의 특이성을 다양한 천연단백질 및 펩티드 기질을 이용하여 조사하였다. 이들 기질을 이용하여 TPAP는 절단점 방향의 아미노산 잔기 N-말단에 관하여 매우 비특이적인 것으로 나타났다. TPAP는 Pro 잔기 및 CM-Cys 잔기 뒤에서도 절단 능력이 있다. 그러나, 절단점 방향의 Pro 잔기 C-말단은 TPAP에 의한 절단을 완전히 저해한다. 천연 단백질의 TPAP 처리에 의해 얻어지는 특정 절단 산물은 IPE, YVD, WRQ, KGA, LPS, ANL, NGT, LMQ, YFE, GPG, GGG, ADG, RST, SVE, KKP, EGV, NTG, AGD, RHN, LKT, VEK, KPE, GVN, TGA, GDR, HNL, HSQ, GTF, TSD, YSK, YLD, SRR, AQD, FVQ, WLM 및 ATL의 트리펩티드 서열을 포함한다.

(실시예 8)

A. niger TPAP 활성의 저해

프로테아제 저해제, 클로로메틸케톤 Ala-Ala-Phe-CMK (AAF-CMK)에 의한 TPAP의 저해를 상기 조건하에서 시험하였다. AAF-CMK는 TPAP를 완벽하게 저해하는 것으로 나타났다.

발효 육즙에의 AAF-CMK의 첨가는 TPAP 활성을 완전히 저해할 수 있다. 5 가지 다른 AMG 배치의 열안정성을 TPAP 활성의 존재 그리고 비존재하에 조사하였다. TPAP가 저해받았을 때 37℃에서 2주 저장후 모든 5 AMG 배치의 열안정성은 변하지 않았다. 저해제가 없는 대응하는 시료는 모두 명백하게 불안정화되었다.

(실시예 9)

AMG 생산 A. niger 균주의 배양으로부터 얻어진 10 ml 배양 육즙의 분취액을 수산화나트륨으로 pH 6.5이든지 또는 pH 7.0이든지로 맞추었다. 시료를 각각 25℃, 40℃ 및 50℃에서 한시간 동안 배양하고 이어서 시료를 아세트산으로 pH 4.3으로 맞추었다. 처리된 시료의 저장안정성을 측정하였다. 이 간단한 회수 단계(높은 온도에서의 pH 처리에 기초한)는 TPAP 활성의 효과적인 제거를 초래했다(표 6). pH 6.5/40℃에서 한시간 동안의 배양 육즙의 처리는 TPAP 활성을 5%로 감소시켰고 40℃에서의 2 주 저장 후 안정성이 변하지 않는 매우 안정한 산물을 제공하였다.

pH/온도 1시간	처리후 TPAP	처리후 AMG	초기 T30	2주 T30	2주 TPAP
참고	100	100	50	31	80
6.5/25℃ 6.5/40℃ 6.5/50℃	90 5 <1	100 97 90	46 47 -	43 53 -	42 <1 -
7.0/25℃ 7.0/40℃ 7.0/50℃	86 <1 <1	99 92 85	48 48 -	44 55 -	<1 <1 -
표 안의 모든 숫자는 %이다. 각각 TPAP 및 AMG에 대해 표시된 값들은 표시된 시간에서의 상대적 활성이다.

(실시예 10)

PCR 클로닝

A. niger TPAP(이것의 서열은 SEQ ID No. 3에 보임)의 N-말단 아미노산 서열로부터 네개의 PCR 프라이머를 설계하였다(표 7). A. niger의 균주로부터의 게놈 DNA가 네개의 PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. 기대되는 크기 65 bp의 PCR 단편을 정제하고 플라스미드 pCRTMII(Invitrogen Corporation)내로 클로닝하였다. 세 클론에 대한 삽입체의 서열결정은 그들중의 둘은 프라이머에 대응하는 부위에서 축퇴 서열을 포함하는 한편, 사이의 서열이 N-말단 아미노산 서열에 불변함을 증명하였다.

트리펩티딜 아미노펩티다제를 코딩하는 보다 큰 DNA 단편을 클로닝하기위해 불변 서열에 대응하는 프라이머 #6010 (GCACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTG)을 제조하였다. 두 개의 다른 펩티드 서열로부터 세 PCR 프라이머를 설계하였다(표 7). 세 PCR 반응(#6010/#5988, #6010/#5989, 및 #6010/#5990)은 주형으로서 게놈성 A. niger DNA를 사용하여 수행하였다. 반응은 두 어닐링 온도 42℃ 및 45℃에서 수행했다. 반응들 #6010/#5989(약 80 bp의 한 단편) 및 #6010/#5990(약 120 bp, 500 bp, 및 950 bp의 세 단편)은 다른 두 온도에서 아가로스 젤상에서 동일한 밴드 유형을 보였다. 반응 #6010/#5988에서 약 120 bp의 단편이 42℃에서 보였으나, 45℃에서는 약 950 bp의 단편이 보였다. 950 bp의 단편이 적절한 것으로 나타났으며 pCR II AT 벡터내로 삽입되었다. 950 kb 단편을 가지는 E. coli 균주는 부다페스트 조약의 규정하에, DSM 9570으로, 1994년 12월 5일에 도이췌 잠룽 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 네엠바하(독일연방공화국 데-38124 브라운쉬바이크 바쉐르오데르 베크 1베)에 기탁되었다.

950 bp 단편은 양끝으로부터 서열결정되었다. 이 단편은 TPAP의 N-말단 부분을 코딩하는 단편인 것으로 나타났다. N-말단 부분의 부분적 서열을 SEQ ID No. 2에 보이며, 다른 끝으로부터의 서열결정으로부터 얻어진 부분적 서열을 SEQ ID No. 3에 보인다. 908 bp에 의해 구성되는 것으로 밝혀진 전체 "950 염기 단편"의 서열을 서열 1에 보인다.

서던 분석

A. niger의 균주 및 A. oryzae IFO 4177로부터의 게놈 DNA를 이전에 기술된 바와 같이 분리하였다(Yelton 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1470-1474). 게놈 DNA를 적절한 제한효소로 분해시켰고, 0.7% 아가로스 겔상에서 분별하 였고, 제조자에 의해 기술된 바와 같은 Immobilon^TM-N에 블라팅시켰다. 막을 Feinberg 등, 1983, Anal. Biochem. 132:6에 의해 기술된 방법에 따른 랜덤 프라이밍(random priming)에 의해 알파-32P dATP(NewEngland)로 표지된 950 bp TPAP 유전자 서열의 존재에 대해 조사하였다. 이어서 막은 2시간 동안 65℃에서 혼성화 용액(5xSSC(0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산삼나트륨), 10xDenhardt 0.2% Ficoll, (0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소혈청알부민), 10 mM EDTA, 1% SDS, 150 μg/ml Poly A, 50 μg/ml 효모 RNA)내에서 배양하였다. 다음에, 방사능 표지된 프로브를 첨가하고 65℃에서 하루밤 서서히 교반하면서 배양하였다. 막을 30℃에서 15분간 2xSSC, 1% SDS로 2회 세척하였다. 마지막으로, 막을 건조하고, 플라스틱 랩으로 덮고, -70℃에서 X-레이 필름(Fuli-RX)에 노출시켰다.

두 균주는 TPAP를 코딩하는 단 하나의 유전자를 포함한다는 결과를 나타냈다.

본 발명의 TPAP 생산세포로부터의 TPAP 생산의 감소방법에 의할 때, 상기 세포로부터의 감소된 TPAP 생산을 유발하도록 상기 세포내에 존재하고 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 불활성화시킨다. 본 발명에 의해 제시된 바와 같이, 단백질 산물에 TPAP가 소량으로 존재할 지라도 상기 산물의 열안정성이 감소하는 결과를 초래한다. 더 나아가, 본 발명의 상기 방법에 의하면 TPAP 활성이 본질적으로 없는 산물을 제조 할 수 있다.

<110> NOVOZYMES A/S <120> METHOD FOR REDUCING OR ELIMINATING TRIPEPTIDYL AMINOPEPTIDASE PRODUCTION <140> 10-2003-7016094 <141> 2003-12-08 <150> DK1288/94 <151> 1994-11-08 <150> DK1470/94 <151> 1994-12-22 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 908 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 1 cactgtctga agcagctgta caacatcggt gactaccagg ccgatcccaa gtccggcagc 60 aagatcggct ttgccaccta ccttgaggaa tacccccggt atgccgatct cgagaggttc 120 gagcagcacc tggctcccaa tgccatcggc cagaacttca gcgtcgtcca attcaacggc 180 ggcctcaacg atcagctttc atcgagtgac agcggcgaag ccaacctcga cctgcagtac 240 atcctgggcg tcagcgctcc cgtccccatc accgagtaca gcaccggcgg acgcggcgaa 300 ctagtccccg acctgagctc ccccgacccc aacgacaaca gcaacgagcc ctaccttgac 360 ttccttcagg gaatcctcaa gcttaacaac tccgacctcc cacaagtcat ctctacctcc 420 tacggtgaag acgaacaggt atgcacctca cctgacccat tccattttac atccctcacc 480 tctctcaacc aaactaacaa caccaacaga ctatccccct cccctacgcc cgcaccgtct 540 gcaacctcta cgcccaactc ggcagccgcg gcgtctctgt aatcttctcc agcggcgact 600 ccggcgtcgg cgccgcctgc ctcaccaacg acggcaccaa ccgcacgcac ttccctcctc 660 aattccccgc ctcctgcccc tgggtaacct ccgtcggcgc aacctccaag acctcccccg 720 agcaagccgt ctccttctcc tccggcggct tctccgacct ctggccccgc ccctcctacc 780 aacacgccgc cgtgcaaacc tacctcacca agcacctggg caacaagttc tcggggcttt 840 tcaacgcctc cggccgcgcc ttccccgacg tctccgcgca gggcgtcaac tacgctgttt 900 acgacaaa 908 <210> 2 <211> 228 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 2 cactgtctga agcagctgta caacatcggt gactaccagg ccgatcccaa gtccggcagc 60 aagatcggct tgggcagcta ccttgaggaa tacgcccggt atgccgatct cgagaggttc 120 gagcaccacc tggctccaat ccatccccag aactcaccgt cctccaattc accgccgctc 180 acgatcagct tcatcgagtg acagcggcga gcaactcgac tgcagtac 228 <210> 3 <211> 134 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 3 cctcctacca acaccccgcc ctccaaccta cctgaccaac cacctcccaa caagttctcg 60 cggcttttca acccctccgc ccccgccttc cccgacgtct ccccccaccg cctcaactac 120 cctgtttacg acaa 134 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 4 Ala Gln Asn Thr Ser His Cys Asp Ser Ile Ile Thr Pro His Cys Leu 1 5 10 15 Lys Gln Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Tyr Gln Ala Asp Pro Lys 20 25 30 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 5 Thr Ser Pro Glu Gln Ala Val Ser Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asp 1 5 10 15 Leu Trp Pro Arg Pro Ser Tyr Gln His 20 25 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 6 Phe Ser Gly Leu Phe Asn Ala Ser Gly Arg Ala Phe Pro Asp Val Ser 1 5 10 15 Ala Gln Gly Val Asn Tyr Ala Val Tyr Asp Lys 20 25 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 7 Ile Gly Phe Ala Ser Tyr Leu Gln Glu Tyr Ala Arg Tyr Ala Asx Leu 1 5 10 15 Glu Arg Phe Glu Gln His Leu 20 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 8 Xaa Leu Asx Leu Gln Tyr Ile Leu Gly Val Ser Ala Pro Val Pro Ile 1 5 10 15 Thr Glu Tyr Ser Thr Gly Gly Arg Gly Glu Leu Val Pro 20 25 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 9 Gly Ala Leu Asx Asp Ile Val Asn Gly Thr Ser Val Gly Gln Asp Gly 1 5 10 15 Arg Asn Arg Phe Gly Gly Thr Pro Asn Gly Ser 20 25 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 10 Glu Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Tyr Gln Ala Asp Ala Asn Ser Gly Ser 1 5 10 15 Lys <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 11 Thr Thr Pro Glu Arg Gly Thr Tyr Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn 1 5 10 15 Tyr Trp Pro Arg Pro Glu Trp Gln Asn Gln Ala Val Ala Ser Tyr Leu 20 25 30 <210> 12 <211> 44 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 12 Gly Thr Leu Gly Glu Phe Asp Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ala Phe 1 5 10 15 Ser Ala Val Ile Ala Leu Leu Asn Asp Ala Arg Leu Arg Ala Gly Lys 20 25 30 Pro Thr Leu Gly Phe Leu Asn Pro Trp Leu Tyr Lys 35 40 <210> 13 <211> 37 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 13 Thr Gly Arg Gln Gly Leu Gln Asn Ile Thr Leu Gly Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Xaa Thr Gly Arg Ala Arg Phe Gly Gly Ala Pro Asn Gly Gly Pro Val 20 25 30 Val Pro Tyr Ala Ser 35 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 14 Ala Lys Xaa Ile Ser His Xaa Asp Ser Ile Ile Thr Pro Pro Xaa Leu 1 5 10 15 Lys Glu Leu Tyr Asn Ile Gly 20 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 15 Ala Xaa Asn Xaa Ser His Cys Asp Ser Ile Ile Thr Pro Xaa Cys Leu 1 5 10 15 Lys Xaa Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Tyr Gln Ala Asp Xaa Xaa 20 25 30

Claims (20)

1. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 트리펩티딜아미노펩티다제 (TPAP) 생산 세포로부터 TPAP 생산을 감소 또는 제거하는 방법으로서, 상기 세포에 존재하며 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 불활성화시켜 상기세포로부터 감소된 또는 제거된 TPAP 생산을 초래하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, DNA 서열이 TPAP 또는 TPAP 활성의 발현에 필수적인 그것의 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, DNA 서열이 TPAP를 코딩하는 DNA 서열로부터 TPAP의 발현에 필요한 조절 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, DNA 서열이 프로모터 서열 또는 이것의 기능 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 TPAP 생산 세포를 돌연변이 생성시키는 것 및 TPAP 생산능이 감소 또는 제거된 세포를 선택하는 것에 의해 DNA 서열의 변형 또는 불활성화를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 돌연변이생성이 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이생성에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 TPAP 생산 세포로부터 TPAP 생산을 감소 또는 제거하는 방법으로서, TPAP를 코딩하는 서열에 상보적이어서 세포내에서 생산된 TPAP mRNA에 혼성화가 가능한 누클레오티드 서열을, 누클레오티드 서열이 TPAP mRNA로 혼성화되고 따라서 상기 mRNA로부터의 번역된 TPAP 양을 감소시키거나 그러한 번역을 제거하는 것을 허용하는 조건하에서 누클레오티드 서열이 세포내에서 전사되는 방식으로, 세포내로 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 7 항 중의 어느 한 항에 따라 제조되는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 숙주 세포.
9. 삭제
10. 삭제
11. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 TPAP 생산 세포에서 발현되는, TPAP 활성의 60% 이상이 제거된 단백질 산물을 제조하는 방법으로서, 제 8 항에 따른 균류 숙주세포를 단백질 산물을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키는 것, 형질전환된 세포를 단백질 산물을 발현하는 조건하에서 배양하는 것, 및 배양물로부터 단백질 산물을 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 TPAP 생산 세포에서 발현되는, TPAP 활성의 60% 이상이 제거된 단백질 산물을 제조하는 방법으로서, 단백질 산물이 TPAP를 발현하는 세포내에 존재하는 DNA 서열에 의해 코딩되며, 방법이 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 7 항 중의 어느 한항에 따르는 방법에 따라 상기 세포내에 존재하고 TPAP 발현에 필요한 DNA 서열을 변형 또는 불활성화시키고 이어서 단백질 산물을 발현하는 조건 하에서 세포를 배양하고, 배양물로부터 단백질 산물을 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 균류 TPAP 생산 세포에서 발현되는 단백질 산물을 또한 생산하는 TPAP-생산 세포의 발효에 의해 TPAP활성의 60% 이상이 제거된 단백질 산물을 제조하는 방법으로서, 발효 중 또는 발효가 완료된 후에 발효 육즙에 TPAP 활성을 저해할 수 있는 프로테아제 저해제의 유효량을 첨가하는 것, 발효 육즙으로부터 목적 단백질 산물을 회수하는 것, 및 선택적으로 회수된 단백질 산물을 추가로 정제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 균류 TPAP 생산 세포에서 발현되는 단백질 산물을 또한 생산하는 TPAP-생산 세포의 발효에 의해 TPAP 활성의 60% 이상이 제거된 단백질 산물을 제조하는 방법으로서, 발효 육즙 또는 TPAP 및 목적 단백질 산물을 함유하는 것으로부터 분리된 효소 제제를 TPAP 활성을 감소시키기에 충분한 시간동안 pH 및 온도의 조합된 처리를 하는 것, 및 처리된 육즙으로부터 단백질 산물을 선택적으로 회수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, TPAP 감소 처리가 6.5 내지 7의 범위의 pH에서 그리고 25 내지 40℃의 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 11 항에 있어서, 단백질 산물이 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 단백질 산물이 녹말분해성 효소, 지방분해성 효소, 단백질분해성 효소, 셀룰로스분해성 효소, 산화환원 효소, 및 식물 세포벽 분해 효소로부터 선택되는 것을 특징으로하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 단백질 산물이 아밀로글루코시다제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 아밀라제, 프로테아제, 퍼옥시다제, 트랜스글루타미나제, 라카제, 카탈라제, 글루코스 산화효소, 또는 피타제인 것을 특징으로 하는 방법.
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