DE69535696T2

DE69535696T2 - Tripeptidyl-aminopeptidase

Info

Publication number: DE69535696T2
Application number: DE69535696T
Authority: DE
Inventors: Kaj Andre Holm; Grethe Rasmussen; Torben Halkier; Jan Lehmbeck
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2015-11-09
Also published as: KR20040023615A; KR100545010B1; WO1996014404A1; CN1611601A; JP2007020578A; US5989889A; CA2204257C; DK0804558T3; KR970707277A; JP4571604B2; EP0804558B1; CN1164868A; CA2204257A1; EP0804558A2; US5821104A; ES2301163T3; ATE384787T1; AU3802595A; DE69535696D1; JPH10508475A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Tripeptidyl-Aminopeptidase (TPAP), ein die TPAP-kodierendes DNA-Konstrukt, ein Verfahren zum Erzeugen von TPAP und Verfahren zur Reduzierung der TPAP-Erzeugung in Zellen, in denen TPAP-Aktivität unerwünscht ist.
Hintergrund der Erfindung
Tripeptidyl-Aminopeptidasen sind Enzyme, die in der Lage sind, Fragmente von unsubstituierten N-Termini von Peptiden, Oligopeptiden oder Proteinen abzuspalten. Tripeptidyl-Aminopeptidasen können unspezifisch sein, d. h. sie können jede Tripeptidsequenz von dem unsubstituierten N-terminalen Ende spalten, oder sie können spezifisch, d. h. in der Lage sein, spezifische Typen von Tripeptidsequenzen zu spalten.
Tripeptidyl-Aminopeptidasen tierischer Herkunft wurden bisher bereits beschrieben. Zum Beispiel offenbart Doebber et al. (1978), Endocrinology 103: 1794–1804, eine Tripeptidyl-Aminopeptidase isoliert aus Rinderhypophysen, von der gezeigt wurde, dass sie Tripeptide vom N-terminalen Ende des Rinderwachstumshormons abspaltet. In Mammalian Proteases Band 2, Exopeptidases (AP 1986, Herausgeber J. K. McDonald und A. J. Barret) sind Tripeptidyl-Aminopeptidasen offenbart, die aus Rinderhypophysen, aus Ovarien von schwangeren Schweinen bzw. Schweinemilz isoliert wurden.
Eine aus Streptomyces lividans 66 isolierte bakterielle Tripeptidyl-Aminopeptidase ist durch Krieger et al. (Febs Letters Vol. 352, Nr. 3, Seiten 385–388, 1994) beschrieben. Butler et al., Applied and Environmental Microbiology, August 1995, Seiten 3145–3150, offenbart das Gen, welches diese Peptidase und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz kodiert. Die Peptidase ist als eine Serin-Protease mit einem pH-Optimum zwischen 7,5 und 8,5 charakterisiert.
Es ist wohl bekannt, dass die Stabilität von mikrobiell erzeugten Erzeugnissen wie z. B. Enzymen oder anderen Proteinen variieren kann, unter anderem abhängig von dem Verfahren durch welches das Erzeugnis erzeugt wird und/oder abhängig vom Ursprung oder vom mikrobiellen Erzeuger des Erzeugnisses. Eine reduzierte Stabilität des mikrobiell erzeugten Erzeugnisses kann z. B. auf einer reduzierten Resistenz gegenüber Hitze, Licht oder anderen externen Bedingungen beruhen, oder kann auf die Zusammensetzung des Erzeugnisses zurückzuführen sein. In diesem Zusammenhang kann die Anwesenheit von sogar Spurenmengen an Proteaseaktivität in einem Proteinerzeugnis in einer erheblich reduzierten Stabilität des besagten Erzeugnisses resultieren. Oft ist es jedoch nicht möglich, den Grund für die variierende Stabilität exakt zu identifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun überraschenderweise gefunden, dass verschiedene Pilzspezies TPAP erzeugen, und dass Proteinerzeugnisse erzeugt durch diese Organismen geringe Mengen an TPAP enthalten können, die in manchen Fällen gefunden wurden, eine reduzierte Stabilität dieser Erzeugnisse herbeizuführen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung waren erfolgreich im Isolieren und Charakterisieren der TPAP. Es wurde festgestellt, dass die TPAP in der Lage ist, Tripeptide von dem unsubstituierten N-Terminus der Proteinerzeugnisse unspezifisch abzuspalten, eine Spaltung, die unter manchen Umständen wünschenswert sein kann, und unter anderen Umständen (z. B. wenn es in einer reduzierten Stabilität eines Proteinerzeugnisses umfassend TPAP resultiert) höchst unerwünscht ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend, eine im Wesentlichen reine Tripeptidylpeptidase bereitzustellen, die zum Spalten von Peptiden oder Proteinsequenzen verwendet werden kann. Ein anderer Gegenstand ist es, ein Verfahren zum Erzeugen von Proteinerzeugnissen bereitzustellen, die im Wesentlichen frei von TPAP sind, im Besonderen Erzeugnisse, die TPAP-Substrate sind, und die eine reduzierte Stabilität in der Gegenwart von TPAP besitzen.
In einem ersten allgemeinen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine isolierte TPAP mit Herkunft aus Pilz. Insbesondere kann die TPAP aus Stämmen der Pilzspezies Aspergillus erhältlich sein. In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung eine TPAP, die durch Aminosäuren und/oder DNA-Sequenzinformationen und/oder durch Enzymproteincharakteristika identifiziert wurde, TPAP-kodierende DNA-Konstrukte und ein DNA-Konstrukt, welches eine zu einem ausreichenden Teil der DNA-Sequenz komplementäre, TPAP-kodierende Nukleotidsequenz umfasst, um in der Lage zu sein, mit besagter Sequenz zu hybridisieren und dadurch die TPAP-produzierende Fähigkeit einer gegebenen Wirtszelle aufzuheben.
In einem weiteren wichtigen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der TPAP-Erzeugung aus einer TPAP-produzierenden Zelle, wobei in dem Verfahren eine DNA- Sequenz kodierend für TPAP oder für die TPAP-Promotorsequenz modifiziert oder inaktiviert wird, so dass dies in einer reduzierten TPAP-Erzeugung in besagter Zelle reduziert.
Definitionen
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "TPAP" eine Aminopeptidase bezeichnen, die Tripeptide von dem N-terminalen Ende eines Peptids oder einer Proteinsequenz abspaltet, z. B. von einer verlängerten Proteinsequenz wie sie z. B. in einem Prohormon oder einem Proenzym gefunden wird. In allgemeiner Weise ausgedrückt ist die TPAP in der Lage, das Tripeptid XYZ von der unsubstituierten N-terminalen Aminogruppe eines Peptids oder Proteins abzuspalten, wobei X, Y, Z einen beliebigen Aminosäurerest darstellt (d. h. ausgewählt aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr. Val). In den TPAP-Substraten können alle X, Y und Z unterschiedlich oder identisch sein, oder zwei der X, Y und Z können identisch sein. Es soll verstanden werden, dass die erfindungsgemäße TPAP gegenüber der Aminosäuresequenz des zu spaltenen Tripeptids unspezifisch ist. In Beispiel 7 sind spezifische Beispiele von Tripeptid-Erzeugnissen gegeben, die durch das Spalten von natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen erhalten wurden.
Der Begriff "erhältlich" wie er für die Herkunft von DNA-Sequenzen verwendet wird, die Teil des erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes darstellen, soll bezeichnen, dass die in Frage kommende DNA-Sequenz aus Nukleinsäurematerial (DNA oder RNA) des relevanten Organismus isoliert werden oder auf Basis eines solchen Materials hergestellt werden kann. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz aus einer genomischen oder cDNA-Bibliothek isoliert werden, die unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Vorgehensweisen aus dem Organismus hergestellt wurde, oder sie kann auf Basis eines solchen Materials hergestellt sein.
Analog soll der Begriff "erhältlich", falls in Verbindung mit der erfindungsgemäßen TPAP verwendet, bezeichnen, dass die TPAP aus dem in Frage kommenden Organismus wiedergewonnen werden kann, oder durch eine aus diesem Organismus erhältliche DNA-Sequenz kodiert werden kann, und aus einem Organismus wiedergewonnen werden kann, der diese DNA-Sequenz exprimiert.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die erfindungsgemäße TPAP
Im Laufe der zur vorliegenden Erfindung geführten Forschungsarbeit wurden zwei unterschiedliche TPAPs isoliert und charakterisiert – eine aus einem Stamm von A. niger, eine andere aus einem Stamm von A. oryzae. Die beiden TPAPs werden als repräsentative Beispiele einer allgemein neuen Klasse von Tripeptidyl-Aminopeptidasen genannt.
Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung eine TPAP, die durch ein DNA-Konstrukt umfassend

i) mindestens eine der, jedoch vorzugsweise zwei oder mehr der in SEQ ID NR: 1, 2 und 3 gezeigten partiellen DNA-Sequenzen, oder
ii) die partielle DNA-Sequenz kodierend für den N-terminalen Teil einer reifen TPAP, vorliegend in DSM 9570, oder
iii) eine Nukleotidsequenz, die an eine Oligonukleotidsonde hybridisiert, die auf der Basis der in SEQ ID NR: 1, 2 oder 3 gezeigten DNA-Sequenzen oder auf der Basis einer beliebigen in SEQ ID NR: 4–14 gezeigten Aminosäuresequenz hergestellt wurde, und welche eine TPAP kodiert.

Eine detailliertere Erläuterung der Nukleotidsequenz iii) ist weiter nachstehend in dem Abschnitt mit dem Titel "Das DNA-Konstrukt und der Vektor der Erfindung" gegeben.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine im Wesentliche reine TPAP, die eine oder mehrere der folgenden Charakteristika besitzt:

– die Fähigkeit, das Substrat Phe-Pro-Ala-pNA zu spalten,
– ein Molekulargewicht von ungefähr 65 kDa (im Wesentlichen bestimmt wie von Laemmli, U. K., 1970, "Cleavage of structural Proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, S. 680–685 beschrieben),
– ein pI im Bereich von 4–6,
– ein pH-Optimum im Bereich von etwa 5,0–7,5,
– ist immunologisch kreuzreaktiv mit der aufgereinigten TPAP aus A. niger oder der aufgereinigten TPAP aus A. oryzae,
– umfasst die N-terminale Sequenz

Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6) (SEQ ID Nr: 15), in der jeder der Xaa(1), Xaa(2), Xaa(3), Xaa(4), Xaa(5) und Xaa(6) unterschiedlich oder identisch und ausgewählt aus beliebigen natürlich vorkommenden Aminosäureresten sein kann ist. Vorzugsweise ist Xaa(1) Lys oder Gln, Xaa(2) Ile oder Thr, Xaa(3) Pro oder His, Xaa(4) Glu oder Gln, Xaa(5) Pro oder Ala und/oder Xaa(6) Lys oder Asn.
Antikörper, die zum Bestimmen von immunologischer Kreuzreaktivität verwendet werden, können durch Verwenden der aufgereinigten TPAP hergestellt werden. Genauer gesagt kann ein Antiserum gegen das erfindungsgemäße Enzym durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagern) gemäß der in N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications 1982 (genauer gesagt Seiten 27–31) beschriebenen Vorgehensweise gewonnen werden. Aufgereinigte Immunglobuline können aus dem Antiserum z. B. durch Salzpräzipitation [(NH₄)₂SO₄] gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex^TM, erhalten werden Eine immunchemische Charakterisierung der Proteine kann entweder durch Ouchterlonys Doppeldiffusionsanalyse (O. Outcherlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weier, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655–706), durch gekreuzte Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 2) durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße TPAP mindestens eine der in SEQ ID NR: 4–9 gezeigten partiellen Aminosäuresequenzen und/oder besitzt ein pH-Optimum von etwa 5,0–5,5 und/oder einen pI von etwa 5,1 oder 5,2.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße TPAP mindestens eine der partiellen Aminosäuresequenzen SEQ ID NR: 10–14 und/oder besitzt ein pH-Optimum in dem Bereich von etwa 5,5–7,5 und/oder einen pI von etwa 4,5.
Die TPAP, die durch eine DNA-Sequenz umfassend mindestens eine der in SEQ ID NR: 1, 2 und 3 gezeigten Sequenzen oder durch die in DSM 9570 beherbergten kodiert wird, oder die die in SEQ ID NR: 4–9 gezeigten Peptide umfasst, wurde aus einem durch einen A. niger-Stamm erzeugten Proteinerzeugnis isoliert (siehe nachstehendes Beispiel 1). Die TPAP umfassend die Peptide der SEQ ID NR: 10–14 wurde aus einem A. oryzae-Stamm isoliert, siehe nachstehendes Beispiel 2.
Es wird gegenwärtig angenommen, dass eine TPAP, die zu der hierin definierten allgemein neuen Klasse von Tripeptidyl-Aminopeptidasen gehört, jeglichen Ursprungs sein kann, einschließlich tierischem oder pflanzlichen Ursprungs, jedoch vorzugsweise mikrobiellen, z. B. bakteriellen oder Pilz-Ursprungs. Soweit die Erfinder der vorliegenden Erfindung Kenntnis haben, ist die vorliegende Offenbarung der erste Bericht über TPAP mit Ursprung aus Pilz. Die erfindungsgemäße TPAP kann aus Stämmen aufgereinigt werden, die natürliche TPAP-Erzeuger sind, oder sie kann zweckmäßigerweise durch Mittel rekombinanter DNA-Techniken als ein homologes oder heterologes Genprodukt erzeugt werden, wie es nachstehend weiter erklärt wird.
Inbesondere kann die erfindungsgemäße TPAP aus einem Stamm des Aspergillus erhältlich sein, wie z. B. aus A. oryzae, A. niger, A. japonicus, A. aculeatus, A. nidulans oder A. foetidus, oder aus einem Trichoderma-Stamm, z. B. T viride, T. reesei, T. longibrachiatum oder T. harzianum, oder einer Fusarium-Spezies, z. B. F. oxysporum, F. graminearum oder F. sojani, oder einem Thermomyces-Stamm, z. B. T. lanuginosus oder T. insolens.
Die erfindungsgemäße TPAP wird vorzugsweise in einer isolierten und in einer im Wesentlichen reinen Form bereitgestellt, z. B. mindestens 90% rein wie zum Beispiel mindestens 95% rein.
Während die Gegenwart von TPAP in Proteinerzeugnissen, bedingt durch die resultierende reduzierte Stabilität des besagten Erzeugnisses, als unerwünscht betrachtet werden kann, kann die Verwendung von aufgereinigter erfindungsgemäßer TPAP zur kontrollierten Destabilisierung von Proteinerzeugnissen vorteilhaft sein. So ist z. B. vorgesehen, dass die aufgereinigte erfindungsgemäße TPAP zur Deaktivierung von Enzymen verwendet werden kann, nachdem diese ihre gewünschte Wirkung ausgeübt haben, und daher als ein "Killerenzym" fungiert. Solch eine Deaktivierung wird konventionell durch Thermoinaktivierung erreicht (oder alternativ wird die unerwünschte Enzymaktivität durch Aufreinigung aufgehoben). Die Verwendung von TPAP zur Destabilisierung von thermophilen Enzymen kann besonders vorteilhaft sein.
Als ein Beispiel für diese Verwendung kann die Deaktivierung von AMG genannt werden, die zur Verflüssigung von Stärke verwendet wird, welches derzeit durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf hohe Temperaturen (80–85°C) durchgeführt wird. Diese Deaktivierung kann z. B. durch Zugabe von TPAP, vorzugsweise in einem Batch-Prozess nachdem AMG Dextrine zu Glukose hydrolysiert hat, erzielt werden. Eine Thermoinaktivierung von AMG ist dann mittels Erhöhung der Temperatur auf nur etwa 66°C für eine kurze Zeit möglich.
Ein anderes Beispiel ist die Deaktivierung von AMG, die in der Fermentation von Bier wie kalorienarmem Bier verwendet wird. In der normalen Bier-Fermentationsvorgehensweise wird AMG durch Pasteurisierung inaktiviert. Die Zugabe von TPAP kann die Thermostabilität des verwendeten AMG reduzieren und somit die Temperatur für die Pasteurisierung reduzieren. Durch diese Behandlung können die organoleptischen Charakteristika verbessert werden.
Außerdem kann die erfindungsgemäße aufgereinigte TPAP für eine Vielzahl von Zwecken nützlich sein, in denen das spezifische Spalten von Tripeptidsequenzen wünschenswert sind. Zum Beispiel werden einige Proteine oder Peptide in Form von Vorläufermolekülen synthetisiert, die eine Anzahl von zusätzlichen Aminosäureresten am N-terminalen Aminosäurerest umfassen, deren Anwesenheit für das zu verwendende Protein unerwünscht ist.
Dies kann z. B. in der Prozessierung von Proteinen oder Peptiden sein, die in protektierter Form als Vorläuferproteine synthetisiert werden können.
Das DNA-Konstrukt und der Vektor der Erfindung
Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die Erfindung ein TPAP kodierendes DNA-Konstrukt, welches

i) mindestens eine der, jedoch vorzugsweise zwei oder alle der in SEQ ID NR: 1, 2 und 3 gezeigten partiellen DNA-Sequenzen umfasst, oder
ii) die partielle DNA-Sequenz kodierend für den N-terminalen Teil der TPAP und der in DSM 9570 vorliegenden, oder
iii) eine Nukleotidsequenz, die an eine Oligonukleotidsonde hybridisiert, die auf der Basis einer beliebigen der in SEQ ID NR: 1, 2 oder 3 gezeigten DNA-Sequenzen oder auf der Basis einer beliebigen der in SEQ ID NR: 4–14 gezeigten Aminosäuresequenzen hergestellt wird, und welche eine TPAP kodiert, oder
iv) eine Nukleotidsequenz komplementär zu der DNA/Nukleotidsequenz von i), ii) oder iii).

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt kann entweder für die rekombinante Erzeugung von TPAP (DNA/Nukleotidsequenzen i)–iii)) oder zur Reduzierung der TPAP-erzeugenden Fähigkeit einer Zelle verwendet werden, in der die Erzeugung unerwünscht ist (Nukleotidsequenz iv)).
Die Nukleotidsequenz iii) kann z. B. aus einem anderen oder einem verwandten (z. B. dem gleichen) Organismus isoliert werden, von dem bekannt ist oder von dem angenommen wird, dass er TPAP auf der Basis jeder der in SEQ ID NR: 1–14 gezeigten partiellen DNA- oder partiellen Aminosäuresequenzen oder der partiellen TPAP-kodierenden DNA-Sequenz von DSM 9570, z. B. unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorgehensweisen, erzeugt, oder auf der Basis jeder der DNA- oder Aminosäuresequenzen konstruiert wird, z. B. durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz als die durch die TPAP kodierte DNA-Sequenz führen, welche jedoch der Kodon-Benutzung des Wirtsorganismus entsprechen, der für die Erzeugung von TPAP herangezogen werden soll, oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz und somit möglicherweise zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen, wodurch eine TPAP-Mutante mit unterschiedlichen Eigenschaften als die der nativen TPAP, jedoch mit intakter TPAP-Aktivität bedingt wird. Andere Beispiele möglicher Modifikationen sind Insertion eines oder mehrerer Nukleotide in die Sequenz, die Addition eines oder mehrerer Nukleotide an eines der beiden Enden der Sequenz, oder die Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden an einem der beiden Enden oder innerhalb der Sequenz.
Es soll verstanden werden, dass die in SEQ ID NR: 1–3 gezeigten DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz von DSM 9570 partielle Sequenzen sind, die zum Isolieren einer gesamten TPAP-kodierenden DNA-Sequenz einbezogen und verwendet werden können. Dies kann auf einfache Weise mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung zielt die Nukleotidsequenz iii) darauf ab, die gesamte DNA-Sequenz einzuschließen.
Die Hybridisierung, auf die oben Bezug genommen wird, soll bezeichnen, dass die Nukleotidsequenz iii) unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die nachstehend im Detail im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben sind an die gleiche Sonde wie die DNA-Sequenz hybridisiert, die die TPAP kodiert (oder an besagte DNA-Sequenz kodierend für TPAP). Normalerweise ist die Nukleotidsequenz iii) hoch homolog zu der in SEQ ID NR: 1, 2 oder 3 gezeigten DNA-Sequenz oder zu der TPAP-kodierenden DNA-Sequenz von DSM 9570 (wenn man den Teil der Nukleotidsequenz iii), der der(n) hierin offenbarten partiellen DNA-Sequenz(en) entspricht, vergleicht), wie zum Beispiel mindestens 65%, z. B. mindestens 70% homolog zu dieser DNA-Sequenz, z. B. mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog zu einer beliebigen oder zu allen der besagten Sequenzen. Entsprechend wird die erfindungsgemäße TPAP in Betracht gezogen, zu mindestens 65%, z. B. mindestens 70% der durch besagte DNA-Sequenz(en) kodierten Aminosäuresequenz homolog zu sein (wie evaluiert auf der Basis eines Vergleichs zwischen dem Teil der TPAP-Aminosäuresequenz, welcher dem Teil entspricht, der durch die in Frage kommende DNA-Sequenz kodiert ist), z. B. mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder sogar mindestens 95% homolog.
Die Nukleotidsequenz iii) kann eine DNA- oder eine RNA-Sequenz sein.
Die DNA-Sequenzen i)–iii) des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts können durch gut bekannte Vorgehensweisen hergestellt werden. So kann die relevante DNA-Sequenz beispielsweise durch Etablierung einer cDNA oder genomischen Bibliothek aus einem Organismus isoliert werden, von dem erwartet wird, dass er die Sequenz birgt, z. B. eine wie oben beschriebene Zelle, und durch Screenen auf positive Klone mittels konventioneller Verfahren. Beispiele für solche Vorgehensweisen sind das Hybridisieren von geeigneten Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York 1989), und/oder Selektion auf Klone, die die relevante Aktivität exprimieren, und/oder Selektion auf Klone, die ein Protein erzeugen, welches gegenüber einem Antikörper reaktiv ist, der gegen das relevante Enzym gerichtet ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Isolieren einer DNA-Sequenz aus einer cDNA oder genomischen Bibliothek ist das Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von degenerierten Olegonukleotidsonden. Zum Beispiel kann die PCR unter Verwendung der in PCR Protocols 1993, Hrsg. Bruce A. White und The polymerase chain Reaction, 1994, Hrsg. Kary B. Mullis beschriebenen Techniken durchgeführt werden.
Alternativ dazu können die DNA-Sequenzen i) und ii) auf einfache Weise aus DSM 9570 isoliert werden.
Des Weiteren können die DNA-Sequenzen des erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes z. B. die Nukleotidsequenz iv), die zu der DNA/Nukleotidsequenz i), ii) oder iii) komplementär ist, durch etablierte Techniken, z. B. basierend auf den von Narang, SA, 1984, Tetrahedron 39:3 und Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323 offenbarten Prinzipien, synthetisiert werden.
Das DNA-Konstrukt, welches durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet) gemäß Standardtechniken hergestellt wird, kann gemischt genomischen und synthetischen, gemischt synthetischen und cDNA- oder gemischt genomischen und cDNA-Ursprungs sein, die Fragmente entsprechen den verschiedenen Teilen des gesamten rekombinanten DNA-Moleküls.
Es soll verstanden werden, dass eine bevorzugte Verwendung der DNA-Sequenz i), ii) oder iii) in der Herstellung von rekombinanter TPAP liegt, wohingegen eine bevorzugte Verwendung der DNA-Sequenz iv) in der Reduzierung der TPAP-produzierenden Fähigkeit von Zellen liegt, die beabsichtigt werden, zur Verwendung in der Erzeugung von Proteinerzeugnissen, welche TPAP gegenüber empfindlich sind, verwendet zu werden.
Obwohl die DNA-Sequenz iv) zu der gesamten TPAP-kodierenden Sequenz komplementär sein kann, reicht es normalerweise aus, dass die DNA-Sequenz iv) nur zu einem Teil dieser Sequenz komplementär ist. In funktionsfähiger Weise exprimiert, muss die DNA-Sequenz iv) zu einer ausreichenden Länge der TPAP-kodierenden DNA-Sequenz komplementär sein, um die Hybridisierung an die TPAP-kodierende DNA und somit die Reduktion oder das Unterbinden der Transkription der entsprechenden mRNA zu erlauben. Typischerweise ist es ausreichend, dass die DNA-Sequenz iv) ein DNA-Fragment von mindestens 17 Nukleotiden wie zum Beispiel mindestens 300 Nukleotiden umfasst.
Der Vektor, der das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt trägt, ist vorzugsweise ein rekombinanter Expressionsvektor, kann aber auch jeder beliebige Vektor sein, der üblicherweise rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterzogen wird, und die Auswahl des Expressionsvektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, z. B. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid oder ein Bakteriophage. Alternativ kann der Vektor einer sein, der sich, wenn in eine Wirtszelle eingeführt, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en) repliziert, in welche(s) er sich integriert hat.
In dem DNA-Konstrukt oder dem Vektor sollte die DNA-Sequenz mit einer geeigneten Promotorsequenz funktionsfähig verbunden sein. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt, und kann von Genen abstammen, die entweder homologe oder zu der Wirtszelle heterologe Proteine kodieren. Der Promotor kann von Genen abstammen, die sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine kodieren, wie beispielsweise Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Lipasen, Cellulasen und glycolytische Enzyme. Beispiele von geeigneten Promotoren zum Steuern der Transkription des erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes sind Promotoren, die von Genen aus A. oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei Asparagin-Proteinase, A. niger Glucoamylase, A. niger neutraler α-Amylase, A. niger saurer stabiler α-Amylase und Rhizomucor miehei Lipase abstammen. Beispiele von Genpromotoren für glycolytische Enzyme sind TPI, ADH und PGK. Der Promotor kann ebenso ein homologer Promotor sein, d. h. ein bzgl. des Wirtsstamms natives Gen kann verwendet werden.
Die Promotorsequenz kann mit Linkern bereitgestellt werden zu dem Zweck, spezifische Restriktionsschnittstellen einzuführen, die die Ligation der Promotorsequenz mit dem Gen der Wahl oder mit einem ausgewählten Signalpeptid oder einer Präregion zu ermöglicht.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt und/oder der Expressionsvektor kann ebenso eine geeignete Terminatorsequenz umfassen, die funktionsfähig mit der DNA-Sequenz verbunden ist, welche die TPAP- und/oder eine Polyadenylierungssequenz kodiert. Die Terminator- und Polyadenylierungssequenzen können von den gleichen Quellen abstammen wie die Promotoren. Enhancersequenzen können ebenso in das Konstrukt eingeführt werden.
Das DNA-Konstrukt und/oder der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, sich in der in Frage kommenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC 177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Das DNA-Konstrukt und/oder der Vektor kann ebenfalls einen selektierbaren Marker umfassen. Beispiele solcher Selektionsmarker schließen die amdS oder argB, trpC oder pyrG (die letzteren drei Marker z. B. aus A. nidulans oder A. niger) mit ein.
Die zur Konstruktion des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts verwendete Vorgehensweise umfasst das Ligieren der oben genannten DNA-Sequenzen des Promotors, des Terminators bzw. der anderen Elemente, und um dieses in geeignete Vektoren zu insertieren, die die zur Replikation notwendige Information enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt sind (vgl. beispielsweise Sambrook et al. op. cit.).
Die Zelle und ein Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen TPAP
In einer Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zelle, die entweder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor wie oben stehend definiert umfasst, als eine Wirtszelle für die rekombinante Erzeugung der erfindungsgemäßen TPAP verwendet. In diesem Fall umfasst das DNA-Konstrukt oder der Expressionsvektor eine beliebige der TPAP-kodierenden DNA-Sequenzen i)–iii) oder das Insert von DSM 9570 wie oben stehend definiert. Die Zelle kann mit dem DNA-Konstrukt transformiert werden, geeigneterweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom, obwohl das DNA-Konstrukt auch als eine extrachromosomale Einheit existieren kann. Die Integration wird jedoch im Allgemeinen als vorteilhaft betrachtet, da die DNA-Sequenz eher stabil in der Zelle beibehalten wird. Die Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann gemäß üblicher Verfahren, z. B. durch homologe Rekombination durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die Zelle mit einem Expressionsvektor in Verbindung mit den verschiedenen Typen an Wirtszellen wie nachstehend beschrieben transformiert werden.
Die erfindungsgemäße Zelle kann eine Zelle eines höheren Organismus wie die eines Säugers oder eines Insekts sein, ist aber vorzugsweise eine mikrobielle Zelle, z. B. eine bakterielle oder Pilz-(einschließlich Hefe-)-Zelle.
Beispiele von geeigneten Bakterien sind grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder gramnegative Bakterien wie zum Beispiel E. coli. Die Transformation der Bakterien kann beispielsweise durch Protoplastentransformation oder durch Verwendung von kompetenten Zellen in einer per se bekannten Weise erfolgen.
Der Hefeorganismus kann bevorzugterweise von einer Saccharomyces- oder Schizosaccharomyces-Spezies ausgewählt werden, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Der filamentöse Pilz kann vorteilhafterweise zu einer Spezies des Aspergillus gehören, z. B. Aspergillus oryzae, A. nidulans, A. foetidus, A. aculeatus, A. japonicus oder A. niger, einer Trichoderma-Spezies, z. B. T. reesei, T. longibrachiatum oder T. harzianum, oder einer Fusarium-Spezies, z. B. F. oxysporum, F. graminearum oder F. solani. Pilzzellen können durch einen Prozess transformiert werden, der die Bildung von Protoplasten und die Transformation der Protoplasten gefolgt durch Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Weise einbezieht.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von TPAP, wobei das Verfahren umfasst:

i) das Kultivieren einer erfindungsgemäßen Zelle wie oben stehend definiert in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression von TPAP erlaubt, und das Wiedergewinnen von TPAP aus der Kultur.

Das zum Kultivieren der Zellen verwendete Medium kann jedes herkömmliche Medium sein, welches für das Wachstum der in Frage kommenden Wirtszelle geeignet ist. Geeignete Medien sind von kommerziellen Herstellern erhältlich oder können gemäß publizierter Rezepte (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Es wird angenommen, dass die Gegenwart von Protein in dem Medium in einer erhöhten TPAP-Erzeugung resultieren kann.
Die TPAP kann aus dem Medium mittels herkömmlicher Verfahren einschließlich dem Trennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, falls notwendig nach Aufschließen der Zellen, dem Präzipitieren der proteinösen Komponenten des Überstandes oder des Filtrats mittels Salz, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt durch Aufreinigung mittels einer Vielzahl an chromatographischen Vorgehensweisen, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder ähnlichem, wiedergewonnen werden.
Entfernung oder Reduzierung der TPAP-Aktivität
Die Identifizierung von TPAP als ein destabilisierender Faktor in mikrobiell erzeugten Proteinerzeugnissen kann wichtige Konsequenzen für die Erzeugung einer großen Anzahl an verschiedenen Proteinerzeugnissen haben. Daher können, wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gezeigt, sogar geringe Mengen an anwesender TPAP in einem Proteinerzeugnis in einer reduzierten Thermostabilität dieses Erzeugnisses resultieren. Entsprechend ist es durch die vorliegende Erfindung möglich, Produktionsstämme zu konstruieren, die eine reduzierte TPAP-produzierende Fähigkeit besitzen.
Die Reduzierung der TPAP-Erzeugung aus einer TPAP-produzierenden Zelle kann in geeigneter Weise durch Modifikation oder Inaktivierung einer DNA-Sequenz begleitet werden, die in der Zelle vorhanden und zur Expression von TPAP notwendig ist, so dass dies in einer reduzierten TPAP-Erzeugung in dieser Zelle resultiert.
Die zu modifizierende DNA-Sequenz kann z. B. eine DNA-Sequenz sein, die TPAP oder ein für das Aufweisen der TPAP-Aktivität essenziellen Teil davon kodiert oder kann eine regulatorische Sequenz sein, die zur Expression von TPAP von einer TPAP-kodierenden DNA-Sequenz benötigt wird.
Die regulatorische Sequenz kann beispielsweise eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon sein, d. h. ein Teil, der ausreichend ist, die Expression von TPAP zu bewirken.
Die Modifizierung oder Inaktivierung der DNA-Sequenz kann erzielt werden, indem die TPAP-produzierende Zelle einer Mutagenese unterzogen wird, und durch Selektieren auf Zellen, in denen die TPAP-produzierende Fähigkeit reduziert wurde. Die Mutagenese, welche spezifisch oder zufallsbedingt sein kann, kann z. B. durch Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenesemittels, durch Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids, oder mittels dem Unterziehen der DNA-Sequenz einer PCR-generierten Mutagenese durchgeführt werden. Des Weiteren kann die Mutagenese durch Verwendung einer beliebigen Kombination dieser Mutagenesemittel durchgeführt werden.
Beispiele von physikalischen oder chemischen Mutagenesmitteln, die für den vorliegenden Zweck geeignet sind, schließen ultraviolette (UV) Bestrahlung, Hydroxylamin, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, Salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga ein.
Wenn solche Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese typischerweise durchgeführt durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in der Gegenwart des gewählten Mutagenesmittels unter für die stattzufindene Mutagenese geeigneten Bedingungen und durch Selektion auf mutierte Zellen, die eine reduzierte TPAP-Erzeugung aufweisen.
Wenn die Modifizierung oder Inaktivierung durch die Einführung, die Substitution oder die Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in der TPAP-kodierenden Sequenz oder einem regulatorischen Element durchgeführt wird, welches für die Transkription oder Translation davon benötigt wird, können Nukleotide z. B. insertiert oder entfernt werden, so dass dies in der Einführung eines Stop-Kodons, der Entfernung des Start-Kodons oder einer Veränderung des offenen Leserahmens resultiert. Die Modifikation oder Inaktivierung der TPAP-kodierenden Sequenz oder eines regulatorischen Elementes kann mittels stellenspezifischer Mutagenese oder PCR-generierter Mutagenese gemäß den im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Obwohl die Modifikation im Prinzip in vivo durchgeführt werden kann, d. h. direkt auf der Zelle, die das zu modifizierende TPAP-Gen trägt, wird es gegenwärtig vorgezogen, die Modifikation wie nachstehend exemplarisch geschildert in vitro durchzuführen.
Ein Beispiel eines geeigneten Weges, die TPAP-Erzeugung einer Wirtszelle der Wahl zu inaktivieren oder zu reduzieren, basiert auf den Prinzipien des Gen-Austausches oder der Gen-Unterbrechung. Zum Beispiel bezieht das Gen-Unterbrechungsverfahren die Verwendung von DNA-Sequenzen, die dem endogenen Gen oder Gen-Fragment entsprechen, von welchem gewünscht ist, es zu zerstören, mit ein. Die DNA-Sequenz wird in vitro zu einem defekten Gen mutiert und in die Wirtszelle transformiert. Durch homologe Rekombination ersetzt das defekte Gen das endogene Gen oder Gen-Fragment. Es kann daher wünschenswert sein, dass das defekte Gen oder Gen-Fragment einen Marker kodiert, welcher zur Selektion der Transformanten verwendet werden kann, in denen das TPAP-Gen modifiziert oder zerstört wurde.
Alternativ dazu kann die Modifizierung oder Inaktivierung der DNA-Sequenz durch Verwendung von etablierten Anti-Sense-Techniken unter Benutzung einer zu der TPAP-kodierenden Sequenz komplementären Nukleotidsequenz erfolgen, z. B. der oben stehend beschriebenen Nukleotidsequenz iv). Genauer gesagt kann die TPAP-Erzeugung in einer TPAP-produzierenden Zelle durch die Einführung einer Nukleotidsequenz reduziert oder eliminiert werden, die zur TPAP-kodierenden Sequenz komplementär und somit in der Lage ist, in der Zelle an die in der Zelle produzierten TPAP-mRNA so zu hybridisieren, dass die Nukleotidsequenz in der Zelle unter Bedingungen transkribiert werden kann, die es der Nukleotidsequenz erlauben mit TPAP-mRNA zu hybridisieren und somit die Menge der von besagter mRNA translatierten TPAP zu reduzieren oder jedwede Translation zu eliminieren.
Die so geschaffenen TPAP-defizienten Mutanten sind besonders für die Expression von heterologen Proteinen verwendbar. Im vorliegenden Kontext soll der Begriff "heterologe Proteine" ein Protein bezeichnen, welches in der Wirtszelle nicht nativ ist, ein natives Protein in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die native Sequenz zu verändern oder ein natives Protein, dessen Expression als ein Ergebnis einer Manipulation der Wirtszelle durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ verändert wurde.
Es wird bevorzugt, dass die zu modifizierende TPAP-erzeugende Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung ein Stamm ist, der für die Erzeugung der gewünschten Proteinerzeugnisse geeignet ist, entweder homolog oder heterolog zu dieser Zelle. Zum Beispiel sind Zellen der Pilzgattungen Aspergillus, Trichoderma und Fusarium Beispiele für bevorzugte Erzeugerzellen. Entsprechend ist die zu modifizierende Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Zelle eines Aspergillus sp., im Besonderen eine Zelle von A. niger, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus oder A. nidulans oder eine Zelle eines Trichoderma sp., z. B. T. reesei, T. longibrachiatum oder T. harzianum, oder eine Zelle eines Fusarium sp., z. B. F. oxysporum, F. graminearum oder F. solani.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist die zu modifizierende Zelle eine Zelle von A. niger oder A. oryzae, welche zur Erzeugung von Enzymen wie AMG verwendet wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches im Wesentlichen frei von TPAP-Aktivität ist, wobei das Verfahren das Transformieren einer Wirtszelle mit einer das Erzeugnis-kodierenden DNA-Sequenz wie oben stehend beschrieben umfasst, welche eine reduzierte oder keine TPAP-erzeugende Fähigkeit besitzt, das Kultivieren der transformierten Zelle unter zur Expression des Erzeugnisses geeigneten Bedingungen und das Wiedergewinnen des Erzeugnisses aus der Kultur.
In einem alternativen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches im Wesentlichen frei von TPAP-Aktivität ist, wobei das Erzeugnis durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die in der TPAP-exprimierenden Zelle vorhanden ist, und wobei das Verfahren das Modifizieren oder Inaktivieren einer DNA-Sequenz umfasst, die in besagter Zelle vorhanden und zur Expression von TPAP wie oben stehend beschrieben notwendig ist, und das anschließende Kultivieren der Zelle unter zur Expression des Erzeugnisses geeigneten Bedingungen, und das Wiedergewinnen des Erzeugnisses aus der Kultur.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches im Wesentlichen frei von TPAP ist, durch Fermentierung einer TPAP-produzierenden Zelle, welche ebenfalls das Erzeugnis erzeugt, wobei das Verfahren die Zugabe einer wirksamen Menge eines Inhibitors, der in der Lage ist, die TPAP-Aktivität zu inhibieren, zum Fermentationsmedium, entweder während oder nachdem die Fermentierung beendet wurde, umfasst, das Gewinnen des Erzeugnisses von Interesse aus dem Fermentationsmedium, und wahlweise das Unterziehen des gewonnenen Erzeugnisses einer weiteren Aufreinigung. Dieses Verfahren ist in den nachstehenden Beispielen weiter illustriert.
In noch einem weiteren alternativen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches im Wesentlichen frei von TPAP-Aktivität ist, wobei das Erzeugnis durch eine in der TPAP-exprimierenden Zelle vorhandene DNA-Sequenz kodiert wird, wobei das Verfahren das Kultivieren der TPAP-exprimierenden Zelle kodierend das Erzeugnis unter Bedingungen, die die Expression des Erzeugnisses erlauben, das Unterziehen des resultierenden Kulturmediums einer kombinierten pH- und Temperatur-Behandlung, so dass die TPAP-Aktivität substantiell reduziert wird, und das Gewinnen des Erzeugnisses aus dem Kulturmedium umfasst. Alternativ dazu kann die kombinierte pH- und Temperatur-Behandlung an einer aus dem Kulturmedium gewonnenen Enzym-Zubereitung durchgeführt werden. Die kombinierte pH- und Temperatur-Behandlung kann gegebenenfalls auch in Verbindung mit einer TPAP-Inhibitor-Behandlung verwendet werden.
Entsprechend diesem Aspekt der Erfindung ist es möglich, mindestens 60% der TPAP-Aktivität, wie beispielsweise mindestens 75% der Aktivität, vorzugsweise mindestens 85% der Aktivität, noch bevorzugterweise mindestens 95% der Aktivität und am stärksten bevorzugt im Wesentlichen mindestens 99% der TPAP-Aktivität zu entfernen. Es wird in Betracht gezogen, dass eine vollständige Entfernung der TPAP-Aktivität durch Verwendung dieses Verfahrens erhalten werden kann.
Die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung wird vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 6,5–7 und bei einer Temperatur im Bereich von 25–40°C für eine Zeitdauer durchgeführt, die ausreicht, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Typischerweise sind 0,5–1 Stunde ausreichend, um den gewünschten Effekt zu erzielen.
Die zur Kultivierung und Aufreinigung des Erzeugnisses von Interesse verwendeten Verfahren können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, z. B. wie hierin oben stehend beschrieben, durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zum Erzeugen eines im Wesentlichen TPAP-freien Erzeugnisses sind von besonderem Interesse bei der Herstellung von eukaryotischen Proteinen, im Besonderen Pilzproteinen wie zum Beispiel Enzymen. Die Enzymerzeugnisse können z. B. ausgewählt werden aus einem amylolytischen Enzym, einem lipolytischen Enzym, einem proteolytischen Enzym, einem cellulytischen Enzym, einer Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand-abbauenden Enzym. Beispiele solcher Enzyme schließen AMG, Amylase, Lipase, Cutinase, Esterase, Cellulase, Hemicellulase, Protease, Peroxidase, Laccase, Phenoloxidase, Catalase, Glucoseoxidase, Phytase, Lyase, Pectinase, Glucosidase, Mannosidase, Isomerase, Invertase, Transferase, Ribonuclease, Galactosidase, Transglutaminase und Chitinase ein. Die TPAP-defizienten Zellen können ebenso verwendet werden, um heterologe Proteine von pharmazeutischem Interesse wie zum Beispiel Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Ähnliche zu exprimieren.
Man soll verstehen, dass der Begriff "eukaryotische Proteine" beabsichtigt, nicht nur native Proteine einzuschließen, sondern auch solche Proteine (z. B. Enzyme), die durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen oder anderen Modifikationen modifiziert wurden, welche durchgeführt wurden, um Aktivität, Thermostabilität, pH-Toleranz und Ähnliches zu verstärken.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Proteinerzeugnis, welches im Wesentlichen frei von TPAP-Aktivität ist, und welches durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt wird.
BEISPIEL 1
AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON A. niger-TPAP
Material und Methoden

Phe-Pro-Ala-pNA-Substrat (erhältlich von Bachem, Schweiz).

Proteaseinhibitoren

Ala-Ala-Phe-Chlormethylketon
Benzyloxycarbonyl-Ala-Pro-Phe-Chlormethylketon
Benzyloxycarbonyl-Gly-Gly-Phe-Chlormethylketon.

Aufreinigung von TPAP
TPAP wurde aus einem kommerziellen A. niger AMG-Präparat (erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark) aufgereinigt. Eine Probe von 300 ml formuliertem AMG-Erzeugnis wurde wiederholt verdünnt und bei 4°C in einem Filtron^®-Konzentrator ausgerüstet mit einer 3 kDa Cutoff-Membran konzentriert, bis die Leitfähigkeit weniger als 1,5 mS/cm betrug. Alle anderen Aufreinigungsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Kationen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCl-Gradienten
Das Konzentrat (600 ml) wurde auf pH 4,0 eingestellt und vor dem Auftragen auf eine 200 ml (2,6 × 37 cm) S-Sepharosesäule, äquilibriert mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,0, filtriert. Es wurde eine Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min verwendet. Die TPAP wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,2 M in 10 Säulenvolumina eluiert. Es wurde ein Zusammenschluß enthaltend den größten Teil der Peptidaseaktivität hergestellt. Ein Pufferwechsel zu 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 wurde in einer Amiconzelle ausgestattet mit einer Diaflo-Membran mit einem Cutoff von 10 kDa durchgeführt.
Anionen-Austauschchromatographie
Der Zusammenschluß von der S-Sepharosesäule wurde auf einer HiLoad-Q-Sepharose-HP-Säule (50 ml, 2,6 × 10 cm) äquilibriert mit 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 weiter aufgereinigt. Die Elution von TPAP wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0–0,5 M in 15 Säulenvolumen durchgeführt. Das Protein wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 8,0 ml/min aufgetragen und mit 5,0 ml/min eluiert. Es wurde ein Zusammenschluß enthaltend den größten Teil der TPAP hergestellt. Ein Pufferaustausch zu 20 mM Natriumacetat, pH 4,0 wurde in einer Amiconzelle wie oben stehend beschrieben durchgeführt.
Kationen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines pH-Gradienten
Der Zusammenschluss von der HiLoad-Q-Sepharose-HP-Säule wurde schließlich auf einer Mono-S-Säule (5/5), äquilibriert mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,0, aufgereinigt. Ein Gradient von pH 4,0 bis pH 6,0 wurde in 30 Säulenvolumen unter Verwendung von 20 mM Natriumacetat, pH 4,0 und 20 mM Natriumacetat, pH 6,0 durchgeführt. Die Fließgeschwindigkeit war 1,0 ml/min. Zwei Isoenzyme von TPAP eluierten bei pH 5,1 bzw. 5,2.
Aufreinigung von AMG
AMG G1 wurde aus einem kommerziellen AMG-Präparat (Novo Nordisk A/S) durch Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose aufgereinigt. Eine 50 ml Säule wurde mit 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 äquilibriert und die G1-Form mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 8 Säulenvolumina eluiert. Die Fließgeschwindigkeit war 8,0 ml/min.
AMG_trunc wurde nach TPAP-Behandlung von AMG G1 auf einer Mono-Q-Säule, äquilibriert mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,3, aufgereinigt. Ein linearer NaCl-Gradient von 0 bis 1,0 M in 30 Säulenvolumen wurde zur Elution verwendet. Die Fließgeschwindigkeit war 1,0 ml/min.
Destabilisierungstest
Aliquots der aufgereinigten AMG G1 wurden mit verschiedenen Mischungen an TPAP und Puffer in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,3 für mehrere Wochen bei 37°C inkubiert. Das Endvolumen betrug entweder 1 oder 2 ml mit einer Konzentration an AMG G1 von 10 AGU/ml. 100 μl der Inkubationsmischung wurden zurückbehalten und mit 0,1 M Natriumacetat, pH 4,3 auf 2 AGU/ml verdünnt. Eine Hitzebehandlung bei 65°C für 30 Minuten wurde mit der verdünnten Probe durchgeführt. Nach Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur wurde die Aktivität der unbehandelten und der hitzebehandelten Proben in Mikrotiterplatten unter Verwendung des farbstoffbildendes Substrats p-Nitrophenyl-α-D-glycopyranosid (pNPG) (Merck, Art. 6792) gemessen. 50 μl 3 mM pNPG in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,3 wurden mit 25 μl der Probe für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 75 μl 0,1 M Natriumtetraborat gestoppt. Das Absorptionsvermögen bei 405 nm wurde in einem UV-max-Kinetik-Mikroplattenauslesegerät gemessen. T₃₀ wurde als die Prozentzahl der nach Hitzebehandlung übrig geblieben Aktivität berechnet. Alle Messungen wurden zweifach durchgeführt.
TPAP-Test
Der Test wurde entweder in einem Mikrotiterplattenauslesegerät oder in einem Spektrophotometer unter Verwendung einer Substratkonzentration von 0,2 mM Phe-Pro-Ala-pNA in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,3 durchgeführt. Eine 5 mM Stocklösung von Phe-Pro-Ala-pNA wurde in DMSO hergestellt und vor Verwendung verdünnt. Die Reaktion wurde für 4 Min. bei 405 nm entweder in einem UV-max-Kinetik-Mikroplattenauslesegerät oder einem Spektrophotometer verfolgt und die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltungsreaktion kalkuliert.
Inhibition von TPAP
Aliquots enthaltend 4 μg TPAP wurden mit einer Anzahl an Proteaseinhibitoren inkubiert: 1 mM Ala-Ala-Phe-Chlormethylketon, 1 mM Benzyloxycarbonyl-Ala-Pro-Phe-Chlormethylketon und 1 mM Benzyloxycarbonyl-Gly-Gly-Phe-Chlormethyl-keton. Nach 30 Min. Inkubation wurde die restliche Aktivität bestimmt.
Lagerungsstabilität von filtrierten Fermentationsmedien
Die Kulturmedien wurden zentrifugiert und durch einen 0,22 μm Filter steril filtriert. Die Medien wurden im Hinblick auf Kaliumsorbat und Natriumbenzoat 0,1%ig hergestellt, und der pH wurde auf 4,3 eingestellt. Aliquote von 2 ml wurden entweder mit 200 μl an 10 mM Ala-Ala-Phe-Chloromethylketon oder 200 μl an 0,1 M Natriumacetat, pH 4,3 versetzt. Proben wurden zurückbehalten und vor der T₃₀-Bestimmung wie oben stehend beschrieben auf 2 AGU/ml verdünnt.
Bestimmung von AMG-Aktivität (AGU)
Die AMG-Aktivität wurde wie von K. A. Holm, 1980, Anal. Chem. Acta., 117, S. 359–362, beschrieben bestimmt. In Kürze, das Verfahren basiert auf Hydrolyse von Maltose durch AMG unter Bildung von alpha-D-Glucose. Nach einer kurzen kontinuierlichen Dialysevorgehensweise wird die Konzentration an Glucose durch eine Glucose-Dehydrogenase (GlucDH)-Reaktion (durchgeführt bei pH 7,6) bestimmt. Standardbedingungen für das automatisierte „Auto-Analyzer"-Verfahren sind:
Substrat: Maltose 28 mM
Inkubationspuffer: Acetat 0,1 M, pH 4,3
Inkubationstemperatur: 37°C
Inkubationszeit: 5 Min.
Der Bereich des Verfahrens, in dem das Enzym arbeitet, ist 0,5–4 AGU/ml.
Ergebnisse
TPAP wurde bis zur Homogenität aus einem kommerziellen AMG-Präparat (Novo Nordisk A/S) gemäß dem in Tabelle 1 gezeigten Aufreinigungsschema aufgereinigt. Das Elutionsprofil von der finalen Kationen-Austauschchromatographiesäule zeigte die Gegenwart von zwei TPAP-Isoenzymen (TPAP-I und TPAP-II) mit pI 5,1 bzw. 5,2. Beide Isoformen wurden anhand von SDS-PAGE und N-terminaler Sequenzierung als rein bewertet, jedoch unterschieden sich die spezifischen Aktivitäten der Enzyme (vgl. Tabelle 1). TPAP-II hatte eine 20% höhere spezifische Aktivität als TPAP-I.
Die Deaminierung von einem oder mehreren Asn- oder Gin-Resten entweder in dem Fermentationsmedium oder während der Aufreinigung kann die geringe Differenz im pI zwischen den beiden TPAP-Isoformen erklären.
pH-Optimum
Das pH-Optimum von TPAP wurde unter Verwendung der gleichen Vorgehensweise wie der im oben beschriebenen TPAP-Test bestimmt. 0,1 M Acetatpuffer wurde verwendet, um den pH zu regulieren. Die resultierende pH-Optimumskurve ist in 1 gezeigt. Es kann entnommen werden, dass die TPAP optimalerweise bei einem pH im Bereich von 5,0–5,5, im Besonderen bei 5,25 funktioniert.
Bestimmung des Temperaturoptimums für TPAP
Die Temperatur/Aktivitätsbeziehung von TPAP wurde in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5 unter Verwendung des oben beschriebenen TPAP-Test bestimmt. Wie aus der Tabelle entnommen werden kann, hat TPAP eine maximale Aktivität im Temperaturbereich zwischen 45–55°C. Tabelle 2

Temperatur (°C) 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Rel. Akt. (%) 42 52 63 78 100 99 98 51 8
Massenspektrometrie
Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie von TPAP aufgereinigt aus A. niger gab ein breites Signal, welches darauf hinwies, dass die TPAP glycosyliert ist. Die durchschnittliche Masse wurde als 54,5 kDa ermittelt.
BEISPIEL 2
AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON A. oryzae-TPAP
Material und Methoden
Als ein Ausgangsmaterial für die Aufreinigung wurde der Überstand einer A. oryzae IFO 4177 Fermentation verwendet, die bei pH 5 in einem Soja-enthaltenden Medium fermentiert wurde. Nach Fermentierung wurde das Kulturmedium zentrifugiert, um die Mehrheit der Zellen zu entfernen.
Aufreinigung
Ungefähr 4 l Überstand wurden keimfrei auf einer Seitz EKS-Platte gefiltert. Das EKS-Filtrat wurde auf einer 3k Cutoff-Filtron-Kassette (Minisette) auf minimales Volumen ultrafiltriert. Ultrafiltrat = 240 ml. 170 ml des Ultrafiltrats wurde mit festem Ammoniumsulfat (AMS) präzipitiert, um eine AMS-Sättigung von ungefähr 90% zu erhalten. Nach Rühren für mindestens 30 Min. wurde das AMS-Präzipitat durch Zentrifugation in einer Sorvall RC3B-Zentrifuge (4.500 UpM, 15 Min., Raumtemperatur) wiedergewonnen. 100 ml deionisiertes Wasser wurde zu dem AMS-Präzipitat hinzugegeben, um das Protein zu lösen und 1% (Gew./Vol) FGV120 Aktivkohle wurde hinzugegeben, um die Farbe zu entfernen. Nach ungefähr 1-stündigem Rühren wurde die Suspension auf einer Seitz EK1-Platte gefiltert, um die Kohle (und die Farbe) zu entfernen. Das EK1-Filtrat wurde 1) gegen 100 mM H₃BO₃, 10 mM Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl₂, pH 5, und 2) gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Nach einer EK1-Filtration wurde das Dialysat (260 ml) in Aliquots eingefroren.
Ein 120 ml Aliquot des Dialysats wurde aufgetaut und auf eine 1,4 l G25-Sephadexsäule äquilibriert in 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 5,0 aufgetragen. Um die Farbe und sehr saure Proteine zu entfernen, wurde das G25-Filtrat auf eine 40 ml Q-Sepharose FF-Säule äquilibriert im selben Puffer (CH₃COOH/NaOH, pH 5,0) aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (0–200 mM) eluiert. Fraktionen von der Säule wurden auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Das meiste der TPAP-Aktivität wurde im Durchfluss gesehen (70%), wohingegen das meiste des Proteins an der Säule gebunden war.
Der Durchfluss von der Q-Sepharosesäule wurde auf eine 50 ml S-Sepharose HP-Säule, äquilibriert in 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 5,0, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 → 200 mM) eluiert. Fraktionen von der Säule wurden auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Die meiste TPAP-Aktivität wurde wiederum im Durchfluss gesehen (75%). Der Rest der TPAP-Aktivität befand sich zu Beginn des NaCl-Gradienten. Der Durchfluss + Fraktionen 1–11 wurden vereinigt und gegen 50 mM H₃BO₃, 5 mM Dimethylglutarsäure, 1 mM CaCl₂, pH 6,0, dialysiert.
Nach Einstellen des pH des dialysierten Zusammenschlusses auf pH 7,0 wurde das Enzym auf eine 23 ml SOURCE-Q-Säule, äquilibriert in 50 mM H₃BO₃, 5 mM Dimethylglutarsäure, 1 mM CaCl₂, pH 7,0, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 → 500 mM) eluiert. Fraktionen von der Säule wurden auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Die gesamte TPAP-Aktivität wurde im Durchfluss gesehen (95%). Der Grund für diese Beobachtung wird darin gesehen, dass die Säule mit dem Protein überladen wurde. Der Durchfluss wurde gegen 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,0, dialysiert.
Das dialysierte Enzym wurde auf eine 50 ml S-Sepharose HP-Säule, äquilibriert in 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,0, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem NaCl-Gradienten (0 → 200 mM) eluiert. Fraktionen von der Säule wurden auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Die TPAP-Aktivität eluierte mit 100 mM NaCl. Die TPAP-Aktivität wurde vereinigt und gegen 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,0, dialysiert. Um eine bessere Auflösung zu bekommen als die, die die S-Sepharosesäule bieten kann, wurden die dialysierten, vereinigten Fraktionen auf eine 8 ml SOURCE-S-Säule, äquilibriert im selben Puffer (20 mM CH₃COOH/-NaOH, pH 4,0) aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem NaCl-Gradienten (0 → 200 mM) eluiert. Fraktionen von der Säule wurden auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Die TPAP-Aktivität eluierte mit 60 mM NaCl. Die TPAP-Aktivität wurde vereinigt und gegen 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 5,5, dialysiert.
Das dialysierte Enzym wurde auf eine 23 ml SOURCE Q-Säule, äquilibriert in 20 mM CH₃COOH/NaOH, pH 5,5, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Protein mit einem NaCl-Gradienten (0 → 200 mM) eluiert. Die TPAP-Aktivität eluierte mit 30 mM NaCl. Fraktionen von der Säule wurden mittels SDS-PAGE und auf TPAP-Aktivität hin analysiert. Das SDS-PAGE-Gel zeigte, dass die TPAP-Aktivität enthaltenden Fraktionen zwei Hauptbanden enthielten: eine 65 kDa Bande (TPAP) und eine 30 kDa Bande. Die TPAP-Bande war diffus, wohingegen die 30 kDa Bande scharf war, darauf hinweisend, dass die TPAP glycosyliert ist, wohingegen die 30 kDa Bande es nicht ist.
Die TPAP-enthaltenden Fraktionen wurden mittels Ultrafiltration auf 1 ml konzentriert und auf eine 150 ml Sephacryl S100-Säule, äquilibriert in 20 mM Trisacetat, 100 mM NaCl, pH 5,5, aufgetragen. Mit einer Fließrate von 1,0 ml/min wurden die beiden Banden aufgetrennt. Die TPAP-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden als A. oryzae TPAP vereinigt.
Massenspektrometrie
Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie von TPAP aufgereinigt aus A. oryzae gab ein breites Signal, welches darauf hinwies, dass die TPAP glycosyliert ist. Die durchschnittliche Masse wurde als 55,0 kDa ermittelt.
pH-Profil von A. oryzae-TPAP
Die pH-Abhängigkeit der TPAP-Aktivität von A. oryzae wurde unter Verwendung des farbstoffbildenden Substrats Phe-Pro-Ala-pNA untersucht. Zu 50 μl des Enzyms wurden 150 μl Britton-Robinson-Puffer bei dem angegebenen pH vor Inkubation mit 50 μl Phe-Pro-Ala-pNA bei einer Substratendkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt. Die Tests wurden von einem UV- max-Kinetik-Mikrotiterplattenauslesegerät durchgeführt, und die Reaktion wurde für 3,5 Min. bei 405 nm verfolgt. Die relative Aktivität (RA) ist in der untenstehenden Tabelle 3 angegeben. Table 3

pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

RA 13 11 14 26 61 100 74 29 1 0 0
BEISPIEL 3
Peptidsequenzen von A. niger-TPAP
Die N-terminale Aminosäuresequenzierung von intakten A. niger-TPAP-Formen I und II (Beispiel 1) sowie von Peptiden abstammend von der TPAP-Form I wurde in einem Applied Biosystems 473A-Sequenzierer durchgeführt, der gemäß den Herstellerangaben betrieben wurde.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der intakten TPAP-Formen I und II wurden für 30 Reste bestimmt. Die zwei Sequenzen waren identisch und setzten sich wie folgt zusammen:
Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys-(SEQ ID NR. 4)
Die Sequenz zeigte keine Homologie zu anderen Proteinen.
Nach Denaturierung, Reduktion und S-Carboxymethylierung wurden Peptide von der TPAP-Form I mittels proteolytischer Spaltung unter Verwendung der Lysyl-spezifischen Protease aus Achromobacter erzeugt. Die resultierenden Peptide wurden fraktioniert und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC wieder aufgereinigt. Die Reinheit und die Masse der Peptide wurde durch Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie unter Verwendung eines „VG-Analytical TofSpecs" evaluiert, welches gemäß den Empfehlungen des Herstellers betrieben wurde. Die folgenden 7 Peptide wurden sequenziert.
Peptid 1:

Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys

Asn3 ist glycosyliert wie durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung gezeigt. Peptide 1 ist identisch zu den Aminosäureresten 1–17 der intakten TPAP und somit zu der Sequenz gezeigt in SEQ ID NR: 4.
Peptid 2:

Gln-Leu-Tyr-Asn-lle-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys

Peptid 2 ist identisch zu den Aminosäureresten 18–30 der intakten TPAP (und somit zu der Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NR: 4). Peptid 2 ist in 2 Formen wie durch Massensprektrometrie und Aminosäuresequenzierung aufgezeigt, wiedergewonnen. Eine Form mit einem N-terminalen Gln-Rest und eine Form wo dieser Gln-Rest in ein Pyroglutamatrest umgewandelt ist.
Peptid 3:

Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His-(SEQ ID NR. 5)

Peptid 4:

Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys (SEQ ID NR. 6)

Asn6 ist glycosyliert wie durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung gezeigt.
Peptid 5:

Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu-(SEQ ID NR. 7)

Es war nicht möglich zu unterscheiden, ob Asx15 ein Asp- oder ein Asn-Rest war.
Peptid 6:

Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro-(SEQ ID NR. 8)

Es war nicht möglich zu unterscheiden, ob Asx3 ein Asp- oder ein Asn-Rest war. Xaa1 wurde nicht identifiziert.
Peptid 7:

Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser-(SEQ ID NR. 9)

Es war nicht möglich zu unterscheiden, ob Asx4 ein Asp- oder Asn-Rest war. Es ist zu beachten, das Asn25 nicht glycosyliert ist, obwohl es in der Konsensussequenz für N-Glycosylierung gefunden wurde.
Peptidsequenzen von A. oryzae-TPAP
Die N-terminale Aminosäuresequenzierung von intakter TPAP sowie von TPAP-abstammenden Peptiden wurde in einem Applied Biosystems 473A-Proteinsequenzierer gemäß den Herstellerangaben ausgeführt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von intakter TPAP wurde nach SDS-PAGE und Elektroblotting auf eine PVDF-Membran mittels Standardvorgehensweisen bestimmt. Die folgenden 23 Reste der Aminosäuresequenz wurden gefunden:
Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-(SEQ ID NR. 14)
Diese Sequenz ist eindeutig homolog zu der N-terminalen Aminosäuresequenz von TPAP aus A. niger. Basierend auf dieser Homologie ist Xaa höchstwahrscheinlich ein glycosylierter Asn-Rest, während Yaa wahrscheinlich Cys-Reste darstellt.
Nach Denaturierung, Reduktion und S-Carboxymethylierung wurden Peptide von TPAP mittels proteolytischer Spaltung unter Verwendung der Lysyl-spezifischen Protease aus Achromobacter erzeugt. Die resultierenden Peptide wurden fraktioniert und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC wieder aufgereinigt. Die Reinheit und die Masse der Peptide wurde mittels Matrix-assistierter Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie unter Verwendung eines "VG-Analytical TofSpecs" evaluiert, welches gemäß den Empfehlungen des Herstellers betrieben wurde. Die folgenden 4 Peptide wurden sequenziert.
Peptid 8:

Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-Ser-Lys (SEQ ID NR: 10)

Dieses Peptid überlappt mit den letzten 6 Aminosäureresten, die durch die N-terminale Sequenzierung der intakten TPAP bestimmt wurden, wobei sie die N-terminale Sequenz um 34 Reste verlängern.
Peptid 9:

Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-Tyr-Leu-(SEQ ID NR: 11)

Dieses Peptid ist zu Peptid 3 aus A. niger TPAP homolog.
Peptid 10:

Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys (SEQ ID NR: 12)

Peptid 11:
Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Gly-Xaa-Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser-(SEQ ID NR: 13)
Xaa bezeichnet einen nicht identifizierten Rest.
BEISPIEL 4

Die Aminosäurezusammensetzungen von A. niger TPAP-Formen I und II wurden bestimmt. Duplikate von lyophilisierten Aliquots von TPAP-Formen I und II wurden in 6 N HCl enthaltend 0,1% Phenol bei 110°C im Vakuum für 16 Stunden hydrolysiert. Tryptophan wurde nach Hydrolyse in 3 M Methansulfonsäure bestimmt. Nach Hydrolyse wurden die Aminosäurezusammensetzungen unter Verwendung eines Applied Biosystems 420A Aminosäure-Analysesystems, betrieben gemäß den Herstellerangaben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die TPAP-Formen I und II innerhalb eines experimentellen Fehlers identische Aminosäurezusammensetzungen, wie nachstehend in Tabelle 4 gezeigt, besitzen. Tabelle 4 Aminosäurezusammensetzung von A. niger-TPAP-Formen I und II.

	TPAP I (Mol%)	TPAP II (Mol%)
Asx	13.1	13.4
Glx	8.2	7.9
Ser	10.5	10.7
Gly	13.7	13.1
His	0.5	0.5
Arg	3.1	3.1
Thr	5.7	5.6
Ala	8.0	7.9
Pro	7.2	7.3
Tyr	3.7	3.8
Val	6.0	5.9
Met	0.3	0.5
Cys	0.6	0.7
Ile	2.5	2.5
Leu	8.4	8.4
Phe	4.5	4.8
Lys	3.1	3.0
Trp	0.9	1.0

BEISPIEL 5
Die Monosaccharidzusammensetzungen von A. niger-TPAP-Formen I und II wurden bestimmt. Dublikate von lyophilisierten Aliquots von TPAP-Formen I und II wurden in 2 M TFA bei 100°C im Vakuum für 1 h, 2 h und 4 h hydrolysiert. Nach Hydrolyse wurden die Monosaccharidzusammensetzungen durch High-Performance-Ionen-Austauschchromatographie unter Verwendung einer CarboPac^TM PA1-Säule analysiert, die mit 16 mM NaOH eluiert wurde. Die Monosaccharide wurden mittels PAD-Aktivierung (pulsed amperometric detection) detektiert. Bedingt durch die unterschiedliche Stabilität und Freisetzung der Monosaccharide in 2 M TFA wurde die Menge an Galactose nach 1 h Hydrolyse bestimmt, die Menge an Mannose nach 2 h Hydrolyse und die Menge an Glucosamin nach 4 h Hydrolyse. Die erzielten Ergebnisse weisen auf sehr geringe Unterschiede im Mannose-Gehalt der TPAP-Formen I und II, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt, hin. Tabelle 5 Monosaccharidzusammensetzungen der TPAP-Formen I und II. Die Ergebnisse sind in pmol Monosaccharid/pmol Protein wie durch Aminosäureanalyse bestimmt angegeben.

TPAP-Form I (pmol/pmol) TPAP-Form II (pmol/pmol)

Glucosamin 4 4

Galactose 12 11

Mannose 52 47
BEISPIEL 6
SPALTUNG DURCH A. niger-TPAP
Die Fähigkeit von A. niger-TPAP, die AMG-G1 Form zu destabilisieren, wurde unter Verwendung von aufgereinigter AMG und TPAP (erhalten wie im Abschnitt "Material und Methoden" in Beispiel 1 beschrieben) bei TPAP/AMG-Verhältnissen untersucht, die zu denen in formulierten Erzeugnissen äquivalent sind. Die Aminosäuresequenzierung der destabilisierten Zubereitungen zeigte eine Modifikation in dem N-Terminus der katalytischen Domäne von AMG. Ein Tripeptid umfassend die ersten drei Aminosäurereste (Ala-Thr-Leu) wurde von der Peptidase abgespalten, was darauf hinweist, dass das Enzym eine Tripeptidyl-Aminopeptidase ist. Die Klassifizierung als eine Tripeptidyl-Aminopeptidase basierend auf der Spaltung von AMG sowie auf der des farbstoffgebenden Substrats Phe-Pro-Ala-pNA wurde des weiteren durch die Abwesenheit von Aktivität gegenüber dem anderen farbstoffgebenden Substrats Succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA unterstützt. In diesem Substrat wurde die freie Aminogruppe am N-Terminus succinyliert und dadurch wurde das Substrat bzgl. einer Spaltung durch TPAP unzugänglich gemacht. Die TPAP-Spaltung der AMG-Batchs war nach 3 Wochen Lagerung nicht vollständig, da eine Mischung von intakter und trunkierter AMG (AMG_trunc) durch Aminosäuresequenzierung ermittelt wurde.
Die Destabilisierung von AMG-G1, die mit unterschiedlichen Dosierungen von TPAP bei unterschiedlichen Temperaturen erhalten wurde, wurde untersucht. Eine TPAP-Dosierung von 3 bis 10 μg/ml ergab eine signifikante Destabilisierung von AMG und ebenso TPAP/AMG Verhältnisse, die zu denen gemessen in mehreren Fermentationen ähnlich waren. Der Destabilisierungseffekt war bei 37°C am meisten ausgeprägt, jedoch auch bei 25°C wurde ein deutlicher Effekt auf die Thermostabilität nach 27 Tagen Lagerung beobachtet. Eine Lagerung bei 4°C beeinträchtigte die Thermostabilität von AMG nicht.
BEISPIEL 7
Die Spezifität von A. niger TPAP wurde unter Verwendung von verschiedenen nativen Protein- und Peptidsubstraten untersucht. Unter Verwendung diese Substrate wurde gefunden, dass TPAP höchst unspezifisch bzgl. des Aminosäurerestes N-terminal zur Spaltstelle ist. TPAP ist sogar zur Spaltung nach Pro-Resten und CM-Cys-Resten in der Lage. Ein Pro-Rest C-terminal zur Spaltstelle jedoch verhindert die Spaltung durch TPAP vollständig. Spezifische Spaltprodukte, die erhalten wurden, indem native Proteine einer TPAP-Behandlung unterzogen wurden, schließen die Tripeptidsequenzen IPE, YVD, WRQ, KGA, LPS, ANL, NGT, LMQ, YFE, GPG, GGG, ADG, RST, SVE, KKP, EGV, NTG, AGD, RHN, LKT, VEK, KPE, GVN, TGA, GDR, HNL, HSQ, GTF, TSD, YSK, YLD, SRR, AQD, FVQ, WLM und ATL ein.
BEISPIEL 8
INHIBITION VON A. niger TPAP-AKTIVITÄT
Inhibition von TPAP durch den Proteaseinhibitor Chlormethylketon Ala-Ala-Phe-CMK (AAF-CMK) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen getestet. Es wurde gefunden, dass AAF-CMK TPAP vollständig inhibiert.
Zugabe von AAF-CMK zu Fermentationsmedien kann die TPAP-Aktivität vollständig inhibieren. Die Thermostabilität von 5 unterschiedlichen AMG-Batchs wurde mit und ohne anwesender TPAP-Aktivität untersucht. Die Thermostabilität von allen 5 AMG-Batchs war nach 2 Wochen Lagerung bei 37°C unverändert, wenn TPAP inhibiert wurde. Die entsprechenden Proben ohne Inhibitor waren alle deutlich destabilisiert.
BEISPIEL 9
Teile von 10 ml Kulturmedien, die durch eine Kultivierung eines AMG-erzeugenden A. niger-Stammes erhalten wurden, wurden auf einen pH von entweder 6,5 oder 7,0 mit Natriumhydroxid eingestellt. Die Proben wurden bei 25°C, 40°C bzw. 50°C für eine Stunde inkubiert, und anschließend wurden die Proben mit Essigsäure auf einen pH von 4,3 eingestellt. Die Lagerungsstabilität der behandelten Proben wurde gemessen. Es wurde gezeigt, dass dieser einfache Wiedergewinnungsprozess (basierend auf einer pH-Behandlung bei erhöhten Temperaturen) in einer effizienten Entfernung der TPAP-Aktivität resultierte (Tabelle 6).

Behandlung des Kultrumediums bei pH 6,5/40°C für eine Stunde reduzierte die TPAP-Aktivität auf 5% und ergab ein sehr stabiles Erzeugnis mit einer unveränderten Thermostabilität nach 2 Wochen Lagerung bei 40°C. Tabelle 6

pH/Temp. 1 Stunde	TPAP nach Behandlung	AMG nach Behandlung	T₃₀ Anfang	T₃₀ 2 Wochen	TPAP 2 Wochen
Referenz	100	100	50	31	80
6.5/25 C	90	100	46	43	42
6.5/40 C	5	97	47	53	< 1
6.5/50 C	< 1	90	-	-	-
7.0/25 C	86	99	48	44	< 1
7.0/40 C	< 1	92	48	55	< 1
7.0/50 C	< 1	85	-	-	-

Alle Zahlen in der Tabelle sind in % angegeben. Die für TPAP bzw. AMG aufgeführten Werte entsprechen der relativen Aktivität bei der angegebenen Zeit.
BEISPIEL 10
PCR-Klonierung
Ausgehend von der N-terminalen Aminosäuresequenz der A. niger TPAP, deren Sequenz in SEQ ID NR: 3 gezeigt ist, wurden 4 PCR-Primer konzipiert (Tabelle 7). Genomische DNA aus einem A. niger-Stamm wurde als Template in 4 PCR-Reaktionen verwendet. PCR-Fragmente in der erwarteten Größe von 65 bp wurden aufgereinigt und in das Plasmid pCR^TMII (Invitrogen Corporation) kloniert. Sequenzierung des Inserts aus 3 Klonen zeigte, dass 2 von diesen die degenerierte Sequenz in den den Primern entsprechenden Bereichen enthält, während die dazwischen liegende Sequenz bzgl. der N-terminalen Aminosäuresequenz invariant war.
Um ein größeres DNA-Fragment zu klonieren, welches die Tripeptidyl-Aminopeptidase kodiert, wurde der Primer #6010 (GCACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTG) entsprechend der invarianten Sequenz hergestellt. Ausgehend von zwei anderen Peptidsequenzen wurden drei PCR-Primer konzipiert (Tabelle 7). Drei PCR-Reaktionen (#6010/#5988, #6010/#5989 und #6010/#5990) wurden unter Verwendung von genomischer A. niger-DNA als Template durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei den zwei Annealing-Temperaturen von 42°C und 45°C durchgeführt. Reaktionen #6010/#5989 (ein Fragment von etwa 80 bp) und #6010/#5990 (drei Fragmente von etwa 120 bp, 500 bp und 950 bp) zeigen das gleiche Bandenmuster auf einem Agarosegel bei den zwei unterschiedlichen Temperaturen. In Reaktion #6010/#5988 wurde ein Fragment von ungefähr 120 bp bei 42°C gesehen, bei 45°C jedoch wurde ein Fragment von ungefähr 950 bp gesehen. Das 950 bp-Fragment erwies sich als das richtige und wurde in den pCR II AT-Vektor insertiert. Ein E. coli-Stamm, der das 950 kb-Fragment enthielt, wurde bei der Deutschen Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 5. Dezember 1994 als DSM 9570 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt. Tabelle 7 Oligonukleotidprimer
Das 950 bp-Fragment wurde von beiden Enden sequenziert. Es wurde gefunden, dass dieses Fragment den N-terminalen Teil von TPAP kodiert. Die partielle Sequenz des N-terminalen Teils ist in SEQ ID NR: 2 gezeigt, die partielle Sequenz, die vom Sequenzieren des anderen Endes erhalten wurde, ist in SEQ ID NR: 3 gezeigt. Die Sequenz des gesamten "950 Basenfragments", von dem gefunden wurde, dass es durch 908 bp konstituiert wird, ist in SEQ ID NR: 1 gezeigt.
Southern-Analyse
Genomische DNA aus einem A. niger-Stamm und aus A. oryzae IFO 4177 wurde wie bereits zuvor beschrieben isoliert (Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1470–1474). Die genomische DNA wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf einem 0,7% Agarosegel fraktioniert und auf Immobilon^TM-N wie vom Hersteller beschrieben geblottet. Die Membranen wurden auf die Gegenwart der 950 bp TPAP-Gensequenz, markiert mit alpha-32^p dATP (NewEngland) durch Random Priming gemäß des durch Feinberg et al., 1983, Anal. Biochem. 132:6 beschriebenen Verfahrens, hin mit Sonden untersucht. Die Membranen wurden dann für 2 Stunden bei 65°C in Hybridisierungslösung (5×SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat), 10×Denhardt (0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Rinderserum-Albumin), 10 mM EDTA, 1% SDS, 150 μg/ml Poly A, 50 μg/ml Hefe-RNA) inkubiert. Als nächstes wurde die radioaktiv markierte Sonde hinzugegeben und bei 65°C über Nacht unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Membranen wurden zwei Mal bei 30°C für 15 min in 2×SSC, 1% SDS gewaschen. Schließlich wurden die Membranen getrocknet, mit Plastikfolie abgedeckt und gegenüber einem Röntgenfilm (Fuli-RX) bei –70°C exponiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Stämme nur ein TPAP-kodierendes Gen enthalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Reduzierung oder Eliminierung der Tripeptidyl-Aminopeptidase-(TPAP)-Erzeugung aus einer TPAP-produzierenden Zelle der Gattung Aspergillus, wobei in dem Verfahren eine in besagter Zelle vorhandene DNA-Sequenz, die TPAP oder ein für das Aufweisen der TPAP-Aktivität essentiellen Teil davon oder die TPAP-Promotorsequenz kodiert, die für die Expression von TPAP von einer TPAP-kodierenden DNA-Sequenz benötigt wird, modifiziert oder inaktiviert wird, so dass dies in einer reduzierten oder in keiner TPAP-Erzeugung in besagter Zelle resultiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Modifizierung oder Inaktivierung der DNA-Sequenz erzielt wird, indem die TPAP-produzierende Zelle einer Mutagenese unterzogen wird, und durch Selektieren auf Zellen, in denen die TPAP-produzierende Fähigkeit reduziert oder entfernt wurde.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Mutagenese durch zufallsbedingte oder stellenspezifische Mutagenese durchgeführt wird.
Verfahren zur Reduzierung oder Eliminierung der TPAP-Erzeugung aus einer TPAP-produzierenden Zelle der Gattung Aspergillus, wobei in dem Verfahren eine Nukleotidsequenz, komplementär zur TPAP-kodierenden Sequenz und somit in der Lage, mit in der Zelle produzierten TPAP mRNA zu hybridisieren, in die Zelle in solch einer Art und Weise eingefügt wird, dass die Nukleotidsequenz in der Zelle unter Bedingungen transkribiert werden kann, die es der Nukleotidsequenz erlauben, mit TPAP mRNA zu hybridisieren und somit die Menge der von besagter mRNA translatierten TPAP zu reduzieren oder jedwede Translation zu eliminieren.
Wirtzelle hergestellt gemäß den Ansprüchen 1–4.
Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, worin mindestens 60% der TPAP-Aktivität entfernt sind, wobei das Verfahren das Transformieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 5 mit einer das Erzeugnis kodierenden DNA-Sequenz, das Kultivieren der transformierten Zelle unter zur Expression des Erzeugnisses geeigneten Bedingungen, und das Wiedergewinnen des Erzeugnisses aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, worin mindestens 60% der TPAP-Aktivität entfernt sind, wobei das Erzeugnis durch eine in der TPAP-exprimierenden Zelle vorhandene DNA-Sequenz kodiert wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Modifizieren oder Inaktivieren einer DNA-Sequenz, die in besagter Zelle vorhandenen ist und TPAP oder ein für das Aufweisen der TPAP-Aktivität essentiellen Teil davon oder den TPAP-Promotor kodiert, der für die Expression von TPAP von einer TPAP-kodierenden DNA-Sequenz benötigt wird, gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, und das anschließende Kultivieren der Zelle unter zur Expression des Erzeugnisses geeigneten Bedingungen und das Wiedergewinnen des Erzeugnisses aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, worin mindestens 60% der TPAP-Aktivität durch Fermentierung einer TPAP-produzierenden Zelle der Gattung Aspergillus, welche ebenfalls das Erzeugnis herstellt, entfernt sind, wobei das Verfahren die Zugabe einer wirksamen Menge von Ala-Ala-Phe-Chlormethylketon, entweder während oder nachdem die Fermentierung beendet wurde, zum Fermentationsmedium, das Wiedergewinnen des gewünschten Erzeugnisses aus dem Fermentationsmedium, und wahlweise das Unterziehen des wiedergewonnenen Erzeugnisses einer weiteren Aufreinigung umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, worin mindestens 60% der TPAP-Aktivität durch Fermentierung einer TPAP-produzierenden Zelle der Gattung Aspergillus, welche ebenfalls das Erzeugnis herstellt, entfernt sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Unterziehen des Fermentationsmediums oder einer daraus isolierten, TPAP und das gewünschte Erzeugnis enthaltenen Enzympräparation einer kombinierten pH- und Temperatur-Behandlung für eine zur Reduktion der TPAP-Aktivität ausreichende Zeitdauer, und wahlweise das Wiedergewinnen des Erzeugnisses aus dem behandelten Medium.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die TPAP-reduzierende Behandlung bei einem pH im Bereich von 6.5–7 und bei einer Temperatur im Bereich von 25–40°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6–10, bei dem das Erzeugnis ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Erzeugnis ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem amylolytischen Enzym, einem lipolytischem Enzym, einem proteolytischem Enzym, einem zellulytischem Enzym, einer Oxidoreduktase, und einem Pflanzenzellwand-abbauendem Enzym.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Erzeugnis eine AMG, Lipase, Kutinase, Zellulase, Amylase, Protease, Peroxidase, Transglutaminase, Laccase, Katalase, Glukose-Oxidase oder Phytase ist.