CN1611601A

CN1611601A - 三肽基氨肽酶

Info

Publication number: CN1611601A
Application number: CNA2004100955038A
Authority: CN
Inventors: K·A·霍尔姆; G·拉斯默森; T·哈凯尔; J·莱姆贝克
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 2005-05-04
Also published as: CA2204257A1; CN1164868A; KR970707277A; ES2301163T3; KR100545010B1; DK0804558T3; JPH10508475A; ATE384787T1; US5821104A; AU3802595A; WO1996014404A1; JP4571604B2; DE69535696D1; US5989889A; EP0804558A2; DE69535696T2; JP2007020578A; KR20040023615A; EP0804558B1; CA2204257C

Abstract

一种三肽基氨肽酶(TPAT)，它由一种DNA结构编码，该DNA结构包括：i)序列1、2或3中示出的DNA序列，或ii)DSM 9570的部分TPAP编码DNA序列，或iii)一个核苷酸序列，它能够与以序列1、2或3中示出的DNA序列为基础制备的寡核苷酸探针或以序列4－14中任一个示出的氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸探针杂交，而且它编码一种TPAP。该TPAP可通过重组DNA技术获得。通过对TPAP编码DNA序列进行灭活或修饰可以生产出TPAP缺陷型生产菌株。

Description

三肽基氨肽酶

本发明涉及一种三肽基氨肽酶(TPAP)，一种编码该TPAP的DNA结构，一种生产TPAP的方法和在不需要TPAP活性的细胞中减少TPAP产量的方法。

三肽基氨肽酶是能够裂解来自肽、寡肽或蛋白质的未取代的N-末端的片段的酶。三肽基氨肽酶可以是非特异性的，即能够裂解来自所述未取代的N-末端的任何三肽序列；或者是特异性的，即能够裂解特殊类型的三肽序列。

此前已报导过来源于动物的三肽基氨肽酶。例如，Doebber等(1978)披露了一种自牛脑垂体中提取的三肽基氨肽酶(Endocrinology103：1794-1804)，已证实其能够裂解来自牛生长激素N-末端的三肽。在Mammalian Protease Vol.2，Exopeptidases(AP 1986，作者：J.K.McDonald和A.J.Barrett)中，披露了分别自牛脑垂体、受孕的猪卵巢和猪脾中提取的三肽基氨肽酶。

Krieger等披露了一种自铅色链霉菌(Streptomyces lividans)66中提取的一种细菌三肽基氨肽酶(Febs Letters Vol.352，No.3，pp385-388，1994)。Butler等披露了编码所述氨肽酶的基因及其推定的氨基酸序列(Applied and Environmental Micrology，1995年8月，P.3145-3150)。这种肽酶被鉴定为丝氨酸蛋白酶，其最佳pH为7.5～8.5。

众所周知，由微生物生产的制品如酶或其它蛋白的稳定性会变化，特别是受生产所述制品的方法和/或所述制品的来源或微生物生产菌的影响。例如，由微生物生产的制品的稳定性的降低，可能是由对热、光或其它外界条件的抗性的降低所致，或是由所述制品本身的组成所致。就此而言，即使有微量的蛋白酶活性存在于蛋白质制品中也会导致该蛋白制品的稳定性明显下降。不过，通常不能够正确鉴定所述稳定性变化的原因。

本发明人意外地发现，有多种真菌菌种能够产生TPAP，而且，由这些微生物所产生的蛋白制品可能含有微量的TPAP，在某些情况下已发现TPAP能导致该蛋白制品稳定性的降低。本发明人已成功地提取并鉴定了所述TPAP。已证实TPAP能够非特异性地裂解来自蛋白制品的未取代的N-末端的三肽，这种裂解在某些情况下是需要的，但在另一些情况下却很不需要(例如，当导致含有TPAP的蛋白制品的稳定性降低时)。

因此，本发明的一个目的是提供一种可用于裂解肽或蛋白序列的基本纯净的三肽基肽酶。本发明的另一个目的是提供一种生产基本上不含TPAP的蛋白制品的方法，特别是生产那些为TPAP底物的蛋白制品，TPAP的存在会使这种制品的稳定性下降。

在第一个大的方面，本发明涉及一种自真菌中提取的TPAP。具体地讲，TPAP可得自真菌曲霉菌的菌株。另一方面，本发明涉及通过氨基酸和/或DNA序列资料和/或通过酶蛋白特征鉴定的TPAP，涉及编码该TPAP的DNA结构，还涉及这样一种DNA结构：它包括一段与所述编码TPAP的部分DNA序列互补到足于与该序列杂交的程度的核苷酸序列，从而破坏特定宿主细胞的TPAP生产能力。

在另一个重要方面，本发明涉及一种降低产TPAP细胞的TPAP产量的方法，在该方法中，对存在于所述细胞中的、为TPAP表达所必须的一段DNA序列进行修饰或使其失活，以便降低该细胞的TPAP产量。

定义

在本文中，“TPAP”用来表示一种氨肽酶，它能裂解来自肽或蛋白序列的N-末端三肽，例如，来自一种伸展蛋白序列，如激素原或酶原中的序列。一般而言，TPAP能够裂解来自肽或蛋白的未取代的N-末端氨基的三肽XYZ，其中，X、Y、Z表示任何氨基酸残基(即：选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)。在TPAP底物中，所有的X、Y和Z可以不同或相同，或者X、Y和Z中有两者相同。应当指出，本发明的TPAP对于被裂解的三肽氨基酸序列来说是非特异性的。在例7中，列举了通过裂解天然存在的肽和蛋白质所获得的三肽产物的具体例子。

在谈及构成本发明DNA结构一部分的DNA序列的来源时所使用的“可获自”一词，是用于表示该DNA序列可以自相关生物的核酸(DNA或RNA)中提取，或以这些材料为基础进行制备。例如，所述DNA序列可以采用本领域已知的方法从由所述生物制备的基因组或cDNA文库中提取，或以这些材料为基础进行制备。

类似地，当“可获自”一词与本发明的TPAP一起使用时，是指该TPAP可以自所述生物中回收，或者可以由获自所述生物的一段DNA序列编码并从能表达该DNA序列的生物中回收。

本发明的TPAP

在完成本发明的研究过程中，提取并鉴定了两种不同的TPAPs-一种获自黑曲霉(A.niger)菌株，另一种获自米曲霉(A.oryzae)菌株。这两种TPAPs可以作为一种大致为新的类型的三肽基氨肽酶的范例。

因此，一方面，本发明涉及一种TPAP，它由一种DNA结构编码，该DNA结构包括：

i)由序列1、2和3中至少一个所示的部分DNA序列，最好是两个或两个以上的序列，或

ii)编码存在于DSM 9570中的成熟TPAP的N-末端部分的部分DNA序列，或

iii)一个核苷酸序列，它能够与以序列1、2或3中示出的DNA序列为基础制备的寡核苷酸探针或以序列4-14中任一个示出的氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸探针杂交，而且，它编码一种TPAP。

在下文中以“本发明的DNA结构和载体”为标题的相应部分中，将对iii)的核苷酸序列作更详细的说明。

另一方面，本发明涉及一种基本纯净的TPAP，它具备以下特征中的一种或几种：

-裂解底物Phe-Pro-Ala-pNA的能力，

-分子量大约为65kDa(基本上按Laemmli所披露的方法测定，U.K.1970，“Cleavage of structural Proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T₄”，Nature，227，P.680-685)，

-pI范围为4-6，

-最佳pH值范围约为5.0-7.5，

-能与纯化的黑曲霉TPAP或纯化的米曲霉TPAP发生免疫交叉反应，

-包括以下N-末端序列：

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6)(序列15)，其中Xaa(1)、Xaa(2)、Xaa(3)、Xaa(4)、Xaa(5)和Xaa(6)可以相同或是不同，并可以选自任一种天然氨基酸残基。理想的是，Xaa(1)为Lys或Gln、Xaa(2)为Ile或Thr，Xaa(3)为Pro或His，Xaa(4)为Glu或Gln，Xaa(5)为Pro或Ala和/或Xaa(6)为Lys或Asn。

用于测定免疫交叉反应性的抗体可以用纯化的TPAP进行制备。更具体地讲，抗本发明的酶的抗血清可以按照N.Axelsen等所述的方法(见：A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 23，或A.Johnstone和Thorpe所述方法(见：Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982，pp.27-31)通过对兔(或其它啮齿动物)进行免疫制备。可以从抗血清中获取纯化的免疫球蛋白，例如，通过盐沉淀[(NH₄)₂SO₄]，接着再进行透析和离子交换层析，例如在DEAE-Sephadox^TM上进行层析。蛋白质的免疫化学特征分析可以用Outcherlony双扩散分析法(O.Onchterlony，见：Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir著)，BlackwellScientific Publications，1967，pp.655-706)，通过交叉免疫电泳(N.Axelsen等，Supra，Chapter3和4)进行；或通过火箭免疫电泳(N.Axelsen等，Supra，Chaper2)。

在一种实施方案中，本发明的TPAP包括在序列4-9中所示出的氨基酸序列的至少一种的部分序列和/或其最佳pH值约为5.0～5.5和/或pI约为5.1或5.2。

在另一种实施方案中，本发明的TPAP包括在序列10-14中示出的氨基酸序列的至少一种的部分序列和/或其最佳pH值范围约为5.5～7.5和/或pI约为4.5。

从由一个黑曲霉菌株所产生的蛋白制品中提取TPAP，该TPAP是由包括序列1、2或3中至少一个所示出的序列的一段DNA序列编码，或是获自DSM 9570，或是包括在序列4-9中所示出的肽(参见下面的例1)。从一个米曲霉菌株中提取到含有序列10-14所示肽的TPA，参见下面的例2。

目前认为，属于本文所述的大致为新类型的三肽基氨肽酶的TPAP可以是任何来源的，包括动物或植物，但最好来源于微生物，即细菌或真菌。就本发明人所知，本发明所披露的内容是首次报导来源于真菌的TPAP。本发明的TPAP可以从天然的TPAP生产菌中提取，或者更常见的是，作为同源或异源基因产物通过重组DNA技术生产，下文将对此作进一步说明。

具体地讲，本发明的TPAP可获自曲霉属的一个菌株，如米曲霉、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、构巢曲霉(A.nidulans)或臭曲霉(A.foetidus)的菌株，或木霉属的菌株，如绿色木霉(T.viride)、T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum的菌株，或镰孢属的一个种，如尖镰孢(F.oxysporum)、禾本科镰孢(F.graminearum)或腐皮镰孢(F.solani)，或高温霉属(Thermomyces)的一个菌株，如疏绵状高温霉(T.lanuginosus)或T.insolens。

本发明的TPAP最好以提取的和基本纯净的形式提供，例如，纯度至少为90％，如95％。

尽管蛋白制品中含有TPAP可能被视为是不理想的，因为它会导致该制品的稳定性降低，但是，把本发明的纯化TPAP用于控制蛋白制品的去稳定作用是有利的。例如，预计本发明的纯化TPAP可用于在酶起到其应有的作用后使其失活，因此，它起到“杀手酶”的作用。这种失活作用通常是通过热失活实现的(或者通过纯化除去不理想的酶活性)。将TPAP用于对耐热酶进行去稳定作用特别有利。

作为上述用途的一个例子，下面将述用于淀粉液化的AMG的失活。目前，AMG的失活是通过将反应混合物加热至高温(80-85℃)而实现的。加入TPAP也可实现这种失活目的，最好是在AMG已经把糊精水解成葡萄糖后以分批方式进行。然后，就可以通过仅把温度提高到大约60℃的方法在短时间内实现AMG的失活。

另一个例子是用于啤酒如低热量啤酒发酵的AMG的失活。在正常的啤酒发酵方法中，是通过巴氏消毒法使AMG失活的。加入TPAP可以降低所用AMG的热稳定性，因此，可降低巴氏消毒法的温度。通过这种处理，可以改善其感观特性。

另外，本发明的纯化TPAP可用于一些需要特异性裂解三肽序列的目的247例如，某些肽或蛋白质是以前体形式合成的，这种前体的N-末端氨基酸残基中包括若干附加的氨基酸残基，但这些附加氨基酸残基的存在不利于该蛋白的使用。例如，在以诸如前体蛋白的保护形式合成蛋白或肽的过程中就会出现这种情况。

本发明的DNA结构和载体

再一方面，本发明涉及一种编码一个TPAP的DNA结构，它包括：

i)序列1、2和3中所示部分DNA序列的至少一种，最好是两种或全部，或

ii)编码TPAP的N-末端的部分DNA序列，它存在于DSM 9570中，或

iii)一个核苷酸序列，它能与以序列1、2或3中任一个所示的DNA序列为基础制备的寡核苷酸探针或以序列4-14中任一个所示的氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸探针杂交，而且，它编码一种TPAP，或

iv)一个互补于i)、ii)或iii)的DNA/核苷酸序列的核苷酸序列。

本发明的DNA结构既可用于TPAP(i)-iii)的DNA/核苷酸序列)的重组生产，又可用于在不需要产生TPAP(核苷酸序列iv))的细胞中降低其生产能力。

例如，可以从已知的其它生物或相关生物(如同一种生物)中提取核苷酸序列iii)，或是以序列1-14中任一个所示的部分DNA序列或氨基酸序列或DSM 9570的部分TPAP编码DNA序列为基础生产TPAP；例如，使用本文所披露的方法，或以所述DNA或氨基酸序列中任一个为基础构建，例如，通过引入核苷酸取代基，这种取代基不会使由该DNA序列编码的TPAP出现另一种氨基酸序列，但会影响被用于生产这种TPAP的宿主生物的密码子使用；或通过引入核苷酸取代基，这种取代基会导致出现另一种氨基酸序列，因此，会出现一种不同的蛋白质结构，这种结构会导致一个TPAP突变型，该突变型具有不同于天然TPAP的特性，但其TPAP活性保持不变。可进行改变的其它例子有：将一个或几个核苷酸插入该序列；在该序列的任一端增加一个或几个核苷酸；在该序列的任一端或在该序列中缺失一个或几个核苷酸。

可以理解的是，序列1-3中所示的DNA序列和DSM 9570的DNA序列是部分序列，其可以包含于一个完整的TPAP编码DNA序列中，或用于提取完整的TPAP编码DNA序列。通过本领域的公知方法可以轻易地达到上述目的。根据本发明，核苷酸序列iii)欲包括所述完整的DNA序列。

上文提及的杂交是指在某种特定条件下核苷酸序列iii)与和编码TPAP的DNA序列相同的探针杂交(或者与编码TPAP的DNA序列杂交)，在下文的材料和方法一节将对此作详细说明。通常，核苷酸序列iii)是与序列1、2或3中示出的DNA序列或DSM 9570的TPAP编码DNA序列高度同源的(比较核苷酸序列iii)的部分序列，其与本文披露的部分DNA序列相应)，如同源性至少为65％，例如与所述DNA序列的同源性至少为70％，例如与所述序列的任一个或全部的同源性至少为75％、80％、85％、90％，或者甚至至少为95％。因此，预计本发明的TPAP与由所述DNA序列编码的氨基酸序列的同源性至少为65％，例如，至少为70％(这一结果是基于对TPAP氨基酸序列部分与由所述DNA序列编码部分的比较而得出的)，例如，同源性至少为75％、80％、85％、90％或者甚至至少为95％。

核苷酸序列iii)可以是DNA或RNA序列。

可以用众所周知的方法制备本发明DNA结构的DNA序列i)-iii)。因此，可以通过建立cDNA或基因组文库的方法，从预计获得了相关DNA序列的生物，如上述细胞中提取DNA序列，并通过常规方法筛选阳性克隆。这种方法的例子有：按标准方法(见Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，Now York，1989)与合适的寡核苷酸探针杂交，和/或筛选表现相关活性的克隆，和/或筛选能产生一种蛋白质的克隆，该蛋白能与抗所述相关酶的抗体反应。

从cDNA或基因组文库中提取DNA的优选方法为：通过采用简并寡核苷酸探针的聚合酶链式反应(PCR)。例如，可使用披露于PCR Protocols(1993，Bruce A.White著)和The Polymerase Chain Reaction (1994，KaryB.Mullis著)中的技术实现上述PCR反应。

或者仅仅从DSM 9570中提取DNA序列i)和ii)。

另外，本发明DNA结构的DNA序列，例如，互补于DNA/核苷酸序列i)、ii)或iii)的核苷酸序列iv)可以通过已建立的技术合成，例如，根据Narang，SA(1983，Tetrahedron 39：3)和Itakura等(1984，Annu.Rev.Biochem.53：323)所披露的原理合成。

本发明的DNA结构可以是按照标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段(视需要)而制备的基因组和合成片段的复合体、合成片段和cDNA的复合体或基因组和cDNA起源的复合体，所述合成片段相应于完整的重组DNA分子的各个部分。

可以理解的是，DNA序列i)、ii)或iii)的优选用途是用于制备重组TPAP，而DNA序列iv)的优选用途是用于减少用来生产蛋白制品的细胞的TPAP生产能力，这种蛋白制品对TPAP敏感。

尽管DNA序列iv)可以互补于完整的TPAP编码序列，但通常只要DNA序列iv)互补于该编码序列的一部分就够了。从功能角度考虑，DNA序列iv)与编码TPAP的DNA序列必需有足够长的互补长度，以便能与TPAP编码DNA杂交，从而减少或抑制所述mRNA的转录。通常，DNA序列iv)包括一个至少有17个核苷酸，如至少有300个核苷酸的DNA序列就足够了。

带有本发明DNA结构的载体，最好是重组表达载体，它可以是任何能方便地进行重组DNA操作的载体，而表达载体的选择通常取决于其中要导入该载体的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制的载体，即作为一种染色体外实体存在的裁体，其复制独立于染色体复制，例如质粒或噬菌体。或者，所述载体也可以是在导入宿主细胞后能整合到宿主细胞基因组中，并能与它所整合的染色体一起复制。

在所述DNA结构或载体中，所述DNA序列应当可操作地与一个合适的启动子序列连接。该启动子序列可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中具有转录活性，而且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。该启动子可来源于编码胞外和胞内蛋白如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和糖酵解酶的基因。适于指导本发明的DNA结构转录的启动子的例子包括来自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳性α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂肪酶的基因的启动子。来源于编码糖酵解酶的基因的启动子的例子有TPI、ADH和PGK。该启动子也可以是同源启动子，即：为被使用的宿主菌株所固有的基因。

所述启动子序列可以带有接头，以便引入特殊的限制位点，从而有利于该启动子序列与所选择的基因或与选择的信号肽或前导片段的连接。

本发明的DNA结构和/或表达载体还可以包括一个合适的终止子，它可操作地与编码TPAP的DNA序列连接，和/或一个聚腺苷酸化序列。所述终止子和聚腺苷酸化序列可以和所述启动子为同一来源。还可将增强子序列插入该DNA结构。

该DNA结构和/或载体还可以包括一个使该载体能够在相应的宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的例子包括质粒pUC19、pACYC 177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

该DNA结构和/或载体还可以包括一个选择标记。选择标记的例子包括amdS或argB，trpC或pyrG(后三种标记可获自构巢曲霉或黑曲霉)。

用于构建本发明的DNA结构的方法包括，分别连接上述DNA序列、启动子、终止子和其它因子，并将其插入带有复制所必需的信息的合适载体上。该方法为本领域技术人员所熟知(例如，见所引用的Sambrook等的书)。

生产本发明TPAP的细胞和方法

在一种实施方案中，将含有上述本发明DNA结构或表达载体的本发明的细胞用作宿主细胞，用于本发明TPAP的重组生产。在这种情况下，所述DNA结构或表达载体含有TPAP编码DNA序列i)-iii)中的任一个或如上所述的DSM 9570插入片段。可用该DNA结构转化所述宿主细胞，通常是将该DNA结构整合到宿主染色体上，尽管该DNA结构也可以作为染色体外实体存在。不过，一般认为这种整合是有利的，因为这样一来所述DNA序列似乎能更稳定地保持在宿主细胞中。所述DNA结构向所述宿主染色体上的整合作用可以按照常规方法进行，例如，通过同源重组。或者，根据不同类型的宿主细胞用下述一种表达载体转化宿主细胞。

本发明的细胞可以是高等生物，如哺乳动物或昆虫的细胞，但最好是微生物细胞，例如，细菌或真菌(包括酵母)细胞。

合适的细菌的例子包括革兰氏阳性细菌，如枯草杆菌(Bacillussubtilis)、地衣型芽胞杆菌(B.licheniformis)、Bacillus lentus、短杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽胞杆菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、Bacilluslautus、苏云金杆菌(B.thuringiensis)或蓝色链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰色链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌(E.coli)。举例来说，所述细菌的转化可以通过原生质体转化实现或以已知方式用感受态细胞实现。

理想的酵母生物可以选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的一个种，如酿酒酵母。丝状真菌最好是属于曲霉属的一个种，如米曲霉、构巢曲霉、臭曲霉、棘孢曲霉、日本曲霉或黑曲霉，木霉属(Trichoderma)的一个种，如T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum，或镰孢霉属(Fusarium)的一个种，如尖镰孢(F.oxysporum)、禾本科镰孢或腐皮镰孢。也可以用一种已知方法转化真菌细胞，该方法涉及原生质体形成和原生质体转化，以及随后的细胞壁再生。

另一方面，本发明涉及一种生产TPAP的方法，该方法包括：

i)在能够表达所述TPAP的条件下，在合适的培养基中培养上述本发明的细胞，以及从培养物中回收所述TPAP。

用于培养所述细胞的培养基，可以是任何适于相关宿主细胞生长的常见培养基。合适的培养基可从供货商处购买，也可以按照公开的配方制备(例如，可参阅Catalogues of the Americam Type Culture Collection)。据信，向培养基中添加蛋白后能使TPAP的产量增加。

可以用常见方法从培养基中回收TPAP，包括以下步骤：通过离心或过滤从培养基中分离细胞；如有必要，在细胞破裂后用盐，如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白类组分；接着通过各种层析方法进行纯化，如离子交换层析法或亲和层析法等。

消除或降低TPAP活性

TPAP作为由微生物生产的蛋白制品的去稳定因子的确定，对于很多种不同蛋白制品的生产具有重要意义。因此，正如由本发明人所证实的，即使在蛋白制品中存在微量TPAP，也会导致该制品热稳定性的降低。因此，可以通过本发明构建一种具有较低TPAP生产能力的生产菌株。

通常，可以通过如下方式降低TPAP生产细胞的TPAP产量：修饰存在于所述细胞中的一段DNA序列或使其失活，该序列是TPAP表达所必须的，以便降低该细胞的TPAP产量。

举例来说，被修饰的DNA序列可以是编码TPAP的DNA序列或是表现TPAP活性所必需的该序列的一部分，也可以是由一个TPAP编码DNA序列表达TPAP所需要的调节序列。

作为所述调节序列的一个例子，它可以是一个启动子序列或该序列的功能部分，即足于实现TPAP表达的一部分。

所述DNA序列的修饰或失活可以这样实现：对所述TPAP生产细胞进行诱变处理，并选择TPAP生产能力已被降低的细胞。诱变可以是特异性的或是随机的，例如，可以用合适的物理或化学诱变剂进行诱变，用合适的寡核苷酸进行诱变，或对该DNA序列进行PCR诱变处理。另外，也可以用所述诱变剂的任意组合形式进行诱变处理。

适用于本目的的物理或化学诱变剂的例子包括：紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

当采用以上诱变剂时，诱变通常是这样进行的：在存在被选用的诱变剂的情况下培养待诱变的细胞，培养是在适于诱变发生的条件下进行；选择具有较低TPAP产量的突变细胞。

当所述修饰或失活是通过TPAP编码序列或该序列转录或翻译所必须的调节因子上的一个或几个核苷酸的插入、置换或去除而实现的时候，核苷酸的插入或去除可以导致这样的结果：例如，引入一个终止密码子，去除起始密码子或改变开放读框。TPAP编码序列或调节因子的修饰或失活可以按照本领域已知方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变而实现。尽管原则上讲可在体内进行修饰，即直接在带有待修饰的TPAP基因的细胞上进行，但目前看来，在体外进行修饰比较理想，如下文所述。

使所选择的宿主细胞的TPAP生产能力丧失或降低的一种常用方法的例子，是基于基因置换或基因间断原理。例如，所述基因间断法涉及使用与想要破坏的内源基因或基因片段相关的DNA序列。该DNA序列在体外诱变成缺损基因，并将其转化到宿主细胞中。该缺损基因通过同源重组的方式取代所述内源基因或基因片段。该缺损基因或基因片段最好编码一种标记，该标记可用于选择其TPAP基因已被修饰或破坏的转化体。

另外，也可以通过已建立的反义技术，用互补于TPAP编码序列的核苷酸序列，如上述核苷酸序列iv)实现所述DNA序列的修饰或失活。更具体地讲，可通过以下方法使TPAP生产细胞的TPAP生产能力降低或丧失：将一种互补于TPAP编码序列、因而能够与该细胞中所产生的TPAPmRNA杂交的核苷酸序列导入所述细胞中，以便在该核苷酸序列能与所述TPAP mRNA杂交的条件下在细胞中转录该核苷酸序列，从而降低由该mRNA翻译成的TPAP量或失去这种翻译能力。

由此产生的TPAT缺陷型突变体特别适用于异源蛋白的表达。在本文中，“异源蛋白”被用来表示一种并非宿主细胞所固有的蛋白，其天然序列已因修饰作用而改变的天然蛋白，或其表达量已因对宿主细胞所做的重组DNA技术操作而改变的天然蛋白。

理想的是，待按照本发明方法进行修饰的TPAP生产细胞为适于生产所需蛋白制品的菌株，该蛋白制品与所述细胞同源或异源。例如，曲霉属、木霉属和镰孢菌属的真菌细胞可以作为优选生产细胞的例子。因此，本发明的待修饰细胞最好是一种曲霉菌细胞，特别是黑曲霉、米曲霉、日本曲霉、臭曲霉或构巢曲霉的细胞；或是一种木霉菌细胞，如T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum细胞；或是一种镰孢菌细胞，如尖镰孢、禾本科镰孢或腐皮镰孢细胞。

在本发明的一种具体实施方案中，所述待修饰的细胞是被用于酶，如AMG生产的黑曲霉或米曲霉细胞。

另一方面，本发明涉及一种制备一种基本上无TPAP活性的制品的方法，该方法包括：用一个编码所述制品的DNA序列转化上述具有较低或无TPAP生产能力的宿主细胞，在适于所述制品表达的条件下培养转化的细胞，以及从培养物中回收所述制品。

又一方面，本发明涉及一种制备一种基本上无TPAP活性的制品的方法，所述制品是由存在于一种TPAP表达细胞里的一种DNA序列编码，该方法包括：对一种DNA序列进行修饰或使其失活，该DNA序列存在于所述细胞中，并为上述TPAP的表达所必需；随后在适于所述制品表达的条件下培养该细胞，以及从培养物中回收所述制品。

另一方面，本发明涉及一种通过TPAP生产细胞发酵的方式制备一种基本上无TPAP的制品的方法，所述细胞还能产生所述制品，该方法包括：在发酵期间或发酵结束后将有效量的一种能抑制TPAP活性的抑制剂加入发酵液中，从该发酵液中回收所述想要的制品，并选择性地对回收的制品作进一步纯化。在下面的实施例中对该方法做进一步说明。

再一方面，本发明涉及一种制备一种基本上无TPAP活性的制品的方法，所述制品是由存在于一种TPAP表达细胞中的一段DNA序列编码，该方法包括：在允许所述制品表达的条件下培养所述编码该制品的TPAP表达细胞；用pH和温度综合处理所得到的培养液，以明显降低TPAP活性；并从该培养液中回收所述制品。另外，还可以对从所述培养液中回收的一种酶制剂进行上述综合pH和温度处理。所述综合pH和温度处理可以有选择地与用TPAP抑制剂进行的处理结合使用。

根据本发明的这一方面，可以消除至少60％的TPAP活性，如至少75％的活性，能消除至少85％的活性较好，能消除至少95％的活性更好，能大致消除至少99％的TPAP活性最好。预计，使用该方法可以彻底消除TPAP活性。

所述综合pH和温度处理最好是在pH为6.5-7的范围内，和25～40℃的温度范围内进行足够长的时间，以取得想要的效果。通常，0.5～1小时就足于取得理想效果。

用于培养和纯化感兴趣的制品的方法可以通过本领域已知的方法进行，例如，按上文所述方法进行。

本发明用于生产一种基本上无TPAP的制品的方法，特别适用于生产真核蛋白，尤其是真菌蛋白，如真菌酶。例如，所述酶制品可选自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。上述酶的例子包括：AMG、淀粉酶、脂肪酸、角质酶、酯酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、过氧化物酶、漆酶、酚氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、裂合酶、果胶酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、半乳糖苷酶、转谷氨酰胺酶和壳多糖酶。这种TPAP-缺损细胞还可用于表达有药用价值的异源蛋白，如激素、生长因子、受体等。

应当理解，“真核蛋白”一词不仅包括天然蛋白，而且包括通过氨基酸取代、缺失、增加而作过修饰或作过其它修饰的蛋白(如酶)，这种修饰是为了提高其活性、热稳定性和pH耐性等。

另一方面，本发明涉及一种基本上无TPAP活性的蛋白制品，该制品是由本发明的方法所生产。

例1

黑曲霉TPAP的纯化和鉴定

材料和方法

Phe-Pro-Ala-pNA底物(从Bachem公司购得，瑞士)。

蛋白酶抑制剂

Ala-Ala-Phe-氯甲基酮

苄氧基羰基-Ala-Pro-Phe-氯甲基酮

苄氧基羰基-Gly-Gly-Phe-氯甲基酮。

TPAP的纯化

从市售黑曲霉AMG制剂中提纯TPAP(所述制剂购自NovoNordiskA/S，丹麦)。对所配制的300ml AMG制品的样品反复进行稀释，并在4℃下，在装有3kDa截断膜的Filtron^_浓缩器中浓缩，直到其导电性低于1.5mS/cm。其它纯化步骤都是在环境温度下进行。

采用NaCl梯度的阳离子交换层析

将浓缩液(600ml)调至pH4.0并过滤，然后上一个用20mM乙酸钠(pH4.0)平衡过的体积为200ml(2.6×37cm)的S-Sepharose柱。采用10ml/分钟的流速。用0～0.2M线性梯度NaCl以10倍的柱体积洗脱TPAP。得到含有大部分肽酶活性的收集液。在一个装有截断值为10kDa的Diaflo膜的Amicon池中将缓冲液改为20mM乙酸钠，pH5.5。

阴离子交换层析

在一个用20mM乙酸钠，pH5.5平衡的HiLoad Q-Sepharose HP柱(50ml，2.6×10cm)上对从上述S-Sepharose柱中得到的收集液进行进一步纯化。用0-0.5M的线性梯度NaCl以15倍的柱体积洗脱TPAP。该蛋白以8.0ml/分钟的流速加入，并以5.0ml/分钟的速度洗脱。制成具有大部分TPAP活性的收集液。以上述方式在一个Amicon池中将缓冲液改为20mM乙酸钠，pH4.0。

采用pH梯度的阳离子交换层析

在一个用20mM乙酸钠，pH4.0平衡的Mono S柱(5/5)上对来自上述HiLoad Q-Sepharose HP柱的收集液作最后纯化。用20mM乙酸钠，pH4.0和20mM乙酸钠，pH6.0以30倍柱体积形成pH4.0～pH6.0的梯度。流速为1.0ml/分钟。TPAP的两种同功酶分别在pH5.1和pH5.2时洗脱。

AMG的纯化

已通过阴离子交换层析法用Q-Sepharose柱从市售AMG制剂(Novo Nordisk A/S)中纯化得到 AMG G1。用20mM乙酸钠，pH5.5平衡一个50ml柱，并用0～0.6M的线性NaCl梯度以8倍柱体积洗脱G1型。流速为8.0ml/分钟。

在一个用20mM乙酸钠，pH4.3平衡的Mono Q柱上用TPAP处理AMG G1后纯化 AMG _trunc。用30倍柱体积的0～1.0M线性NaCl梯度进行洗脱，流速为1.0ml/分钟。

去稳定化分析

将纯化AMG G1的等分试样与不同的TPAP在0.1M乙酸钠，pH4.3中混合，并在37℃下培养几周。终体积为1或2ml，AMG G1的浓度为10AGU/ml。取100μl培养混合物，并用0.1M乙酸钠，pH4.3稀释至浓度为2AGU/ml。在65℃温度下对稀释样品作30分钟的热处理。待该样品冷却至环境温度后，在微量滴定板上用对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(pNPG)(MercK，Art.6792)作显色底物测未处理过的和热处理过的样品的活性。将50μl在0.1M乙酸钠，pH4.3中配成的3mM pNPG与25μl样品一起在环境温度下培养30分钟。通过加入75μl 0.1M的四硼酸钠终止反应。在一台UV-max动力微量板读数器上测405nm波长处的光吸收。计算T₃₀，作为热处理后保留活性的百分比。所有测试均重复2次。

TPAP分析

该分析在微量滴定板读数器上或在分光光度计上进行，采用在0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.3中制成的浓度为0.2mM的底物Phe-Pro-Ala-pNA。在DMSO中配制浓度为5mM的Phe-Pro-Ala-pNA母液，并在使用前稀释。随后进行反应4分钟，用一台UV-max动力微量板读数器或一台分光光度计在405nm波长下监测反应，并计算起始裂解速度。

TPAP的抑制

将含有4μgTPAP的等分试样与若干种蛋白酶抑制剂一起培养，所述蛋白酶抑制剂为：1mM Ala-Ala-Phe-氯甲基酮、1mM苄氧基羰基-Ala-Pro-Phe-氯甲基酮和1mM苄氧基羰基-Gly-Gly-Phe-氯甲基酮。培养30分钟后测残余活性。

过滤发酵液的储藏稳定性

对培养液进行离心，并通过0.22μm的滤器灭菌过滤。将相应的山梨酸钾和苯甲酸钠加入培养液中，使其浓度为0.1％，并将pH调节至4.3。分别向2ml的等分试样中加200μl 10mM Ala-Ala-Phe-氯甲基酮或200μl0.1M乙酸钠，pH4.3。取样，并稀释至2AGU/ml，然后按上述方法测T₃₀。

AMG活性的测定(AGU)

按照K.A.Holm所述方法(1980，Anal.Chem.Acta.，117，pp359-362)测AMG活性。简言之，该方法基于由AMG进行的麦芽糖水解，水解产物为α-D-葡萄糖。经过一个短暂、连续的透析处理之后，通过葡萄糖脱氢酶(GlucDH)反应(在pH7.6下进行)测葡萄糖浓度。自动化Auto-Analyzer法的标准条件为：

底物：28mM麦芽糖

培养缓冲液：乙酸盐0.1M，pH4.3

培养温度：37℃

培养时间：5分钟

该方法的酶工作面积为0.5～4AGU/ml。

结果

按照表1所示的纯化方案从市售AMG制剂(Novo Nordisk A/S)中提纯TPAP，使其均匀。最终阳离子交换柱的洗脱曲线显示，存在两种TPAP同功酶(TPAP-I和TPAP-II)，其pI值分别为5.1和5.2。通过SDS-PAGE和N-末端测序证实，两种异构型都是纯净的，但其比活性不同(见表1)。TPAP-II的比活性比TPAP-I的比活性高20％。

两种TPAP异构型之间pI值的小的差异，可以解释为在发酵液中或在纯化过程中发生了一个或几个Asn-或Gln-残基的脱酰氨基作用。

表1.从市售AMG制剂中纯化TPAP

	收集液	体积ml	总蛋白mg^#	总活性^*μmol/分钟	比活性μmol/分钟/mg^#	产率％	纯化倍数
	收集液	体积ml	总蛋白mg^#	总活性^*μmol/分钟	比活性μmol/分钟/mg^#	产率％	纯化倍数	UF-浓缩液		600	117,000	1,900	0.016	100	-
S-sepharose		250	410	1,100	2.7	58	170	UF-浓缩液		600	117,000	1,900	0.016	100	-
S-sepharose		250	410	1,100	2.7	58	170	HPQ-sepharose		45	27	390	14	20	880
Mono S	TPAP-I	8.5	6.0	132	22	7	1380	HPQ-sepharose		45	27	390	14	20	880
	TPAP-I	8.5	6.0	132	22	7	1380	TPAP-II	8	4.9	132	27	7	1680

^#：基于这样的假定：1mg/ml能产生A₂₈₀＝1

^#：在TPAP分析中测pNA的释放量

pH最佳值

以与在TPAP分析中所述的相同方法测定TPAP的pH最佳值。用0.1M的乙酸盐缓冲液调节pH。所得到的pH最佳值曲线如图1所示。可以看出，在5.0-5.5范围内的pH值下TPAP的作用较理想，当pH值为5.25时特别理想。

测定TPAT的最佳温度

在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5中，用上述TPAP分析法测定TPAP的温度/活性关系。从下表中可以看出，在45-55℃的温度范围内TPAP具有最大活性。

表2

温度(℃)	25	30	35	40	45	50	55	60	65
温度(℃)	25	30	35	40	45	50	55	60	65	相对活性(％)	42	52	63	78	100	99	98	51	8

质谱分析

对从黑曲霉中提取的TPAP进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法分析，得到一个宽的信号，表明TPAP被糖基化。证实其平均质量为54.5kDa。

例2

米曲霉TPAP的纯化和鉴定

材料和方法

在含有大豆的培养基中在pH5的条件下发酵米曲霉IFO 4177，将发酵上清液作为原材料用于提纯。发酵之后对培养液进行离心，以除去大部分细胞。

纯化

将大约4L上清液在Seitz EKS板上除菌过滤。在一个3k截断的Filtron盒(Minisette)上对EKS-滤液进行超滤，使其到最低体积，超滤液＝240ml。用固体硫酸胺(AMS)沉淀超滤液，使AMS的饱和度达到大约90％。搅拌至少30分钟，然后通过在一台Sorvall RC3B离心机中离心(4500rpm，15分钟，室温)回收AMS沉淀。将100ml去离子水加入AMS沉淀中，以溶解所述蛋白，并加入1％(w/v)FGV120活性炭进行脱色。搅拌大约1小时后在一个Seitz EK1板上过滤悬浮液，以除去碳(和色素)。用1)100mM H₃BO₃、10mM二甲基戊二酸、2ml CaCl₂，pH5和2)去离子水对EK1-滤液进行透析。经EK1-过滤之后以等分试样形式冷冻透析液(260ml)。

将120ml透析液的等分试样解冻，并将其加注到在20mM CH₃COOH/NaOH，pH5.0中平衡的1.4L G25 Sephadex柱上。为了除去色素和酸性很强的蛋白，将G25-滤液加注到用同一种缓冲液(CH₃COOH/NaOH，pH5.0)平衡的40ml Q-Sepharose FF柱上。洗涤该柱，然后用线性NaCl梯度(0-＞200mM)洗脱结合蛋白。分析来自该柱的级分的TPAP活性。大部分TPAP活性(70％)存在于流通液中，而大部分蛋白结合在柱上。

将来自Q-Sepharose柱的流通液加注到用20mM CH₃COOH/NaOH，pH5.0平衡的50ml S-Sepharose HP柱上。洗涤该柱，然后用线性NaCl梯度(0-＞200mM)洗脱结合蛋白。分析来自该柱的级分的TPAP活性。大部分TPAP活性(75％)也存在于流通液中。其余TPAP活性存在于NaCl梯度的起始部分。收集流通液+级分1-11，并用50mM H₃BO₃、5mM二甲基戊二酸、1mMCaCl₂，pH6.0进行透析。

将透析过的收集液调节至pH7.0，然后将该酶加注到用50mMH₃BO₃、5mM二甲基戊二酸、1mM CaCl₂，pH7.0平衡的23ml Source Q柱上。洗涤该柱，然后用线性NaCl梯度(0-＞500mM)洗脱结合蛋白。分析来自该柱的级分的TPAP活性。所有TPAP活性(95％)均存在于流通液中。其原因必然是该柱中载有过多的蛋白。用20mM CH₃COOH/NaOH，pH4.0透析该流通液。

将以上透析过的酶加注到一个用20mM CH₃COOH/NaOH，pH4.0平衡的50ml S-Sepharose HP柱上。洗涤该柱，然后用NaCl梯度(0-＞200mM)洗脱结合蛋白。分析来自该柱的TPAP活性。TPAP活性由100mM NaCl洗脱。收集TPAP活性，并用20mM CH₃COOH/NaOH，pH4.0透析。为了取得比S-Sepharose柱好的分离度，将透析过的收集液加注到一个用相同的缓冲液(20mM CH₃COOH/NaOH，pH4.0)平衡的8mlSOURCE S柱上。洗涤该柱，然后用NaCl梯度(0-＞200mM)洗脱结合蛋白。分析来自该柱的级分的TPAP活性。TPAP活性由60mM NaCl洗脱。收集TPAP活性并用20mM CH₃COOH/NaOH，pH5.5透析。

将透析过的酶加注到一个用20mM CH₃COOH/NaOH，pH5.5平衡的23ml SOURCE Q柱上。洗涤该柱，然后用NaCl梯度(0→200mM)洗脱结合蛋白。TPAP活性由30mM NaCl洗脱。通过SDS-PAGE分析来自该柱级分的TPAP活性。SDS-PAGE凝胶显示，具有TPAP活性的级分中含有两条带：一条65kDa带(TPAP)和一条30kDa带。TPAP带是扩散的，而30kDa带尖锐，这表明TPAP被糖基化，而30kDa带没有。

通过超滤将含有TPAP的级分浓缩至1ml，并加注到一个用20mMTris-乙酸、100mM NaCl，pH5.5平衡的150ml Sephacryl S-100柱上。以1.0ml/分钟的速度将上述两条带分开。收集具有TPAP活性的级分作为米曲霉TPAP。

质谱分析

对自米曲霉中提取的TPAP进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，得到一个宽的信号，表明TPAP被糖基化。测得的平均质量为55.0kDa。

米曲霉TPAP的pH曲线

以Phe-Pro-Ala-pNA为显色底物研究了获自米曲霉的TPAP的活性对pH的依赖性。将150μl标定pH下的Britton-Robinson缓冲液加入50μl酶中，然后与50μl终浓度为0.2mM的底物Phe-Pro-Ala-pNA一起培养。在一台UV-max动力微量滴定板读数器上进行分析，并在405nm波长下鉴测反应3.5分钟。其相对活性示于下表3中。

表3

pH	4.0	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0	8.5	9.0
pH	4.0	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0	8.5	9.0	RA	13	11	14	2 6	61	100	7 4	2 9	1	0	0

例3

黑曲霉TPAP的肽序列

在一台Applied Biosystems 473A测序仪上，按照生产商的说明书对完整的I型和II型黑由霉TPAP(例1)以及由I型TPAP衍生而来的肽的N-末端氨基酸进行测序。

测完整的I型和II型TPAP的N末端的30个氨基酸的序列。两个序列相同，其为：

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys-(序列4)

该序列与其它蛋白之间无任何同源性。

在变性、还原和S-羧甲基化之后，用获自无色杆菌属(Achromobacter)的赖氨酰特异性蛋白酶对I型TPAP进行蛋白酶解，得到肽。分馏所得到的肽，并通过反相HPLC进行再纯化。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析测定该肽的纯度和质量，采用的是一台VG Analytical TofSpec，按生产商的推荐操作。对以下7种肽进行测序。

肽1：

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys

通过质谱分析和氨基酸测序证实，Asn3是糖基化的。肽1与序列4中

所示的序列和完整TPAP序列的氨基酸残基1-17相同。

肽2：

Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys

肽2与完整TPAP序列(和序列4所示氨基酸序列)的氨基酸残基18-30相同。质谱分析和氨基酸序列分析证实回收的肽2有两种型式。一种型式的N-末端有一个Gln残基，而另一种形式中该Gln残基被转化成焦谷氨酸残基。

肽3：

Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His-(序列5)

肽4：

Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys(序列6)

通过质谱分析和序列分析证实，Asn6是糖基化的。

肽5：

Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu-(序列7)

不可能辨别出Asx15是Asp还是Asn残基。

肽6：

Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro-(序列8)

分辨不出Asx3究竟是Asp还是Asn残基。Xaa1的身份未得到确认。

肽7：

Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser-(序列9)

分辨不出Asx4究竟是Asp还是Asn残基，注意，Asn25未被糖基化，尽管它存在于N-糖基化共有序列中。

米曲霉TPAP的肽序列

在一台Applied Biosystem 473A蛋白测序仪上，按生产商的说明书操作，测完整TPAP及采自TPAP的肽的N-末端氨基酸序列。

用标准方法，通过SDS-PAGE和电吸印到PVDF-膜上测定完整TPAP的N-末端氨基酸序列。发现23个残基的氨基酸序列：

Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-(序列14)

该序列明显与黑曲霉TPAP的N-末端氨基酸序列同源。基于这种同源性，Xaa极可能是糖基化Asn残基，而Yaa可能是Cys-残基。

在变性、还原和S-羧甲基化之后，用获自无色杆菌属的赖氨酰特异性蛋白酶对TPAP进行蛋白酶解，得到肽。分馏所得到的肽，并通过反相HPLC进行再纯化。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析测定该肽的纯度和质量，采用的是一台VG Analytical TofSpec，按照生产商的推荐操作。对以下4种肽进行测序。

肽8：

Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-Ser-Lys(序列10)

该肽与通过N-末端测序测定的完整TPAP的最后6个氨基酸残基重叠，因此，将N-末端序列延长至34个残基。

肽9：

Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-Tyr-Leu-(序列11)

该肽与获自黑曲霉TPAP的肽3同源。

肽10：

Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys(序列12)

肽11：

Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Gly-Xaa-Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser-(序列13)，

Xaa表示未得到证实的残基。

例4

测定了I型和II型黑曲霉TPAP的氨基酸组成。在110℃温度下，在含有0.1％苯酚的6N HCl中，在真空条件下对双份的I型和II型TPAP冻干的等分试样进行水解，水解时间为16小时。水解以后，在3M甲磺酸中测色氨酸。水解之后，用一台Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统，按照生产商的说明书操作，测定氨基酸组成。结果显示，在实验误差范围内，I型和II型TPAP具有相同的氨基酸组成，如表4所示。

表4

I型和II型黑曲霉TPAP的氨基酸组成

	TPAP I(Mol％)	TPAP II(Mol％)
	TPAP I(Mol％)	TPAP II(Mol％)	Asx	13.1	13.4
Glx	8.2	7.9	Asx	13.1	13.4
Glx	8.2	7.9	Ser	10.5	10.7
Gly	13.7	13.1	Ser	10.5	10.7
Gly	13.7	13.1	His	0.5	0.5
Arg	3.1	3.1	His	0.5	0.5
Arg	3.1	3.1	Thr	5.7	5.6
Ala	8.0	7.9	Thr	5.7	5.6
Ala	8.0	7.9	Pro	7.2	7.3
Tyr	3.7	3.8	Pro	7.2	7.3
Tyr	3.7	3.8	Val	6.0	5.9
Met	0.3	0.5	Val	6.0	5.9
Met	0.3	0.5	Cys	0.6	0.7
Ile	2.5	2.5	Cys	0.6	0.7
Ile	2.5	2.5	Leu	8.4	8.4
Phe	4.5	4.8	Leu	8.4	8.4
Phe	4.5	4.8	Lys	3.1	3.0
Trp	0.9	1.0	Lys	3.1	3.0

例5

测定了I型和II型黑曲霉TPAP的单糖组成，在100℃的真空条件下在2M TFA中对双份的I型和II型TPAP冻干的等分试样进行水解，水解时间分别为1小时、2小时和4小时。水解以后通过高效离子交换层析分析单糖的组成，采用一个CarboPac^TMPA1柱，用16mM NaOH洗脱。通过脉冲安培计测定法测定单糖。由于不同的稳定性及在2M TFA中释出的单糖，水解1小时之后测半乳糖的量，水解2小时后测甘露糖的量，并在水解4小时后测葡糖胺的量。所得到的结果显示，I型和II型TPAP在甘露糖含量方面的差异极小，如下面的表5所示。

表5

I型和II型TPAP的单糖组成。结果以pmol单糖/pmol蛋白形式给出，有关数据是在氨基酸分析时获得。

	I型TPAP(pmol/pmol)	II型TPAP(pmol/pmol)
	I型TPAP(pmol/pmol)	II型TPAP(pmol/pmol)	葡糖胺	4	4
半乳糖	12	11	葡糖胺	4	4
半乳糖	12	11	甘露糖	52	47

例6

由黑曲霉TPAP进行的裂解

用纯化的AMG和TPAP(用例1的材料和方法一节中所述方法获得)研究黑曲霉TPAP对AMG G1型的去稳定化能力，TPAP/AMG之比等于所配制的制品中二者的比例。对该去稳定化制剂进行的氨基酸测序显示，在AMG催化域的N-末端有一个修饰。用肽酶对一种包括前3个氨基酸残基(Ala-Thr-Leu)的三肽进行裂解，结果表明，该酶是三肽基氨肽酶。是基于能裂解AMG和显色底物Phe-Pro-Ala-pNA而将其归类为三肽基氨肽酶的，这一结论还得到其缺乏裂解另一种显色底物琥珀酰-Ala-Ala-Ala-pNA的能力的支持。在该底物中，N-末端的游离氨基被琥珀酰化，因而使得该底物不能够由TPAP裂解。存放3周以后TPAP对AMG样品的裂解仍不彻底，通过氨基酸测序发现，其为完整AMG和截短AMG(AMG_trunc)的混合物。

在不同温度下以各种剂量研究了TPAP对AMG G1的去稳定化作用。TPAP在3-10μg/ml的剂量范围内能产生明显的AMG去稳定化作用，而且，TPAP/AMG之比类似于在几种发酵液中测得的比例。在37℃温度下去稳定化作用最突出，但在25℃温度下存放27天后对热稳定性也有明显影响。在4℃下存放不影响AMG的热稳定性。

例7

用各种天然蛋白和肽底物研究了黑曲霉TPAP的特异性。用这些底物发现，TPAP N-末端的氨基酸残基的裂解位点极不专一。TPAP甚至能在Pro残基和CM-Cys残基之后进行裂解。不过，在其裂解位点的ProC-末端可以完全抑制TPAP的裂解。用TPAP处理天然蛋白所得到的特异裂解产物包括以下三肽序列：IPE、YVD、WRQ、KGA、LPS、ANL、NGT、LMQ、YFE、GPG、GGG、ADG、RST、SVE、KKP、EGV、NTG、AGD、RHN、LKT、VEK、KPE、GVN、TGA、GDR、HNL、HSQ、GTF、TSD、YSK、YLD、SRR、AQD、FVQ、WLM和ATL。

例8

黑曲霉TPAP活性的抑制

用蛋白酶抑制剂氯甲基酮Ala-Ala-Phe-CMK(AAF-CMK)抑制TPAP，在上述条件下进行试验。证实AAF-CMK能完全抑制TPAP。

将AAF-CMK加入发酵液中可以完全抑制TPAP活性。在有或没有TPAP活性的情况下，检验了5批不同AMG的热稳定性。当TPAP被抑制时，在37℃下存放2周后所有5批AMG的热稳定性未发生改变。没有抑制剂的相应样品都明显发生了去稳定化作用。

例9

通过培养一种黑曲霉的AMG生产菌株获得10ml培养液，用NaOH将pH调至6.5或7.0。将各个样品分别在25℃、40℃和50℃温度下培养1小时，然后用乙酸将样品的pH调至4.3。测定处理过的样品的储存稳定性。结果发现，这种样品回收方法(基于高温下的pH处理)能够有效消除TPAP活性(表6)。在pH6.5/40℃条件下处理所述培养液1小时，可将TPAP活性降低至5％，并得到一种很稳定的产品，其热稳定性在40℃下放置2周后不会改变。

表6

PH/温度1小时	处理后的TPAP	处理后的AMG	初始T₃₀	2周后的T₃₀	2周后的TPAP
PH/温度1小时	处理后的TPAP	处理后的AMG	初始T₃₀	2周后的T₃₀	2周后的TPAP	对照	100	100	50	31	80
6.5/25C6.5/40C6.5/50C	905＜1	1009790	4647-	4353-	42＜1-	对照	100	100	50	31	80
6.5/25C6.5/40C6.5/50C	905＜1	1009790	4647-	4353-	42＜1-	7.0/25C7.0/40C7.0/50C	86＜1＜1	999285	4848-	4455-	＜1＜1-

该表中的所有数字均为％，分别用于表示TPAP和AMG的值是在所标明时间的相对活性。

例10

PCR克隆

根据序列3所示的黑曲霉TPAP N-末端氨基酸序列，设计4种PCR引物(表7)。将获自黑曲霉的一个菌株的基因组DNA用作4个PCR反应的模板。提取预计为65bp的PCR片段，并克隆到质粒pCR^TMII(Invitrogen公司)上。对3个克隆的插入片段测序，发现其中两个在相当于所述引物的位置具有简并序列，而在引物之间的序列相对N-末端氨基酸序列没有发生改变。

为了克隆编码三肽基氨肽酶的较大DNA片段，制备相当于所述不变序列的引物#6010(GCACTGTC TGAAGCAGCTGTACAACATCGGTG)。再根据另外两种肽序列设计3个PCR引物(表7)。以黑曲霉基因组DNA为模板进行了3个PCR反应(#6010/#5 988，#6010/#5989和#6010/#5990)。该反应是在42℃和45℃两种退火温度下进行的。反应#6010/#5989(一个约80bp的片段)和#6010/#5990(3个片段，大约分别为120bp、500bp和950bp)证实，在两种不同的温度下进行的退火，在琼脂糖凝胶电泳上出现相同的带型。在反应#6010/#5988中，在42℃下见到一个大约120bp的片段，而在45℃下见到一个大约950bp的片段。950bp的片段正是所需要的，并将其插入PCR II AT载体。按照布达佩斯条约规定，已将获得了950kp片段的大肠杆菌交由Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH保藏，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保存日期为1994年12月5日，保藏号DSM9570。

表7

寡核苷酸引物

#5765

5′-G A C T C C A T C A T C A C C C C

T T T T T

A A A A

G G

#5766

5′-G A C A G C A T C A T C A C C C C

T T T T T

A

G

#5767

C T G A T G G T T C G G C T G G G-5′

A A C A A

#5768

C T G A T G G T T C G C C T G G G-5′

A A C T A

#5988

A T A C G A C A A A T A C T A T T-5′

G C C G G

G G

T T

#5989

A T A A A A C T C C T C A T A C G-5′

G G C T T G

G

#5990

C T T C T A A A A C T T G T T G T-5′

C G G C C

从两端测950bp片段的序列。发现该片段编码TPAP的N-末端部分。该N-末端部分的部分序列如序列2所示，从另一端测序所得到的部分序列示于序列3中。发现完整的“950个碱基的片段”的序列由908bp组成，其序列示于序列1中。

Southern分析

按上述方法从黑曲霉菌株和米曲霉菌株IFO 4177中提取基因组DNA(Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81：1470-1474)。用合适的限制酶消化基因组DNA，在0.7％的琼脂糖凝胶上分级，并按照生产商的说法吸印到Immobilon^TM-N上。检测该膜上950bp TPAP基因片段的存在，按照Feinberg等所述的方法(1983，Anal.Biochem.132：6)通过随机引导的方式用α-³²P dATP(NewEngland)进行标记。然后将该膜放在杂交溶液(5×SSC(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)，10×Denhardt(0.2％Ficoll，0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白)，10mM EDTA，1％SDS，150μg/ml PolyA，50μg/ml酵母RNA)中，在65℃温度下温育2小时。随后加入放射性标记的探针，并在65℃温度下温育过夜，伴以轻微振荡。在30℃下，在2×SSC，1％SDS中将膜洗两遍，每次15分钟。最后将该膜干燥，用塑料膜封装，并在-70℃下使X光片(Fuli-RX)曝光。结果表明，两个菌株都只含有一个编码TPAP的基因。

序列表

序列1

908个碱基

CACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTGACTACCAGGCCGATCCCAAGTCCGGCAG-

CAAGATCGGCTTTGCCAGCTACCTTGAGGAATACGCCCGGTATGCCGATCTCGAGAGG-

TTCGAGCAGCACCTGGC TCCCAATGCCATCGGCCAGAACTTCAGCGTCGTCCAATTCAACG-

GCGGCCTCAACGATCAGCTTTCA TCGAGTGACAGCGGCGAAGCCAACCTCGACCTGCAGTA-

CATCCTGGGCGTCAGCGCTCCCGTCCCCA TCACCGAGTACAGCACCGGCGGACGCGGCGAA-

CTAGTCCCCGACCTGAGCTCCCCCGACCCCAACGA CAACAGCAACGAGCCCTACCTTGACT-

TCCTTCAGGGAATCCTCAAGCTTAACAACTCCGACCTCCCA CAAGTCATCTCTACCTCCTA-

CGGTGAAGACGAACAGGTATGCACCTCACCTGACCCATTCCATTTTA CATCCCTCACCTCT-

CTCAACCAAACTAACAACACCAACAGACTATCCCCGTCCCCTACGCCCGCACC GTCTGCAA-

CCTCTACGCCCAACTCGGCAGCCGCGGCGTCTCTGTAATCTTCTCCAGCGGCGACTCCG

GCGTCGGCGCCGCCTGCCTCACCAACGACGGCACCAACCGCACGCACTTCCCTCCTCAATT

CCCCGC CTCCTGCCCCTGGGTAACCTCCGTCGGCGCAACCTCCAAGACCTCCCCCGAGCAA-

GCCGTCTCCTTC TCCTCCGGCGGCTTCTCCGACCTCTGGCCCCGCCCCTCCTACCAACACG-

CCGCCGTGCAAACCTACC TCACCAAGCACCTGGGCAACAAGTTCTCGGGGCTTTTCAACGC-

CTCCGGCCGCGCCTTCCCCGACGT CTCCGCGCAGGGCGTCAACTACGCTGTTTACGACAAA

序列2

CACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTGACTACCAGGCCGATCCCAAGTCCGGCAGCA

AGATCGGCTTGGGCAGCTACCTTGAGGAATACGCCCGGTATGCCGATCTCGAGAGG

TTCGAGCAGCACCTGGCTCCAATGCATCGGCAGAACTCAGCGTCGTCCAATTCACGGCGGCT-

CACGATCAGCTTCATCGAGTGACAGCGGCGAGCAACTCGACTGCAGTAC

序列3

CCTCCTACCAACACGCCGCCGTGCAACCTACCTGACCAAGCACCTGGCAACAAGTTCTCGG-

GGCTTTTCAACGCCTCCGGCCGCGCCTTCCCCGACGTCTCCGCGCAGGGCGTCAACTACGCT-

GTTTACGACAA

序列4

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-

Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys

序列5

Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-

Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His-

序列6

Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-

Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys

序列7

Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-

Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu-

序列8

Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-

Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro-

序列9

Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-

Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser-

序列10

Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-

Ser-Lys

序列11

Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-

Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-

Tyr-Leu-

序列12

Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-

Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-

Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys

序列13

Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-

Gly-Xaa-Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-

Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser-

序列14

Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-

Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-

序列15

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa

(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-

Xaa(5)-Xaa(6)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule 13bis)

A.The indications made below relate to themicroorganism referred to in the descriptionon page 39 ，line 7-10
		B.IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identifiedon an additional sheet□
Name of depositary institutionDEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELL-KULTUREN GmbH
		Address of depositary institution(including postal code and country)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Federal Re-public of Germany
Date of deposit5 December 1994	Accession NumberDSM 9570
Date of deposit5 December 1994	Accession NumberDSM 9570	C.ADDITIONAL INDICATIONS(leave blank if not applicable)This information is continued on an additional sbeet□
In respect of those designations in which a Europeanand/or Australian patent is sought，during thependency of the patent application a sample of thedeposited microorganism is only to be provided to anindependent expert nominated by the person requestingthe sample (Rule 28(4)EPC/Regulation 3.25 ofAustralia Statutory Rules 1991 No 71).
		D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE(if the indications are not for all designated States)

		E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable)
The indications listed below will be submitted to the Intemational Bureaulater(specify the gener al nature of the indications e.g.，″AccessionNumber of Depasit″)

Claims

1.一种降低或消除真菌TPAP生产细胞的TPAP生产能力的方法，在该方法中，对存在于该细胞中并为TPAP表达所必须的DNA序列进行修饰或使其失活，以便降低该细胞的TPAP产量，或不产生TPAP。

2.如权利要求1的方法，其中，所述DNA序列编码TPAP或其表达TPAP活性所必须的部分。

3.如权利要求1的方法，其中，所述DNA序列是从TPAP编码DNA序列表达TPAP所需的调节序列。

4.如权利要求3的方法，其中，所述DNA序列是启动子序列或其功能片段。

5.如权利要求1-4中任一项的方法，其中，所述DNA序列的修饰或失活是这样实现的：对TPAP生产细胞进行诱变处理，和筛选TPAP生产能力已降低或丧失的细胞。

6.如权利要求5的方法，其中，所述诱变是通过随机或定点诱变实现的。

7.一种降低或消除真菌TPAP生产细胞的TPAP生产能力的方法，在该方法中，将充分互补于TPAP编码序列并因此能够与该细胞中所产生的TPAP mRNA杂交的核苷酸序列导入所述细胞中，使该核苷酸序列可以在一定条件下在该细胞中转录，所述条件使该核苷酸序列与所述TPAP mRNA杂交并因此降低由所述mRNA翻译成的TPAP的量或消除所有此类翻译。

8.一种按照权利要求1-7中任一项所述方法制备的宿主细胞。

9.如权利要求8的宿主细胞，它是微生物细胞。

10.如权利要求9的宿主细胞，它是真菌细胞。

11.如权利要求10的宿主细胞，它是选自曲霉菌(Aspergillus sp.)、木霉菌(Trichoderma sp.)或镰孢菌(Fusarium sp.)的细胞。

12.一种制备基本上无TPAP活性的产物的方法，该方法包括：用编码该产物的DNA序列转化权利要求8-11中任一项所述的宿主细胞，在适于所述产物表达的条件下培养转化的细胞，以及从培养物中回收所述产物。

13.一种制备基本上无TPAP活性的产物的方法，所述产物是由存在于TPAP表达细胞中的DNA序列编码，该方法包括：按权利要求1-7中任一项所述方法修饰存在于所述细胞内并为表达TPAP所必需的DNA序列或使其失活，接着在适于该产物表达的条件下培养所述细胞，并从培养物中回收所述产物。

14.一种通过发酵TPAP生产细胞制备基本上无TPAP的产物的方法，所述细胞也能产生所述产物，该方法包括：在发酵期间或在发酵完成之后将有效量的、能抑制TPAP活性的抑制剂加入发酵液中，从发酵液中回收目的产物，并任选地对所回收的产物作进一步纯化。

15.一种通过发酵TPAP生产细胞制备基本上无TPAP的产物的方法，所述细胞也能产生所述产物，该方法包括：对发酵液或从该发酵液中提取的含有TPAP和目的产物的酶制剂进行综合pH和温度处理，处理的时间足够长以便降低TPAP活性，并任选地从处理过的发酵液中回收所述产物。

16.如权利要求15的方法，其中所述降低TPAP活性的处理是在6.5～7的pH范围和25～40℃的温度范围内进行的。

17.如权利要求12-16中任一项的方法，其中所述产物是酶。

18.如权利要求17的方法，其中所述产物选自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。

19.如权利要求18的方法，其中所述产物是AMG、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶、转谷氨酰胺酶、漆酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶。

20.一种基本上无TPAP活性的蛋白产物，它是通过权利要求12-19中任一项的方法生产的。

21.如权利要求20的产物，它是AMG。

22.一种提取的真菌三肽基氨肽酶。

23一种三肽基氨肽酶(TPAP)，它由一种DNA结构编码，该结构包括i)序列1、2或3中示出的DNA序列，或ii)DSM 9570的部分TPAP编码DNA序列，或iii)一个核苷酸序列，它能够与以序列1、2或3中示出的DNA序列为基础制备的探针或以序列4-14中任一个所示出的氨基酸序列为基础制备的探针杂交，而且它编码一种TPAP。

24.一种提取的TPAP，它能够裂解底物Phe-Pro-Ala-pNA，并且能与纯化的黑曲霉(A.niger)TPAP或纯化的米曲霉(A.oryzae)TPAP发生免疫交叉反应，和/或包括以下N-末端序列

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6)(序列15)，其中，Xaa(1)、Xaa(2)、Xaa(3)、Xaa(4)、Xaa(5)和Xaa(6)中的任一个可以相同或不同，而且可以选自任何天然氨基酸残基。

25.如权利要求24的TPAP，其中Xaa(1)为Lys或Gln，Xaa(2)为Ile或Thr，Xaa(3)为Pro或His，Xaa(4)为Glu或Gln，Xaa(5)为Pro或Ala和/或Xaa(6)为Lys或Asn。

26.如权利要求22-25中任一项的TPAP，其最佳pH范围为5.0-7.5。

27.如权利要求22-26中任一项的TPAP，它包括序列4-9中示出的部分氨基酸序列中的至少一种，和/或最佳pH范围大约为5.0～5.5。

28.如权利要求22-26中任一项的TPAP，它包括序列10-14中示出的部分氨基酸序列中的至少一种，和/或最佳pH范围大约为5.5～7.5。

29.如权利要求23-28中任一项的三肽基氨肽酶，它来源于微生物。

30.如权利要求29的三肽基氨肽酶，它来源于真菌。

31.如权利要求30的三肽基氨肽酶，它可以获自曲霉属(Aspergillus)的一个菌株，特别是获自米曲霉、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)或臭曲霉(A.foetidus)。

32.一种DNA结构，包括一个编码一种来源于真菌的TPAP的DNA序列。

33.一种编码一种TPAP的DNA结构，它包括

i)序列1、2和3中示出的DNA序列中的至少一个，或

ii)DSM 9570的与TPAP相关的DNA序列，或

iii)一个核甘酸序列，它能够与以序列1、2或3中示出的DNA序列为基础制备的寡核苷酸探针或以序列4-14中任一个所示出的氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸探针杂交，而且它能编码一种TPAP，或

iv)一个互补于i)、ii)或iii)的DNA序列的DNA序列。

34.一种表达载体，它包括权利要求32或33所述的DNA结构。

35.一种宿主细胞，它包括权利要求32或33所述的DNA结构，或包括权利要求34的表达载体。

36.一种生产TPAP的方法，包括在适于TPAP表达的条件下培养权利要求35的宿主细胞，以及从培养物中回收TPAP。

37.DSM 9570或其突变体，它包括一种序列1所示DNA序列的类似物。