DE69833784T2

DE69833784T2 - Polypeptide mit aminopeptidase-aktivität und für diese codierende nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69833784T2
Application number: DE69833784T
Authority: DE
Inventors: Alexander Davis BLINKOVSKY; S. Tony Davis BYUN; V. Alan Dixon KLOTZ; Alan Davis SLOMA; Kimberly Elk Grove BROWN; Maria Fairfield TANG; Miko Fujii; Chigusa Marumoto; Venke Lene KOFOD
Original assignee: Novozymes AS; Japan Tobacco Inc; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Japan Tobacco Inc; Novozymes Inc
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2018-11-14
Also published as: AU755387B2; DE69833784D1; US6673571B2; BR9813608B1; CA2315274A1; US20020177210A1; ATE319818T1; AU1332899A; KR20010033182A; WO1999031226A1; US6303360B1; JP2003525573A; KR20050046012A; EP1042457A1; BR9813608A; EP1042457B1; JP3979622B2; US6184020B1; CA2315274C; CN1282369A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität und die isolierten Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Beschreibung der verwandten Technik
Verschiedene Lebensmittelprodukte, z.B. Suppen, Soßen und Gewürze, enthalten Aromastoffe, die durch Hydrolyse von proteinartigen Materialien erhalten werden. Diese Hydrolyse wird zweckmäßigerweise unter Verwendung von starker Chlorwasserstoffsäure und anschließende Neutralisation mit Natriumhydroxid erreicht. Allerdings führt eine solche chemische Hydrolyse zu einem schwerwiegenden Abbau der während der Hydrolyse erhaltenen Aminosäuren sowie zu gesundheitsschädlichen Nebenprodukten, die im Laufe dieser chemischen Reaktion gebildet werden. Die zunehmende Besorgnis hinsichtlich der Verwendung von Aromastoffen, die durch chemische Hydrolyse erhalten werden, hat zur Entwicklung von enzymatischen Hydrolyseverfahren geführt.
Die enzymatische Hydrolyse von proteinartigen Materialien hat das Ziel, einen hohen Hydrolysegrad (DH) zu erhalten, und dies wird im Allgemeinen unter Verwendung eines Komplexes von unspezifisch wirkenden proteolytischen Enzymen (das heißt unspezifisch wirkende Endo- und Exopeptidasen) erreicht. Beispielsweise beschreibt WO 94/25580 ein Verfahren zur Hydrolyse von Proteinen durch die Verwendung einer unspezifisch wirkenden Enzympräparation, die aus Aspergillus oryzae erhalten wurde. Spezifisch wirkende proteolytische En zyme wurden bisher für diesen Zweck noch nicht verwendet, da solche Enzyme nur zu einem unzureichenden Hydrolysegrad führen.
Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität katalysieren die Abspaltung von einer oder mehreren Aminosäureresten vom N-Terminus von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen. Solche Polypeptidasen werden unter der Enzyme Classification Number E.C. 3.4.11. – von der International Union of Biochemistry and Molecular Biology klassifiziert.
WO 96/28542 offenbart eine Aminopeptidase, die ein Molekulargewicht von 35 kDa aufweist. JP-7-5034631 (Noda) offenbart eine Leucin-Aminopeptidase, die aus gelbem Koji-Schimmel erhalten wird, welcher Aspergillus oryzae einschließt. JP-7-4021798 (Zaidan Hojin Noda Sangyo) offenbart die Herstellung von Miso durch Zugabe einer Leucin-Aminopeptidase II, die durch Kultivieren einer Anzahl von Stämmen hergestellt wird, einschließlich des Aspergillus oryzae-Stamms 460 (ATCC 20386) und des Stamms IAM 2616. Der Aspergillus oryzae-Stamm 460 produziert bekanntlich eine Anzahl von Leucin-Aminopeptidasen, wovon drei, gemäß Gelfiltration, ein Molekulargewicht von 26,5, 56 und 61 kDa aufweisen (Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 757–765; Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 767–774; bzw. Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 775–782). Penicillium citrium produziert eine intrazelluläre Leucin-Aminopeptidase mit einem Molekulargewicht von 65 kDa gemäß SDS-PAGE (Kwon et al., 1996, Journal of Industrial Microbiology 17: 30–35).
WO 97/04108 (Roehm) offenbart DNA, die eine Aspergillus sojae-Leucin-Aminopeptidase codiert. Chang und Smith (1989, Journal of Biological Chemistry 264: 6979–6983) offenbaren die molekulare Klonierung und Sequenzierung eines Gens, das eine vakuoläre Aminopeptidase aus Saccharomyces cerevisiae codiert. Chang et al. (1992, Journal of Biological Chemistry 267: 8007–8011) offenbaren die molekulare Klonierung und Sequenzierung eines Gens, das eine Methionin-Aminopeptidase aus Saccharomycse cerevisiae codiert.
Die Herstellung von Proteinhydrolysaten mit wünschenswerten organoleptischen Eigenschaften und einem hohen Hydrolysegrad erfordert im Allgemeinen die Verwendung eines Gemisches von Peptidaseaktivitäten. Es wäre wünschenswert ein Einzelkomponenten-Peptidaseenzym bereitzustellen, welche Aktivität aufweist, die zur Verbesserung der organoleptischen Eigenschaften und des Hydrolysegrades von Proteinhydrolysaten, die in Lebensmittelprodukten entweder allein oder in Kombination mit anderen Enzymen verwendet werden, geeignet ist.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung verbesserter Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität und der Nukleinsäure, die die Polypeptide codiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 70 % Identität mit den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2;
(b) einem Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen mit (i) der Nukleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1 oder (ii) ihrem komplementären Strang oder einer Untersequenz davon von mindestens 100 Nukleotiden hybridisiert;
(c) einem Fragment von (a) oder (b), wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität besitzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase gegenüber dem pH-Wert, gemessen bei Raumtemperatur unter Verwendung einer 100 mg/ml Lösung von Ala-pNA in DMSO.
2 zeigt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase gegenüber der Temperatur in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5.
3 zeigt die Aktivität einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase gegenüber der Temperatur in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5.
4 zeigt die Auswirkung des DH bei Zugabe eines Sphingomonas capsulata-Rohenzymextrakts und einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase bei niedriger bzw. hoher Flavourzyme^TM-Hintergrunddosis.
5 zeigt die Auswirkung des DH bei Zugabe eines Sphingomonas capsulata-Rohenzymextrakts und einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase zu einer geringen bzw. hohen Flavourzyme^TM-Hintergrunddosis.
6 zeigt den durch verschiedene Kombinationen von Flavourzyme^TM, Alcalase^® und einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase erhaltenen DH.
7 zeigt den durch verschiedene Kombinationen von Flavourzyme^TM, Alcalase^® und einer Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase erhaltenen DH.
8 zeigt eine Restriktionskarte von pSJ1678.
9 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Sphingomonas capsulata-IFO 12533-Aminopeptidase (SEQ-ID. Nrn. 1 bzw. 2).
10 zeigt eine Restriktionskarte von pMRT014-1.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität
Der Begriff "Aminopeptidase-Aktivität" ist hier als Peptidase-Aktivität definiert, die die Abspaltung von Aminosäuren von dem N-terminalen Ende von Peptiden, Oligopeptiden oder Proteinen katalysiert. Allgemein definiert, vermag die Aminopeptidaseaktivität die Aminosäure X vom N-Terminus eines Peptids, Polypeptids oder Proteins, wobei X einen beliebigen Aminosäurerest darstellen kann, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val, aber zumindest Ala, Gly, Leu, Glu, Asp, Lys, Ile und/oder Val, abzuspalten. Es ist selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen isolierten Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität im Hinblick auf die abzuspaltende Aminosäuresequenz des Peptids, Polypeptids oder Proteins unspezifisch sein können. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Aminopeptidaseaktivität durch Messen der Ausgangsgeschwindigkeit der Hydrolyse des p-Nitroanilids von Alanin bei 405 nm gemessen.
Bei einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die einen Identitätsgrad mit den Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2 (das heißt das reife Polypeptid) von mindestens 70 %, stärker bevorzugt von mindestens 80 %, noch stärker bevorzugt von mindestens 90 %, am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 95 % und besonders bevorzugt von mindestens etwa 97 %, aufweist, die Aminopeptidaseaktivität aufweisen (im Folgenden "homologe Polypeptide"). Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die sich um 5 Aminosäuren, vorzugsweise um 4 Aminosäuren, stärker bevorzugt um 3 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt um 2 Aminosäuren und am stärksten bevorzugt um 1 Aminosäure, von der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist der Identitätsgrad zwischen 2 oder mehreren Aminosäuresequenzen durch das Protein-Datenbasis-Suchprogramm BLAST 2.0 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) mit den folgenden Argumenten bestimmt: blastall -p blastp -a 4 -e 10 -E 0 -v 500 -b250 -I [query-file] -d prot_all, wobei -p den Programmnamen bestimmt, -a sich auf die Anzahl der zu verwendenden Prozessoren bezieht, -e sich auf den Erwartungswert bezieht, -E sich auf die Kosten zur Ausdehnung eines Spaltes bezieht, -v sich auf die Anzahl von Online-Beschreibungen bezieht, -b sich auf die Anzahl von Alignments, die sich zeigen, bezieht, -I sich auf die Suchdatei bezieht und -d sich auf die für die Suche verwendete Datenbasis bezieht.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide die Aminosäuresequenz SEQ-ID. Nr. 2 oder eine allelische Variante davon; oder ein Fragment davon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität aufweist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide die Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2, die das reife Polypeptid der SEQ-ID. Nr. 2 ist, oder eine allelische Variante davon; oder ein Fragment davon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2 oder aus einer allelischen Variante davon; oder aus einem Fragment davon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2 oder aus einer allelischen Variante davon; oder aus einem Fragment davon, wobei das Fragment Aminopeptidaseaktivität aufweist. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ-ID. Nr. 2.
Ein Fragment der SEQ-ID. Nr. 2 ist ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren aus dem Amino- und/oder Carboxylterminus dieser Aminosäuresequenz deletiert wurden. Vorzugsweise enthält ein Fragment mindestens 524 Aminosäurereste, stärker bevorzugt mindestens 574 Aminosäurereste und am stärksten bevorzugt mindestens 624 Aminosäurereste.
Eine allelische Variante bezeichnet eine von zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, die auf demselben Chromsomenlocus liegen. Eine allelische Variation entsteht auf natürliche Weise durch Mutation und kann zu Polymorphismus innerhalb der Populationen führen. Genmutationen können still sein (keine Änderung in dem codierten Polypeptid) oder können Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen codieren. Eine allelische Variante eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das von einer allelischen Variante eines Gens codiert wird.
Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2 oder dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten und/oder durch die Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten durch verschiedene Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise sind Aminosäureänderungen von geringfügiger Natur, das heißt konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung und/oder Aktivität des Proteins nicht nennenswert beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von 1 bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest; ein kleines Linker-Polypeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten; oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Änderung der Nettoladung oder eine andere Funktion, wie Polyhistidintrakt, ein antigenisches Epitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtert.
Beispiele für konservative Substitutionen liegen innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und kleinen Aminosäuren (Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäuresubstitutionen, die im Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht verändern, sind aus der Technik bekannt und werden beispielsweise von H. Neurath und R.L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York, beschrieben. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Ile, Ala/Glu und Asp/Gly sowie umgekehrt.
Bei einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit Aminopeptidaseaktivität, die von Nukleinsäuresequenzen codiert werden, die unter hohen und vorzugsweise sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter den gleichen Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 1 oder mit ihrem komplementären Strang oder mit einer Untersequenz davon, die ein Polypeptidfragment codiert, das Aminopeptidaseaktivität aufweist (J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York) oder mit allelischen Varianten und Fragmenten der Polypeptide, wobei die Fragmente Aminopeptidaseaktivität aufweisen, hybridisieren.
Die Nukleinsäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 1 oder eine Untersequenz davon sowie die Aminosäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 2 oder ein Fragment davon können zur Konstruktion einer Nukleinsäuresonde zur Identifizierung und Klonierung von DNA-codierenden Polypeptiden mit Aminopeptidaseaktivität aus Stämmen verschiedener Gattungen oder Spezies nach aus der Technik gut bekannten Verfahren verwendet werden. Insbesondere können solche Sonden zur Hybridisierung mit der genomischen oder cDNA der Gattung oder Spezies von Interesse unter Befolgung der Southern-Blot-Sandardverfahren verwendet werden, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können beträchtlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollten allerdings mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden werden typischerweise zum Nachweis des entsprechenden Gens markiert (beispielsweise mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin oder Avidin). Solche Sonden sind in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
Somit kann eine DNA- oder cDNA-Genbank, die aus solchen anderen Organismen hergestellt wird, auf DNA gescreent werden, die mit den vorstehend beschriebenen Sonden hybridisiert, und die ein Polypeptid mit Aminopeptidaseaktivität codiert. Genomische oder andere DNA aus solchen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder andere Trenntechniken getrennt werden. DNA aus den Genbanken oder die abgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder auf ein anderes geeignetes Trägermaterial transferiert und immobilisiert werden. Zur Identifizierung eines Klons oder einer DNA, die mit der SEQ-ID. Nr. 1 homolog ist, wird das Trägermaterial in einem Southern-Blot verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet Hybridisierung, dass die Nukleinsäuresequenz unter niedrigen bis sehr hohen Stringenzbedingungen an eine Nukleinsäuresonde, entsprechend der Nukleinsäuresequenz, die in SEQ-ID. Nr. 1 gezeigt wird, ihren komplementären Strang oder an eine Untersequenz davon hybridisiert. Moleküle, an die die Nukleinsäuresonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der SEQ-ID. Nr. 2 codiert, oder eine Untersequenz davon. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die SEQ-ID. Nr. 1. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die Nukleinsäuresonde aus den Nukleotiden 670 bis 2592 der SEQ-ID. Nr. 1, die ein reifes Polypeptid mit Aminopeptidaseaktivität codiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenz, die in Plasmid pMRT004.1-14 enthalten ist, das in Escherichia coli NRRL B-30032 enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequenz das Polypeptid der SEQ-ID. Nr. 2 codiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenz, die das reife Polypeptid der SEQ-ID. Nr. 2 codiert (das heißt die Ami nosäuren 33 bis 674), die in Plasmid pMRT004.1-14 enthalten sind, das in Escherichia coli NRRL NRRL B-30032 enthalten ist.
Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden sind niedrige bis sehr hohe Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 μg/ml gespaltener und denaturierter Lachssperma-DNA und entweder 25, 35 bzw. 50 % Formamid für eine niedrige, mittlere und hohe bzw. sehr hohe Stringenz, gefolgt von Southern-Blot-Standardverfahren.
Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden wird das Trägermaterial schließlich dreimal 15 min unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2 % SDS, vorzugsweise mindestens bei 45 °C (sehr niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 50 °C (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 55 °C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 60 °C (mittlere bis hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65 °C (hohe Stringenz) und am stärksten bevorzugt bei mindestens 70 °C (sehr hohe Stringenz), gewaschen.
Für kurze Sonden, die etwa 15 bis etwa 70 Nukleotide lang sind, sind die Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung, Hybridisierung und Waschen nach Hybridisierung bei 5 °C bis 10 °C unter der berechneten T_m unter Verwendung der Berechnung nach Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0.5 % NP-40, 1X Denhardt-Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM einbasiges Natriumphosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml und anschließende Southern-Blot-Standardverfahren.
Für kurze Sonden, die etwa 15 bis etwa 70 Nukleotide lang sind, wird das Trägermaterial einmal 15 Minuten in 6X SCC plus 0,1 % SDS und jeweils zweimal für 15 Minuten unter Verwendung von 6X SSC bei 5 °C bis 10 °C unter der berechneten T_m gewaschen.
Bei einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (a) Aminopeptidaseaktivität im pH-Bereich zwischen pH 5,0 bis 8,5, gemessen bei 37 °C, (b) isoelektrischer Punkt (pI) im Bereich von 7,4 bis 8,5; (c) Aminopeptidaseaktivität im Temperaturbereich von 20 bis 55 °C, gemessen bei pH 7,5 unter Verwendung von Gly-pNA in Tris-HCl-Puffer; (d) hydrolysiert Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA und Val-pNA; (e) hydrolysiert nicht Phe-pNA oder Pro-pNA; (f) wird nicht durch Phenylmethansulfonylfluorid gehemmt, wird leicht gehemmt durch EDTA, Diisopropylfluorphosphat, p-Chlormercuribenzoesäure und Iodessigsäure, wird vollständig gehemmt durch o-Phenanthrolin und/oder (g) wird aus einem Stamm erhalten, der Sphingomonas angehört, und besitzt eine Molekülmasse von 67 ± 5 kDa.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid Aminopeptidaseaktivität im pH-Bereich zwischen pH 5,0 bis 8,5, gemessen bei 37 °C, stärker bevorzugt im pH-Bereich von 6,5 bis 8,0 und noch stärker bevorzugt mit der höchsten Aminopeptidaseaktivität im pH-Bereich von 7,0 bis 7,5, gemessen bei 37 °C.
Der isoelektrische Punkt der Aminopeptidase ist variabel, da der isoelektrische Punkt des frisch hergestellten Enzyms unter Verwendung einer Aktivitätsanfärbemethode auf 8,4 geschätzt wird, allerdings variiert der isoelektrische Punkt von 7,4 bis 8,5 während der Reinigung und/oder der Aufbewahrung. Die Unsicherheit des isoelektrischen Punktes kann auf dem Selbstabbau der Aminopeptidase von seinem Aminoende aus beruhen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine Molekülmasse von 67 ± 5 kDa, stärker bevorzugt eine Molekülmasse von 67 ± 2 kDa, und wird aus einem Stamm erhalten, der Sphingomonas, stärker bevorzugt Sphingomonas capsulata und besonders bevorzugt Sphingomonas capsulata IFO 12533, angehört. Die Molekülmasse wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorse (SDS-PAGE) unter Verwendung eines 10- bis 15 %igen Gradientengels auf einem Gerät von FAST System von Pharmacia (Uppsala, Schweden) ge messen. Die Molekülmasse des Enzyms wurde aus der Regressionsgeraden der Molekulargewichtsmarker wie folgt abgeschätzt: Phosphorylase b (94 kDa), Albumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carbonanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,4 kDa).
Bei einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit immunchemischer Identität oder einer teilweisen immunchemischen Identität mit dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 2. Die immunchemischen Eigenschaften werden durch immunologische Kreuzreaktionsidentitätstests durch das gut bekannte Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren bestimmt. Insbesondere wird ein Antiserum, das polyklonale Antikörper enthält, die immunreaktiv sind oder an Epitope des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 2 binden, durch Immunisierung von Kaninchen (oder anderen Nagern) nach der von Harboe und Ingild, in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere Seiten 27–31) beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Ein Polypeptid mit immunchemischer Identität ist ein Polypeptid, das unter Anwendung einer speziellen immunchemischen Technik, wie Gesamtfusion von Präzipitaten, identische Präzipitatmorphologie und/oder identische elektrophoretische Mobilität, mit dem Antiserum auf identische Weise reagiert. Eine weitere Erklärung für die immunchemische Identität wird von Axelsen, Bock und Krøll, in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 10, beschrieben. Ein Polypeptid mit einer teilweisen immunchemischen Identität ist ein Polypeptid, das unter Anwendung einer speziellen immunchemischen Technik mit dem Antiserum zum Teil identisch reagiert, wie eine teilweise Fusion von Präzipitaten, zum Teil identische Präzipitatmorphologie und/oder zum Teil identische elektrophoretische Mobilität. Eine weitere Erklärung für die teilweise immunchemische Identität ist von Bock und Axelsen, in N.H. Axelsen, J. Krøll und B. Weeks, Hrsg., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 11, beschrieben.
Der Antikörper kann auch ein monoklonaler Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können hergestellt und verwendet werden, z.B. nach den Verfahren von E. Harlow und D. Lane, Hrsg., 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide weisen mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 40 %, stärker bevorzugt mindestens 60 %, noch stärker bevorzugt mindestens 80 % und noch stärker bevorzugt mindestens 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens 100 % der Aminopeptidaseaktivität der SEQ-ID. Nr. 2 auf.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann aus Mikroorganismen jeder beliebigen Gattung erhalten werden. Beispielsweise kann das Polypeptid ein grampositives bakterielles Polypeptid sein, wie ein Bacillus-Polypeptid, z.B. ein Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus brevis-, Bacillus circulans-, Bacillus coagulans-, Bacillus lautus-, Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus megaterium-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus subtilis- oder Bacillus thuringiensis-Polypeptid; oder ein Streptomyces-Polypeptid, z.B. ein Streptomyces lividans- oder Streptomyces murinus-Polypeptid; oder ein gramnegatives bakterielles Polypeptid, z.B. ein E. coli- oder ein Pseudomonas sp.-Polypeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Sphingomonas-Polypeptid, wie ein Sphingomonas adhaesiva-, Sphingomonas capsulata-, Sphingomonas parapaucimobilis-, Sphingomonas paucimobilis- oder Sphingomonas yanoikuyae-Polypeptid.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Sphingomonas capsulata-Polypeptid ein Sphingomonas capsulata IFO 12533 Polypeptid, z.B. das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2.
Selbstverständlich umfasst die Erfindung für die zuvor genannten Spezies andere taxonomische Äquivalente ohne Rücksicht auf den Speziesnamen, unter dem sie bekannt sind. Die Fachleute erkennen leicht die Identität entsprechender Äquivalente. Beispielsweise ist Sphingomonas capsulata auch als Flavobacterium capsulatum bekannt, Sphingomonas paucimobilis als Flavobacterium devorans und Pseudomonas paucimobili, und Sphingomonas sp. als Chromobacterium lividum bekannt. Siehe Yabuuchi et al., 1990, Microbiol. Immunol. 34: 99–119, bezüglich der Diskussion der Taxonomie von Sphingomonas.
Stämme dieser Spezies sind für die Öffentlichkeit aus einer Anzahl von Kultursammlungen, wie American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) leicht zugänglich.
Außerdem können solche Polypeptide aus anderen Quellen identifiziert und erhalten werden, einschließlich Mikroorganismen, die aus der Natur (z.B. Boden, Kompost, Wasser, etc.) unter Anwendung der oben erwähnten Sonden isoliert wurden. Die Verfahren zur Isolierung von Mikroorganismen aus natürlichen Lebensräumen sind aus der Technik gut bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann anschließend durch Screening der genomischen oder cDNA-Genbank anderer Mikroorganismen in gleicher Weise abgeleitet werden. Nachdem eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen wurde(n), kann die Sequenz unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, isoliert oder kloniert werden (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wie hier definiert, ist ein "isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen Nicht-Aminopeptidasepolypeptiden ist, z.B. mindestens etwa 20 % rein, vorzugsweise mindestens etwa 40 % rein, stärker bevorzugt etwa 60 % rein, noch stärker bevorzugt etwa 80 % rein, am stärksten bevorzugt etwa 90 % rein und am stärksten bevorzugt etwa 95 % rein, wie bestimmt durch SDS-PAGE.
Polypeptide, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen codiert werden, umfassen auch fusionierte Polypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide, in denen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder eines Fragments davon kondensiert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Kondensieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die ein anderes Polypeptid codiert, an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (oder einen Teil davon) hergestellt. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind aus der Technik bekannt und umfassen die Ligation der codierenden Sequenzen, die die Polypeptide codieren, so dass sie im Raster sind und dass die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle des (der) gleichen Promotor(en) und der gleichen Terminationssequenz ist.
Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz in SEQ-ID. Nr. 1 erläutert. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die in Plasmid pMRT004.1-14 enthalten ist, das in Escherichia coli NRRL B-30032 enthalten ist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die das reife Polypeptid von SEQ-ID. Nr. 2 (das heißt Aminosäuren 33 bis 674) codiert, die in Plasmid pMRT004.1-14 enthalten sind, das in Escherichia coli NRRL B-30032 enthalten ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die Nukleinsäuresequenz aus den Nukleotiden 670 bis 2592 von SEQ-ID. Nr. 1, die ein reifes Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 2 oder das reife Polypeptid davon codieren, das sich von der SEQ-ID. Nr. 1 aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Untersequenzen von SEQ-ID. Nr. 1, die Fragmente von SEQ-ID. Nr. 2 codieren, die Phospholipase-Aktivität aufweisen.
Eine Untersequenz der SEQ-ID. Nr. 1 ist eine Nukleinsäuresequenz, die in der SEQ-ID. Nr. 1 eingeschlossen ist, mit der Ausnahme, dass eines oder mehrere Nukleotide aus dem 5'- und/oder 3'-Ende deletiert worden sind. Vorzugsweise enthält eine Untersequenz mindestens 1572 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 1722 Nukleotide und am stärksten bevorzugt mindestens 1872 Nukleotide.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch mutierte Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eine Mutation in der reifen Polypeptid-codierenden Region der SEQ-ID. Nr. 1 umfassen, in der die mutierte Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2 besteht.
Die zur Isolierung oder Klonierung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, angewandten Techniken sind aus der Technik bekannt und umfassen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine Kombination davon. Das Klonieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz aus einer solchen genomischen cDNA kann durchgeführt werden, z.B. unter Anwendung der gut bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder des Antikörperscreenings von Expressionsbibliotheken zum Nachweis klonierter DNA-Fragmente, denen Strukturmerkmale gemeinsam sind. Siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods und Application, Academic Press, New York. Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, wie Ligasekettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), können eingesetzt werden. Die Nukleinsäuresequenz kann aus einem Stamm von Sphingomonas oder einem anderen oder verwandten Organismus kloniert werden, und somit kann sie beispielsweise ein Allel oder eine Speziesvariante der Polypeptid-codierenden Region der Nukleinsäuresequenz sein.
Der Begriff "isolierte Nukleinsäuresequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuresequenzen, z.B. mindestens etwa 20 % rein, vorzugsweise mindestens etwa 40 % rein, stärker bevorzugt min destens etwa 60 % rein, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % rein und besonders bevorzugt mindestens etwa 90 % rein, wie durch Agaroseelektrophorese bestimmt. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch Standard-Klonierungsverfahren erhalten werden, die in der Gentechnik zur Relokation der Nukleinsäuresequenz aus ihrer natürlichen Lokation an eine andere Stelle, wo sie reproduziert wird, angewandt werden. Die Klonierungsverfahren können das Ausschneiden und die Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments, das die Nukleinsäuresequenz umfasst, die das Polypeptid codiert, die Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und Einschleusung des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo multiple Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden, umfassen. Die Nukleinsäuresequenz kann genomischen Ursprungs sein, aus cDNA, RNA stammen, halbsynthetischen Ursprungs oder eine beliebige Kombinationen davon sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die einen Homologiegrad mit der reifen Polypeptid-codierenden Sequenz der SEQ-ID. Nr. 1 (das heißt Nukleotide 670 bis 2592) von mindestens 50 %, vorzugsweise etwa 55 %, vorzugsweise etwa 60 %, vorzugsweise etwa 65 %, vorzugsweise etwa 70 %, vorzugsweise etwa 80 %, stärker bevorzugt etwa 90 %, noch stärker bevorzugt etwa 95 % und am stärksten bevorzugt etwa 97 % Homologie aufweisen, die ein aktives Polypeptid codieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Homologiegrad zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen durch das Wilbur-Lipman-Verfahren (Wilbur und Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726–730) unter Verwendung der LASERGENE^TM MEGALIGN^TM-Software (DNASTAR, Inc., Maison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden multiplen Alignment-Parametern: Gap Penalty von 10 und Gap Längen Penalty von 10. Die paarweisen Alignrrient-Parameter waren Ktuple = 3, Gap Penalty = 3 und Windows = 20] bestimmt.
Die Modifizierung einer Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann für die Synthese von Polypeptiden, die im Wesentlichen dem Polypeptid ähnlich sind, notwendig sein. Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich" mit dem Polypeptid bezieht sich auf nicht natürlich vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich gen technisch beliebig von dem aus seinen nativen Quellen isolierten Polypeptid unterscheiden. Beispielsweise kann es von Interesse sein, unter Verwendung z.B. der ortsgerichteten Mutagenese Varianten des Polypeptids zu synthetisieren, so dass sich diese Varianten in der spezifischen Aktivität, Wärmestabilität, pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden. Die analoge Sequenz kann auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz, die als der Polypeptid-codierende Teil der SEQ-ID. Nr. 1 dargestellt wird, z.B. eine Untersequenz davon und/oder durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, die keine andere Aminosäuresequenz des von der Aminosäuresequenz codierten Polypeptids entstehen lassen, sondern die der Kodonanwendung des Wirtsorganismus entsprechen, der zur Produktion des Enzyms beabsichtigt ist, oder durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, die eine unterschiedliche Aminosäuresequenz entstehen lassen, konstruiert werden. Für eine allgemeine Beschreibung der Nukleotidsubstitution siehe z.B. Ford et al., 1991, Protein Expression und Purification 2: 95–107.
Für die Fachleute ist es klar, dass solche Substitutionen außerhalb von den Regionen, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, vorgenommen werden können und dennoch ein aktives Polypeptid ergeben. Aminosäurereste, die für die Aktivität des Polypeptids essentiell sind, das von der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenz codiert wird und darum vorzugsweise nicht der Substitution unterliegen, können nach den aus der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085). Bei der letzteren Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingebracht, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf Aminopeptidaseaktivität getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Substrat-Enzym-Bindungsstellen können ebenfalls durch Analyse der dreidimensionalen Struktur bestimmt werden, wie durch solche Techniken, wie kernmagnetische Resonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt (siehe z.B. de Vos et al., 1992, Science 255: 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59–64).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, das unter niedrigen Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt mittleren Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt hohen Stringenzbedingungen und am meisten bevorzugt sehr hohen Stringenzbedingungen, mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die unter den gleichen Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1 oder ihrem komplementären Strang hybridisiert; oder allele Varianten und Subsequenzen davon (Sambrook et al., 1989, supra), wie hierin definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die hergestellt werden durch (a) Hybridisieren einer DNA mit der Sequenz von SEQ-ID. Nr. 1 oder ihrem komplementären Strang oder einer Untersequenz davon, die ein Polypeptidfragment codiert, das Aminopeptidaseaktivität unter niedrigen, mittleren, hohen oder sehr hohen Stringenzbedingungen aufweist; und (b) Isolieren der Nukleinsäuresequenz.
Verfahren zur Herstellung von mutierten Nukleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung einer mutierten Nukleinsäuresequenz, umfassend das Einbringen von mindestens einer Mutation in die reife Polypeptid-codierende Sequenz von SEQ-ID. Nr. 1 oder eine Untersequenz davon, wobei die mutierte Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 33 bis 674 der SEQ-ID. Nr. 2 oder einem Fragment davon, das Aminopeptidaseaktivität aufweist, besteht.
Das Einbringen einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz, um ein Nukleotid durch ein anderes auszutauschen, kann durch ortsgerichtete Mutagenese unter Anwendung von jedem der aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Besonders geeignet ist das Verfahren, welches einen Superhelix-Doppelstrang-DNA-Vektor mit einem Insert von Interesse und zwei synthetischen Primern, die die gewünschte Mutation enthalten, verwendet. Die Nukleotidprimer, jeweils komplementär zu den entgegengesetzten Strängen des Vektors, vergrößern sich während der temperaturabhängigen Reaktionscyclen mittels-Pfu-DNA-Polymerase. Bei Einbau der Primer wird ein mutiertes Plasmid erzeugt, das versetzte Nicks enthält. Nach den temperaturabhängigen Reaktionszyclen wird das Produkt mit DpnI behandelt, das für methylierte und hemimethylierte DNA spezifisch ist, um das Eltern-DNA-Templat abzubauen und um eine synthetisierte, die Mutation enthaltende DNA zu selektieren. Weitere aus der Technik bekannte Verfahren können ebenfalls angewandt werden.
Nukleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, die mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen operabel verknüpft ist, die die Expression der codierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter den mit den Kontrollsequenzen kompatiblen Bedingungen lenken. Die Expression wird so verstanden, dass sie jeden Schritt einschließt, der bei der Produktion des Polypeptids beteiligt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transkription, posttranskriptionelle Modifikation, Translation, posttranslationelle Modifikation und Sekretion.
"Nukleinsäurekonstrukt" wird hier als Nukleinsäuremolekül definiert, entweder einzel- oder doppelsträngig, das aus einem natürlich auftretenden Gen isoliert wird, oder das modifiziert worden ist, um Nukleinsäuresegmente zu enthalten, die auf eine Weise kombiniert und neben einander gestellt werden, die anderweitig in der Natur nicht vorkommen würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist synonym zu dem Begriff Expressionskassette, wenn das Nukleinsäurekonstrukt alle zur Expression einer erfindungsgemäßen codierenden Sequenz erforderlichen Kontrollsequenzen enthält. Der Begriff "codierende Sequenz" ist hier als Teil einer Nukleinsäuresequenz definiert, die direkt die Aminosäuresequenz ihres Proteinprodukts spezifiziert. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden allgemein durch eine Ribosomen-Bindungsstelle (Prokaryoten), die unmittelbar stromaufwärts von dem offenen Leseraster am 5'- Ende der mRNA angeordnet ist, und eine Transkriptionsterminationssequenz, die unmittelbar stromabwärts des offenen Leserasters am 3'-Ende der mRNA angeordnet ist, festgelegt. Eine codierende Sequenz kann DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann auf eine Vielzahl von Wegen zur Bereitstellung der Expression des Polypeptids manipuliert werden. Die Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann je nach Expressionsvektor wünschenswert oder notwendig sein. Die Verfahren zur Modifizierung der Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken sind aus der Technik gut bekannt.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" ist hier so definiert, dass er sämtliche Komponenten einschließt, die für die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids notwendig oder zweckmäßig sind. Jede Kontrollsequenz kann für die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, nativ oder fremd sein. Solche Kontrollsequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor, eine Signalsequenz und ein Transkriptions-Terminationssequenz. Zumindest umfassen die Kontrollsequenzen einen Promotor und ein Stoppsignal für Transkription- und Translation. Die Kontrollsequenzen können zum Einbringen spezieller Restriktionsstellen mit Linkem bereitgestellt werden, die die Ligation der Kontrollsequenzen mit der codierenden Region der Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, erleichtern. Der Begriff "operabel verknüpft" ist hier als die eine Konfiguration definiert, in der eine Kontrollsequenz entsprechend an einer Position relativ zu der codierenden Sequenz der DNA-Sequenz positioniert ist, derart, dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids lenkt.
Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz, eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird, sein. Die Promotorsequenz enthält transkriptionelle Kontrollsequenzen, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann jede Nukleinsäuresequenz sein, die eine Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, einschließlich mutiert, gekürzt, und Hybridpromotoren, und kann aus Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide, die für die Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind, codieren.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren, die aus dem E. coli lac-Operon, dem Streptomyces coelicolor-Agarasegen (dagA), dem Bacillus subtils-Levansaccharasegen (sacB), dem Bacillus licheniformis-alpha-Amylasgen (amyL), dem Bacillus stearothermophilus-maltogenen Amylasegen (amyM), dem Bacillus amyloliquefaciens-alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis-Penicillasegen (penP), den Bacillus subtilis xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen beta-Lactamasegen (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731) erhalten werden, sowie der tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25). Weitere Promotoren sind beschrieben in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; und in Sambrook et al., 1989, supra.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminationssequenz, eine Sequenz, die von einer Wirtszelle zur Beendigung der Transkription erkannt wird, sein. Die Terminationssequenz ist mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, verknüpft. Jede Terminationssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, die für die Translation durch die Wirtszelle von Bedeutung ist, sein. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Signalpeptid-codierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz codiert, die mit dem Aminoterminus des Polypeptids verknüpft ist, der das codierte Polypeptid auf seinen Zell-Sekretionsweg lenkt. Das 5'-Ende der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann von Natur aus eine Signalpeptid-codierende Region enthalten, die von Natur aus in dem Translations-Leseraster mit der Sequenz der codierenden Region verknüpft ist, die das sezernierte Polypeptid codiert. Alternativ kann das 5'-Ende der codierenden Sequenz eine Signalpeptid-codierende Region erhalten, die für die codierende Sequenz fremd ist. Die fremde Signalpeptid-codierende Region kann erforderlich sein, wenn die codierende Sequenz normalerweise keine Signalpeptid-codierende Region enthält. Alternativ kann die Fremdsignalpeptid-codierende Region einfach die natürliche Signalpeptid-codierende Region ersetzen, um eine verstärkte Sekretion des Polypeptids zu erhalten. Allerdings kann bei der vorliegenden Erfindung jede Signalpeptid-codierende Region, die das exprimierte Polypeptid auf den sekretorischen Weg einer Wirtszelle der Wahl lenkt, verwendet werden.
Eine wirksame Signalpeptid-codierende Region für bakterielle Wirtszellen ist die Signalpeptid-codierende Region, die aus dem maltogenen Amylasegen von Bacillus NCIB 11837, dem Bacillus stearothermophilus alpha-Amylasegen, dem Bacillus licheniformis Subtilisin-Gen, dem Bacillus licheniformis beta-Lactamasegen, dem Bacillus stearothermophilus neutralen Proteasegenen (nprT, nprS, nprM) oder dem Bacillus subtilis prsA-Gen erhalten wird. Weitere Signalpeptide sind bei Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109–137, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Propeptid-codierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz codiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids angeordnet ist. Das resultierende Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid (oder in einigen Fällen als Zymogen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann in ein reifes aktives Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids aus dem Propolypeptid umgewandelt werden. Die Propeptid-codierende Region kann aus dem Bacillus subtilis- Alkalische-Protease-Gen (aprE) oder dem Bacillus subtilis-Neutrale Protease-Gen (nprT) erhalten werden.
Wo sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidregionen am Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden sind, ist die Propeptidregion unmittelbar an dem Aminoterminus eines Polypeptids positioniert, und die Signalpeptidregion ist unmittelbar neben dem Aminoterminus der Propeptidregion positioniert.
Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression des Polypeptids relativ zum Wachstum der Wirtszelle gestatten. Beispiele für regulatorische Systeme sind diejenigen, die bewirken, dass die Expression des Gens als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus ein- oder abgeschaltet wird, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen würden die lac-, tac- und trp-Operator-Systeme einschließen. Weitere Beispiele für regulatorische Sequenzen sind diejenigen, die die Genamplifikation ermöglichen. In diesen Fällen wäre die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, mit der regulatorischen Sequenz operabel verknüpft.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nuleinsäuresequenz, einen Promotor und ein Transkriptions- und Translationsstoppsignal umfassen. Die verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen, die vorstehend beschrieben sind, können miteinander verknüpft werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere zweckmäßige Restriktionsstellen einschließen kann, um die Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, an solchen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz durch Insertion der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäurekonstruktes, das die Sequenz umfasst, in einen für die Expression geeigneten Vektor expri miert werden. Bei der Erzeugung des Expressionvektors wird die codierende Sequenz in dem Vektor so angeordnet, dass die codierende Sequenz mit den entsprechenden Kontrollsequenzen für die Expression operabel verknüpft ist.
Der rekombinante Expressionsvektor kann jeder Vektor sein (z.B. ein Plasmid oder Virus), mit dem in zweckmäßiger Weise rekombinate DNA-Verfahren durchgeführt werden können und der die Expression der Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle ab, in die der Vektor einzubringen ist. Die Vektoren können lineare oder circulär geschlossene Plasmide sein.
Der Vektor kann ein sich autonom replizierender Vektor sein, das heißt ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor kann jedes Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in die er integriert worden ist, repliziert wird. Außerdem kann ein Einzelvektor oder ein Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die Gesamt-DNA, die in das Genom der Wirtszelle einzubringen ist, enthalten, oder ein Transposon verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, welche die einfache Selektion von transformierten Zellen gestatten. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt Biozid- oder Virus-Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie oder Auxotrophie und dergleichen bereitstellt. Beispiele für bakterielle selektierbare Marker sind die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikumresistenz verleihen, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten vorzugsweise ein Element (Elemente), das (die) die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenom oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig von dem Genom der Zelle gestattet (gestatten).
Zur Integration in das Wirtszellengenom kann der Vektor die Nukleinsäuresequenz heranziehen, die das Polypeptid codiert, oder jedes andere Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht-homologe Rekombination.
Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zum Steuern der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen die Integration des Vektors in das Wirtszellengenom an einer exakten Stelle (an exakten Stellen) in dem (den) Chromosom(en). Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Integration an einer bestimmten Stelle, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl an Nukleinsäuren, wie 100 bis 1500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1500 Basenpaare und am stärksten bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare, enthalten, die mit der entsprechenden Zielsequenz stark homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können jede Sequenz sein, die mit der Zielsequenz in dem Genom der Wirtszelle homolog ist. Außerdem können die Integrationselemente nicht-codierende oder codierende Nukleinsäuresequenzen sein. Andererseits kann der Vektor durch nicht-homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle integriert werden.
Zur autonomen Replikation kann der Vektor außerdem einen Replikationsursprung umfassen, der die autonome Replikation des Vektors in der in Frage kommenden Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, die die Replikation in E. coli ermöglichen und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, die die Replikation in Bacillus ermöglichen. Der Replikationsursprung kann ein Replikationsursprung mit einer Mutation sein, die seine Wir kung in der Wirtszelle Temperaturempfindlich macht (siehe z.B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences LISA 75: 1433).
Mehr als eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kann in die Wirtszelle eingeschleust werden, um die Produktion des Genprodukts zu steigern. Eine Steigerung in der Kopienanzahl der Nukleinsäuresequenz kann durch Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellengenom oder durch Einschluss eines amplifizierbaren selektierbaren Markergens mit der Nukleinsäuresequenz, wo Zellen, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markergens enthalten, und dadurch zusätzliche Kopien der Nukleinsäuresequenz enthalten, durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart des geeigneten selektierbaren Mittels selektiert werden können, erhalten werden.
Die zur Ligation der vorstehend beschriebenen Elemente zur Konstruktion der erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren verwendeten Verfahrensweisen sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die zweckmäßigerweise bei der rekombinanten Produktion der Polypeptide verwendet wird. Ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfasst, wird in eine Wirtszelle eingeschleust, so dass der Vektor als chromosomaler Integrand oder als selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor, wie bereits beschrieben, gehalten wird. Der Begriff "Wirtszelle" umfasst jeden Nachkommen einer Elternzelle, der aufgrund von Mutationen, die während der Replikation auftreten, mit der Elternzelle nicht identisch ist. Die Wahl einer Wirtszelle ist zu einem großen Ausmaß von dem Gen, das das Polypeptid codiert, und seinen Quellen abhängig.
Die Wirtszelle kann jeder einzellige Mikroorganismus, z.B. eine Prokaryote, sein. Geeignete einzellige Zellen sind Bakterienzellen, wie grampositive Bakterien, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, eine Bacillus-Zelle, z.B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Streptomyces-Zelle, z.B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien, wie E. coli und Pseudomonas sp. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus stearothermophilus- oder eine Bacillus subtilis-Zelle. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Bacillus-Zelle ein alkalophiler Bacillus.
Die Einschleusung eines Vektors in eine bakterielle Wirtszelle kann beispielsweise durchgeführt werden durch Protoplastentransformation (siehe z.B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111–115), unter Verwendung kompetenter Zellen (siehe z.B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), Elektroporation (siehe z.B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6, 742–751), oder Konjugation (siehe z.B. Koehler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771–5278).
Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren eines Stamms, der in seiner Wildtypform in der Lage ist, das Polypeptid zu produzieren, um einen Überstand zu produzieren, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids. Vorzugsweise ist der Stamm von der Gattung Sphingomonas und stärker bevorzugt Sphingomonas capsulata.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids geeignet sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids geeignet sind, wobei die Wirtszelle eine mutierte Nukleinsäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 1 mit mindestens einer Mutation in der Nukleinsäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 1 umfasst, wobei die mutierte Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ-ID. Nr. 2 codiert, und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Bei den erfindungsgemäßen Produktionsverfahren werden die Zellen in einem Nährmedium kultiviert, das zur Produktion des Polypeptids unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren geeignet ist. Beispielsweise kann die Zelle in Schüttelkolbenkultur, durch Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche, chargenweise, zugeführt chargenweise oder Festzustands-Fermentation) in Labor- oder Industriefermentern, durchgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die die Expression und/oder Isolierung des Polypeptids ermöglichen, kultiviert werden. Die Kultivierung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren. Geeignete Medien stehen von kommerziellen Herstellern zur Verfügung oder können nach veröffentlichten Zusammensetzungen hergestellt werden (z.B. in den Katalogen der American Type Culture Collection). Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wird das Polypeptid nicht sezerniert, kann es aus den Zelllysaten gewonnen werden.
Die Polypeptide können unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen werden, die für die Polypeptide spezifisch sind. Diese Nachweisverfahren können die Verwendung spezifischer Antikörper, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Ver schwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Beispielsweise kann ein Enzymtest zur Bestimmung der Aktivität des Polypeptids verwendet werden. Verfahren zur Bestimmung der Aminopeptidaseaktivität sind aus der Technik bekannt. Wie bereits beschrieben, wird die Aminopeptidaseaktivität durch Messen der Hydrolyseausgangsgeschwindigkeit des p-Nitroanilids von Alanin bei 405 nm bestimmt.
Das resultierende Polypeptid kann durch aus der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann das Polypeptid durch herkömmliche Verfahren aus dem Nährmedium gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Evaporation oder Präzipitation.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch eine Vielzahl von aus der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Chromatographie (z.B. Ionenaustauschaffinitäts-, hydrophobe, chromatofokussierende und Größenausschluss-Chromatographie), elektrophoretische Verfahren (z.B. präparatives isoelektrisches Fokussieren), differentielle Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfatfällung), SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989).
Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine transgene Pflanze, Pflanzenteile oder Pflanzenzelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Aminopeptidaseaktivität codiert, transformiert worden ist, so dass das Polypeptid in gewinnbaren Mengen exprimiert und produziert wird. Das Polypeptid kann aus der Pflanze oder aus einem Pflanzenteil gewonnen werden. Alternativ kann die Pflanze oder das Pflanzenteil, das das rekombinante Polypeptid enthält, als solches zur Verbesserung der Qualität eines Lebensmittels oder einer Nahrung, z.B. Verbesserung von Nährwert, Geschmack und rheologischer Eigenschaften oder zur Zerstörung eines antinutritiven Faktors verwendet werden.
Die transgene Pflanze kann dicotyl oder monocotyl, kurz dicot oder monocot, sein. Beispiele für monocotyle Pflanzen sind Gräser, wie Wiesengras (Blaugras, Poa), Futtergras, wie Festuca, Lolium, Gras aus gemäßigten Zonen, wie Agrostis, und Getreidearten, z.B. Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Hirse und Mais (Corn), sein.
Beispiele für dicotyle Pflanzen sind Tabak, Gemüse, wie Lupinen, Kartoffeln, Zuckerrübe, Erbse, Bohne und Sojabohne und Kreuzblütler (Familie Brassicaceae), wie Blumenkohl, Ölsamen, Raps, und der eng verwandte Modellorganismus Arabidopsis thaliana.
Beispiele für Pflanzenteile sind Stamm, Kallus, Blätter, Wurzel, Früchte, Samen und Wurzelknollen. Im vorliegenden Zusammenhang werden auch spezielle Pflanzengewebe, wie Chloroplast, Apoplast, Mitochondrien, Vakuole, Peroxisomen und Cytoplasma, als Pflanzenteil betrachtet. Außerdem wird jede beliebige Pflanzenzelle, gleich welchen Gewebeursprungs, als Pflanzenteil betrachtet.
Ebenfalls im Umfang der Erfindung eingeschlossen sind die Abkömmlinge von solchen Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenzellen.
Die transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann nach aus der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Kurz gesagt, wird die Pflanze oder die Pflanzenzelle konstruiert, indem ein oder mehrere Expressionskonstrukte, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, in das pflanzliche Wirtsgenom eingebaut und die resultierende modifizierte Pflanze oder Pflanzenzelle in einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle vermehrt wird.
Zweckmäßigerweise ist das Expressionskonstrukt ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, das mit den entsprechenden regulatorischen Sequenzen operabel verknüpft ist, die zur Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze oder dem Pflanzenteil der Wahl erforderlich sind. Außer dem kann das Expressionskonstrukt einen selektierbaren Marker, der zur Identifizierung der Wirtszellen geeignet ist, in die das Expressionsprodukt integriert worden ist und DNA-Sequenzen, die zum Einbau des Konstrukts in die in Frage kommende Pflanze (letztere hängt von dem zu verwendenden DNA-Einbauverfahren ab) geeignet sind, umfassen.
Die Wahl der regulatorischen Sequenzen, wie Promotor- und Terminationssequenzen und optionale Signal- oder Transitsequenzen, wird bestimmt z.B. auf der Grundlage davon, wann, wo und wie die Expression des Polypeptids gewünscht ist. Beispielsweise kann die Expression der Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, konstitutiv oder induzierbar sein oder kann entwicklungsgemäß, Stadium- oder Gewebe-spezifisch sein, und das Expressionskonstrukt kann auf ein spezifisches Gewebe oder ein spezifisches Pflanzenteil, wie Samen oder Blätter, ausgerichtet sein. Regulatorische Sequenzen sind z.B. von Tague et al., Plant, Phys., 86, 506, 1988, beschrieben.
Zur konstitutiven Expression kann der 35S-CaMV-Promoter verwendet werden (Franck et al., 1980, Cell 21: 285–294). Organ-spezifische Promotoren können z.B. ein Promotor aus den Speichergeweben, wie Samen, Kartoffelknollen und Früchte (Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275–303), oder aus Bildungsgeweben, wie Meristeme (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863–878), ein Samen-spezifischer Promotor, wie Glutelin-, Prolamin-, Globulin- oder Albumin-Promoter aus Reis (Wu et al., Plant and Cell Physiology, Bd. 39, Nr. 8, S. 885–889 (1998)), ein Vicia faba-Promotor aus dem Legumin B4 und dem unbekannten Samenproteingen aus Vicia faba, beschrieben von U. Conrad et al., Journal of Plant Physiology, Bd. 152, Nr. 6, S. 708–711 (1998), ein Promotor aus einem Samenöl-Masseprotein) (Chen et al., Plant and cell physiology, Bd. 39, Nr. 9, S. 935–941 (1998)), dem Speicherprotein-napA-Promotor aus Brassica napus, oder jeder andere Samen-spezifische Promotor, der aus der Technik bekannt ist, z.B. wie beschrieben in WO 91/14772 sein. Außerdem kann der Promotor ein Blatt-spezifischer Promotor sein, wie der rbcs-Promotor aus Reis oder Tomate (Kyozuka et al., Plant Physiology, Bd. 102, Nr. 3, S. 991–1000 (1993)), der Chlorella-Virus Adenin-Methyltransferase-Genpromotor (A. Mitra und D.W. Higgins, Plant Molecular Bio logy Bd. 26, Nr. 1, S. 85–93 (1994)), oder der aldP-Genepromotor aus Reis (Kagaya et al., Molecular and General Genetics, Bd. 248, Nr. 6, S. 668–674 (1995)), oder ein Wundeninduzierbarer Promotor, wie der Kartoffel pin2-Promotor (Xu et al., Plant Molecular Biology, Bd. 22, Nr. 4, S. 573–588 (1993)), sein.
Ein Promotor-Enhancerelement kann zum Erreichen einer höheren Expression des Polypeptids in der Pflanze eingesetzt werden. Beispielsweise kann das Promotor-Enhancerelement ein Intron sein, welches zwischen Promotor und Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, angeordnet ist. Beispielsweise offenbaren Xu et al. op cit die Verwendung des ersten Introns des Reis-Actin-1-Gens zur verstärkten Expression.
Das selektierbare Markergen und alle anderen Teile des Expressionkonstrukts können aus denjenigen, die aus der Technik zur Verfügung stehen, gewählt werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird in das Pflanzengenom nach herkömmlichen, aus der Technik bekannten Verfahren eingebaut, einschließlich Agrobacterium-vermittelte Transformation, Virus-vermittelte Transformation, Mikroinjektion, Teilchenbombardment, biolistische Transformation und Elektroporation (Gasser et al, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989).
Derzeit ist der Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentransfer das Verfahren der Wahl zur Erzeugung transgener Dicotyle (Übersicht bei Hooykas & Schilperoort, 1992). Allerdings kann er auch zur Transformation von Monocotylen verwendet werden, obwohl andere Transformationsverfahren im Allgemeinen für dies Pflanzen bevorzugt sind. Derzeit ist das Verfahren der Wahl zur Erzeugung transgener Monocotyle das Teilchenborbardment (mikroskopische Gold- oder Wolframteilchen, die mit der transformierenden DNA beschichtet sind) oder embryonale Kalli oder sich entwickelnde Embryonen (Christou, 1992. Plant J. 2: 275–281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158–162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667–674). Ein alternatives Verfahren zur Transformation von Monocotylen beruht auf der Protoplastentransformation, wie von S. Omirulleh et al., Plant Molecular Biology, Bd. 21, Nr. 3, S. 415–428 (1993), beschrieben.
Nach der Transformation werden Transformanten mit eingearbeitetem Expressionskonstrukt selektiert und nach aus der Technik bekannten Verfahren zu ganzen Pflanzen regeneriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer transgenen Pflanze oder einer Pflanzenzelle, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Aminopeptidaseaktivität codiert, unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids geeignet sind, und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Entfernung oder Verminderung der Aminopeptidaseaktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer Zellmutante einer Elternzelle, welches das Unterbrechen oder Deletieren einer Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid oder eine Kontrollsequenz davon codiert, umfasst, was zu der Zellmutante führt, die weniger Polypeptid als die Elternzelle produziert, wenn sie unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird.
Die Konstruktion von Stämmen, die eine verminderte Aminopeptidaseaktivität aufweisen, kann zweckmäßigerweise durch Modifikation oder Inaktivierung einer Nukleinsäuresequenz erfolgen, die zur Expression des Polypeptids mit Aminopeptidaseaktivität in der Zelle notwendig ist. Die zu modifizierende oder zu inaktivierende Nukleinsäuresequenz kann beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz sein, die das Polypeptid oder einen Teil davon codiert, der wesentlich ist, um die Aminopeptidaseaktivität aufzuweisen, oder die Nukleinsäuresequenz kann eine regulatorische Funktion aufweisen, die zur Expression des Polypeptids aus der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz notwendig ist. Ein Beispiel für eine solche regulatorische oder Kontrollsequenz kann eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon sein, das heißt ein Teil, der ausreicht, um die Expression des Polypeptids zu beeinflussen. Weitere Kontrollsequenzen für eine mögliche Modifikation sind vorstehend beschrieben.
Die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durch die Durchführung einer Mutagenese mit der Zelle und durch Selektion und Screening auf Zellen, in denen die Aminopeptidase-produzierende Fähigkeit vermindert worden ist, durchgeführt werden. Die Mutagenese, die spezifisch oder zufallsmäßig sein kann, kann beispielsweise durch Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Mittels, durch Verwendung eines geeigneten Nukleotids oder durch die Durchführung der PCR-generierten Mutagenese mit der DNA-Sequenz erfolgen. Außerdem kann die Mutagenese durch Verwendung jeder Kombination dieser mutagenisierenden Mittel durchgeführt werden.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches mutagenisierendes Mittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, umfassen Ultraviolett-(UV)-Bestrahlung, Hydroxylamin, n-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, Salpetersäure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloge.
Werden solche Mittel verwendet, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubation der zu mutagenisierenden Zelle in Gegenwart des mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektion auf Zellen, die reduzierte Aminopeptidaseaktivität oder – Produktion aufweisen, durchgeführt.
Die Modifikation oder Inaktivierung der Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids kann durch Einfügen Substitution oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder einem regulatorischen Element, das zur Transkription oder Translation davon erforderlich ist, erreicht werden. Beispielsweise können Nukleotide inseriert oder entfernt werden, so dass sich der Einbau eines Stoppkodons, die Entfernung des Startkodons oder eine Änderung des offenen Leserasters ergibt. Eine solche Modifikation oder Inaktivierung kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder PCT-gene rierte Mutagenese nach aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Obwohl die Modifikation im Prinzip in vivo, das heißt direkt an der Zelle, die die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz exprimiert, durchgeführt werden kann, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro, wie nachstehend beispielhaft ausgeführt, durchgeführt wird.
Ein Beispiel für einen zweckmäßigen Weg der Inaktivierung oder Reduktion der Produktion durch eine Wirtszelle der Wahl beruht auf den Techniken des Gen-Austauschs oder der Gen-Interruption. Beispielsweise wird bei den Gen-Interruptionsverfahren eine Nukleinsäuresequenz, die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht, in vitro mutagenisiert, um eine fehlerhafte Nukleinsäuresequenz zu produzieren, die dann in die Wirtszelle übergeführt wird, um ein fehlerhaftes Gen zu produzieren. Durch homologe Rekombination ersetzt die fehlerhafte Nukleinsäuresequenz das endogene Gen oder Genfragment. Es kann wünschenswert sein, dass das fehlerhafte Gen oder Genfragment auch einen Marker codiert, der zur Selektion von Transformanten verwendet werden kann, in denen das Gen, das das Polypeptid codiert, modifiziert oder zerstört worden ist.
Alternativ kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, durch Erstellen von Antisense-Techniken unter Verwendung einer zu der Polypeptid-codierenden Sequenz komplementären Sequenz durchgeführt werden. Insbesondere kann die Produktion des Polypeptids durch eine Zelle durch Einfügen einer Nukleotidsequenz vermindert oder ausgeschaltet werden, die zu der Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die das Polypeptid codiert, welches in der Zelle transkribiert werden kann und in der Lage ist, an die in der Zelle produzierte Polypeptid-mRNA zu hybridisieren. Somit wird unter Bedingungen, durch die sich die komplementäre Antisense-Nukleotidsequenz an die Polypeptid-mRNA hybridisieren lässt, die Menge an translatiertem Polypeptid vermindert oder beseitigt.
Es ist bevorzugt, dass die nach den erfindungsgemäßen Verfahren zu modifizierende Zelle mikrobiellen Ursprungs ist, beispielsweise ein Pilzstamm ist, der zur Produktion von ge wünschten Proteinprodukten, die entweder homolog oder heterolog gegenüber der Zelle sind, geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Zellmutante einer Elternzelle, die eine Unterbrechung oder Deletion einer Nukleinsäuresequenz umfasst, die das Polypeptid oder eine Kontrollsequenz davon codiert, was dazu führt, dass die Zellmutante weniger Polypeptid als die Elternzelle produziert.
Die so erzeugten Polypeptid-Mangel-Zellmutanten sind besonders als Wirtszellen zur Expression von homologen und/oder heterologen Polypeptiden geeignet. Darum betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines homologen oder heterologen Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren der Zellmutante unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids geeignet sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids. Der Begriff "heterologe Polypeptide" ist hier als Polypeptide definiert, die für die Wirtszelle nicht nativ sind, ein natives Protein, in dem Modifikationen vorgenommen worden sind, um die native Sequenz zu ändern, oder ein natives Protein, dessen Expression als Ergebnis einer Manipulation der Wirtszelle durch rekombinante DNA-Techniken quantitativ geändert wurde.
Bei noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinprodukts, das im Wesentlichen frei von Aminopeptidaseaktivität ist, durch Fermentation einer Zelle, die sowohl ein erfindungsgemäßes Polypeptid als auch das Proteinprodukt von Interesse produziert. Das Verfahren umfasst die Zugabe einer wirksamen Menge eines Mittels, das in der Lage ist, die Aminopeptidaseaktivität zu hemmen, zu dem Fermentationsmedium entweder während oder nachdem die Fermentation abgeschlossen worden ist, Gewinnen des Produkts von Interesse aus dem Fermentationsmedium und gegebenenfalls Unterziehen des gewonnenen Produkts einer weiteren Reinigung. Dieses Verfahren wird in den nachstehenden Beispielen weiter erläutert.
Bei wieder einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Proteinprodukts, das im Wesentlichen frei von Aminopeptidaseaktivität ist, wobei das Proteinprodukt von Interesse von einer DNA-Sequenz codiert wird, die in einer Zelle vorhanden ist, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. Das Verfahren umfasst das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Expression des Produkts ermöglicht, das Unterziehen des resultierenden Kulturmediums einer kombinierten pH- und Temperaturbehandlung, so dass die Aminopeptidaseaktivität im Wesentlichen vermindert wird, und das Gewinnen des Produkts aus dem Kulturmedium. Alternativ kann die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung an einer Enzympräparation durchgeführt werden, die aus dem Kulturmedium gewonnen wurde. Die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung kann gegebenenfalls in Kombination mit einer Behandlung mit einem Aminopeptidaseinhibitor verwendet werden.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist die Entfernung von mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 75 %, stärker bevorzugt mindestens 85 %, noch stärker bevorzugt mindestens 95 % und besonders bevorzugt von mindestens 99 % der Aminopeptidaseaktivität möglich. Es wird davon ausgegangen, dass eine vollständige Entfernung von Aminopeptidaseaktivität durch die Anwendung dieses Verfahrens erhalten werden kann.
Die kombinierte pH- und Temperaturbehandlung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 und einer Temperatur im Bereich von 40 bis 60 °C für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, wobei typischerweise 30 bis 60 min ausreichend sind, durchgeführt.
Die zur Kultivierung und Reinigung des Produkts von Interesse angewandten Verfahren können durch aus der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion eines im Wesentlichen Aminopeptidasefreien Produkts sind bei der Produktion von eukaryotischen Polypeptiden, insbesondere Pilzproteinen, wie Enzyme, von besonderem Interesse. Das Enzym kann aus z.B. einem amyloly tischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischen Enzym, cellulytischen Enzym, Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand-abbauenden Enzym ausgewählt werden. Beispiele für solche Enzyme umfassen eine Aminopeptidase, Amylase, Amyloglucosidase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Deoxyribonuclease, Esterase, Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucoseoxidase, Glucosidase, Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase, Laccase, Ligase, Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, pectinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Phenoloxidase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuclease, Transferase, Transglutaminase oder Xylanase. Die Aminopeptidase-Mangelzellen können auch zur Expression heterologer Proteine von pharmazeutischem Interesse, wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen, eingesetzt werden.
Selbstverständlich umfasst der Begriff "eukaryotische Polypeptide" nicht nur native Polypeptide, sondern auch diejenigen Polypeptide, z.B. Enzyme, die durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen oder andere derartige Modifikationen zur Verstärkung der Aktivität, Thermostabilität, pH-Toleranz und dergleichen modifiziert worden sind.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Proteinprodukt, das im Wesentlichen frei von Aminopeptidaseaktivität ist, welches durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellt wird.
Anwendungen
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können bei der Produktion von Proteinhydrolysaten zur Verstärkung des Hydrolysegrades und zur Aromaentwicklung angewandt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch zur Deaktivierung eines Enzyms eingesetzt werden.
Außerdem kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid für eine Anzahl von Zwecken geeignet sein, wobei eine spezifische Spaltung der Peptidsequenzen erwünscht ist. Beispielsweise werden einige Proteine oder Peptide in Form von inaktiven Vorläufern synthetisiert, die eine Anzahl von zusätzlichen Aminosäureresten am N-Terminus des reifen Proteins umfassen. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid könnte die notwendige posttranslationale Verarbeitung zur Aktivierung solcher Vorläuferproteine bereitstellen.
Signalpeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die ein Gen umfassen, das ein Protein codiert, das mit einer Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist, die aus den Nukleotiden 574 bis 699 der SEQ-ID. Nr. 1 besteht, die ein Signalpeptid codiert, bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 32 der SEQ-ID. Nr. 2, wobei das Gen für die Nukleinsäuresequenz fremd ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionvektoren und rekombinante Wirtszellen, die ein solches Nukleinsäurekonstrukt umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Produktion eines Proteins, umfassend (a) Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfasst, das ein Gen umfasst, das ein Protein codiert, das mit einer Signalpeptid-codierenden Regionoperabel verknüpft ist, bestehend aus den Nukleotiden 574 bis 669 der SEQ-ID. Nr. 1, wobei das Gen für die Nukleinsäuresequenz fremd ist, unter Bedingungen, die zur Produktion des Proteins geeignet sind; und (b) Gewinnen des Proteins.
Die Nukleinsäuresequenz kann operabel mit Fremdgenen mit anderen Kontrollsequenzen verknüpft sein. Solche anderen Kontrollsequenzen sind supra beschrieben.
Das Protein kann jedes Protein sein. Außerdem kann das Protein für eine Wirtszelle nativ oder heterolog sein. Der Begriff "Protein" bedeutet hier nicht die Bezugnahme auf eine spezifische Länge des codierten Produkts, und darum umfasst er Peptide, Oligopeptide und Proteine. Der Begriff "Protein" umfasst ebenfalls zwei oder mehrere Polypeptide, die unter Bildung des codierten Produkts kombiniert werden. Die Proteine umfassen auch Hybridpolypeptide, die eine Kombination von partiellen oder vollständigen Polypeptidsequenzen umfassen, die aus mindestens zwei verschiedenen Proteinen erhalten wurden, wobei eine oder mehrere heterolog oder nativ gegenüber der Wirtszelle sein können. Die Proteine umfassen weiterhin natürlich vorkommende allelische und gentechnisch hergestellte Variationen der oben erwähnten Proteine und Hybridproteine.
Vorzugsweise ist das Protein ein Hormon, eine Hormonvariante, ein Enzym, ein Rezeptor oder ein Teil davon, ein Antikörper oder ein Teil davon oder ein Reporter. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Protein eine Oxidoreduktase, Transferase, Hydrolase, Lyase, Isomerase oder Ligase. Bei noch einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Protein eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Deoxyribonuclease, Esterase, alpha-Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Invertase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Mutanase, Oxidase, pectinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuclease, Transglutaminase oder Xylanase.
Das Gen kann aus jeder prokaryotischen eukaryotischen oder anderen Quelle erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten aus", wie hier in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet, bedeuten, dass das Protein von der Quelle oder von einer Zelle produziert wird, in die das Gen aus der Quelle inseriert worden ist.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung konzipiert werden sollten.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von Rohenzymextraktpulver aus Sphingomonas capsulata
Sphingomonas capsulata IFO 12533 wurde 9 h bei 30 °C mit Belüftung und Rühren in einem 5-1-Fermenter, der 3 1 Medium, bestehend aus 0,5 % Saccharose, 1 % Gelatine, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Maisquellwasser, 0,3 % NaCl, 0,2 % K₂HPO₄ und 0,1 % MgSO₄·7H₂O enthält, kultiviert. Die Zellmasse wurde aus dem Kulturmedium gesammelt und zweimal in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Puffer gewaschen und ergab 43 g Nassgewicht an Zellmasse. Die Zellmasse wurde in 200 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Puffer suspendiert und durch Zugabe von Lysozym und Triton X-100 in Endkonzentrationen von 1 mg/ml bzw. 0,1 % und Inkubieren der Lösung 1 h bei 37 °C suspendiert. Die Lösung wurde ultrabeschallt und dann bei 15000 × g 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen (200 ml), und Protaminsulfat wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % zur Ausfällung der Nukleinsäuren zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation auf die gleiche Weise verworfen, und die resultierende Lösung wurde als Rohenzymextrakt verwendet.
Die Aktivität des Rohenzymextrakts gegenüber verschiedenen synthetischen Peptiden wurde wie in Tabelle 1 gezeigt bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Rohenzymextrakt Dipeptidylpeptidase-IV-, Leucinaminopeptidase-, Glycinaminopeptidase- und Prolyloligopeptidase-Aktivität besaß. Tabelle 1 Aktivitäten verschiedener Peptidase-Aktivitäten in der Rohenzym-Extraktlösung
Der Rohenzymextrakt wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von kaltem Aceton präzipitiert. Das Enzympräzipitat wurde in einem kleinen Volumen 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,0 gelöst, und die unlöslichen Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt. Das Enzym wurde lyophilisiert, um ein Rohenzympulver herzustellen.
Beispiel 2: Reinigung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I aus Rohenzympulver
Das in Beispiel 1 beschriebene Rohenzympulver wurde in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst und verdünnt, bis die Leitfähigkeit der Probe derjenigen des Ladungspuffers, 20 mM Phosphat, pH 7,0, entsprach. Die Probe wurde auf eine Pharmacia Q-Sepharose- oder Mono-Q-Säule geladen, die mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, voräquilibriert war. Die Durchflüsse aus dieser Säule wurden auf die Aminopeptidaseaktivität mit Alanin-para-nitroanilid (Ala-pNA) unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens getestet.
Eine Stammlösung von 100 mg Ala-pNA pro ml in Dimethylsulfoxid wurde mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bis auf eine Konzentration von 2 mg/ml verdünnt. Die Reaktion der Aminopeptidase mit dem para-Nitroanilid wurde gestartet, wenn ein 10- bis 50-μl-Aliquot der Enzymlösung zu 200 μl der Substratlösung in einer Mikrotiterplattenvertiefung zugesetzt wurden. Die Analyse der anfänglichen Hydrolysegeschwindigkeit des para-Nitroanilids wurde bei 405 nm bei Raumtemperatur in einem THERMOmax Microplate Reader (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA) überwacht.
Die Aminopeptidaseaktivität war im Eluat vorhanden. Das Eluat wurde unter Verwendung eines Amicon Spial Ultrafiltration System (Amicon, New Bedford, MA, USA), ausgestattet mit einer DIAFLO^® PM 10-Ultrofiltrationsmembran (Amicon, Inc., USA), konzentriert und der pH-Wert des konzentrierten Eluats wurde sodann auf pH 6,0 unter Verwendung von 70 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, eingestellt.
Das konzentrierte Eluat wurde auf eine Pharmacia Mono S 5/5-vorgepackte 7 × 50 mm Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) voräquilibriert mit 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, aufgebracht. Die Fraktionen wurden wie vorstehend auf die Aminopeptidaseaktivität getestet. Die gebundene Aminopeptidaseaktivität wurde mit einem Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, eluiert. Sodann wurden die Fraktionen mit nennenswerter Aktivität erneut unter Verwendung einer PM 10-Ultrafiltrationsmembran konzentriert und anschließend in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, äquilibriert.
Die konzentrierte Probe wurde anschließend auf eine Phenylsuperosesäule geladen, die mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, voräquilibriert wurde. Das Enzym wurde mit einem Gradienten von 0,5 M Ammoniumsulfat, enthaltend 50 mM Phosphatpuffer bis 50 mM Phosphatpuffer, enthaltend kein Ammoniumsulfat, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt.
Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Aminopeptidase ergab eine Bande mit einem Molekulargewicht von 67 kDa. Die gereinigte Aminopeptidase wurde als Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I bezeichnet.
Beispiel 3: Reinigung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I aus Rohenzympulver
Das in Beispiel 1 beschriebene Rohenzympulver wurde in destilliertem Wasser gelöst und auf eine CM Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), voräquilibriert mit 15 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, geladen. Die Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 15 mM bis 60 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen von 7,4 ml wurden gesammelt und auf Aminopeptidaseaktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet.
Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen 15 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, dialysiert. Die Dialysate wurden nacheinander auf eine Hydroxylapatidsäule, äquilibriert mit 15 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, geladen. Die Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 15 mM bis 300 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf die Aminopeptidaseaktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Beispiel 4: Reinigung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I
Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I wurde aus einem Kulturmedium-Überstand, hergestellt durch Kultivieren von Sphingomonas capsulata Stamm IFO 12533 für 15 h bei 31 °C, 250 U/min und einem Anfangs-pH von 7,45 in 1,5 l Medium, bestehend pro Liter aus 10 g Bactopepton, 5 g Hefeextrakt, 3 g NaCl, 2 g K₂HPO₄, 0,1 g MgSO₄·7H₂O und 5 g Glucose (getrennt autoklaviert), aufgereinigt.
Die Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit Alanin-para-nitroanilid (Ala-pNA), wie in Beispiel 2 beschrieben, gemessen.
Der Kulturmedium-Überstand (etwa 1 l), hergestellt durch Zentrifugation, filtriert unter Verwendung von Whatman-Glas-Mikrofaserfilter (Whatman, Maidstone, England), filtriert unter Verwendung von Nalgene Filterware, ausgestattet mit einem 0,22-mm-Filter, und konzentriert unter Verwendung eines Amicon Spiral Ultrafiltration System, ausgestattet mit einer PM 10-Ultrafilterationsmembran, wurde mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, äquilibriert, bis die Leitfähigkeit und der pH dem Ladungspuffer, 50 mM MES, pH 6,0, entsprach. Die filtrierte Lösung wurde auf eine 24 × 390 mm-Säule, enthaltend etwa 180 ml SP-Sepharose, Fast Flow (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), voräquilibriert mit 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, geladen. Das Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität wurde mit einem 240-ml-Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen mit Aminopeptidase I-Aktivität wurden vereinigt, unter Verwendung einer PM 10-Membran entsalzt und mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert.
Die vereinigten Lösungen wurden anschließend auf eine Pharmacia MonoQ Beads-Säule, voräquilibriert mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, geladen. Das Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität band nicht an die Säule und wurde im Eluat gesammelt. Das Eluat wurde unter Verwendung eines PM 10-Membransystems, wie vorstehend, konzentriert, und der pH mit 70 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, auf 6,0 eingestellt.
Das konzentrierte Eluat wurde auf eine Pharmacia Mono S-Säule, voräquilibriert mit 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, geladen. Die Aminopeptidase wurde mit einem 60 ml Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, eluiert. Die Fraktionen mit nennenswerter Ala-pNA-Aktivität wurden anschließend vereinigt, konzentriert und mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M (NH₄)₂SO₄, unter Verwendung einer PM 10-Membran, wie vorstehend, äquilibriert.
Schließlich wurde die konzentrierte Probe auf eine Pharmacia Phenyl Superose 5/5-vorgepackte Säule, 7 × 50 mm (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), voräquilibriert mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M (NH₄)₂SO₄, geladen. Das Protein mit Aminopeptidase I-Aktivität wurde anschließend mit einem 30-ml-Gradienten von 0,5 bis 0 M (NH₄)₂SO₄ in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, eluiert. Fraktionen, die Aminopeptidase I-Aktivität enthielten, wurden durch SDS-PAGE analysiert und anschließend vereinigt.
Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I ergab eine Bande mit einem Molekulargewicht von 67 kDa.
Beispiel 5: Aminosäuresequenzierung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I (67 kDa)
Proben der gereinigten Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I, beschrieben in Beispiel 2, wurden unter Verwendung eines 8 bis 16 % Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgels elektrophoresiert und anschließend unter Verwendung von 10 mM CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure), pH 11, in 10 % Methanol 2 h mittels Blotting auf eine PVDF-Membran transferiert. Die PVDF-Membran wurde mit 0,1 % Coommassie-Blau R-250 in 40 % Methanol/1 % Essigsäure für 20 s angefärbt und in 50 % Ethanol entfärbt, um die Proteinbanden zu beobachten. Die Hauptbande von 67 kDa wurde ausgeschnitten und einer Amino-terminalen Sequenzierung auf einem Applied Biosystems Proteinsequenzierer, Modell 476A, unter Verwendung einer Blot-Patrone und Flüssigphasen-TFA-Abgabe nach den Anweisungen des Herstellers unterzogen. Es wurde festgestellt, dass das Protein für die Edman-Sequenzierung N-terminal blockiert war.
Eine 1,0 ml Probe der gereinigten, in Beispiel 2 beschriebenen Aminopeptidase I wurde auf einem Savant Speed Vac AS 160 getrocknet und anschließend mit 300 μl 70 % Ameisensäure (wässrig) rekonstituiert. Einige Kristalle von Cyanogenbromid wurden zugesetzt und bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht inkubiert. Die Probe wurde wieder in dem Speed Vac getrocknet und in Tricin-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA, USA) rekonstituiert. Die Cyanogenbromid-Spaltfragmente wurden unter Verwendung eines 10- bis 20 %igen Tricin-SDS-Polyacrylamidgels in Banden von 42, 30, 17, 15, 10, 6 und 4 kDa getrennt und mittels Blotting auf eine PVDF-Membran transferiert. Die 6-, 10-, 15-, 17-, 30- und 42-kDa-Banden wurden ausgeschnitten und einer Amino-terminalen Sequenzierung unterzogen. Die N-terminalen Sequenzen der 15-, 10- und 6-kDa-Banden wurden erhalten und zeigten die folgenden Sequenzen:
15 kDa: AVPIAHGVPDAQDVPYPG (SEQ-ID. Nr. 2)
10 kDa: AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI (SEQ-ID. Nr. 2)
6 kDa: GSIGLEHHRSSENQQEPKSLTDWAA (SEQ-ID. Nr. 2)
Die gereinigte Aminopeptidase wurde auch teilweise mit Endoproteinase Glu-C wie folgt verdaut: 7,5 μl 0,125 M Tris-HCl, pH 6,7, enthaltend 2,5 % SDS, wurde zu 60 μl konzentrierter Aminopeptidase in 0,125 M Tris-HCl, pH 6,7, gegeben. Die Probe wurde gemischt, 2 min gekocht und sodann 15 min bei 23 °C gekühlt. Anschließend wurden 10 μl Endoproteinase Glu-C Sequenzierungsqualität (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bei einer Konzentration von 400 μg/ml in 0,125 M Tris-HCl, pH 6,7, zugesetzt. Die Probe wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 45 μl 2X Tricin-SDS-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA, USA) zugesetzt, und die Probe wurde 5 h gekocht.
Die Peptidfragmente wurden unter Verwendung von 10 bis 20 % Noves-Tris-Tricingelen unter reduzierenden Bedingungen getrennt. Die Peptidbanden wurden beobachtet und bei 40, 30, 25, 22, 20, 17, 10, 6, 5 und 4 kDa ausgeschnitten. Die Sequenzierung der 40-, 30- und 10-kDa-Banden ergab, dass sie sehr gemischt waren. Die 17- und 22-kDa-Banden waren vermischt, allerdings mit einer Hauptsequenz von FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV (SEQ-ID. Nr. 2).
Beispiel 6: Charakterisierung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I (67 kDa)
Stammlösungen von jeweils 100 mg para-Nitroanilid pro ml Dimethylsulfoxid wurden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bis auf Konzentrationen von 2 mg pro ml verdünnt. Wo die Substrate unvollständig löslich waren, wurden ihre Suspensionen verwendet (angedeutet durch einen Stern in Tabelle 2, nachstehend). Die Reaktion der Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I, jeweils mit para-Nitroanilid, wurde gestartet, wenn ein 10-μl-Aliquot der Enzymlösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, zu 190 μl einer Substratlösung in einer 96-Well-Mikrotiterplatte zugesetzt wurde. Die Analyse der Ausgangshydrolysegeschwindigkeiten der para-Nitroanilide wurde bei 405 nm und 25 °C auf einem THERMOmax Mikroplattenleser (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA) aufgezeichnet. Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigten, dass die Aminopeptidase I vorzugsweise Ala-pNA, aber auch Gly-pNA, hydrolysierte. Allerdings hydrolysierte die Aminopeptidase I unter den Dipeptidsubstraten Gly-Phe-pNA schneller als Ala-Ala-pNA. Tabelle 2 Substratspezifität von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I

Aminosäure-p-Nitroanilide relative Aktivität (%)

Ala 100

Met 24

Gly* 20

Leu 18,5

Glu* 6

Asp 4,5

Lys 6

Ile 0,5

Val 0,5

Phe* 0

Pro 0
Das pH-Optimum für die 67-kDa-Aminopeptidase I wurde unter Anwendung des folgenden Protokolls bestimmt. Die Pufferlösungen bei verschiedenen pH-Werten wurden durch Zugabe von destilliertem Wasser zu 4,25 g Natriumacetat und 3,78 g Tris (freie Base) zu einem Endvolumen von 250 ml und Einstellen des pH auf 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 5,80, 5,5 und 5,0 mit 36,5 bis 38 % HCl hergestellt. Bei jedem pH wurden Aliquote von 10 ml entnommen. Ein 20-μl-Volumen einer 100 mg/ml Lösung von Ala-pNA in DMSO wurde zu 980 μl Pufferlösung zugesetzt. Der pH für die Pufferlösungen wurde anschließend nach der Zugabe des Substrats als 8,5, 8,0, 7,57, 7,30, 7,09, 6,68, 6,14 und 5,25 bestimmt. Eine weitere Lösung von Substrat bei einer Konzentration von 2 mg/ml wurde bei den verschiedenen pH-Werten hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl Enzymlösung, 5-fach verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, zu 200 μl Substrat bei den verschiedenen pH-Werten bei Raumtemperatur gestartet und bei 405 nm aufgezeichnet.
Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass die Aminopeptidase I ein pH-Optimum im Bereich von 5,3 bis 8,5, stärker bevorzugt im Bereich von 7,0 bis 7,5 (siehe 1) aufwies. Es existierte keine nachweisbare Autohydrolyse von Ala-pNA im pH-Bereich von 5,25 bis 8,5. Bei pH 5,5 folge die durch die Aminopeptidase I katalysierte Hydrolyse von Ala-pNA nicht der Michaelis-Menten-Kinetik, wobei die scheinbaren K_m und V_max- Werte aufgrund der Aktivierung des Enzyms durch ein Substrat negative Werte aufwiesen. Bei pH 7,5 betrug der K_m-Wert 2,5 mM. Tabelle 3 pH-Profil von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I

pH relative Aktivität (%)

5,25 24,9

6,14 56,4

6,68 78,4

7,09 99,4

7,30 100

7,57 92,8

8,0 61

8,49 24,2
Das Temperaturoptimum wurde unter Verwendung von Ala-pNA als Substrat in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, innerhalb des Temperaturbereichs von 30 °C bis 55 °C bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aminopeptidase I ein Temperaturoptimum im Bereich von 35 °C bis 46 °C und stärker bevorzugt im Bereich von 40 °C bis 45 °C bei pH 7,5 (siehe 2) aufweist.
Die Temperaturstabilität der Aminopeptidase I wurde durch Inkubieren des Enzyms für 20 Minuten in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, bei Temperaturen im Bereich von 35 °C bis 55 °C und anschließendes Abkühlen auf Eis und Messung der Restaktivität unter Verwendung von Ala-pNA als Substrat bei pH 7,5, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigten (siehe 3), dass die Aminopeptidase I bis zu 40 °C bei pH 7,5 etwa 100 % stabil war. Bei 45 °C behielt das Enzym etwa 60 % Restaktivität bei, während das Enzym bei 50 °C vollständig inaktiviert war.
Beispiel 7: Vergleich zwischen der DH-Zunahmewirkung von roher und gereinigter Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I
Die DH-Zunahmewirkung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I (67 kDa) wurde durch Hydrolyse von Sojaprotein bewertet und mit der Leistung des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Rohenzympulvers verglichen.
Der Hydrolysegrad (DH) des Sojaproteins wurde wie folgt bestimmt. Der DH, definiert wie bei Adler-Nissen beschrieben (1986, Enzymid Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers), wurde durch Umsetzung des Überstands mit OPA (ortho-Phthaldialdehyd, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), im Wesentlichen wie von Church et al., 1983, Journal of Dairy Science 66: 1219–1227 beschrieben, mit den wie von Adler-Nissen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 27: 1256–1262, bestimmten Korrekturfaktoren bestimmt.
Die Aminopeptidase I wurde in zunehmender Dosis entweder zu einem niedrigen Hintergrund (1,5 % des Substratproteins) oder zu einem hohen Hintergrund (6 % des Substratproteins) von FLAVOURZYME 1000L^TM und einer Dosis von ALCALASE 2,4L^® von 1,5 % des Substratproteins gegeben. Die Experimente wurden, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt:
Die Hydrolyse wurde auf einer 10-ml-Skala bei 50 °C 18 h durchgeführt. Der Anfangs-pH betrug ohne pH-Einstellung während der Hydrolyse 7. Die Inaktivierung des Enzyms wurde bei 85 °C für 3 min in einem Wasserbad durchgeführt. Die Substratkonzentration betrug 2 % Protein aus Sojabohnenmehl. Das Substrat wurde in einem Wasserbad bei 85 °C für 3 min wärmebehandelt. Die mit FLAVOURZYME 1000L^TM und ALCALASE 2,4L^®, vorstehend beschrieben, verwendeten Enzyme waren rohes Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Pulver (siehe Beispiel 1) und die gereinigte Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I, beschrieben in Beispiel 4.
Die Aminopeptidase I-Dosierungen, die angewandt wurden, beruhten auf den Alanyl-Aminopeptidaseeinheiten (AAU), die durch die Hydrolyse von Ala-pNA bei pH 7,5 bestimmt wurden. Eine AAU-Einheit der Aminopeptidase I ist als die Menge eines Enzyms definiert, die 1,0 μmol Ala-pNA/min in einer 9,1 mM Lösung von Ala-pNA bei 7,5, 22 °C und einer Ionenstärke von = 0,05 hydrolysiert.
Die spezifische Aktivität der gereinigten Aminopeptidase I betrug etwa 12 AAU pro mg Enzym. Darum entsprach eine Dosis von 0,24 AAU pro 200 mg Sojaprotein beispielsweise 0,1 g Enzym pro kg Sojaprotein.
Der DH als Funktion der Dosis von AAU ist in 4 für geringe Hintergrunddosierungen von FAVORZYME^TM und in 5 für eine hohe Hintergrunddosierung von FLAVOURZYME^TM gezeigt.
4 und 5 zeigen, dass die Hydrolysate der Sättigung mit Aminopeptidase I-Aktivität bei den höchsten Dosierungen von AAU nahe kamen. Das Rohenzym war in der Lage, den DH von 44 % auf 72 % zu steigern, wenn es einer geringen Dosis von FLAVOURZYME^TM zugesetzt wurde. Die gereinigte Aminopeptidase I erhöhte den DH auf 61 % bis 62 %. Somit war die gereinigte Aminopeptidase I für (62–44)/(72–44) × 100 % = 64 % des DH-Zunahme effekts des Rohenzyms verantwortlich. Das Rohenzym steigerte den DH von 61 % auf 77 %, wenn es einer hohen Dosis von FLAVOURZYME^TM zugesetzt wurde. Die gereinigte Aminopeptidase I erhöhte den DH auf 71 %. Somit war gereinigte Aminopeptidase I für (71–61)/(77–61) × 100 % = 63 % des Zunahmeeffekts des rohen Enzyms verantwortlich.
Eine Alternative zur Zugabe von Aminopeptidase I ist die Zugabe von mehr FLAVOURZYME^TM. Die Zugabe von 0,5 % zusätzlichem FLAVOURZYME^TM zu der Hintergrunddosierung von 1,5 % erhöhte den DH von 44 % auf 48 %. Die Wirkung der Zugabe von Aminopeptidase I wurde als (62–48)/(72–48) × 100 % = 58 % der Wirkung des Rohenzyms berechnet.
Gleichermaßen erhöhte die Zugabe von 1 % zusätzlichem FLAVOURZYME^TM zu der Hintergrunddosierung von 6 % FLAVOURZYME^TM den DH von 61 % auf 63 %. Die Wirkung der Aminopeptidase I wurde als (71–63)/(77–63) × 100 % = 57 % der Wirkung des Rohenzyms beschrieben.
Der höchste DH, der erhalten wurde, betrug 77 %. Der DH-Wert beruhte auf Gesamtprotein und nicht auf löslichem Protein. Die Proteinlöslichkeit betrug etwa 85 %. Darum betrug der DH in dem löslichen Protein ca. 91 %, was sehr nahe an 100 % lag.
Die relative Zunahme in % in den einzelnen freien Aminosäuren (FAA) aufgrund von AAU-Zugaben sind in Tabelle 4 gezeigt. Hyp, Methioninsulfonsäure und Trp wurden aufgrund sehr fluktuierender und unsicherer Ergebnisse nicht in die Tabelle aufgenommen. Tabelle 4 Relative Zunahme an FAA durch die Zugabe von Aminopeptidasen in %
Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn rohe oder gereinigte Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I zugesetzt wurde, Gly die Aminosäure war, die die höchste Zunahme zeigte. Ande re Aminosäuren, die eine verstärkte Freisetzung zeigten, waren Ala, Glu, Gln, Asp und Ser, allerdings setzte anscheinend das Rohenzym für diese Aminosäuren mehr als die gereinigte Aminopeptidase I allein frei, wahrscheinlich aufgrund der Gegenwart von anderen Aminopeptidasen in dem Rohenzym.
Ein Hydrolysat mit hohem DH wurde unter Verwendung einer hohen Dosis an FLAVOURZYME^TM hergestellt. Der gleiche hohe DH und Freisetzung von FAA wurden unter Verwendung von niedrig dosiertem FLAVOURZYME^TM, angereichert mit 67-kDa-Aminopeptidase I oder dem Rohenzym, erhalten. Nach Tabelle 4 besitzt ein Hydrolysat, das unter Verwendung von niedrig dosiertem FLAVOURZYME^TM, angereichert mit 67-kDa-Aminopeptidase I, eine höhere Konzentration, insbesondere an Gly, jedoch auch an Ala, Glu und Asp, und eine niedrigere Konzentration an Met, Pro und Ile im Vergleich mit Hydrolysaten, die unter Verwendung von hoch dosiertem FLAVOURZYME^TM allein erhalten wurden.
Beispiel 8: DH-Zunahmewirkung von Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I bei der Gelatine-Hydrolyse
Die DH-Zunahmewirkung der Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I wurde bei der Gelatine-Hydrolyse getestet.
Die Aminopeptidase I wurde in zunehmender Dosis zu entweder einem niedrigen oder hohen Hintergrund von FLAVOURZYME^TM und ALCALASE^®, wie in Beispiel 7 ausgeführt, zugesetzt.
Die Hydrolyse wurde in 200-μl-Reaktionen in Eppendorf-Röhrchen durchgeführt. Das Substrat Gelatine (Merck) wurde bei 85 °C 5 min in destilliertem Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf 50 °C wurde der pH auf 6,5 eingestellt. Die Gelatine-Endkonzentration wurde nach Zugabe der Enzyme auf 2 % eingestellt. Die Substratkonzentration bei jeder Reaktion wurde als 4 mg berechnet.
Die mit FLAVOURZYME^TM und ALCALASE^® verwendeten Enzyme waren rohes Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Pulver und gereinigte Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I, wie in Beispiel 7. Die Glycinaminopeptidase-Einheit (GAPU) sowohl von rohem als auch gereinigtem Enzym wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, bei 37 °C unter Verwendung von Gly-pNA als Substrat gemessen. Aminopeptidase I wurde bei 37 °C in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) getestet. Gly-pNA (Bachem Feinchemikalien AG, Bubendorf, Schweiz) wurde in 40 % Dioxan bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml gelöst, und 1,5 Volumina 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) wurden zu einer Substratkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Die Enzymprobe wurde in 500 μl des gleichen Puffers verdünnt, und 100 μl der Substratlösung wurden zugesetzt und bei 37 °C 5 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 300 μl 1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0, beendet. Für die Leerprobe wurde die Stopplösung der Enzymlösung zugesetzt und bei 37 °C 5 min inkubiert, und sodann wurde die Substratlösung zugesetzt. Die Extinktion bei 410 nm wurde sowohl für die Probe als auch die Leerprobe gemessen. Die Enzymaktivität wurde unter Verwendung des molekularen Extinktionskoeffizienten bei 410 nm für pNA als 9480 M^–1 cm^–1 berechnet. Eine Einheit von GAPU wurde als die Menge an Enzym definiert, die 1 mmol Gly-pNA bei 37 °C pro min unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen hydrolysiert. Die spezifischen Aktivitäten der rohen und gereinigten verwendeten Aminopeptidase I betrugen 0,725 GAPU/mg bzw. 6,45 GAPU/mg. Die Enzyme wurden gemäß dem Schema in Tabelle 5 den 4 mg Protein zugesetzt. Tabelle 5
Die Enzym-/Substratverhältnisse sind nach den als Gewicht angegebenen Mengen der Enzyme in Klammern angegeben.
Die Hydrolysereaktionen wurden 18 h bei 50 °C durchgeführt. Die Enzyme wurden 5 min bei 85 °C inaktiviert und anschließend zentrifugiert. Der DH wurde auf der Grundlage des Gesamtproteingehalts des Hydrolysats unter Anwendung des OPA-Verfahrens berechnet.
Die DH-Zunahmewirkung von gereinigter Aminopeptidase, die in den 6 und 7 gezeigt ist, zeigte, dass die Zugabe des rohen und des gereinigten Enzyms (0,2 U/4 mg Gelatine) zu dem niedrigen FLAVOURZYME^TM-Hintergrund, den DH von 38 % auf 67 % bzw. 61 steigerte. Die DH-Zunahmewirkung war bei dieser Dosis fast gesättigt.
Wurde die Dosis an FLAVOURZYME^TM bis auf 7 % erhöht, erhöhte sich der Kontroll-DH auf 43 %. Allerdings betrug der mit gereinigter Aminopeptidase I erhaltene DH 61 %, was fast mit denjenigen zusammenfiel, die bei dem niedrigen FLAVOURZYME^TM-Hintergrund erhalten wurden.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I Proteine bis zu einem extrem hohen DH hydrolysiert. Außerdem kann die Dosis von anderen proteolytischen Enzymen unter Verwendung von Aminopeptidase I vermindert werden, um den gleichen DH zu erhalten.
Beispiel 9: Herstellung von Sonden für die Sphingomonas capsulata B46-Aminopeptidase I-Genidentifizierung
Auf der Grundlage interner Aminosäuresequenzen der nachstehend gezeigten Sphingomonas capsulata B46-Aminopeptidase I wurden degenerierte Primer zur Amplifikation von Sonden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) synthetisiert, um das Sphingomonas capsulata B46-Aminopeptidase I-Gen zu identifizieren.
Internes Peptid AB0713: AVNGDAYDADKLKGAITNAKTGNPGAGRPI (SEQ-ID. Nr. 2) Internes Peptid AB0781: FKDEPNPYDKARMADAKVLSLFNSLGVTLDKDGKV (SEQ-ID. Nr. 2)
Die mit 550-39-1, 550-23-4 und 550-39-2 bezeichneten Primer, die nachstehend gezeigt sind, wurden bei den nachstehend beschriebenen Amplifikationsreaktionen verwendet.
550-23-4: 5'-gcrtcrtangcrtcncc-3' (SEQ-ID. Nr. 3)
550-39-1: 5'-aargaygarccnaaycc-3' (SEQ-ID. Nr. 4)
550-39-2: 5'-acyttytcrtcyttrtc-3' (SEQ-ID. Nr. 5)
Die Amplifikationsreaktionen wurden in 50-μl-Volumina mit 50 pmol von einem der Primer 550-39-1 und 550-23-4 oder 550-39-1 und 550-39-2, 1 μg Sphingomonas capsulata B46 Chromosomen-DNA als Templat, 1X PCR-Puffer (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 200 M jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 0,5 U AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA) hergestellt. Chromosomale Sphingomonas capsulata B46-DNA wurde unter Anwendung des in Qiagen Genomic Handbook beschriebenen Bakterien-Isolierungsprotokolls (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) isoliert. Die Reaktionen wurden in einem Stratagene Robocycler 40 (Stratagene, La Jolla, CA), der auf 1 Cyclus bei 95 °C für 10 min, jeweils 35Cyclen für 1 min bei 95 °C, 44 °C für 1 min und 72 °C für 1 min und 1 Cyclus bei 72 °C für 7 min programmiert war, inkubiert.
Die Amplifikation mit den Primern 550-39-1 und 550-39-2 ergab ein 100-bp-Produkt, das als 100bp bezeichnet wurde und mit den Primern 550-39-1 und 550-23-4 ergab sich ein 191-bp-Produkt, das als 191bp bezeichnet wurde. Beide PCR-Produkte wurden individuell in den Vektor pCR2.1/TOPO aus dem TOPO/TA Cloning Kit (Invitrogen, Inc., La Jolla, CA) nach den Anweisungen des Herstellers kloniert. Die Sequenzierung mit einem Applied Biosystems Sequenzierer, Modell 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA) zeigte, dass die Sequenz des 100 pb Produkts in dem 191 by Produkt enthalten war, was anzeigte, dass die Aminosäuresequenz AB0713 etwa 30 Aminosäuren stromaufwärts von der Aminosäuresequenz AB0781 liegt.
Eine neue Serie von nicht-degenerierten Primern, bezeichnet als 550-71-2 und 550-79-1, die nachstehend beschrieben ist, wurde anschließend verwendet, um die DIG-markierten Sonden von 191bp unter Verwendung des Genius System PCR DIG Probe Synthesis Kits (Boehringer-Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) nach den Anweisungen des Herstellers in einem Stratagene Robocycler 40 (Stratagene, La Jolla, CA), programmiert auf 1 Cylus bei 95 °C für 2 min, 25 Cyclen jeweils bei 95 °C für 1 min, 56 °C für 1 min und 72 °C für 1 min, und 1 Cyclus bei 72 °C für 7 min, durch PCR zu amplifizieren.
550-71-2: 5'-cttttcgtccttgtccagc-3' (SEQ-ID. Nr. 6)
550-79-1: 5'-gcgtcatatgcgtctcc-3' (SEQ-ID. Nr. 7)
Beispiel 10: Screening der chromosomen Bibliotheken
Die in Beispiel 9 beschriebene Sonde 191bp wurde zum Screening einer chromosomen Bibliothek von Sphingomonas capsulata B46 verwendet. Die Bibliothek wurde durch Ligation von durch Sau 3A teilweiser verdauter (5–7 kb) Sphingomonas capsulata B46 chromosomaler DNA in die Bam HI-Stellen des Vektors pSJ1678 (8) konstruiert. Escherichia coli XL1 Blue MR (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) wurde mit der chromosomalen Bibliothek transformiert und durch Kolonienabhebungen unter Verwendung der DIG-markierten 191bp-Sonde, hergestellt mit dem Genius DIG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling & Detection System (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), nach den Anweisungen des Hersteller gescreent. Nach dem Screening von etwa 5000 Kolonien hybridisierten 5 Kolonien an die Sonde, und die resultierenden Plasmide wurden als pMRT004.1-7, pMRT004.1-14, pMRT004.1-15, pMRT004.1-16 und pMRT004.1-17 bezeichnet. Die Plasmid-DNA aus sämtlichen positiven Klonen wurde unter Verwendung eines QIAGEN Miniprep Plasmid Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) hergestellt. Die Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA mit Restriktionsendonuclease- Pst I auf einem 1 %igen Agarosegel zeigte an, dass das Plasmid pMRT004.1-7 ein Insert von etwa 6 kb enthielt, dass das Plasmid pMRT004.1-14 ein Insert von etwa 5,6 kb enthielt, dass das Plasmid pMRT004.1-15 ein Insert von etwa 8,5 kb enthielt, dass das Plasmid pMRT004.1-16 ein Insert von etwa 8,6 kb enthielt und dass das Plasmid pMRT004.1-17 ein Insert von etwa 7,2 kb enthielt. Dieses Gel wurde weiter durch Southern-Hybridisierung mit dem Genius DIG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling & Detection System nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der DIG-markierten 191bp-Sonde analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die DIG-markierte 191bp-Sonde an etwa 3500 bp-Fragmente in pMRT004.1-7, pMRT004.1-14, pMRT004.1-16 und pMRT004.1-17 hybridisierte, während sie nur an ein etwa 1600-pb-Fragment in pMRT004.1-15 hybridisierte.
Plasmid-DNA aus pMRT004.1-7 und pMRT004.1-14 wurde unter Verwendung eines QIA-GEN Maxiprep Plasmid Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) hergestellt. DNA aus pMRT004.1-7 wurde anschließend der Sequenzierung unterzogen. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem automatischen Applied Biosystems DNA-Sequenzierer, Modell 377 XL, unter Verwendung der Kettenabbruch-Synthese mit Farbstoffen durchgeführt. Zusammenhängende Sequenzen wurden unter Verwendung einer Transposon-Insertionsstrategie (Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa ein Drittel des Aminopeptidase I-Gens in Richtung des N-Terminus des Proteins aus diesem Klon fehlte. Somit wurde der Rest des Aminopeptidase I-Gens durch Sequenzieren des Klons pMRT004.1-14 erhalten, der anscheinend das gesamte Aminopeptidase I-Gen enthielt, basierend auf der Restriktionsanalyse mit Ava I, Sph I und Eco RI.
Beispiel 11: Isolierung des Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Gens mittels PCR
Die PCR wurde eingesetzt, um das Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Gen als Nru I/Bgl II-Fragment aus dem Klon pMRT004.1-14, der in Beispiel 10 beschrieben wurde, zu isolieren. Die Amplifikation wurde mit den Primern 591-35-1 und 591-36-1, die nachstehend beschrieben sind, durchgeführt. Die Amplifikationsreaktionen wurden in 50-μ- Volumina mit 50 pmol der Primer 591-35-1 und 591-36-1, 10 ng pMRT004.1-14 Plasmid-DNA als Templat, 1X PCR-Puffer (Perkin-Elmer, Foster City, CA), jeweils 200 μM dATP. dCTP, dGTP und dTTP, 1 μl DMSO und 0,5 U AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA) hergestellt. Die Reaktionen wurden in einem Stratagene Robocycler 40 (Stratagene, La Jolla, CA), programmiert für 1 Cyclus bei 95 °C für 10 min, jeweils 30 Cyclen bei 95 °C für 1,5 min, 55 °C für 1,5 min, und 72 °C für 3 min, und 1 Cyclus bei 72 °C für 7 min, inkubiert.
591-35-1: 5'-cgaatcggccagatctccatcg-3' (SEQ-ID. Nr. 8)
591-36-1: 5'-gatcctggcgcagctcgcgaaggcgcagg-3' (SEQ-ID. Nr. 9)
Die Amplifikation ergab ein 2100 pb-PCR-Produkt. Das 2100-bp-Produkt wurde in pCR2.1/TOPO aus dem Invitrogen TOPO/TA Cloning Kit nach den Anweisungen des Herstellers kloniert und, wie bereits beschrieben, sequenziert. Dieser neue Klon wurde als pMRT010-4 bezeichnet. Der Vergleich der aus pMRT010-4 abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz der Aminopeptidase I aus pMRT004.1-14 zeigte, dass sie identisch waren. Allerdings enthielt pMRT010-4 auf DNA-Niveau eine stille Punktmutation in der Aminosäureposition 170, die das Kodon ggt, welches ein Glycin codiert, in ggc änderte, welches ebenfalls ein Glycin codiert.
Der Aminopeptidase I-Klon codierte ein offenes Leseraster von 2019 bp, welcher ein Polypeptid von 673 Aminosäuren codierte. Die Nukleotidsequenz (SEQ-ID. Nr. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ-ID. Nr. 2) sind in 9 gezeigt. Unter Anwendung des Signale Programms (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1–6) mit Ausschlusswerten für max. C, max. Y, max. S bzw. Mean S von 0,42, 0,34, 0,95 bzw. 0,55 wurde ein Signalpeptid von 32 Resten vorhergesagt, das daher ein Molekulargewicht von etwa 70600 Dalton für die sezernierte Aminopeptidase I anzeigte. Somit besteht die reife Aminopeptidase I aus 641 Aminosäuren.
Ein Vergleichsalignment der Aminopeptidasesequenzen wurde unter Verwendung des Proteindatenbasis-Suchprogramms BLAST 2.0 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) mit den folgenden Argumenten vorgenommen: blastall -p blastp -a 4 -e 10 -E 0 -v 500 -b 250 -I [query file] -d prot_all, wobei -p sich auf den Programmnamen bezieht, -a sich auf die Anzahl der zu verwendenden Prozessoren bezieht, -e sich auf den Erwartungswert bezieht, -E sich auf die Kosten zur Extension eines Spalts bezieht, -v sich auf die Anzahl von Online-Beschreibungen bezieht, -b sich auf die Anzahl der gezeigten Alignments bezieht, -I sich auf die Suchdatei bezieht und -d sich auf die zur Suche verwendeten Datenbasis bezieht.
Die BLAST-Suche ergab, dass sich die Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Regionen mit einer Identität von 23 % mit einem hypothetischen 67-kDa-Protein aus Synechocystis sp. (Zugangsnummer Q55449) teilt.
Beispiel 12: Klonieren des Sphingomonas capsulata-Aminopeptidase I-Gens in den Bacillus-Expressionsvektor pPL2419CAsub2-P_ter/498
Die Strategie zur Expression und Sekretion der Aminopeptidase I in Bacillus subtilis bestand darin, die Region des Aminopeptidasegens zu klonieren, die die reife Region des Proteins hinter einem starken Promotor und einer grampositiven Signalsequenz, im Raster, in einem Bacillus-Integrationsvektor codiert. Das Plasmid pCAsub2-P_ter/498 wurde zur Expression und Sekretion gewählt, da es einen starken Promotor, P_ter, und eine grampositive Signalsequenz aus der Bacillus-Protease PD498 (US-Patent Nr. 5,621,089) codiert. Dieses Plasmid wurde bereits durch Verdau des Plasmids p498-5 (US-Patent Nr. 5,621,089) mit Sph I konstruiert, und das 2500 bp-Fragment, das die P_ter/498-Expressionkassette enthielt, wurde in die Sph I-Stelle von pIC20R kloniert (Marsh et al., 1984, Gene 32: 481–485), um pIC20R-P_ter/498 zu generieren. Anschließend wurde pIC20R-P_ter/498 mit HindIII und BamHI verdaut, und das 2500-bp-Fragment, das die P_ter/498-Expressionskassette enthielt, wurde in die HindIII/BamHI-Stelle von pSJ2882 (WO 98/22598) kloniert, um pSJ2882-P_ter/498 zu generieren. pSJ2882-P_ter/498 wurde mit HindIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Ende zu erzeugen und anschließend mit BamHI verdaut. Das 2500 bp-Fragment, das die P_ter/498-Expressionskassette enthielt, wurde sodann in die NotI (aufgefüllt mit dem Klenow-Fragment)/BamHI-Stelle des Integrationsvektors pCAsub2 (WO 98/22598) kloniert, um pCAsub2-P_ter/498 zu generieren.
Damit der finale Integrationsvektor das Aminopeptidase I-Gen enthält, wurde die Plasmid-DNA aus pCAsub2-P_ter/498 mit MscI und BglII verdaut, und die Plasmid-DNA aus pMRT010-4 wurde mit NruI und BglII verdaut. Das 8000 bp-MscI/BglII-Fragment aus pCAsub2-P_ter/498 und das 2100 bp-NruI/BglII-Fragment aus pMRT010-4 wurden auf 1 %igen A- garosegelen isoliert und mit dem QIAGEN Agarose DNA Gel Extraction Kit II (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Ligation dieser beiden Fragmente wurde unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN) durchgeführt, um den Integrationsvektor pMRT014-1 (10) zu generieren, der direkt in Bacillus subtilis PL1801-spoIIE-Zellen nach dem Verfahren von Petit et al., 1990, supra, übergeführt wurde. Die Transformanten wurden auf Chloramphenicol-Resistenz selektiert. Bacillus subtilis PL1801-spoIIE ist Bacillus subtilis 168 (Bacillus Stock Center, Columbus, OH) mit Deletionen der Gene apr und npr und einer Tn917-Insertion in das spoIIE-Gen). Die Transformanten wurden auf Trypton-Blutagarbasis-(TBAB)-Platten aufgestrichen, die 5 μg/ml Chloramphenicol enthielten, und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Genom-DNA aus einem Transformanten, bezeichnet als Bacillus subtilis 1801IIe::pMRT014-1, wurde unter Anwendung des Bakterienisolierungsprotokolls, das im Qiagen Genomic Handbook (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) beschrieben ist, isoliert. Die genomische DNA aus Bacillus subtilis 1801IIe::pMRT014-1 wurde in Bacillus subtilis 164Δ5 (WO 98/22598), wie vorstehend beschrieben, transformiert. Ein Transformant, der als Bacillus subtilis A164Δ5::pMRT014-1 bezeichnet wurde, wurde dreimal auf TBAB-Agarplatten, enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol, amplifiziert.
Beispiel 13: Expression des Sphingomonas capsulata B46-Aminopeptidase I-Gens in Bacillus subtilis
Bacillus subtilis A164Δ5::pMRT014-1 wurde in Schüttelkolben, enthaltend 50 ml PS-1-Medium, bestehend aus 10 % Saccharose, 4 % Sojabohnenmehl, 0,42 % wasserfreiem Dinatriumphosphat, 0,01 % Pluronicsäure und 0,5 % Calciumcarbonat, bei 37 °C und 250 U/min 4 Tage zweifach kultiviert. Zusätzlich wurde Bacillus subtilis A164ΔS::pCAsub2, der den Integrationsvektor enthielt, als negative Kontrolle verwendet.
Proben von 1 ml aus jedem Kolben wurden nach 24, 48 und 72 Stunden entnommen. Die Lebensfähigkeit und Stabilität der Aminopeptidase I-Integration wurde durch Plattenausstrich auf Luria-Bertani-(LB)-Platten und anschließendes Patching auf TBAB, enthaltend 30 μg/ml Chloramphenicol, bestätigt. In jedem Fall war die Integration zu 100 % stabil, wie durch das Wachstum über Nacht auf den Patch-Kolonien auf den TBAB-Platten gezeigt.
Die SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung von Novex 8–16 % Tris-Glycin Precast Gels-1,0 mm × 12 Well und Novex DryEase Mini Gel Drying System (Novel Experimental Technology, San Diego, CA) wurde auf 12 μl Überstand aus jedem Kolben nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, um die Expressionsniveaus zu bestimmen. Die Expressionsniveaus für den getesteten Stamm wurden auch spektralphotometrisch über Aminopeptidase-Plattentests unter Verwendung von L-Ala-pNA als Substrat bestimmt. Die SDS-PAGE-Gel-Daten unterstützten die spektralphotometrischen Daten insofern, als die Aminopeptidase I-Expression für Bacillus subtilis A164Δ5::pMRT014-1 beobachtet wurde, wobei die höchste Expression bei 48 h festgestellt wurde.
Hinterlegung von biologischem Material
Das folgende biologische Material wurde unter den Richtlinien des Budapester Vertrags in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt und es wurde die folgende Zugangsnummer verteilt:
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung soll nicht im Umfang durch die hier offenbarten speziellen Ausführungsformen eingeschränkt werden, da diese Ausführungsformen als Erläuterungen der verschiedenen Aspekte der Erfindung gedacht sind. Alle entsprechenden Ausführungsformen sollen im Umfang der Erfindung liegen. In der Tat werden den Fachleuten aus der vorhergehenden Beschreibung diverse Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen klar. Solche Modifikationen sollen in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen. Im Konfliktfall ist die vorliegende Offenbarung einschließlich der Definitionen kontrollierend.
Es werden hier verschiedene Referenzen zitiert, deren Offenbarungen hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Angaben über einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT-Regel 13')

Claims

Isoliertes Polypeptid mit Aminopeptidase-Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 70 % Identität mit den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2; (b) einem Polypeptid, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen mit (i) der Nucleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1 oder (ii) ihrem komplementären Strang oder einer Untersequenz davon von mindestens 100 Nucleotiden hybridisiert; (c) einem Fragment von (a) oder (b), wobei das Fragment Aminopeptidase-Aktivität besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 70 % Identität mit den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2 aufweist, derart, dass mindestens 80 % und vorzugsweise mindestens 95 % Identität mit den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2 bestehen.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2.
Polypeptid nach Anspruch 1, bestehend aus der Aminosäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 2 oder einem Fragment davon, wie einem Fragment, das aus den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen mit der Nucleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1 oder ihrem komplementären Strang oder mit einer Untersequenz davon von mindestens 100 Nucleotiden hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 1, das (a) Aminopeptidase-Aktivität in dem pH-Bereich zwischen pH 5,0 bis 8,5, gemessen bei 37 °C, aufweist, (b) einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 7,4 bis 8,5 aufweist; (c) Aminopeptidase-Aktivität in dem Temperaturbereich von 20 bis 55 °C aufweist, gemessen bei pH 7,5 unter Verwendung von Gly-pNA in Tris-HCl-Puffer; (d) Ala-pNA, Gly-pNA, Leu-pNA, Glu-pNA, Asp-pNA, Lys-pNA, Ile-pNA und Val-pNA hydrolysiert; (e) weder Phe-pNA noch Pro-pNA hydrolysiert; (f) durch Phenylmethansulfonylfluorid nicht gehemmt wird, durch EDTA, Diisopropylfluorphosphat, p-Chlormercuribenzoesäure und Iodessigsäure leicht gehemmt wird, durch o-Phenanthrolin vollständig gehemmt wird; und/oder (g) aus einem Stamm, der Sphingomonas angehört, erhalten wird und eine Molekülmasse von 67 ± 5 kDa aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das aus dem Stamm Sphingomonas erhalten wird.
Polypeptid nach Anspruch 7, das aus dem Stamm Sphingomonas capsulata erhalten wird.
Polypeptid nach Anspruch 1, das von der Nucleinsäuresequenz codiert wird, die in dem Plasmid pMRT004.1-14 enthalten ist, das in E. coli NRRL B-30032 enthalten ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das mindestens 20 % der Aminopeptidase-Aktivität der SEQ-ID. Nr. 2 besitzt.
Isolierte Nucleinsäuresequenz, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Isolierte Nucleinsäuresequenz, umfassend eine Nucleinsäuresequenz mit mindestens einer Mutation in der reifen Polypeptid-codierenden Nucleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1, wobei die mutierte Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2 besteht.
Nucleinsäurekonstrukt, umfassend die Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 11 bis 12, operabel verknüpft mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen, die die Produktion des Polypeptids in einem geeigneten Expressionswirt steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor, der das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer mutierten Nucleinsäuresequenz, umfassend (a) Einbringen mindestens einer Mutation in die reife Polypeptidcodierende Sequenz der SEQ-ID. Nr. 1, wobei die mutierte Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, bestehend aus den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2; und (b) Gewinnen der mutierten Nucleinsäuresequenz.
Mutierte Nucleinsäuresequenz, die nach dem Verfahren nach Anspruch 16 erzeugt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren eines Stamms, umfassend die mutierte Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 17, die das Polypeptid codiert, zur Herstellung eines Überstands, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend (a) Kultivieren eines Stamms zur Herstellung eines Überstands, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Polypeptid, das durch das Verfahren nach Anspruch 19 hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid unter Bedingungen codiert, die zur Herstellung des Polypeptids geeignet sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Polypeptid, das durch das Verfahren nach Anspruch 21 hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Herstellung des Polypeptids geeignet sind, wobei die Wirtszelle eine mutierte Nucleinsäuresequenz der SEQ-ID. Nr. 1 mit mindestens einer Mutation in der reifen Polypeptidcodierenden Sequenz der SEQ-ID. Nr. 1 umfasst, wobei die mutierte Nucleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, bestehend aus den Aminosäuren 33 bis 673 der SEQ-ID. Nr. 2, und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Polypeptid, das durch das Verfahren nach Anspruch 23 hergestellt wurde.
Nucleinsäurekonstrukt, umfassend ein Gen, das ein Protein codiert, das mit einer Nucleinsäuresequenz operabel verknüpft ist, die ein Signalpeptid codiert, das aus den Nucleotiden 574 bis 669 der SEQ-ID. Nr. 1 besteht, wobei das Gen für die Nucleinsäuresequenz fremd ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 25.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 25.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend (a) Kultivieren der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 27 unter Bedingungen, die für die Herstellung des Proteins geeignet sind; und (b) Gewinnen des Proteins.