DE69736389T2

DE69736389T2 - Proteine mit zellulase-aktivitäten und prozess für ihre herstellung

Info

Publication number: DE69736389T2
Application number: DE69736389T
Authority: DE
Inventors: National Inst. of Bioscience Takashi Tsukuba-shi YAMANOBE; Meiji Seika Kaisha Ltd. Manabu Odawara-shi WATANABE; Meiji Seika Kaisha Toru Sakado-shi HAMAYA; Meiji Seika Kaisha Ltd. Naomi Odawara-shi SUMIDA; Meiji Seika Kaisha Ltd. Kaoru Odawara-shi AOYAGI; Meiji Seika Kaisha Ltd. Takeshi Odawara-shi MURAKAMI
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2007-08-02
Also published as: WO1997033982A1; DE69736389D1; EP0927756A1; DE69736389T8; AU1941597A; EP0927756A4; ATE334195T1; US6127160A; EP0927756B1; JP3962805B2

Description

Technischer Bereich
Diese Erfindung betrifft ein Protein mit Cellulase-Aktivität und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Insbesondere betrifft sie eine DNA, welche für ein Protein mit Cellulase-Aktivität kodiert, einen Expressionsvektor, welcher die DNA enthält, einen Mikroorganismus, der mit dem Expressionsvektor transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit verstärkter Cellulase-Aktivität, welches den Mikroorganismus verwendet.
Stand der Technik
Cellulose stellt eine Hauptkomponente der Pflanzen dar und kommt in der Natur häufig vor. Da Cellulose ein schwer abbaubares, hoch molekulares Polysaccharid ist, welches eine Wiederholungseinheit enthält, die durch eine β-1,4-glykosidische Bindung polymerisiert ist, ist die Entwicklung von Cellulasen, die die Glykosid-Bindung von Cellulose spalten, wodurch eine wirksame Extraktion der Glucose-Einheit erleichtert wird, wesentlich für eine effektive Nutzung der Cellulose-Biomasse.
Die Terminologie "Cellulase" ist eine allgemeine Bezeichnung für eine Gruppe von Enzymen, die ein enzymatisches Reaktionssystem katalysieren, in dem Cellulose zu Glucose, Cellobiose oder Cellooligosaccharide abgebaut wird. Zu Cellulasen zählen Arten, die entsprechend ihrer Wirkungsweise als C₁-Enzym, C_x-Enzym, β-Glucosidase, Exo-β-Glucanase, Endo-β-Glucanase, Cellobiase usw. bezeichnet werden, wobei die Einzelheiten bisher nicht aufgeklärt sind.
Es wurde die Nutzung von Biomasse durch Verwendung von Cellulase untersucht. Insbesondere gab die Ölkrise in den 70er Jahren Anlass zur technologischen Entwicklung effektiver Nutzung von Pflanzen-Biomasse zur konstanten Bereitstellung von Rohmaterialien für Energie, industrielle Stoffe, Nahrungsmittel usw..
Des Weiteren ist Cellulase als industrielle Enzym-Präparation auf dem Markt und wird als Hauptkomponente verschiedener Produkte, wie beispielsweise Waschmittel, Faserbehandlungsmittel, Nahrungsmittel-Zusatzstoffe und verdauungsfördernde Mittel, verwendet. Aus diesem Grund ist Cellulase in der Praxis von großem Nutzen.
In der oben geschilderten Situation führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Studien bezüglich enzymatischer Verzuckerung von Cellulose durch, wobei es ihnen gelang, den Pilz Acremonium cellulolyticus Y-94 zu isolieren, welcher entsprechend dem Budapester Vertrag im "National Institute of Bioscience & Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology" (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, JAPAN) unter der internationalen Hinterlegungsnummer FERM BP-5826, überführt aus der ursprünglichen Hinterlegung (FERM P-6867, hinterlegt am 12. Januar 1983), am 19. Februar 1997 hinterlegt wurde; dieser Pilz ist in der Lage, Cellulase zu produzieren, wie in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 43954/85 beschrieben ist.
Die von diesem Stamm produzierte Cellulase ist ein komplexes Enzymsystem (im Folgenden gelegentlich als Cellulase-System bezeichnet), welches hauptsächlich aus drei Enzymgruppen besteht: C₁-Enzyme in Form von Avicellase oder FPase, C_x-Enzyme, die auf Carboxymethyl-Cellulose (CMC) wirken, und β-Glykosidase, die auf Cellooligosaccharide, wie beispielsweise Cellubiose, wirkt. Natürliche Cellulose kann am Ende durch diese zusammenwirkenden Enzymgruppen vollständig zu Glucose abgebaut werden. Die Eigenschaften des oben beschriebenen Cellulase-Systems sind in der oben zitierten Veröffentlichung beschrieben.
Das Cellulase-System ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine höhere β-Glykosidase-Aktivität aufweist als die Cellulase, die ihren Ursprung in den bisher isolierten Mikroorganismen der Gattung Trichoderma oder Aspergillus hat; aus diesem Grund ist sie erfolgreicher beim Abbau von Cellulose zu Glucose. Jedoch liegen keinerlei Informationen beispielsweise bezüglich der Identifikation des Proteins, welches das von Acremonium cellulolyticus Y-94 produzierte Cellulase-System bildet, der Aminosäuresequenz des Proteins und der DNA-Sequenz des für die Aminosäuresequenz kodierenden Gens vor.
EP 0312121 beschreibt Cellulasen aus Trichoderma reseei; Sheppard P. O. et al., "The use of conserved cellulose family-specific sequences to clone cellulose homologue cDNAs from Fusarium oxysporum", GENE 150, 163-167, 1994, beschreiben die Klonierung von Cellulasen aus Fusarium oxysporum; JP-A-59166081 beschreibt einen Stamm der Gattung Acremonium; und Yamanobe T. et al., "Purification of Endo-1,4-β-glucanase Components from Fungal Strain Y-94", Agric. Biol. Chem., 54(2), 301-307, 1990, beschreiben die Reinigung verschiedener Cellulase-Enzyme aus dem Pilz Y-94.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten intensive Studien durch, um die Aminosäuresequenz des Proteins, welches das Cellulase-System von Acremonium cellulolyticus Y-94 bildet, zu analysieren, das Gen zu klonieren, das für die Komponenten des Cellulase-Systems kodiert, und eine Technik zu etablieren, bei der ein klonales Gen in den obigen Stamm eingebracht wird, um eine Cellulase mit verstärkter Avicellase-Aktivität herzustellen. Im Ergebnis konnte ein neues und äußerst nützliches Cellulase-Gen aus dem Y-94-Stamm isoliert werden und in einen Mikroorganismus eingeführt werden, wodurch Transformation induziert wurde, die es ermöglicht, Cellulase in großer Menge durch Genexpression zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, welches einen Teil oder die gesamte in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 1 aufgeführte Aminosequenz aufweist, und welches Cellulase-Aktivität aufweist, eine DNA, die für das Protein kodiert, eine DNA-Sequenz, die einen Teil oder die gesamte in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 2 aufgeführte DNA-Sequenz aufweist, einen Expressionsvektor, welcher die DNA enthält, einen Mikroorganismus, der durch den Expressionsvektor transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Cellulase-Aktivität, welches den Mikroorganismus verwendet.
Das erfindungsgemäße Protein mit Cellulase-Aktivität weist die in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführte Aminosäuresequenz auf. Dieses Protein hat seinen Ursprung in dem oben beschriebenen Pilz der Gattung Acremonium. Das Protein, das die in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführte Sequenz von der 21sten Aminosäure bis zur 457sten Aminosäure aufweist, ist ein Reifungsprotein, welches gelegentlich als Cellulase ACC2 bezeichnet wird. Das Gen für die Cellulase ACC2 wird gelegentlich als Cellulase-ACC2-Gen bezeichnet. Von der Sequenz von der 1sten bis zur 20sten Aminosäure der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 angegebenen Sequenz wird angenommen, dass es sich dabei um ein Signalpeptid handelt.
Cellulase ACC2 wirkt auf hochkristalline unlösliche Cellulose, wie beispielsweise Avicel, wodurch reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose und Cellobiose, erzeugt werden. Sie weist ein Molekulargewicht von ungefähr 63 KD (Kilodalton), gemessen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (im Folgenden mit SDS-PAGE abgekürzt), und einen isoelektrischen Punkt bei pI 4,8 auf und besitzt starke Avicel-abbauende Wirkung, insbesondere im sauren Bereich.
Proteine, die einen Teil der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweisen und auch Cellulase-Aktivität besitzen, werden ebenso von dem erfindungsgemäßen Protein umfasst.
Zu spezifischen Beispielen für das erfindungsgemäße Protein mit Cellulase-Aktivität zählen Proteine mit der Aminosäuresequenz von der 21sten bis zur 457sten Aminosäure der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführten Sequenz und Proteine mit der Aminosäuresequenz von der 21sten bis 457sten Aminosäure der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführten Sequenz, bei denen die Aminosäuresequenz von der 1sten bis zur 20sten Aminosäure an den N-Terminus angefügt ist.
Die Aminosäuresequenz des oben beschriebenen Proteins kann folgendermaßen bestimmt werden.
(1) Reinigung der Cellulase ACC2
Acremonium cellulolyticus Y-94 wird kultiviert; eine Fraktion der Kultur, welche Avicellase-Aktivität aufweist, wird soweit gereinigt, dass die resultierende Cellulase-ACC2-Fraktion in SDS-PAGE eine einzige Bande ergibt.
(2) Bestimmung der N-terminalen und inneren Aminosäurereste
Die in dem obigen Schritt (1) erhaltene Cellulase ACC2 wird mit verschiedenen proteolytischen Enzymen (d. h., Proteinase und Peptidase) behandelt; die Aminosäuresequenz der resultierenden Peptide wird mit Hilfe einer Aminosäure-Sequenziervorrichtung bestimmt.
Ein Vergleich der so bestimmten Aminosäuresequenz des Proteins mit Cellulase-Aktivität mit der Sequenz anderer Cellulase-Arten, wie sie in der "Protein Identification Resource" (PIR) R44,0, März 1995, registriert sind, ergibt kein Protein mit der gleichen Aminosäuresequenz, was bestätigt, dass es sich um ein neues Protein handelt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine DNA zur Verfügung, die für die Aminosäuresequenz des obigen Proteins kodiert. Die DNA umfasst typischerweise einen Teil oder die gesamte der in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 2 aufgeführten DNA-Sequenz.
Die in der Sequenzliste unter SEQ ID: 2 aufgeführte DNA-Sequenz hat ihren Ursprung in der chromosomalen DNA von Acremonium cellulolyticus; sie weist ein offenes Leseraster (ORF) auf, das mit ATG an Position 241 beginnt und mit TAG an Position 1941 endet.
Die Sequenz von Base 301 bis Base 1938 entspricht dem oben bezeichneten Reifungsprotein, bestehend aus 437 Aminosäureresten. Es wurde bestätigt, dass 5 Introns in der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 2 aufgeführten DNA-Sequenz vorliegen (siehe Beispiel 7 unten).
Wenn die Aminosäuresequenz eines Proteins vorliegt, kann die DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, leicht daraus gefolgert werden; eine passende DNA-Sequenz kann aus verschiedenen DNA-Sequenzen, die für die gesamte oder einen Teil der in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführten Aminosäuresequenz kodieren, ausgewählt werden. Demgemäß umfasst die "DNA, die für einen Teil oder die gesamte in der Sequenzliste unter SEQ ID: 1 aufgeführte Aminsosäuresequenz kodiert" nicht nur die DNA, die teilweise oder insgesamt die in der Sequenzliste unter SEQ ID: 2 aufgeführte DNA-Sequenz aufweist, sondern ebenso DNA mit anderen Codons, die für die gleiche Aminosäure kodieren (degenerierte Codons).
Die DNA-Sequenz des Gens, das für das erfindungsgemäße Protein mit Cellulase-Aktivität kodiert, unterscheidet sich von allen bisher klonierten und analysierten Cellulase-Genen. Dies wurde durch Vergleich mit Cellualse-Genen, die in der Nukleinsäure-Datenbank "GenBank" (registrierte Handelsbezeichnung) R88.0, Apr., 1995, registriert sind, bestätigt.
Die DNA mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die Synthese der DNA kann durchgeführt werden, indem ein Teil natürlich vorkommender DNA verwendet wird.
Die DNA kann typischerweise aus einer genomischen Bibliothek oder cDNA-Bibliothek von Acremonium cellulolyticus durch üblicherweise auf dem Gebiet der Gentechnik angewendete Verfahren, beispielsweise durch ein Screening-Verfahren unter Verwendung einer geeigneten DNA-Sonde, die auf der Basis der Information einer Teil- Aminosäuresequenz hergestellt wurde, erhalten werden. Die DNA kann ebenso aus dem oben beschriebenen hinterlegten Stamm erhalten werden.
Die erfindungsgemäße DNA kann folgendermaßen bestimmt werden.
(1) Herstellung einer DNA-Sonde zur Klonierung
Acremonium cellulolyticus Y-94 wird kultiviert und die produzierte Cellulase wird durch verschiedene chromatografische Techniken, die Cellulase-Aktivität als Maß verwenden, gereinigt. Dann wird die gereinigte Cellulase durch verschiedene proteolytische Enzyme abgebaut und die Aminosäuresequenz der resultierenden Peptide auf einer Aminosäure-Sequenziervorrichtung bestimmt.
Es wird eine Mischung von Oligonukleotiden hergestellt, welche alle DNA-Sequenzen enthält, die aus der bestimmten Aminosäuresequenz vorausgesagt werden können. Die DNA-Sequenzen werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das resultierende Oligonukleotid wird als Sonde verwendet.
(2) Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek
Acremonium cellulolyticus Y-94 wird kultiviert und die gesamte DNA aus den gesammelten mikrobiellen Zellen präpariert. Die erhaltene DNA wird durch ein Restriktionsenzym verdaut. Unter Verwendung der resultierenden DNA wird eine genomische Phagen-Bibliothek hergestellt.
(3) Klonierung des Cellulase-Gens
Die im obigen Schritt (2) hergestellte Bibliothek und das durch PCR amplifizierte Fragment werden hybridisiert und positive Plaques selektiert.
(4) Bestimmung der DNA-Sequenz
Der so selektierte Phagen-Klon wird in einen Vektor für E. coli subkloniert und die DNA-Sequenz der DNA auf einer DNA-Sequenziervorrichtung bestimmt.
Außerdem wird die aus Acremonium cellulolyticus Y-94 erhaltene mRNA mit einer reversen Transkriptase behandelt, um cDNA zu synthetisieren; die cDNA des ACC2-Gens wird durch das PCR-Verfahren erhalten. Ein Vergleich zwischen der Gesamt-DNA-Sequenz der cDNA und der oben beschriebenen DNA-Sequenz des Genoms zeigt die Existenz von Introns und das Leseraster (siehe Beispiel 7 und SEQ ID NO: 2 in der Sequenzliste).
Die vorliegende Erfindung stellt einen Expressionsvektor zur Verfügung, welcher die obige erfindungsgemäße DNA in einem Wirts-Mikroorganismus replizieren kann und das durch diese DNA kodierte Protein in einer exprimierbaren Form enthält. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Mikroorganismus zur Verfügung, der mit dem Expressionsvektor transformiert ist.
Das Wirts-Vektor-System ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise können Systeme, die E. coli, Strahlenpilze, Hefen, Schimmelpilze usw. verwenden, und fusionierte Protein-Expressions-Systeme aus dem Wirtsprotein und einem weiteren Protein verwendet werden. Zu geeigneten Wirts-Mikroorganismen zählen E. coli, Hefen der Gattung Saccharomyces und Pilze der Gattung Trichoderma, Aspergillus oder Acremonium. Zu geeigneten Vektoren zählen Plasmide, die zur autonomen Replikation in E. coli fähig sind, wie beispielsweise pBR322, pUC (bevorzugt pUC18) und pBluescript, und solche, die zur autonomen Replikation in Hefe fähig sind, wie beispielsweise pYEUra3.
Der erfindungsgemäße Vektor kann durch Methoden und Verfahren, wie sie üblicherweise in der Gentechnologie angewendet werden, erhalten werden.
Damit der erfindungsgemäße Expressionsvektor in einen Wirts-Mikroorganismus eingeführt werden und das gewünschte Protein exprimieren kann, kann der Expressionsvektor zusätzlich zu der erfindungs gemäßen DNA eine DNA zur Expressionskontrolle oder einen genetischen Marker zur Selektion des Mikrooganismus enthalten.
Da angenommen wird, dass die in der Sequenzliste unter SEQ ID: 2 aufgeführte DNA-Sequenz eine derartige regulatorische Sequenz enthält, scheint die Verwendung dieser DNA-Sequenz in einigen Fällen vorteilhaft zu sein.
Der Expressionsvektor kann die Cellulase-kodierende DNA in einer Tandem-Wiederholung enthalten. Diese Sequenzen können in dem Expressionsvektor in konventioneller Weise vorliegen. Die Transformation eines Mikroorganismus mit dem Vektor kann auf übliche Weise durchgeführt werden. Beispielweise wird das Cellulase-ACC2-Gen zusammen mit einem selektiven genetischen Marker in ein Plasmid eingebracht und das resultierende Plasmid durch Protoplasten in Acremonium cellulolyticus eingeführt. Der resultierende Transformand ist resistent gegen den Selektionsmarker und weist verbesserte Cellulase-Aktivität auf.
Der so erhaltene Transformand wird in einem geeigneten Medium kultiviert; das erfindungsgemäße Protein kann aus der Kultur isoliert werden. Die Kultivierungsbedingungen für den Transformanden werden in Abhängigkeit des verwendeten Mikroorganismus entsprechend ausgewählt. Die Gewinnung durch Aufreinigung des Proteins aus der Kultur kann auf übliche Weise durchgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte eines 7 kb großen SalI-verdauten Fragments.
2 zeigt die Struktur des Plasmids pAC2-5.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden detailliert anhand von Beispielen veranschaulicht; die Erfindung ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Beispiel 1:
Aufreinigung von Cellulase ACC2:
Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) wurde in einem Cellulase-induzierenden Medium (4 % Cellulose, 1 % Bacto Pepton, 0,6 % Kaliumnitrat, 0,2 % Harnstoff, 0,16 % Kaliumchlorid, 0,12 % Magnesiumsulfat, 1,2 % primäres Kaliumphosphat, 0,001 % Zinksulfat, 0,001 % Mangansulfat, 0,001 % Kupfersulfat (pH 4,0)), kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand sprühgetrocknet, wodurch ein rohes Cellulase-Pulver erhalten wurde. Das Pulver (50 g) wurde in Wasser (500 ml) gelöst und durch einen Membranfilter von 0,45 μm filtriert.
Die resultierende Enzymlösung wurde durch eine Q-Sepharose-Hochleistungs-Säule (60 × 100 mm), equilibriert mit 5 mM Acetatpuffer (pH 5,8), unter Verwendung des "Biopilot"-Systems (hergestellt von Pharmacia Biotec), geschickt. Die Enzymlösung wurde unter den obigen Pufferbedingungen adsorbiert und die nicht-adsorbierte Fraktion als Fraktion 1 erhalten. Die Fraktion 1 wurde entsalzt, durch Ultrafiltration konzentriert (fraktioniertes Molekulargewicht: 5000) und gefriergetrocknet.
Die gefriergetrocknete Fraktion 1 wurde in einem 20 mM Tris-Essigsäure-Puffer (pH 7,4), enthaltend 1,2 M Ammoniumsulfat, gelöst und anschließend durch den gleichen Membranfilter, der oben verwendet wurde, filtriert. Das Filtrat wurde wiederum durch die obige Säule geschickt und mit einem 20 mM Tris-Essigsäure-Puffer (pH 7,4) mit einem Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten eluiert. Die Fraktion mit Avicellase-Aktivität (Ammoniumsulfat-Konzentration: 0,3 bis 0,5 M) wurde gesammelt. Die Fraktion zeigte in der SDS-PAGE fast ausschließ lich eine einzige Bande des Proteins ACC2 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 63 KD.
Beispiel 2:
(1) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz:
Das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte Protein (ACC2) wurde mit Pyroglutaminsäure-Aminopeptidase aus Rinderleber (erhältlich von Boehringer Mannheim) gemäß dem Verfahren von Podell, D. N. et al., (Podell, D. N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 81, P. 176 (1978)) behandelt, um den modifizierten N-terminalen Rest zu entfernen; die folgenden 9 Aminosäurereste der N-terminalen Seite wurden mit Hilfe einer Protein-Sequenziervorrichtung Modell 492 (hergestellt von Perkin-Elmer) bestimmt. Die 9 Aminosäuren lange Sequenz ist in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 3 wiedergegeben.
(2) Peptid-Mappierung
Um die innere Aminosäuresequenz des Proteins zu bestimmen, wurde das in Beispiel 1 erhaltene Protein (gefriergetrocknet) mit V8-Protease (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einem 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer (pH 7,8), mit Lysyl-Endopeptidase (hergestellt von Seikagaku Corporation) in einem 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) und mit Trypsin (hergestellt von Sigma) in einem 100 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer (pH 8,0) behandelt. Jede Reaktion wurde bei 37 °C über Nacht durchgeführt. Jedes Enzym wurde in einer Menge von ungefähr 1/50 Mol Substrat verwendet.
Das Zersetzungsprodukt wurde Säulenchromatographie (Säule: C8 220 × 2,1 mm) unter Verwendung eines präparativen HPLC-Systems Model 172μ (hergestellt von Perkin-Elmer) unterzogen. Die Gradienten-Eluierung wurde mit Wasser-Acetonitril (5 bis 35 %) durchgeführt, wodurch 7 Arten von Peptiden erhalten wurden. Die Amonisäuresequenz jedes Peptids wurde mit der Protein-Sequenziervorrichtung Modell 492 bestimmt. Die resultierenden Sequenzen sind als SEQ ID NO: 4 bis 10 in der Sequenzliste wiedergegeben.
Diese Aminosäuresequenzen zeigen Homologie zu der Aminosäuresequenz des Cellobiohydrase-II (cbh-II)-Proteins von Trichoderma reesei (Chung Mong Cen et al., Bio/Technology, Vol. 5, pp. 274-278 (1987)), was deutlich darauf hinweist, dass das obige Protein eine Art Cellulase ist.
Die obigen Sequenzen wurden außerdem mit denen anderer Cellulase-Arten, die in der "Protein Identification Resource" (PIR) R44,0 (März 1995) registriert sind, verglichen. Einige registrierte Sequenzen (z. B. cbh-II) waren homolog, jedoch nicht identisch mit diesen Sequenzen, was bestätigte, dass das obige Protein neu ist.
Beispiel 3:
(1) Isolierung der genomischen DNA
Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) wurde in einem (S) Medium (2 % Bouillon, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % Glucose) bei 32 °C 2 Tage kultiviert; die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und gesammelt. Die Zellen wurden mit flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Homogenisator AM-3 (hergestellt von Nihon Seiki K. K.) zerkleinert. Die zerkleinerten Zellen wurden in einem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 1 mM EDTA), enthaltend 1 % SDS, suspendiert und bei 65 °C 30 Minuten inkubiert. Das System wurde mit Phenol behandelt, in Ethanol ausgefällt, mit Proteinase K und Ribonuklease A behandelt und einer Trennung in einer präparativen Ultrazentrifuge 65P7 (hergestellt von Hitachi Koki Co., Ltd.) gemäß einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren unterzogen, um die DNA zu erhalten.
(2) Herstellung der Primer
Es wurden Primer, die dem 1sten bis 5ten Aminosäurerest des Peptids Lys-39 (SEQ ID NO: 9 in der Sequenzliste) und dem 1sten bis 6s0ten Aminosäurerest des Peptids Trp-30 (SEQ ID NO: 10 in der Sequenzliste) entsprechen, synthetisiert. Unter der Annahme, dass das Peptid Lys-39 näher am N-Terminus positioniert ist als das Peptid Trp-30 (auf der Grundlage der Veröffentlichung von Chung Mong Cen et al., Bio/Technology, Vol. 5, pp. 274-278 (1987)), wurden Oligonukleotide mit den jeweiligen in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 11 bis 16 wiedergegebenen Sequenzen synthetisiert. Die Primer für die DNA, die dem Peptid Lys-39 entspricht, wurden aus den Nukleotiden für Lysin, eine durch Lysyl-Endopeptidase erkannte Aminosäure, synthetisiert.
(3) Herstellung einer langkettigen Sonde durch das PCR-Verfahren
Es wurde eine langkettige DNA-Sonde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der in dem obigen Schritt (1) hergestellten Gesamt-DNA von Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) als Template hergestellt.
Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt. Zu 1 μg der in dem obigen Schritt (1) erhaltenen genomischen DNA wurden 1 μM von jedem der in dem obigen Schritt (2) hergestellten Primer gegeben; die DNA wurde bei 94 °C für 10 Minuten in Gegenwart von dNTP denaturiert. Danach wurde Taq-DNA-Polymerase (rekombinante Taq, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dazugegeben und das System einem Replikationszyklus, bestehend aus 1 Minute bei 94 °C, 2 Minuten bei 55 °C und 3 Minuten bei 72 °C, unterworfen. Der Replikationszyklus wurde 30 mal wiederholt. Im Ergebnis wurde eine DNA von 500 bp, die eine Kombination von Lys-39B (SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste) und Trp-30A (SEQ ID NO: 13 in der Sequenzliste) oder eine Kombination von Lys-39B und Trp-30B (SEQ ID NO: 14 in der Sequenzliste) aufweist, spezifisch amplifiziert. Das resultierende DNA-Fragment wurde als Sonde in dem nachfolgenden Screening verwendet.
Beispiel 4:
Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek
Die in Beispiel 3 hergestellte genomische DNA von Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) wurde mit Sau3AI partiell verdaut. Das resultierende DNA-Fragment wurde unter Verwendung von T4-Ligase (Ligation Kit Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) an den BamHI-Arm des Phagen-Vektors λEMBL3 "Cloning Kit" (hergestellt von Stratagene) ligiert. Die ligierte DNA wurde in Ethanol ausgefällt und in TE-Puffer gelöst. Die gesamte Menge der Ligations-Mischung wurde unter Verwendung von "Giga Pack II Packaging Kit" (hergestellt von Stratagene) in Phagen gepackt, wodurch infektiöse Phagenpartikel gebildet wurden. Die resultierende Phase wurde in E. coli XL1-Blue MRA (P2) eingeimpft.
Die Klonierung des gewünschten Gens wurde unter Verwendung der resultierenden Bibliothek aus 7,5 × 10⁴ Phagen-Partikeln durchgeführt.
Beispiel 5:
Klonierung des Cellulase-ACC2-Gens:
(1) Screening durch Plaque-Hybridisierung
Das in Beispiel 3 erhaltene, PCR-amplifizierte DNA-Fragment von 500 bp wurde zunächst in Übereinstimmung mit dem "ECL-Direkt-System" (hergestellt von Amersham) markiert.
Die in Beispiel 4 gebildeten Phagen-Plaques wurden auf eine "Hibond-N⁺-Nylon"-Transfer-Membran (hergestellt von Amersham) überführt, mit Alkali denaturiert, mit 5-fach konzentriertem SSC gewaschen (SSC: 15 mM tertiäres Natriumzitrat, 150 mM Natriumchlorid) und zur Immobilisierung der DNA an der Nylon-Membran getrocknet. Gemäß den Anweisungen des Kits wurde nach der Prä-Hybridisierung (42 °C, 1 Stunde) die markierte DNA-Sonde dazugegeben und die Hybridisierung bei 42 °C über 4 Stunden durchgeführt. Die Sonde wurde gemäß den Anweisungen des Kits gewaschen.
Die gewaschene Nylon-Membran wurde für 1 Minute in die im Kit enthaltene Detektionslösung getaucht und dann mit "Hyper-Film-ECL" des gleichen Herstellers kontaktiert. Der Film wurde licht-exponiert und entwickelt, wodurch 4 positive Klone erhalten wurden.
(2) Herstellung der Phagen-DNA
Die DNA wurde aus den positiven Klonen in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Maniatis et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) hergestellt.
LE392 als E.-coli-Wirt wurde in einem LB-Medium (1 % Bacto Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid) über Nacht kultiviert und mit einer Lösung einer Phase aus einem einzigen Plaque infiziert; anschließend wurde in einem LB-Medium über Nacht weiter inkubiert. Zu der Kultur wurden 1 M Natriumchlorid und 0,8 % Chloroform gegeben, um die Lyse von E. coli zu beschleunigen. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die restlichen mikrobiellen Zellen zu entfernen; die Phagen-Partikel wurden durch Präzipitation in Polyethylenglykol (10 % PEG 6000) gewonnen. Die Phagen-Partikel wurden mit Proteinase K (erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Gegenwart von SDS behandelt, mit Phenol extrahiert und in Ethanol ausgefällt, wodurch die Phagen-DNA gewonnen wurde.
Die so hergestellte DNA wurde durch Southern-Blotting in Übereinstimmung mit dem "ECL-Direkt-System" (hergestellt von Amersham) analysiert. Als Ergebnis der Hybridisierung unter Verwendung des durch PCR amplifizierten Fragments von Beispiel 3 als Sonde wurde das SalI-verdaute Fragment von 7 kb gemeinsam hybridisiert. Die Restriktions-Karte des SalI-verdauten Fragments ist in 1 dargestellt.
Das SalI-Fragment, das gemeinsam hybridisieren kann, wurde in pUC18 (erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd.) subkloniert. Das resultierende Plasmid wird als pAC2-1 bezeichnet.
Beispiel 6:
Bestimmung der DNA-Sequenz:
Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung von "A.L.F. DNA Sequencer II" (hergestellt von Pharmacia Biotec) bestimmt. Als Sequenzier-Gel wurde "Readymix-Gel" (hergestellt von Pharmacia Biotec) oder "Long Ranger" (hergestellt von FMC) verwendet. Zur Gelbildung wurden verschiedene Reagenzien mit A.L.F.-Qualität, hergestellt von Pharmacia Biotec (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin, Harnstoff, Ammoniumpersulfat) verwendet.
Die Reaktionen für die DNA-Sequenz-Analyse wurden mit dem "Autoread Sequencing Kit" (hergestellt von Pharmacia Biotec) durchgeführt. Die Bedingungen der Gelbildung, die Reaktionsbedingungen und die Bedingungen der Elektrophorese wurden entsprechend den in den Kits enthaltenen Anweisungen ausgewählt.
Das Template-Plasmid (im Folgenden einfach als Template bezeichnet) zur Sequenz-Bestimmung wurde durch Verdau von pAC2-1 mit PstI und Klonieren des resultierenden PstI-verdauten Fragments von 3,5 kb unter Verwendung von pUC118 hergestellt. Das derart hergestellte Plasmid (bezeichnet als pAC2-4) ist in 1 dargestellt.
Das Template wurde mit 2 M Natriumhydroxid Alkali-denaturiert und dann mit ACC2-spezifischem Sequenzier-Primer (WACC-01 bis WACC-12) hybridisiert (annealed), um eine Primer-Verlängerung (Extension) durchzuführen.
Als Ergebnis der Analyse der Reaktionsprodukte mit der Sequenzier-Vorrichtung wurde die 2196 bp lange DNA-Sequenz aus dem PstI- verdauten Fragment, wie in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 2 wiedergegeben, bestimmt.
Die DNA-Sequenzen der ACC2-spezifischen Sequenzier-Primer (WACC-01 bis WACC-12) sind in der Sequenzliste als SEQ ID NO: 17 bis 28 wiedergegeben.
Beispiel 7:
Die nicht-kodierenden Bereiche (Introns) wurden dadurch bestimmt, dass mRNA aus Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) auf übliche Weise hergestellt wurde, cDNA durch die Wirkung reverser Transkriptase synthetisiert wurde, und die DNA-Sequenz der cDNA mit chromosomaler DNA verglichen wurde.
(1) Herstellung der Gesamt-RNA
Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM-BP-5826) wurde in einem Celulase-induzierenden Medium, bevorzugt dem oben beschriebenen Celulose-haltigen (S) Medium (5 % Funacel, hergestellt von Funakoshi K. K.), bei 32 °C 2 Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kultur zentrifugiert (3500 rpm × 10 Minuten), um die mikrobiellen Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit sterilisiertem Wasser gewaschen, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mixer zerkleinert.
Die zerkleinerten Zellen wurden in einer denaturierenden Lösung, enthaltend 4 M Guanidin-Thiocyanat (4 M Guanidin-Thiocyanat, 25 mM tertiäres Natriumzitrat, 0,5 % Natrium-N-Laurylsarcosinat, 0,1 M Mercaptoethanol), suspendiert. Nach mehrminütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Zellsuspension mit 2 M Natriumacetat (pH 4,5) neutralisiert. Dann wurde TE-gesättigtes Phenol zugegeben und wieder gerührt. Dazu wurde Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) gegeben; anschließend wurde gerührt. Das System wurde zentrifugiert (3500 rpm × 10 Minuten), um die durch Phenol denaturierten Zellen zu entfernen. Die obere Schicht (wässrige Schicht) wurde gewonnen und die Nukleinsäure in Isopropylalkohol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentri fugation gesammelt (3500 rpm bei 10 Minuten), in 70 % Ethanol/Wasser resuspendiert und wiederum zentrifugiert, um den Niederschlag zu waschen.
Der Niederschlag wurde in TE-Puffer gelöst, so dass eine Nukleinsäure-Konzentration von 1 mg/ml erhalten wurde, und in 2,5 M Lithiumchlorid erneut ausgefällt (5 °C × 2 Stunden). Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (12000 rpm × 10 Minuten) gesammelt und mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, wodurch eine Gesamt-RNA-Fraktion erhalten wurde.
(2) Herstellung von Poly-A-Tail-RNA (= mRNA)
Die mRNA wurde unter Verwendung des "mRNA-Purification-Kits" (hergestellt von Pharmacia Biotec) folgendermaßen hergestellt.
Ein Milligramm der in Schritt (1) erhaltenen Gesamt-RNA wurde in 1 ml Elutionspuffer gelöst, thermisch bei 65 °C für 10 Minuten denaturiert und schnell in Eis abgekühlt. Zu der Lösung wurden 0,2 ml Probenpuffer gegeben. Die gesamte Menge der RNA-Lösung wurde durch eine Oligo(dT)-Cellulose-Säule geschickt. Nachdem die Säule nacheinander dreimal mit einem Hochsalz-Puffer und dreimal mit einem Niedrigsalz-Puffer gewaschen worden war, wurde die Säule mit dem auf 65 °C erhitzten Elutionspuffer eluiert. Diese Operation wurde einmal wiederholt, wodurch eine mRNA-Fraktion erhalten wurde.
(3) Synthese der cDNA
Die cDNA wurde unter Verwendung des "Time Saver cDNA-Synthese Kits" (hergestellt von Pharmacia Biotec) folgendermaßen synthetisiert.
In 20 μl eines Probenpuffers wurden 5 μg der mRNA gelöst und 10 Minuten auf 65 °C erhitzt. Die Lösung wurde zusammen mit einer Dithiothreitol-Lösung und einem Oligo(dT)-Primer zu dem Synthese-Mix für den ersten Strang gegeben; das Ganze wurde 1 Stunde bei 37 °C umgesetzt. Die gesamte Menge des Systems wurde zu dem Mix für den zweiten Strang gegeben und 30 Minuten bei 12 °C und anschließend 1 Stunde bei 22 °C umgesetzt, wodurch die cDNA erhalten wurde.
(4) Amplifikation der Cellulase-ACC2-cDNA durch das PCR-Verfahren
Die ACC2-cDNA wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung der Gesamt-cDNA als Template amplifiziert. Die PCR wurde unter Verwendung des "LA PCR-Kits" (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Die cDNA und Primer, ACC2n-Stu und ACC2c-Xho, wurden einem Replikationszyklus, bestehend aus 1 Minute bei 94 °C, 2 Minuten bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C, unterworfen. Der Replikationszyklus wurde 25 mal wiederholt, wodurch die ACC2-cDNA mit einer Länge von ungefähr 1,5 kb amplifiziert wurde.
Die DNA-Sequenzen der Primer ACC2n-Stu und ACC2c-Sho sind in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30 wiedergegeben.
Das durch PCR amplifizierte Fragment wurde Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, aus dem Agarosegel mit Hilfe des "Band Prep Kits" (hergestellt von Pharmacia Biotec) gewonnen und in pT7-Blue (hergestellt von Novagen) kloniert. Das resultierende Plasmid pACc2-1 wurde als Template zur Intron-Bestimmung verwendet.
(5) Bestimmung der DNA-Sequenz der cDNA
Die Sequenzierungs-Reaktionen wurden mit dem oben erwähnten "Autoread Sequencing Kit" durchgeführt. Das Plasmid pACc2-1 wurde mit 2 M Natriumhydroxid Alkali-denaturiert und in Ethanol ausgefällt. Die dem Kit beigefügten "Universal" und "Reverse" und WACC-02 und WACC-05, deren DNA-Sequenzen in der Sequenzliste unter SEQ ID NO: 18 bzw. SEQ ID NO: 21 angegeben sind, wurden als Primer verwendet und in Gegenwart von T7-Polymerase unter Verwendung des Alkalidenaturierten Plasmids als Template verlängert.
Im Ergebnis stellte sich heraus, dass 5 Introns vorliegen: 320 bis 389 bp (Intron I), 459 bis 516 bp (Intron II), 800 bis 869 bp (Intron III), 1124 bis 1198 bp (Intron IV) und 1598 bis 1651 bp (Intron V).
Die Positionen der nicht-kodierenden Start-Sequenz, nicht-kodierenden Stop-Sequenz und inneren regulatorischen Sequenz dieser Introns sind in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Beispiel 8:
Um das ACC2-Gen selbst in Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) zu klonieren, wurde pAC2-1 mit XbaI verdaut und ein DNA-Fragment mit einer Größe von 7,2 kb gewonnen. Eine Hygromycin-B-resistente Kassette aus pDH25 (Cullen, D., Leong, S. A., Wilson, L. J. und Henner, D. J., Gene, Vol. 57, pp. 21-26 (1987)) wurde in das Fragment eingefügt, um pAC2-5 als Vektor zur Tranformation von Acremonium cellulolyticus herzustellen (siehe 2).
Beispiel 9:
Tranformation von Acremonium cellulolyticus:
Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) wurde in dem oben beschriebenen (S) Medium bei 32 °C kultiviert. Nach 24-stündiger Kultivierung wurde die Kultur bei 3000 rpm 10 Minuten zentrifugiert, um die mikrobiellen Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit 0,5 M Saccharose gewaschen, in einer Zellwand-auflösenden Enzymlösung suspendiert (5 mg/ml Novozym 234, 5 mg/ml Cellulase Onozuka R-10, 0,5 M Saccharose), die durch einen Filter von 0,45 μm filtriert worden war, und bei 30 °C 60 bis 90 Minuten geschüttelt, um Protoplasten zu erhalten.
Die resultierende Suspension wurde gefiltert und bei 2500 rpm 10 Minuten zentrifugiert, um die Protoplasten zu sammeln, die dann mit einem SUTC-Puffer (0,5 M Saccharose, 10 mM Calciumchlorid, 10 M Tris-HCl (pH 7,5)) gewaschen wurden.
Die Protoplasten wurden in 1 ml des SUTC-Puffers suspendiert. Zu 100 μl der Suspension wurden 10 μl einer 1 μg/μl TE-Lösung von pAC2-5 gegeben; das System wurde 5 Minuten auf Eis stehengelassen. Dann wurden 400 μl einer PEG-Lösung (60 w/v % PEG 4000, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)) dazugegeben; das System wurde 20 Minuten auf Eis stehengelassen. Zu der Suspension wurden 10 ml eines SUTC-Puffers gegeben; das System wurde bei 2500 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Die gesammelten Protoplasten wurden in 1 ml des SUTC-Puffers suspendiert und anschließend bei 4000 rpm 5 Minuten zentrifugiert; die gesammelten Protoplasten wurden schließlich in 100 μl des SUTC-Puffers suspendiert.
Die so behandelten Protoplasten wurden auf ein (A) Medium (0,2 % Natriumnitrat, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Kaliumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,001 % Eisensulfat-Heptahydrat, 17,1 % Saccharose, 1 % Bacto-Agar (pH 6,0)), enthaltend 500 μg/ml Hygromycin B zusammen mit einem Weich-Agar-Medium (0,2 % Natriumnitrat, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Kaliumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,001 % Eisensulfat-Heptahydrat, 17,1 % Saccharose, 0,8 % Bacto-Agar (pH 6,0)), gegeben und bei 30 °C 5 bis 9 Tage kultiviert. Die gebildeten Kolonien wurden als Transformanden genommen. Auf diese Weise wurde das Plasmid pAC2-5 in Acremonium cellulolyticus Y-94 (FERM BP-5826) transformiert. Es erschienen ungefähr 2 Kolonien mit Hygromycin-B-Resistenz pro μg DNA.
Beispiel 10:
Von den in Beispiel 9 erhaltenen Transformanden wurden 2 Stämme, die eine hohe Hydromycin-B-Resistenz aufwiesen, in dem gleichen Cellulase-induzierenden Medium, das in Beispiel 1 verwendet wurde, bei 32 °C 7 Tage inkubiert; dann wurde die Kultur zentrifugiert. Die Analyse der Überstands-Flüssigkeit durch SDS-PAGE zeigte, dass die beiden Transformanden eine höhere Menge an ACC2-Protein sekretierten als der Mutterstamm.
Die Cellulase-Aktivität wurde durch Messen der Avicel-abbauenden Aktivität des Kulturüberstands gemäß dem von W. A. Wood, S. T. Kellogg, in Methods in Enzymology, Vol. 160, p. 97, "Biomass part A, Cellulose and Hemicellulose", Academic Press., beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse der Messungen sind in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, wiesen die Transformanden eine verbesserte Cellulase-Aktivität auf. Insbesondere war die spezifische Aktivität des Transformanden 2 1,5 mal höher als die des Mutterstamms.
Tabelle 2
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung offenbart somit die Aminosäuresequenz eines Proteins mit Cellulase-Aktivität und stellt die für das Protein kodierende DNA, einen die DNA enthaltenden Expressionsvektor, einen mit dem Vektor transformierten Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Cellulase-Aktivität, welches den Mikroorganismus verwendet, zur Verfügung.
Die Sequenzliste der vorliegenden Erfindung ist im Folgenden wiedergegeben.
Sequenzliste
Sequenzliste 1
Sequenzliste 2

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, welches das Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder ein Fragment davon codiert, wobei das Fragment Cellulase-Aktivität aufweist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, wobei das Protein ein Reifungsprotein ist, und das Fragment die Aminosäuresequenz von SEQ ID: 1 aufweist, welche mit dem 21sten Aminosäurerest beginnt und mit dem 457sten Aminosäurerest endet.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 2, welches die DNA-Sequenz von SEQ ID: 2 oder ein Fragment davon, welches ein Protein mit Cellulase-Aktivität codiert, aufweist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, wobei das Fragment von SEQ ID: 2 mit dem 301sten Nukleotid beginnt und mit dem 1938sten Nukleotid endet.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, wobei das Fragment von SEQ ID: 2 mit dem 241sten Nukleotid beginnt und mit dem 1941sten Nukleotid endet.
Expressionsvektor, welcher das DNA-Molekül gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
Mikroorganismus, der durch Transformation mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 6 erhalten wird und diesen enthält.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus ein Pilz ist, der zur Gattung Acremonium gehört.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Cellulase-Aktivität, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus von Anspruch 7 und das Gewinnen der Cellulase, die durch eine DNA gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird, aus der Kultur umfasst.
Protein, welches einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei der Teil Cellulase-Aktivität aufweist.
Protein gemäß Anspruch 10, wobei das Protein ein Reifungsprotein ist und ein Segment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, welches mit dem 21sten Aminosäurerest beginnt und mit dem 457sten Aminosäurerest endet.
Protein gemäß Anspruch 11, wobei das Protein an der Seite seines N-Terminus ein Segment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, welches mit dem ersten Aminosäurerest beginnt und mit dem 20sten Aminosäurerest endet.