WO1997033982A1 - Proteine ayant une activite de cellulase et son procede de production - Google Patents

Proteine ayant une activite de cellulase et son procede de production Download PDF

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WO1997033982A1
WO1997033982A1 PCT/JP1997/000824 JP9700824W WO9733982A1 WO 1997033982 A1 WO1997033982 A1 WO 1997033982A1 JP 9700824 W JP9700824 W JP 9700824W WO 9733982 A1 WO9733982 A1 WO 9733982A1
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WO
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protein
seq
dna
amino acid
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PCT/JP1997/000824
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Takashi Yamanobe
Manabu Watanabe
Toru Hamaya
Naomi Sumida
Kaoru Aoyagi
Takeshi Murakami
Original Assignee
JAPAN, represented by DIRECTOR GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Meiji Seika Kaisha Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a cellulase activity and a method for producing the same, and more particularly, to a DNA encoding a protein K having a cellulase activity, an expression vector containing the DNA, and a cell transformed with the vector. And a method for producing a protein having cellulase activity using the microorganism.
  • Cellulose is a major constituent of plants and is widely and naturally occurring. This component is a hardly decomposable high molecular weight polysaccharide that is polymerized through 3-1 and 4-glycosidic bonds with glucose as one unit. Therefore, it is essential to develop a cellulase that can efficiently extract glucose units by cleaving the glycosidic bonds of cellulose to effectively utilize cellulosic biomass.
  • Cellulase cellulose is a generic name for enzymes that catalyze the glucose or cellobiose biose Ya Seroo decomposing enzyme reaction system re pentasaccharide, C by its mode of action, an enzyme, C x enzyme, / 3 - Darco fern Ichize, There are enzymes called various names such as exo-3-glucanase, end-3-glucanase, and cellobiase. However, the actual state of cellulase is not yet clear.
  • Biomass utilization methods using cellulase have been studied.
  • technology development aimed at the effective use of plant-based biomass as an object to continuously supply raw materials such as energy, industrial materials, and feedstuffs Is becoming popular.
  • Cellulase is marketed as an industrial enzyme preparation and is used as a main component in various products such as detergents, textile processing preparations, feed additives, and digestive preparations. Therefore, cellulase is expected to be very useful in practical use.
  • Cellulase production of this strain is mainly to be represented cash by avicelase or FP ⁇ one peptidase and C, enzymes, C x enzyme typified by CM C ⁇ over zero acting on carboxymethyl cellulose (CMC), cellobiose, and the like
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • cellobiose and the like
  • the cellulase system has high cellulase-glucosidase activity derived from microorganisms belonging to the genus Trichoderma and the genus Aspergillus isolated so far, and is excellent in monosaccharide saccharification of cellulose. There is a feature.
  • the present inventors analyzed the amino acid sequence of the protein that constitutes the cellular system of Acremonium cellulolyticus Y-94 strain, and analyzed the gene encoding the cellulase component. Studies were conducted to establish a technique for the production of cellulases with enhanced avicelase activity by introducing cloned genes into this strain and further introducing cloned genes into this strain.
  • the present invention relates to a part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a protein having a cellulase activity, a DNA encoding the protein, a DNA having a part or all of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and an expression vector containing the DNA The present invention also relates to a microorganism transformed by the expression vector and a method for producing a protein having the above-mentioned cellular activity using the microorganism.
  • the protein having cellulase activity according to the present invention has a part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • This protein is derived from the aforementioned filamentous fungi of the genus Acremonium.
  • the protein having the sequence of amino acids 1 to 437 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a mature protein, and this protein is referred to as cellulase ACC 2 in the present invention.
  • the gene may be referred to as the cellulase ACC 2 ⁇ gene.
  • the 120th to 11th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is considered to be a signal peptide.
  • Cellulase ACC 2 acts on highly crystalline insoluble cellulose such as Avicel to produce reducing sugars such as glucose and cellobiose, and has a molecular weight of about 63 KD in SDS-PAGE. The dot indicates pI 4.8, especially strong abicel degradation activity in the acidic region.
  • the protein having a part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: i in the sequence listing includes, for example, addition or insertion of a part of the amino acid in the amino acid sequence.
  • Those having an amino acid sequence in which modification such as deletion, deletion or substitution has occurred, and which still retain cellulase activity are also encompassed in the protein of the present invention.
  • protein having cellulase activity of the present invention include those containing the amino acid sequence of amino acids 1 to 437 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the N-terminal of the sequence. On the other hand, those having an amino acid sequence of 120 to 11 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be mentioned.
  • amino acid sequence of a poor protein having cellulase activity can be determined as follows.
  • C. auremonium Cellulolyticus Y-94 strain is cultured, and a fraction exhibiting abiselase activity is purified from the culture to an extent that shows a single band on SDS-PAGE. And fractionate the cellulase ACC2.
  • the purified cellulase ACC2 obtained in the above (1) is treated with various proteases and peptidases, and the amino acid sequence of the obtained peptides is analyzed with a protein sequencer.
  • the amino acid sequence of a protein-poor protein having cellulase activity determined by the above method can be obtained from the amino acid sequences of other cellulases registered in the Protein Identification Resource (PIR) R44.0 March, 1995. As a result, it was confirmed that there was no identical substance and that it was a new protein.
  • PIR Protein Identification Resource
  • a DNA encoding the amino acid sequence of the above protein is provided.
  • a typical sequence of this DNA has a part or all of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is derived from the chromosomal DNA of A. cerevisiae cell mouth Riticus, and begins with the ATG at position 241, and with the TAG at position 941. It has an open reading frame that terminates (open reading frame), and the nucleotide sequence from No. 301 to No. 193 in the sequence is the same as the mature protein consisting of amino acid of 437 residues. Furthermore, it has been confirmed that five introns are present in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (see Example 7).
  • the DNA sequence encoding it can be easily deduced, and all or part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be obtained.
  • Various nucleotide sequences to be coded can be selected. Therefore, the DNA encoding a part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing according to the present invention has a part or all of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • DNAs having the same amino acid and having degenerate codons as base sequences are also included.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding a protein having cellulase activity according to the present invention is different from the nucleotide sequence of any other cellulase gene that has been cloned and identified so far. It is. This compares with the cellulase gene registered in the nucleic acid database GenBank (registered trademark), R88.0, April 1995. Has already been confirmed.
  • the DNA having the above-mentioned nucleotide sequence according to the present invention may be of natural origin or synthesized. Further, a product synthesized using a part of a product derived from a natural product may be used.
  • Typical methods for obtaining DNA include methods commonly used in the field of gene engineering from a chromosome library derived from Acremonium * cellus ticus or a cDNA library, for example, partial amino acid There is a method in which screening is performed using an appropriate DNA probe created based on the sequence information. Further, it can be obtained from the deposited strain described above.
  • the DNA base sequence according to the present invention can be determined as follows.
  • Acrymonium cellulolyticus Y-94 strain is cultured, and cellulase is purified using various chromatographic techniques with cellulase activity as an indicator. Next, the purified cellulase is degraded by various proteases, and the amino acid sequence obtained is determined by a peptide sequencer.
  • a mixture of oligonucleotides containing all the deduced nucleotide sequences is prepared, and based on this, amplification is performed by PCR, and the resulting oligos are obtained. Use nucleotides as probes.
  • Acrymonium cell mouth Liticus Y-94 strain is cultured and the total DNA is prepared from the cells obtained by harvesting the cells. After the obtained DNA is digested with restriction enzymes, a phage library of the genome is prepared using this DNA.
  • the library prepared as in (2) above is hybridized with the PCR-amplified fragment obtained in (1) above, and the obtained positive plaques are selected.
  • the phage clones selected as described above are subcloned into a vector for Escherichia coli, and the DNA sequence of the DNA is determined using a DNA sequencer.
  • an expression vector comprising the DNA according to the present invention in a state capable of replicating in a host microorganism and capable of expressing the protein encoded by the DNA. Is provided. Further, according to the present invention, there is provided a microorganism transformed by the expression vector.
  • the host-vector system is not particularly limited, and for example, a system using Escherichia coli, actinomycetes, yeast, mold, and the like, and a fusion protein expression system with other proteins using them can be used.
  • Suitable host microorganisms for the present invention include Escherichia coli, yeast of the genus Saccharomyces, Trichoderma, Aspergillus, Acremonium filamentous fungi (preferably Acremonium cellulolyticus), and the like.
  • plasmids such as pBR322, pUC (preferably pUC18) and pBluescript that can be amplified in Escherichia coli ⁇ plasmids such as pYEUra3 that can be amplified in yeast Is available.
  • the procedures and methods for constructing the vector according to the present invention may be those commonly used in the field of genetic engineering.
  • the expression vector of the present invention selects, in addition to the DNA according to the present invention, a DNA or a microorganism that controls the expression, in addition to the DNA according to the present invention, in order to actually introduce the vector into a host microorganism and express the desired protein. For example, may be included.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is considered to include these control sequences and the like, it may be advantageous to use this nucleotide sequence as it is in some cases.
  • the expression vector may contain a DNA encoding cellulase in a repetitive form (tandem). These may be present in an expression vector according to a conventional method, and a method for transforming a microorganism with this vector may be one commonly used in this field.
  • a cellulase ACC2 gene was transformed into a plasmid together with a selectable marker gene, and then protoplast-treated cells / cell mouths Transformation by introducing into Riticus. As a result, the obtained transformant is imparted with resistance to the selectable marker and has improved cellulase activity.
  • the transformant thus obtained is cultured in an appropriate medium, and the above-described protein of the present invention can be isolated from the culture to obtain the transformant.
  • the culture of the transformant and its conditions may be appropriately set according to the microorganism used.
  • the target protein can be recovered and purified from the culture solution according to a conventional method.
  • FIG. 1 is a diagram showing a restriction map of plasmid pAC 2-1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of plasmid p AC 2-5. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Acremonium eel lulolyticus Y-94 strain (FERM BP—5826) was transformed into a cellulase-inducing medium (composition: cellulose 4%, bactereptone 1%, 0.6% of potassium nitrate, 0.2% of urea, 0.16% of potassium chloride, 0.12% of magnesium sulfate, 1.2% of potassium phosphate, 1.2% of zinc sulfate %, Manganese sulfate 0.001%, copper sulfate 0.001% (pH 4.0)), and centrifuged the culture. I got the powder. 50 g of the bulk powder was dissolved in 500 ml of water and filtered through a 0.45 ⁇ m non-blanc filter.
  • This enzyme solution was equilibrated with 5 mM acetate buffer (pH 5.8) using a BioPilot system (manufactured by Pharmacia Biotech) and the Q Sepharose High Performance force ram (6 O x 100 mm).
  • the enzyme solution was adsorbed under the same buffer conditions, and the unadsorbed portion was designated as fraction 1.
  • This fraction 1 was applied to a UF membrane (molecular weight cut off 500 ), Desalted, concentrated and freeze-dried.
  • the lyophilized fraction 1 was dissolved in 2 OmM tris-acetate buffer (pH 7.4) containing 2 M ammonium sulfate, and filtered with the aforementioned membrane filter. This was applied to the same column as above, and eluted with an ammonium sulfate concentration gradient of 20 mM tris-acetate buffer (pH 7.4) to give a fraction showing avicelase activity (ammonium sulfate concentration 3 to 0). .5 M). This fraction electrophoretically contained almost exclusively a protein ACC2 having a molecular weight of about 63 KD (kilodalton) in SDS-PAGE electrophoresis.
  • Purified protein (ACC 2) obtained in Example 1 was purified according to the method of Podell, DN et al. (Podel 1, DN et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1978) 81: 176). Treatment with calf liver pyroglutamate aminopeptidase (manufactured by Boehringer Mannheim) removes the modified N-terminal residue and removes the protein from Gensa-1 Model 492 (Perkins). 9 residues from the N-terminal amino acid sequence were determined by Elma Inc.). The obtained sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Example 1 In order to determine the amino acid sequence inside the protein, the protein obtained in Example 1 was lyophilized and then subjected to V8 injection in 50 mM ammonium bicarbonate buffer (PH 7.8).
  • Thease (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 25 mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 9.0) in lysyl dendeptidase (manufactured by Seikagaku Corporation) or 100 mM ammonium bicarbonate. Trypsin (manufactured by Sigma) was added in a buffer solution (pH 8.0), and the digestion reaction was performed overnight at 37 ° C. Each enzyme was added in an amount of about 50 m 0 1 to the substrate.
  • the degradation products were subjected to column chromatography (column: C8220 x 2.1 mm) using a Model 172 preparative HPLC system (Perkin Elmer). The elution was performed with a gradient of water-acetonitrile (5 to 35%), and all seven peptides were separated. The amino acid sequence of the resulting peptide was determined using a protein sequencer Model 492. The obtained sequences are shown in SEQ ID NOs: 4 to 0 in the sequence listing.
  • amino acid sequences were derived from the amino acid sequence of the seropiohydrase 11 (cbh-11) protein obtained from Trichoderma reesei strain (Chungong Cen et al., Bio / Technology (1987), 5: 274-278) strongly suggests that this protein is a type of cellulase.
  • Acremonium cellulolyticus Y-94 strain (FERM BP-58026) was cultured in an (S) medium (composition: 2% bouillon, 0.5% yeast extract, 2% glucose) for 32%. The cells were cultured at ° C for 2 days, and the cells were collected by centrifugation. The obtained cells were frozen in liquid nitrogen and then pulverized with a homogenizer AM-3 (manufactured by Nippon Seiki). This was suspended in a TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.), 1 mM EDTA) supplemented with 1% SDS, and kept at 65 ° C for 30 minutes.
  • DNA was obtained by a cesium chloride density gradient sedimentation equilibrium method.
  • DNAs corresponding to amino acids 1 to 5 of the peptide Lys-39 (SEQ ID NO: 9) and amino acids 1 to 6 of the peptide Trp-30 (SEQ ID NO: 10) were used. Synthesized. That is, according to the report of Chung Mong Cen et al. (Chung Mong Cen et al. Bio / Technology (1987), 5: 274-278), it was concluded that the peptide Lys-39 is located N-terminal to the peptide Trp-30. As a result, synthetic oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NOS: 11 to 16 in the sequence listing were prepared. In addition, the peptide Lys-39 was targeted from the amino acid residue (lysine) recognized by lysyl dendopeptidase.
  • the DNA probe was prepared using the acrylonitrile 'cellulosic lysate prepared in (1) above.
  • a whole probe of Y-94 strain (FERMBP-58026) was amplified to PCR by PCR and used.
  • the PCR reaction was performed under the following conditions. First, 1 M of each of the primers of (2) was added to the genomic DNA 1 obtained in (1), and heat denaturation was performed at 94 for 10 minutes in the presence of dNTP. Thereafter, Taq polymerase (recombinant TaQ, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, and the reaction conditions were set at 94 for 1 minute, 55 at 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes at 30 ° C. Amplification was performed by repeating twice. As a result, 500 bp DNA is specific only with the combination of Lys-39B (SEQ ID NO: 12) and P-30A (SEQ ID NO: 13) or Lys-39B and Trp-30B (SEQ ID NO: 14). Amplified. This was used as a probe for subsequent screening.
  • the genomic DNA of the acremonium 'cellulolyticus Y-94 strain (FERMBP-58026) prepared in Example 3 was partially digested with Sau3AI. This was ligated to the BamHI arm of a phage vector, iEMBL3 Cloning Kit (Strata Gene) using T4 ligase (Lage Selection Kit Ver. 2 from Takara Shuzo). Was. This was dissolved in a TE buffer after ethanol precipitation. According to the gigapack 11 packaging kit (manufactured by Stratagene), the whole amount of the combined mixture was used to form phage particles. This phage was used to infect E. coli XL1-Blue MRA (P2) strain.
  • P2 E. coli XL1-Blue MRA
  • the target gene was cloned using 7.5 ⁇ 10 4 phage libraries obtained by this method.
  • the DNA fragment of 50 Obp amplified by the PCR method in Example 3 was labeled in advance according to the ECL direct system (Amersham).
  • the phage plaques prepared in Example 4 were transferred to Hybond N + Nylon Transform Armembran (Amersham), denatured with alkali, and then 5-fold concentrated SSC. (SSC: 15 mM sodium citrate, 150 mM sodium chloride), dried and immobilized DNA. Then, according to the method described in the kit, after 1 hour of prehybridization (at 42), the previously labeled probe was added, and hybridization was performed for 4 hours (42 ° C). The probe was cleaned according to the kit method described above.
  • the nylon membrane was immersed in the attached detection solution for 1 minute, and then exposed to the company's Hyperfilm-ECL to obtain four positive clones.
  • LE392 was used as the host E. coli. First, LE392 was cultivated in LB medium (1% Bactotropin, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride), and a single plaque-derived plasmid was added thereto. The phage solution was infected and cultured in LB medium. To this, 1 M of sodium chloride and 0.8% of black form were added to promote the lysis of E. coli. The culture was centrifuged to remove cell debris, and phage particles were collected by precipitation with PEG (10% PEG600).
  • LB medium 1% Bactotropin, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • the phage particles were digested with proteinase K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in the presence of SDS, and the phage particles were treated with phenol and precipitated with ethanol to recover the phage DNA.
  • proteinase K manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 1 shows a restriction map of the Sa1I digested fragment.
  • nucleotide sequence was analyzed using ALF DNA Sequencer ⁇ (Pharmacia Biotech).
  • ALF DNA Sequencer ⁇ an acrylamide carrier of a ready-mix gel (Pharmacia Biotech) or a hydrolink long ranger (AT Biochem) was used.
  • Various reagents for gel preparation were ALF grade reagents manufactured by Pharmaciano Biotech.
  • the base sequence firing reaction used an automated sequencing kit (Pharmacia Biotech). In addition, each of the gel preparation conditions, reaction conditions, and electrophoresis conditions was set with reference to the details of each instruction manual.
  • type I plasmid for nucleotide sequence decoding digests pAC2-1 with PstI, and converts a 3.5 kbp PstI digested fragment into pUC118. And the obtained plasmid was used as pAC2-4 (see Fig. 1).
  • the template was denatured with 2 M sodium hydroxide, and then annealed with an ACC2-specific sequence primer (WACC-001 to WACC-112) to obtain an auto-leaded sheet.
  • the extension reaction was performed according to the Gensing Kit.
  • the nucleotide sequence of the 511 fragment (2, 9 6 13 1) was determined as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the sequences of the ACC2-specific sequence primers (WACC-01 to WACC-12) are shown in SEQ ID NOs: 7 to 28 in the sequence listing.
  • mRNA was prepared from acremonium and cell mouth lyticus Y-94 strain (FERM BP-58826) by a conventional method. CDNA was synthesized using reverse transcriptase, and the same region was determined from the ratio of this to the chromosomal nucleotide sequence.
  • Acremonium Cellus ticus Y-94 strain (FERM BP-58 226) is added to a cellulase induction medium, preferably to the aforementioned (S) medium supplemented with cellulose (5% Funacell: Funakoshi).
  • S aforementioned
  • cellulose 5% Funacell: Funakoshi
  • the cells were cultured at 32 ° C for 2 hours. After culturing, remove the culture The cells were collected by centrifugation (350 rpm, 10 minutes). The cells were washed with sterile water and ground with a blender while frozen in liquid nitrogen.
  • the upper layer (aqueous layer) was recovered, and the nucleic acid was precipitated with isopropanol.
  • the precipitate was collected by centrifugation (350 rpm, 10 minutes) and washed again by centrifugation with 70% ethanol water.
  • the precipitate was dissolved in a TE buffer so as to have a nucleic acid concentration of 1 mg nom1 and then reprecipitated (2.5 V for 2 hours) with 2.5 M chloride. Next, the precipitate was recovered by centrifugation (1200 rpm, 10 minutes), washed with 70% ethanol, and used as a total RNA fraction.
  • the preparation of mRNA was performed using an mRNA pure positioning kit (Pharmacia Biotech).
  • the synthesis of cDNA was carried out using a time-saver cDNA synthesis kit (manufactured by Farmaman Abiotech).
  • RNA was dissolved in 20 ⁇ 1 of sample buffer. After heat treatment for 10 minutes at 65 ° C, dithiothreate is added to the fast-strand synthesis mix. Solution and oligo (dT) primer were added, and reacted at 37 for 1 hour. Next, the whole amount was added to a second strand mix, and the mixture was reacted at 12 ° C. for 30 minutes and then at 22 ° C. for 1 hour to obtain cDNA.
  • the PCR used was a LAPCR kit (Takara Shuzo).
  • For the primer use ACC 2n-Stu and AC C2c-Xho, and repeat the cycle 25 times for 1 minute at 94, 2 minutes at 55 ° C, and 2 minutes at 72 ° C. The reaction was performed. As a result, cDNA of ACC2 of about 1.5 kbp was widened.
  • sequences of ACC2n-Stu and ACC2c_Xho used as primers are shown in SEQ ID NOs: 29 to 30 in the sequence listing.
  • the PCR-amplified fragment was recovered from agarose according to a band prep kit (Pharmacia Biotech), cloned into pT7-Blue (Novagen) (pACc2-1), and Was used as the template for intron determination.
  • the sequencing reaction was performed using an automatic sequencing kit as described above.
  • the above brassmid pAcC2-1 was denatured with 2M sodium hydroxide and precipitated with ethanol. This denatured plasmid was used as a template and reacted with T7 polymerase.
  • the primers used were Universal and Reverse attached to the kit, and WACC-02 and WACC105 described in SEQ ID NOS: 18 and 21 in the Sequence Listing.
  • Table 1 shows the positions of the non-translation initiation sequence, its termination sequence, and the regulatory sequence inside intron.
  • Table 1 Int CIn Non-translation start sequence End sequence Regulatory sequence
  • pAC2-1 was digested with Xbal, and 7.2 kbp was digested. The fragments were recovered.
  • a hygromycin B-resistant cassette derived from pDH25 (Cullen, D., Leong, SA, Wi1son. LJ and Henner. DJ, Gene 57. 21-26, 1987) was inserted, and an acremonium was inserted.
  • PAC2-5 was prepared as a transformation vector for cellularity cas (see Fig. 2).
  • the acremonium cellulolyticus Y-94 strain (FERM BP-58 226) was cultured at 32 ° C in the above-mentioned (S) medium, and after 24 hours, at 300 rpm and 1 rpm. The cells were collected by centrifugation for 0 minutes. The obtained cells were washed with 0.5 M sucrose and filtered through a 0.45 filter. A protoplast-enzyme solution (5 mg / m 1 Novozyme 234), 5 mg Zmi “Cel lulase Onozuka R-10 ", 0.5 M sucrose). The mixture was shaken at 30 ° C. for 60 to 90 minutes to form a mycelium on the protoplast.
  • the suspension was centrifuged at 250 rp ⁇ for 10 minutes to recover the plate, and the SUTC buffer (0.5 M sucrose, 10 mM calcium chloride) was recovered. Washed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)).
  • the plate obtained as above was suspended in 1 ml of SUTC buffer, and 100 g of the PAC 2 — 5 (TE) solution of 100 g was added to 100 g of the PAC 2 — 5 (TE) solution.
  • the protoplasts treated as described above were added to hygromycin B (500 / g / m1) -supplemented (A) medium (0.2% sodium nitrate, 0.1% hydrogen phosphate 2%).
  • A -supplemented (A) medium (0.2% sodium nitrate, 0.1% hydrogen phosphate 2%).
  • plasmid pAC2-5 is introduced into Acremonium 'Cellulolyticus Y-94 (FERMBP-5826), and a strain showing resistance to hygromycin B is obtained. About 2 strains appeared per 1 g of DNA.
  • Example 9 Among the transformants obtained in Example 9, two strains having high resistance were cultured in the cellulase induction medium of Example 1 at 32 ° C. for 7 days. When the culture supernatant obtained by centrifuging the culture was analyzed by SDS-PAGE, the secretion of the ACC2 protein was higher than that of the parent strain.
  • the cellulase activity was determined by the method described in WA Wood, ST Kellogg, Methods in Enzymology, vol. 160 (WA Wood, ST Kellogg. "Methods in Enzymology, vol. 160, Biomass part A, Cellulose and The avicel degradation activity of the supernatant was measured according to "Hemicel lulose” (ACADEM IC PRESS, INC.): P97). The results are shown in Table 2. As is clear from the table, the cellulase activity of the transformant was improved. In particular, Transformant 2 exhibited 1.5 times the specific activity of the parent strain. Table 2 Avicel degradation activity (%) Transformant 110
  • the amino acid sequence of a protein having cellulase activity is clarified, DNA encoding the protein, an expression vector containing the DNA, and A transformed microorganism and a method for producing a protein having cellulase activity using the microorganism are provided.
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • J9S OJd OJd J9S J9S an J9S dJ ⁇ BIV usy J usv BIV ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ usv J 41 3 ⁇ 4IV na
  • VNCI Ma SG9 2 Rooster Leakage ,: One'a
  • Fragment type middle fragment, V8 protease fragment (V8-16)
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Fragment type middle part fragment, V8 protease fragmentation (V8-29)
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Fragment type Intermediate fragment, V8 protease degradation fragment (V8-31)
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Fragment type middle fragment, V8 protease degradation fragment (V8-37
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • Fragment type Intermediate fragment, V8 protease degradation fragment (V8-45 )
  • Organism name Acremonium celiulolyticus
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Fragment type middle fragment, trypsin decomposition fragment (Trp-30) origin
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (created from amino acid sequence, Lys-39A)
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (created from amino acid sequence, Lys-39B)
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (created from amino acid sequence, Trp-30A) Origin
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (created from amino acid sequence 'Trp-30C) Origin
  • Organism name Acremonium cellulolyticus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type synthetic DNA (created from amino acid sequence, Trp-30D)
  • Organism name Acremonium eel lulolyt icus
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus Stock Name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (WAC C-03) Origin Organism name: Acremonium eel lulolyt icus Stock name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium eel luloly t icus Stock name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (WA CC-05) origin
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus Stock name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Synthetic DNA (WA C C-08) source
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type synthetic DNA (WAC C-10) origin
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: 1 strand
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium cellulolyticus Strain name: Y-94
  • Organism name Acremonium eel lulolyt i cus
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Acremonium eel lulolyticus

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Description

明 細 書 セルラーゼ活性を有するタ ンパク質およびその製造法
技術分野
本発明は、 セルラーゼ活性を有するタンパク質およびその製造法に関し、 更に 詳細にはセルラ一ゼ活性を有するタ ンパク Kをコー ドする D N A、 該 D N Aを含 有する発現べクター、 該べクターにより形質転換された微生物並びに該微生物を 用いるセルラーゼ活性を有するタ ンパク質の製造法に関する。
背景技術
セルロースは、 植物体の主要な構成成分であり、 広く 天然に存在する。 本成分 はグルコースを 1 ュニッ 卜 とする 3— 1 ， 4 ーグリ コシ ド結合により重合した難 分解性の高分子多糖である。 従って、 セルロースのグリ コシ ド結合を切断し、 効 率良く グルコースュニッ 卜を抽出できるセルラーゼを開発することは、 セルロー ス系バイオマスの有効活用に必須である。
セルラーゼは、 セルロースをグルコースまたはセロ ビオースゃセロオ リ ゴ糖に 分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、 その作用様式によって C , 酵素、 C x 酵素、 /3 —ダルコ シダ一ゼ、 ェキソ— 3 — グルカナ一ゼ、 エン ド— /3 ーグルカナ一ゼ、 セロビアーゼ等と種々の名称で呼ばれる酵素が存在する。 しか しながら、 セルラーゼの実態は未だ明らかでない。
これまでも、 セルラーゼを用いたバイオマス利用法が検討されている。 特に、 1 9 7 0年代の石油危機を契機に、 エネルギー、 工業材料、 食飼料等の原料を継 続的に供給する対象物と して、 植物系のバイオマスの有効利用を目的と した技術 開発が盛んとなってきている。
また、 セルラ一ゼは、 産業用酵素剤と して市販され、 洗剤、 繊維加工用製剤、 飼料添加剤、 消化剤といった種々の製品の主要成分と して用いられいる。 それ故 、 セルラーゼは実用面でも大いに役立つものと期待されている。
上述の背景下に、 本発明者らはセルロースの酵素糖化を主題に検討を進めた結 果、 アク レモニゥム ♦ セルロ リティカス （Acremonium cellulolyticus ) Y - 9 4 〔工業技術院生命工学工業技術研究所 （〒 3 0 5 日本国茨城県つく ば市東一 丁目 1 番 3号） 、 国際受託番号 ： F E RM B P - 5 8 2 6、 平成 9年 （ 1 9 9 7年） 2月 1 9 日に原寄託 （ F E RM P— 6 8 6 7、 原寄託日 ： 昭和 5 8年 1 月 1 2 曰） からブタプス ト条約に基づく 国際寄託へ移管〕 なる糸伏菌の分離に成 功した （特公昭 6 0 — 4 3 9 5 4号公報） 。
本菌株の生産するセルラーゼは、 主と してアビセラーゼまたは F Pァ一ゼで代 表される C , 酵素、 カルボキシメチルセルロース （ CMC ) に作用する CM Cァ ーゼで代表される C x 酵素、 セロビオースなどのセロォリ ゴ糖に作用する β —ゲ ルコシダーゼの主と して 3種類の酵素群からなる複合酵素系 （以下、 セルラーゼ 系と略記することがある。 ） である。 これら酵素群の調和のとれた相互作用によ つて、 天然のセルロースをグルコースにまで完全分解することができる。 本酵素 の性質は上記特許公報に記載されている。
該セルラ一ゼ系は、 これまでに分離された 卜 リ コデルマ （Trichoderma)属ゃァ スペルギルス （Aspergillus)属の微生物に由来するセルラーゼょり ^ーグルコシ ダーゼ活性が高く 、 セルロースの単糖化に優れているという特徴がある。
しかし、 上述のァク レモ二ゥム ' セルロ リ ティカス Y— 9 4株の生産するセル ラーゼ系を構成するタ ンパク質の同定、 ァ ミ ノ酸配列、 該ァ ミ ノ酸配列をコ一ド する遺伝子の塩基配列等の情報は得られていない。
発明の開示
そこで、 本発明者らはァク レモニゥム · セルロ リティカス Y— 9 4株のセルラ 一ゼ系を構成するタ ンパク質のア ミ ノ酸配列を解析し、 同セルラーゼ系の成分を コ一 ドする遺伝子のクローン化、 更には本菌株にクロ一ン化された遺伝子を導入 してァビセラーゼ活性を高めたセルラーゼを生産する技術を確立すベく検討を重 ねた。
その桔果、 本菌株から新規、 かつ有用性の高いセルラーゼの遺伝子を単離し、 同遗伝子を微生物に導入して形質転換することより、 該遗伝子から発現されるセ ルラーゼを大量に得ることに成功し、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列の一部または全 部を有し、 セルラーゼ活性を保持するタ ンパク質、 該タ ンパク質をコー ドする D N A、 配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列の一部または全部を有する D N A、 上記 D N Aを含む発現ベクター、 該発現べクタ一により形質転換された微生物並 びに該微生物を用いて上記セルラ一ゼ活性を保持するタ ンパク質を製造する方法 に関する。
本発明によるセルラーゼ活性を有するタ ンパク質は、 配列表の配列番号 1 に記 載のア ミ ノ酸配列を一部又は全部有するものである。 このタ ンパク質は、 前述の ァク レモ二ゥム属糸状菌に由来する。 配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列 の 1〜 4 3 7番の配列を有するものは、 成熟タンパク質であり、 このタ ンパク質 を本発明ではセルラ一ゼ A C C 2 と称し、 その遺伝子をセルラーゼ A C C 2遗伝 子と称することがある。 なお、 配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配列の一 2 0〜一 1 番の配列は、 シグナルべプチ ドと考えられる。
セルラ一ゼ A C C 2 は、 アビセル等の結晶性の高い不溶性セルロースに作用し てグルコース、 セロビオース等の還元糖を生成する作用を有し、 分子量は S D S - P A G Eにおいて約 6 3 K Dであり、 等電点は p I 4 . 8 、 特に酸性領域にお いて強いァビセル分解活性を示す。
なお、 配列表の配列番号 i に記載されるァ ミ ノ酸配列の一部を有するタ ンパク 質と しては、 該ア ミ ノ酸配列のうち、 一部のア ミ ノ酸の付加、 挿入、 削除、 欠失 または置換などの改変が生じたァ ミ ノ酸配列を有し、 依然と してセルラーゼ活性 を保持するものも、 本発明のタ ンパク質に包含される。
本発明のセルラーゼ活性を有する夕ンパク質の具体例と しては、 配列表の配列 番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列の 1〜 4 3 7番の配列を含むもの、 該配列の N末端 側に更に配列表の配列番号 1 の一 2 0〜一 1 番のァ ミ ノ酸配列を有するもの等が 挙げられる。
本発明によるセルラーゼ活性を有するタ ンパク貧のア ミ ノ酸配列は以下のよう にして決定することができる。
( 1 ) セルラーゼ A C C 2の精製
ァク レモニゥ厶 . セルロリティカス Y— 9 4株を培養し、 培養物からァビセラ ーゼ活性を示す画分を S D S - P A G Eにおいて単一なバン ドを示す程度に精製 し、 セルラーゼ A C C 2を分画する。
( 2 ) N末端側および内部ァ ミ ノ酸残基の決定
上記 （ 1 ) で得た精製セルラ一ゼ A C C 2を各種のプロテア一ゼ、 ぺプチダー ゼで処理し、 得られたペプチ ドのァ ミ ノ酸配列をプロティ ンシーケンサ一で解析 する。
上記の方法により、 決定されたセルラーゼ活性を有するタ ンパク貧のァ ミ ノ酸 配列は、 Protein Identification Resource ( P I R ) R44.0 March, 1995に登 録されている他のセルラーゼのァ ミ ノ酸配列と比絞したと ころ、 同一のものはな く 、 新規なタ ンパク質であることが確認された。
本発明によれば、 上記のタ ンパク質のァ ミ ノ酸配列をコー ドする D N Aが提供 される。 この D N Aの典型的な配列は、 配列表の配列番号 2 に記載される塩基配 列の一部または全部を有するものである。
配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列は、 ァク レモニゥ厶 · セル口 リ ティカス の染色体 D N Aに由来し、 該配列中 2 4 1 番目の A T Gで始まり、 1 9 4 1 番目 の TA Gで終了するオープンリーディ ングフ レーム （読み取り枠〉 を有する。 また、 該配列中 3 0 1 〜 1 9 3 8番の塩基配列は、 4 3 7残基のァ ミ ノ酸から なる前記成熟タ ンパク質に対応する。 更に、 配列表の配列番号 2の塩基配列中に は 5つのィ ン 卜ロ ンが存在することが確認されている （実施例 7参照） 。
ところで、 タ ンパク質のァ ミ ノ酸配列が与えられれば、 それをコー ドする D N A配列は容易に推定され、 配列表の配列番号 1 に記載されるァ ミ ノ酸配列の全部 または一部をコー ドする種々の塩基配列を選択することができる。 したがって、 本発明による配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配列の一部または全部をコー ドする D N Aとは、 配列表の配列番号 2 に記載の一部または全部の塩基配列を有 する ものに加え、 同一のア ミ ノ酸をコー ドする配列であつて縮重関係にあるコ ド ンを塩基配列と して有する D N Aも含まれる。
本発明によるセルラーゼ活性を有する夕 ンパク質をコ一 ドする遺伝子の塩基配 列は、 これまでにクローン化され、 明らかにされた他のいかなるセルラ一ゼ遣伝 子の塩基配列と も相違する ものである。 これは、 核酸データベース GenBank (登 録商標） 、 R88.0 、 Apri l 1995に登録されているセルラーゼ遺伝子と比铰するこ とによつて既に確認されている。
本発明による上記の塩基配列を有する D N Aは、 天然由来のものであっても、 合成したものであってもよい。 また、 天然物に由来のものの一部を利用して合成 を行ったものであってもよい。
D N Aの典型的な取得方法と しては、 アク レモニゥム * セル口 り ティカス由来 の染色体ライブラ リーまたは c DNAライブラ リ一から遗伝子工学の分野で慣用 されている方法、 例えば部分ァ ミ ノ酸配列の情報を基にして作成した適当な DN Aプローブを用いてスク リ一二ングを行う方法が挙げられる。 また、 前記した寄 託菌株より得ること も可能である。
本発明による D N A塩基配列は以下のようにして決定することができる。
( 1 ) クローン化用 D N Aプローブの作成
アク レモニゥム · セルロ リティカス Y— 9 4株を培養し、 セルラーゼ活性を指 標と して各種クロマ 卜グラフィ 一を用いてセルラーゼを精製する。 次いで、 この 精製セルラーゼを各種プロテア一ゼによって分解し、 得られたァ ミ ノ酸配列をぺ プチ ドシークェンサ一によつて決定する。
このア ミ ノ酸配列に基づいて、 推測される塩基配列を全て含むォリ ゴヌ ク レオ チ ドの混合物を調製し、 これを基にして P C R法による増幅を行い、 その結果得 られるオリ ゴヌ ク レオチ ドをプローブと して用いる。
( 2 ) ゲノム D NAライブラ リ 一の作製
アク レモニゥム · セル口 リティカス Y— 9 4株を培養し、 集菌して得た菌体よ り、 全 DNAを調製する。 得られた DNAを制限酵素で分解した後、 この DNA を用いてゲノムのファージライブラ リ一を作製する。
( 3 ) セルラ一ゼ遺伝子のクローン化
上記 （ 2 ) の様に調製したライブラ リーと上記 （ 1 ) で得られた P C R増幅断 片をハイブリ ダィズさせ、 得られる陽性ブラークを選択する。
( 4 ) 塩基配列の決定
上記のようにして選択されたファージクローンを大腸菌用ベク ターにサブクロ ーン化し、 DNAシ一クェンサーを用いて該 DN Aの塩基配列を決定する。
また、 アク レモニゥム · セルロ リティカス Y— 9 4株から得た mRNAに逆転 写酵素を働かせることにより c D NAを合成し、 P C R法により A C C 2遺伝子 の c D N Aを得る。 この c D N Aの全塩基配列と前記ゲノムの塩基配列とを比幸交 することにより、 イ ン 卜ロン、 読み取り枠の存在が明らかになる （実施例 7およ び配列表の配列番号 2参照） 。
また、 本発明によれば、 前記の本発明による DNAを、 宿主微生物内で複製可 能で、 かつその DN Aがコー ドするタ ンパク質を発現可能な状態で含んでなる発 現べクタ一が提供される。 更に、 本発明によれば、 この発現ベクターによって形 質転換された微生物が提供される。
この宿主一ベクター系は特に限定されず、 例えば大腸菌、 放線菌、 酵母、 カビ などを用いた系、 およびそれらを用いた他のタ ンパク質との融合夕 ンパク質発現 系などを用いることができる。 本発明に好適な宿主微生物と しては、 大腸菌、 サ ッカロ ミセス属酵母、 卜 リ コデルマ属、 ァスペルギルス属、 アク レモニゥム厲糸 状菌 （好ま しく はアク レモニゥム · セルロ リティカス） などが挙げられ、 ベクタ 一と しては、 p B R 3 2 2、 p U C (好ま しく は p U C 1 8 ) 、 p B l u e s c r i p t等大腸菌で増幅可能なプラス ミ ドゃ p Y E U r a 3等酵母で増幅可能な プラス ミ ドが利用できる。
本発明によるべクター構築の手順および方法は、 遺伝子工学の分野で慣用され ている ものを用いることができる。
本発明の発現ベク ターは、 これを実際に宿主微生物に導入して所望のタ ンパク 質を発現させるために、 前記の本発明による D N Aの他に、 その発現を制御する D N Aや微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。
配列表の配列番号 2の塩基配列は、 これらの制御配列なども含んでいると考え られることから、 この塩基配列をそのまま利用することも場合によつて有利であ ると考えられる。
また、 この発現ベクターは、 セルラ一ゼをコー ドする DNAを反復した形 （タ ンデム） で含んでいてもよい。 これらは常法に従い発現ベクターに存在させてよ く 、 このベクターによる微生物の形質転換の方法も、 この分野で慣用されている ものを用いることができる。 例えば、 セルラーゼ A C C 2遺伝子を選択マーカー 遗伝子と共にプラス ミ ド化し、 プロ トプラス ト処理したァク レモニゥム · セル口 リ ティカスに導入して形質転換する方法等が挙げられる。 その結果、 得られた形 質転換体は選択マーカーに対する耐性が付与されていると共に、 セルラーゼ活性 が向上している。
こう して得られた形質転換体を適当な培地で培養し、 その培養物から上記した 本発明のタ ンパク質を単離して得ることができる。 形質転換体の培養およびその 条件は、 使用する微生物に応じて適宜に設定すればよい。 また、 培養液からの目 的とする夕 ンパク質の回収、 精製も常法に従って行う ことができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 プラス ミ ド p A C 2— 1の制限酵素地図を示した図である。
第 2図は、 プラス ミ ド p A C 2— 5の構成を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれらの実施例の範囲にのみ限定さ れるものではない。
実施例 1
セルラーゼ A C C 2の精製
ァク レモニゥム · セノレロ リ ティカス (Acremon ium eel lulolyt icus) Y - 9 4株 ( F E RM B P— 5 8 2 6 ) をセルラ一ゼ誘導培地 （組成 ： セルロース 4 %、 バク 卜ペプ ト ン 1 %、 硝酸カ リ ウム 0. 6 %、 尿素 0. 2 %、 塩化カ リ ウム 0. 1 6 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 2 %、 燐酸 1 カ リ ウム 1. 2 %、 硫酸亜鉛 0. 0 0 1 %、 硫酸マンガン 0. 0 0 1 %、 硫酸銅 0. 0 0 i % (p H 4. 0 ) ) で 培養し、 培養物を遠心分離して得た上澄よりスプレー ドライヤーを用いてセルラ 一ゼ原末を得た。 本原末 5 0 gを 5 0 0 m l の水に溶解し、 0. 4 5 ^mのノ ン ブランフィ ルタ一で濾過した。
この酵素溶液をバイオパイ ロ ッ ト システム （フ アルマシアバイオテク社製） を 用い、 5 mM酢酸緩衝液 （ p H 5. 8 ) で平衡化した Q Sepharose H i gh Per f orm ance力ラム （ 6 O x 1 0 0 mm) に供した。 酵素溶液は、 同緩衝液条件下で吸着 させ、 非吸着の部分を画分 1 と した。 この画分 1 を U F膜 （分画分子量 5 0 0 0 ) を用いて脱塩、 濃縮し、 さらに凍結乾燥した。
この凍結乾燥画分 1 を 2 M硫酸ァンモニゥムを含む 2 O mM ト リ ス—酢酸 緩衝液 （p H 7. 4 ) に溶解し、 前述のメ ンブラ ンフィ ルターで濾過した。 これ を前述の同カラムに供し、 2 0 mM 卜 リ ス- 酢酸緩衝液 （ p H 7. 4 ) の硫酸ァ ンモニゥ厶濃度勾配で溶出し、 アビセラーゼ活性を示す画分 （硫酸アンモニゥム 濃度 3〜0. 5 M) を分画した。 本画分は S D S — P A G E電気泳動におい て分子量約 6 3 K D (キロダル ト ン） のタ ンパク質 A C C 2を電気泳動的にほぼ 単一に含んでいた。
実施例 2
( 1 ) N末端ァ ミ ノ酸配列の決定
実施例 1 で得られた精製夕 ンパク質 （A C C 2 ) を、 Podell, D. N. らの方法 (Podel 1, D. N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. (1978) 81:176) に 従い、 仔牛肝臓ピログルタ ミ ン酸ア ミ ノぺプチダーゼ （ベー リ ンガ一 · マンハイ ム社製） を用いて処理することによ り、 修飾 N末端残基を除去し、 プロテイ ンシ —ゲンサ一 Model 492 (パーキンエルマ一社製） により、 N末端側ア ミ ノ酸配 列を 9残基決定した。 得られた配列を配列表の配列番号 3に示す。
( 2 ) ペプチ ドマッ ピング
夕 ンパク質内部のァ ミ ノ酸配列を決定するため、 実施例 1 で得られた夕 ンパク 質を凍結乾燥後、 5 0 mM重炭酸アンモニゥム緩衝液 （ P H 7. 8 ) 中で V 8 プ 口テア一ゼ （和光純薬社製） 、 2 5 mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 9 · 0 ) 中で リ ジルェン ドぺプチダーゼ （生化学工業社製） または 1 0 0 mM重炭酸ァンモニ ゥム緩衝液 （ p H 8. 0 ) 中で ト リ プシン （シグマ社製） を添加し、 3 7てで一 晩それぞれ分解反応を行った。 各々の酵素は基質に対して約 1ノ 5 0 m 0 1 量加 えた。
分解産物は、 Model 172 プレパラティ ブ H P L Cシステム （パーキンエルマ —社製） でカラムクロマ トグラフィ ー （カラム ： C 8 220 X 2.1mm)を行つた。 溶 離は、 水ーァセ トニ ト リルの勾配 （ 5〜3 5 % ) で行い、 全 7種のペプチ ドを分 取した。 得られたペプチ ドのア ミ ノ酸配列を、 プロテイ ンシーケンサー Model 49 2 により決定した。 得られた配列を配列表の配列番号 4 〜 0に示す。 これらのア ミ ノ酸配列は、 ト リ コデルマ · リ ーセィ株 (Tr ichoderma reesei) から得られたセロピオヒ ドラーゼ 11 ( c b h - 11) タ ンパク質のア ミ ノ酸配列 （ Chung ong Cen et al. , Bio/Technology (1987), 5:274-278 ) と相同性を示す ことから、 同タ ンパク質はセルラーゼの一種であることが強く示唆された。
また、 上記配列を Protein Identification Resource ( P I R ) R 44.0 March ， 1995に登録されている他のセルラーゼのァ ミ ノ酸配列と比較したと ころ、 前述 c b h一 11等相同性を示す配列はあるものの、 同一のものはなく 、 新規な夕 ンパ ク質であることが確認された。
実施例 3
( 1 ) ゲノム D NAの単離
アク レモニゥム . セルロ リ ティ カス Y— 9 4株 （ F E RM B P - 5 8 2 6 ) を （ S ) 培地 （組成 ： 2 %ブイ ヨ ン、 0. 5 %イース トエキス、 2 %グルコース ) で 3 2 °Cにて 2 日間培養し、 遠心分離により菌体を回収した。 得られた菌体は 液体窒素で凍結後、 ホモジナイザー AM— 3 (日本精機社製） で粉砕した。 これ を 1 % S D S添加 T E緩衝液 （ 1 0 mM ト リ スー塩酸 （ p H 8. ) 、 1 mM E D TA) に懸濁し、 6 5 °Cで 3 0分間保温した。 次いで、 フヱ ノ ール処理、 ェ タ ノ一ル沈殿化の後プロティナ一ゼ Kおよびリ ボヌ ク レア一ゼ A処理し、 更に超 遠心機 6 5 P— 了 （日立ェ機社製） で塩化セシゥム密度勾配沈降平衡法により D N Aを得た。
( 2 ) プライマーの作成
各プライマーと して、 ぺプチ ド Lys- 39 (配列番号 9 ) の 1 ~ 5番目、 ペプチ ド Trp- 30 (配列番号 1 0 ) の 1 ~ 6番目のァ ミ ノ酸配列に対応する D N Aを合成し た。 すなわち、 Chung Mong Cen らの報告 （Chung Mong Cen et al.. Bio/Techn ology (1987), 5:274- 278)より、 ペプチ ド Lys- 39がペプチ ド Trp- 30より N末端側 に位置すると予測し、 配列表の配列番号 1 1 ~ 1 6に示した配列の合成オリ ゴヌ ク レオチ ドを作成した。 なお、 ぺプチ ド Lys- 39はリ ジルェン ドぺプチダ一ゼの認 識ァ ミ ノ酸残基 （リ ジン） から対象と した。
( 3 ) P C R法による長鎖プローブの作成
D N Aプローブは、 上記 （ 1 ) で調製したアク レモニゥム ' セルロ リ ティ カス Y - 9 4株 （F E RM B P— 5 8 2 6 ) の全 DNAを踌型に P C R法により增 幅された口ングプローブを作成して用いた。
P C R反応は以下の条件で行った。 まず、 （ 1 ) で得たゲノム DNA 1 に 対し、 （ 2 ) のプライマーを各 1 M加え、 d NT P存在下、 9 4てで 1 0分間 熱変性を行った。 その後、 T a qポリ メ ラ一ゼ （ リ コンビナン ト T a Q、 宝酒造 社製） を加え、 9 4 で 1分間、 5 5てで 2分間、 7 2 °Cで 3分間の反応条件を 3 0回繰り返すことにより増幅した。 その結果、 Lys-39B (配列番号 1 2 ) と P-30A (配列番号 1 3 ) または Lys- 39B と Trp-30B (配列番号 1 4 ) の組み合わ せのみで 5 0 0 b pの DNAが特異的に増幅した。 これを以降のスク リ ーニング のプローブと して用いた。
実施例 4
ゲノ ム DNAライ ブラ リ 一の作製
実施例 3で調製したアク レモニゥム ' セルロ リ ティカス Y— 9 4株 （F E RM B P— 5 8 2 6 ) のゲノ ム D NAを S a u 3 A I により部分消化した。 これを ファージベク ター、 ；i EMB L 3 ク ローニングキッ ト （ス 卜 ラタ ジーン社製） の B a mH I アームに T 4 リ ガーゼ （宝酒造社製ラィゲーシ ヨ ンキッ ト Ver. 2 ) を 用いて連結させた。 これをエタ ノール沈殿後、 T E緩衝液に溶解した。 連結混合 物の全量をギガパッ ク 11パッ ケージ ングキッ ト （ス トラ タ ジーン社製） 従い、 フ ァージ粒子を形成させた。 このフ ァージは大腸菌 XL1- Blue MRA ( P 2 ) 株に感 染させた。
この方法により得られた 7. 5 X 1 04 個のフ ァージライブラ リーを用いて目 的遺伝子のクローニングを行った。
実施例 5
セルラ一ゼ AC C 2遺伝子のクローニング
( 1 ) プラークハイブリ ダィゼーショ ンによるスク リーニング
実施例 3で P C R法により増幅された 5 0 O b pの D N A断片を、 あらかじめ E C Lダイ レク ト システム （アマシャム社製） に従い、 標識化した。
実施例 4で作成したフ ァージプラークは、 ハイボン ド N+ ナイ ロ ン ト ラ ンスフ アーメ ンブラ ン （アマシャ ム社製） に転写し、 アルカ リ変性後、 5倍濃度 S S C (S S C ： 1 5 mMクェン酸 3ナ ト リ ウム、 1 5 0 mM塩化ナ ト リ ウム） で洗浄 し、 乾燥させ D N Aを固定した。 次いで、 キッ 卜に記載の方法に従って、 1時間 のプレハイプリ ダイゼーシヨ ン （ 4 2で） の後、 先の標識化したプローブを添加 し、 4時間 （ 4 2 °C) ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンを行った。 プロ—ブの洗浄は前述 キッ 卜の方法に従った。
プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、 添付されている検出溶液に 1分間浸し たあと、 同社製ハイパーフイ ルム一E C Lに感光させ、 4個の陽性クローンを得 た。
( 2 ) フ ァージ DNAの調製
陽性クローンからの D N A調製は Maniatis らの方法 （J. Sambrook, E. F. F ritsch and T. Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborat ory Press.1989) に従つた。
宿主大腸菌は L E 3 9 2を用いた。 まず、 L E 3 9 2を L B培地 （ 1 %バク 卜 卜 リ プ ト ン、 0. 5 %イース トエキス、 0. 5 %塩化ナ ト リ ウム） で一晚培養し 、 これにシングルプラーク由来のフ ァージ溶液を感染させ、 L B培地で一晚培養 した。 これに、 塩化ナ ト リ ウムを 1 M、 ク ロ口ホルムを 0. 8 %加え、 大腸菌の 溶菌を促進させた。 本培養液を遠心分離して菌体残渣を除き、 P E G ( 1 0 % P E G 6 0 0 0 ) 沈殿化によりファージ粒子を回収した。 ファージ粒子は S D S存 在下、 プロティ ナーゼ K (和光純薬社製） で消化し、 これをフヱ ノ ール処理、 ェ タノール沈殿化によりフ ァージ D N Aを回収した。
以上のように して調製した DNAは、 E C Lダイ レク ト システム （アマシャム 社製） に従い、 サザンブロッ ト解析を行った。 実施例 3の P C R増幅断片をプロ 一ブに用いてハイブリ ダイゼーシヨ ンを行つた結果、 7 k b pの S a I I消化断 片が共通にハイブリ ダィズした。 なお、 この S a 1 I消化断片の制限酵素地図を 第 1図に示した。
この共通にハィブリ ダイズする S a i l断片を p U C 1 8 (宝酒造社製） にサ ブクローン化し、 得られたプラス ミ ドを p A C 2— 1 と した。
実施例 6
塩基配列の決定 A. L. F. D N Aシーケンサ一 Π (フアルマシアバイオテク社製） を用いて、 塩基 配列の解析を行った。 シ一ゲンシングゲルは、 レディ ミ ッ クスゲル （フ アルマシ ァバイオテク社製） またはハイ ドロ リ ンクロングレンジャー （AT Biochem社製） のアク リ ルア ミ ド担体を使用した。 ゲル作成用各種試薬 （N, N, N' , N' — テ トラメチルエチ レンジア ミ ン、 尿素、 過硫酸ァンモニゥム） はフ アルマシアノ ' ィォテク社製の A. L. F グレー ドの試薬を用いた。
塩基配列解銃反応は、 オー ト リー ドシーゲンシングキッ 卜 （フアルマシアバイ ォテク社製） を用いた。 また、 ゲル作成条件、 反応条件および泳動条件の各々に ついては、 各説明書の詳細を参照して設定した。
また、 塩基配列解読用铸型プラス ミ ド （以下、 テンペレー 卜と記す） は、 p A C 2 — 1 を P s t I で消化し、 3. 5 k b pの P s t I 消化断片を p U C 1 1 8 にクローン化し、 得られたプラス ミ ドを p A C 2 — 4 (第 1 図参照） と して調製 したものを用いた。
まず、 テンペレー トを 2 M水酸化ナ ト リ ウムでアルカ リ変性後、 A C C 2特異 的シーケンスプライマ一 （WA C C— 0 1 ~W A C C 一 1 2 ) とアニー リ ングさ せ、 オー ト リ ー ドシーゲンシングキッ 卜に従い伸長反応を行った。
反応産物をシーケンサーで解読した結果、 ？ 5 1 1 断片のぅち 2 1 9 6 13 1)の 塩基配列を配列表の配列番号 2のように決定した。
なお、 A C C 2特異的シーケンスプライマーの配列 （WA C C - 0 1 〜WA C C - 1 2 ) を配列表の配列番号】 7 ~ 2 8 に示す。
実施例 7
非翻訳領域 （以下、 イ ン トロ ンと記す） の決定には、 ァク レモニゥム ， セル口 リティカス Y— 9 4株 （ F E RM B P— 5 8 2 6 ) から常法により mR NAを 調製し、 逆転写酵素により c D N Aを合成し、 これと染色体の塩基配列との比絞 から同領域を判定した。
( 1 ) 全 R N Aの調製
アク レモニゥム . セル口 り ティカス Y— 9 4株 （ F E RM B P— 5 8 2 6 ) をセルラーゼ誘導培地、 好ま しく はセルロース （ 5 %フナセル ： フナコシ社製） を添加した前述の （ S ) 培地で 3 2 °Cで 2 曰間培養した。 培養終了後、 培養物を 遠心分離 （ 3 5 0 0 r p m， 1 0分） して菌体を回収した。 この菌体を滅菌水で 洗浄し、 液体窒素で凍結したままプレンダ一で粉砕した。
次いで、 これを 4 Mグァニジンチォシアン酸塩を含む変性溶液 （ 4 Mグァニジ ンチオシア ン酸塩、 2 5 mMクェン酸 3ナ ト リ ウム、 0. 5 % N—ラウ リ ルサ ルコシン酸ナ ト リ ウム、 0. 1 Mメルカプトエタノール） に懸濁した。 室温で数 分間撹拌の後、 1 M酢酸ナ ト リ ウム （p H 4. 5 ) で中和し、 T E飽和フヱ ノ ー ルを加え、 さ らに撹拌した。 こ こにク ロ口ホルム一イ ソア ミ ルアルコール （ 2 4 ： 1 ) を加え、 撹拌した後、 遠心分離 （ 3 5 0 0 r p m. 1 0分） によりフエノ ールで変性した菌体成分を除去した。 上層 （水層） を回収し、 イ ソプロパノ ール で核酸を沈殿化した。 同沈殿を遠心分離 （ 3 5 0 0 r p m. 1 0分） で回収し、 7 0 %ェタノ一ルー水で再遠心分離により沈殿を洗浄した。
同沈殿を 1 m gノ m 1の核酸濃度になるよう T E緩衝液に溶解後、 2. 5 M塩 化リチゥムで再度沈殿化 （ 5 Vで 2時間） した。 次に、 遠心分離 （ 1 2 0 0 0 r p m. 1 0分） により沈殿を回収し、 7 0 %エタ ノ ールで洗い、 これを全 RNA 画分と した。
( 2 ) ボリ Aティル + R N A ( = m R N A ) の調製
mRNAの調製は mRNAピュアリ フィ ケーシヨ ンキッ ト （フ アルマシアバイ ォテク社製） を用いて行った。
まず、 （ 1 ) で調製した全 RNAのうち l mgを l m l のエリ シヨ ンバッ フ ァーに溶角？し、 これに 6 5 °C 1 0分間の熱変性処理を加えた。 氷中で急冷し た後、 0. 2 m 1のサンプルバッファーを加えた。 この全量の R N A溶液をオリ ゴ （ d T ) セルロースカラムにチャージし、 ハイ ソル ト フ ァ ーで 3回、 ロウ ソル 卜バッ ファーで 3回カラムを洗浄した後、 6 5 °Cに加温したエリ シヨ ン フ ァーで溶出した。 このカラム操作を 2回繰り返し、 mRNA画分と した。
( 3 ) c D N Aの合成
c D N Aの合成はタイムセ一バー c D N A合成キッ 卜 （フ ァルマンアバイォテ ク社製） を使用して行った。
まず、 5 gの mRNAを 2 0 〃 1 のサンプルバッ フ ァーに溶解した。 6 5て で 1 0分間の熱処理後、 フ ァース 卜 ス トラ ン ド合成ミ ッ ク スにジチオス レィ トー ル溶液、 オリ ゴ （ d T) プライマーと共に添加し、 3 7 で 1時間反応させた。 次に、 この全量をセカン ドス トラ ン ドミ ッ クスに加え、 1 2 °Cで 3 0分間、 次い で 2 2 °Cで 1時間反応させ、 これを c DNAと した。
( 4 ) セルラ一ゼ A C C 2の c D NAの P C R法による増幅
A C C 2の c DNAは全 c DNAを铸型に P C R法により増幅した。
P C Rは L A P C Rキッ ト （宝酒造社製） を用いた。 プライマ一は A C C 2 n— S t uと AC C 2 c — X h oを用い、 9 4 で 1分間、 5 5 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 2分間のサイ クルを 2 5回繰り返すことにより反応を行った。 その結果、 約 1. 5 k b pの A C C 2の c D N Aが增幅された。
なお、 プライマーと して用いた A C C 2 n— S t uと A C C 2 c _ X h oの配 列を配列表の配列番号 2 9 ~ 3 0に示す。
この P C R増幅断片はァガロース電気泳動の後、 バン ドプレップキッ ト （ファ ルマシアバイオテク社製） に従いァガロースから回収し、 pT7-Blue (ノバジェ ン 社製） にクローン化し （ p A C c 2 — 1 ) 、 これをイ ン トロン決定用テンペレ一 ト と した。
( 5 ) c D N Aの塩基配列解析
シーケンシ ング反応は、 前述同様ォー ト リ 一 ドシーゲンシングキッ トを用いて 実施した。 上記のブラス ミ ド p A C c 2 — 1を 2 M水酸化ナ ト リ ウムでアルカ リ 変性し、 エタノールで沈殿化した。 この変性プラス ミ ドをテンペレー トと し、 T 7ポリ メ ラーゼで反応させた。 プライマーはキッ 卜添付のユニバーサルと リバー ス、 更に配列表の配列番号 1 8および 2 1 に記載した W A C C - 0 2および WA C C一 0 5を用いた。
その結果、 3 2 0〜 3 8 9 b p (Intron 1)、 4 5 9 ~ 5 1 6 b p (Intron II) 、 8 0 0〜8 6 9 b p Untron 111)、 1 1 2 4 ~ 1 1 9 8 b p (Intron IV) と 1 5 9 8 - 1 6 5 1 b p (Intron V)の計 5つのイ ン トロンが存在していることが判 明した。
配列表の配列番号 2に示した塩基配列において、 非翻訳開始配列およびその終 了配列、 イ ン ト ロ ン内部の調節配列の位置を第 1表に示す。 第 1 表 イ ン 卜 CIン 非翻訳開始配列 終了配列 調節配列
Intron I 320-325 387-389 367- 371
Intron 11 459〜464 514〜516 496〜 500
Intron III 800~805 867〜869 856- 860
Intron IV 1124-1129 1196〜1198 1177-1181
Intron V 1598-1603 1649-1651 1634-1638 実施例 8
アク レモニゥム · セルロ リ ティ カス Y— 9 4株 （ F E RM B P— 5 8 2 6 ) に A C C 2遺伝子を再導入するために、 p A C 2 — 1 を X b a l で消化し、 7. 2 k b pの断片を回収した。 これに p D H 2 5 (Cullen, D. , Leong, S. A. , Wi 1 son. L. J. and Henner. D. J. , Gene 57. 21-26, 1987) 由来ハイ グロマイ シン B 耐性カセッ トを挿入し、 アク レモニゥ厶 . セルロ リティ カス用形質転換べクタ一 と して p A C 2 — 5を作成した （第 2図参照） 。
実施例 9
A. eel lulotyt icusの形質転換
アク レモニゥム . セルロ リティ カス Y— 9 4株 （ F E RM B P— 5 8 2 6 ) を前述の （ S ) 培地中で 3 2 °Cで培養し、 2 4時間後、 3 0 0 0 r p m、 1 0分 間遠心分雜により集菌した。 得られた菌体を 0. 5 Mシュークロースで洗浄し、 0. 4 5 のフィ ルターで濾過したプロ 卜プラス ト化酵素溶液 （ 5 m g/m 1 「 Novozyme 234 」 、 5 m g Zm i 「Cel lulase Onozuka R- 10」 、 0. 5 Mシュ 一クロース） に懸濁した。 3 0 °Cで 6 0 - 9 0分間振盪し、 菌糸をプロ 卜プラス ト化させた。
この懸濁液を濂過した後、 2 5 0 0 r p πιで 1 0分間遠心分離してプロ 卜ブラ ス 卜を回収し、 S U T C緩衝液 （ 0. 5 Mシュ一クロース、 1 0 mM塩化カルシ ゥム、 1 0 mM ト リ スー塩酸 （ p H 7. 5 ) ) で洗浄した。 以上のようにして調製したプロ 卜プラス 卜を l m l の S U T C緩衝液に懸濁し 、 このうち 1 0 0 〃 1 に対し l gZ〃 i の P A C 2 — 5 (T E ) 溶液を 1 0
1 加え氷中に 5分間静置した。 次に、 4 0 0 1 の P E G溶液 （ 6 0 % (W/V ) P E G 4 0 0 0、 1 0 mM塩化カルシウム、 1 0 mM ト リ ス塩酸 （ p H 7. 5 ) ) を加え、 氷中に 2 0分間静置した後、 1 0 m l の S U T C緩衝液を加え、 2
5 0 0 r p で 1 0分間遠心分離した。 集めたプロ トプラス トを l m l の S UT C緩衝液に懸濁した後、 4 0 0 0 r p mで 5分間遠心分離して、 最終的に 1 0 0 1 の S U T C緩衝液に懸濁した。
以上の処理をしたプロ トプラス トを、 ハイグロマイ シン B ( 5 0 0 / g/m 1 ) 添加 （A) 培地 （ 0. 2 %硝酸ナ ト リ ウム、 0. 1 %リ ン酸水素 2 カ リ ウム、 0. 0 5 %塩化力 リ ウ厶、 0. 0 5 %硫酸マグネシゥム 7水和物、 0. 0 0 1 % 硫酸鉄 7水和物、 1 7. 1 %シュ一ク ロース、 1 %バク 卜ァガ一 （p H 6. 0 ) ) 上に、 钦寒天培地 （ 0. 2 %硝酸ナ ト リ ウム、 0. 1 %リ ン酸水素 2 カ リ ウム 、 0. 0 5 %塩化カ リ ウム、 0. 0 5 %硫酸マグネシウム 7水和物、 0. 0 0 1 %硫酸鉄 7水和物、 1 7. 1 %シュ一クロース、 0. 8 %バク 卜ァガ一 （ p H 6 . 0 ) ) とと もに重層し、 3 0てで 5 ~ 9 日間培養後、 形成したコロニ一を形質 転換体と した。 このよ う に して、 プラス ミ ド p A C 2 — 5をアク レモニゥ厶 ' セ ルロリ ティ カス Y— 9 4 ( F E R M B P — 5 8 2 6 ) に導入し、 ハイグロマイ シン Bに耐性を示す株が 1 gの D N A当り約 2株出現した。
実施例 】 0
実施例 9で得られた形質転換体のうち、 耐性度の高いもの 2株を実施例 1 のセ ルラーゼ誘導培地で 3 2 °Cにて 7 日間培養した。 培養物を遠心分離して得た培養 上澄を S D S— P A G Eにより解析したと ころ、 A C C 2 タ ンパク質は親株より 分泌量が向上していた。
なお、 セルラーゼ活性は、 W. A. Wood, S. T. Kellogg の Methods in Enzymol ogy, vol. 160 に記載される方法 （W. A. Wood, S. T. Kellogg. "Methods in E nzy o logy, vol. 160, Biomass part A, Cellulose and Hemicel lulose" (ACADEM IC PRESS, INC. ): p97) に従って、 上澄のアビセル分解活性を測定した。 結果を 第 2表に示した。 表から明らかなように、 形質転換体のセルラーゼ活性は向上し ており、 特に形質転換体 2 は親株の 1 . 5倍の比活性を示した 第 2表 ァビセル分解活性 （％) 形質転換体 1 1 0 9
形質転換体 2 1 5 9
i 株 1 0 0
産業上の利用可能性
本発明により、 セルラーゼ活性を有するタ ンパク質のァ ミ ノ酸配列が明らカ、に され、 該タ ンパク質をコー ドする D N A、 該 D N Aを含有する発現べク ター、 該 べク ターにより形質転換された微生物並びに該微生物を用いるセルラーゼ活性を 有するタ ンパク質の製造方法が提供される。
尚、 本発明における配列表は以下のように示される。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 4 5 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源：
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名： Y-94
直接の起源
Acremonium cellulolyticus 力く生産した酵索
配列の特徴
存在位置： 1. . 4 5 7
特徴を決定した方法： E
配列
Met Leu
-20
Arg Tyr Leu Ser lie Val Ala Ala Thr Ala He Leu Thr Gly Val Glu Ala Gin
-15 -10 -5 -1
Gin Ser Val Trp Gly Gin Cys Gly Gly Gin Gly Trp Ser Gly Ala Thr Ser Cys
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gin Cys He Pro
20 25 30 35
Gly Thr Ala Thr Ser Thr Thr Leu Val Lys Thr Thr Ser Ser Thr Ser Val Gly
40 45 50
Thr Thr Ser Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr Lys Ala Ser Thr Thr Ala Thr Thr
55 60 65 70
Thr Ala Ala Ala Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly Tyr Gin Leu Tyr Ala Asn Pro 6 T on see 0£8 gsc
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PZS0QIL6dr/L3d ZS6££/L6 OAV Asn Pro Tyr Tyr Ser Ser Glu Val His Thr Leu Ala lie Pro Ser Leu
90 95 100
ACT GGC TCG CTC GCT GCT GCT GCT ACC AAA GCT GCC GAG ATC CCC TCA 788 Thr Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Ala Glu lie Pro Ser
105 110 115 120
TTT GTC TGG CT GTGAGTGTTC CCGAGAACAT CCAGTTGAGT GATATAAATA 839 Phe Val Trp Le
TATGCATCGA GATTTCCTAA ACCTCTATAG T GAC ACG GCA GCC AAA GTG CCT 891 u Asp Thr Ala Ala Lys Val Pro
125 130
ACA ATG GGC ACC TAC TTG GCC AAC ATT GAG GCT GCA AAC AAG GCT GGC 939 Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asn ile Glu Ala Ala Asn Lys Ala Gly
135 140 145
GCC AGC CCA CCT ATT GCC GGT ATC TTC GTT GTC TAT GAC CTG CCT GAC 987 Ala Ser Pro Pro lie Ala Gly lie Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro Asp
150 155 160
CGT GAC TGT GCA GCT GCT GCA ACT AAT GGC GAA TAC ACT GTA GCA AAC 1035 Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Thr Val Ala Asn
165 170 175
AAC GGT GTT GCA AAC TAC AAG GCT TAC ATC GAC AGC ATT GTG GCA CAG 1083 Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr Ile Asp Ser lie Val Ala Gin
180 185 190 195
TTG AAA GCT TAT CCC GAT CTG CAC ACA ATC CTT ATC ATT G GTACGTTCTC 1133 Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Val His Thr Ile Leu Ile Ile G
200 205
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直接の起源
Acremonium cellulolyticus 力く生産した酵素
配列の特徴
存在位置： 1. . 9
特徴を決定した方法： E
配列
Ser Val Trp Gly Gin Xaa Gly Gly Gin 配列番号： 4
配列の長さ ： 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型： 中間部フラグメ ン卜， V8プロテア一ゼ分解フラグメン卜（V8- 16 )
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y-94
直接の起源
Acremonium eel lulolyticus 力く生産した酵素
配列の特徴
存在位置： 1. . 7
特徴を決定した方法： E
配列
Ala Gin Ser Ala Tyr Tyr Glu 配列番号： 5
配列の長さ ： 5 配列の型： アミ ノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメ ン ト型： 中間部フラグメ ント， V8プロテア一ゼ分解フラグメ ント（V8- 29 )
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y - 94
直接の起源
Acremonium cellulolyticus か生産した酵
配列の特徴
存在位置： 1. . 5
特徴を決定した方法： E
配列
Gly Thr Xaa Phe Gin 配列番号： 6
配列の長さ ： 5
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメ ン ト型 ： 中間部フラグメ ント， V8プロテアーゼ分解フラグメ ント（V8- 31 )
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y - 94
直接の起源
Acremonium cellulolyticus 力、生産した酵素
配列の特徴 存在位置： し . 5
特徴を決定した方法： E
配列
Tyr Thr Val Ala Asn 配列番号： Ί
配列の長さ ： 1 1
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメ ン ト型： 中間部フラグメ ン ト， V8プロテアーゼ分解フラグメ ン ト（V8-37
)
起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名 ： Y- 94
直接の起源
Acremonium cellulolyticus 力く生産した酵素
配列の特徴
存在位置： し . 1 1
特徴を決定した方法： E
配列
Thr Ala Ala Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr 配列番号： 8
配列の長さ ： 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメ ン ト型： 中間部フラグメ ン 卜， V8プロテアーゼ分解フラグメ ン 卜（V8- 45 )
起源
生物名 ： Acremonium celiulolyticus
株名 ： Y - 94
直接の起源
Acremonium celiulolyticus 力く生産した酵素
配列の特徴
存在位置： 1. . 7
特徴を決定した方法： E
配列
Xaa Pro Xaa Phe Val Trp Leu 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 1
配列の ： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
フラグメント型： 中間部フラグメント， リ ジルェンドぺプチダ一ゼ分解フラグメ ント (Lys-39)
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y-94
直接の起源
Acremonium eel lulolyticus 力く生産した酵素
配列の特徴
存在位置 ： 1. . 1 1
特徴を決定した方法： E
配列
Ala Tyr ile Asp Ser He Val Ala Gin Leu Lys 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 1 2
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメ ン ト型 ： 中間部フラグメ ン ト， ト リプシン分解フラグメ ン ト （Trp- 30) 起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y - 94
直接の起源
Acremonium eel luloly t i cus ヽ生産した酵素
配列の特徴
存在位置： 1. . 1 2
特徴を決定した方法： E
配列
Asn Ala Trp Ser He Ser Xaa Pro Pro Ser Tyr Thr 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 1 Ί
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DNA (アミノ酸配列から作成， Lys- 39A )
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y - 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 1 7 特徵を決定した方法 E
配列
AAR GCI TAY ATH GAY TC
配列番号： 1 2
配列の長さ ： 1 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DNA (ァミ ノ酸配列から作成， Lys-39B ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名 ： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 1 7
特徴を決定した方法： E
配列
5， -AAR GCI TAY ATI! GAY AG-3' 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 1 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 合成 DN A (アミ ノ酸配列から作成， Trp-30A ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名 ： Y-94
配列の特徴 存在位置： 1. . 1 7
特徴を決定した方法： E
配列
5' -GAR ATI GAC CAN GCR TT-3'
配列番号： 1 4
配列の長さ ： 1 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 合成 DNA (ァミノ酸配列から作成' Trp-30B ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名 ： Y - 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 1 7
特徴を決定した方法： E
配列
5' -CTR ATI GAC CAN GCR TT-3' 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 1 Ί
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 合成 DNA (ァミノ酸配列から作成' Trp-30C) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus
株名 ： Y- 94 配列の特徴
存在位置： 1. . 1 7
特徴を決定した方法： E
配列
5' -GAR ATR CTC CAN GCR TT-3'
配列番号： 1 6
配列の長さ ： 1 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：合成 DNA (ァミノ酸配列から作成， Trp-30D) 起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyt icus
株名 ： Y - 94
配列の特徴
存在位置： し . 1 7
特徵を決定した方法： E
配列
5' - CTR ATR CTC CAN GCR TT-3'
配列番号： 1 7
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 合成 DN A (WA C C - 0 1 )
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus 株名： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5' -CTG CAT CTC TTC GTG GAT TGG CC - 3，
配列番号： 1 8
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DN A (WAC C— 0 2) 起源
生物名： Acremonium cellulolyticus 株名： Y - 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 4
特徴を決定した方法： E
配列
5， -GAT TGT GTG CAC ATC GGG ATA AGC- 3，
配列番号： 1 9
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 合成 DN A (WAC C - 0 3) 起源 生物名 ： Acremonium eel lulolyt icus 株名 ： Y- 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 4
特徴を決定した方法： Ε
配列
5' -GGT GGT GAA ACT GAT GGT ACA TC-3'
配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A (WA C C - 0 4 ) 起源
生物名 ： Acremonium eel luloly t icus 株名 ： Y- 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： Ε
配列
5' -AAA GCT GGT AAC CAG AGA AAG GG-3' 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A (WA C C - 0 5 ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus 株名 ： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5， -CCA ATC CAC GAA GAG ATG CAG GG- 3' 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DN A (WA C C - 0 6 ) 起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus 株名 ： Y-94
配列の特徵
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5' -GTG GGA TAG CAA ACA ATA TCC AC- 3， 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：合成 DN A (WA C C - 0 7 ) 起源
生物名： Acremonium cellulolyticus 株名： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5' -CTT TCC ATC GTT GCC GCC ACG GC-3' 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A (WA C C - 0 8 ) 源
生物名： Acremonium cellulolyticus 株名 ： Y-94
配列の特徵
存在位置： 1. . 2 3
特徵を決定した方法： E
配列
5， -CTA CTA CCA CTG CCG CTG CAT CC- 3， 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポ口ジ一：直鎖状
配列の種類： 合成 DNA (WA C C - 0 9 ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus 株名 ： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 4
特徴を決定した方法： E
配列
5' -AAT ACA CTG TAG CAA ACA ACG GTC-3'
配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DN A (WAC C - 1 0 ) 起源
生物名 ： Acremonium cellulolyticus 株名 ： Y-94
配列の特徵
存在位置： に . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5' -CAA CTA CGA CCC AAG ACA CCC CG - 3， 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A (WAC C— 1 1 ) 起源
生物名： Acremonium cellulolyticus 株名： Y- 94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 4
特徴を決定した方法： E
配列
5， -GTA GCC GCA ATG GAA ATC GTA ACG-3' 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 3
配列の型：核酸
鎖の数： i本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A (WA C C- 1 2) 起源
生物名： Acremonium cellulolyticus 株名： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 2 3
特徴を決定した方法： E
配列
5' -TGC TGA GCT TCA ACT CCG GTC AG-3' 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 3 4
3 a 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 DN A (A C C 2 n-Stu)
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyt i cus
株名 ： Y-94
配列の特徵
存在位置： 1. . 3 4
特徴を決定した方法： Ε
配列
5， -GGG AGG CCT GCG CAT CAT GTT GCG ATA TCT TTC C-3' 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：合成 D N A (A C C 2 c -Xho)
起源
生物名 ： Acremonium eel lulolyticus
株名 ： Y-94
配列の特徴
存在位置： 1. . 3 2
特徴を決定した方法： E
配列
5， -GGG CTC GAG TAC CTT AGA CCA AAG CTG GGT TG-3'

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列表の配列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配列の一部または全部を有し、 セ ルラーゼ活性を保持するタ ンパク質。
2 . 配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列の 1 ~ 4 3 7番の配列を含む 請求の範囲第 1項に記載のタ ンパク質。
3 . 配列表の配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列の - 2 0〜一 1番の配列を N 末端側に有する請求の範囲第 2項に記載の夕ンパク質。
4 . 請求の範囲第 1 項〜第 3項のいずれかに記載のタ ンパク質をコー ドする D N A。
5 . 配列表の配列番号 2 に記載の塩基配列の一部または全部を有する請求の 範囲第 4項に記載の D N A。
6 . 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の 2 4 1 ~ 1 9 4 1 番の塩基配列 を有する請求の範囲第 5項に記載の D N A。
7 . 請求の範囲第 4項〜第 6項のいずれかに記載の D N Aを含む発現べク夕
8 . 請求の範囲第 7項に記載の発現べクターにより形質転換された微生物。
9 . 微生物がァク レモ二ゥム属の糸伏菌である請求の範囲第 8項に記載の微 生物。
10. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の微生物を培養し、 培養物から請 求の範囲第 1 項に記載のタ ンパク質を採取することを特徴とするセルラーゼ活性 を有するタ ンパク質の製造法。
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