JP3107977B2 - 新規セルラーゼおよびその遺伝子 - Google Patents

新規セルラーゼおよびその遺伝子

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JP3107977B2 JP06203564A JP20356494A JP3107977B2 JP 3107977 B2 JP3107977 B2 JP 3107977B2 JP 06203564 A JP06203564 A JP 06203564A JP 20356494 A JP20356494 A JP 20356494A JP 3107977 B2 JP3107977 B2 JP 3107977B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、新規セルラーゼおよびその遺伝子に関し、更
に詳細には新規セルラーゼをコードするDNA配列、該
DNA配列を含有する発現ベクター、該ベクターにより
形質転換された微生物、並びに該微生物による新規セル
ラーゼの製造法に関する。
【0002】背景技術 セルロースは、グルコースがβ−1,4−グリコシド結
合でつながった高分子多糖である。従って、これを加水
分解すればグルコースが得られ、グルコースの供給源と
してセルロースを有効に利用することができる。しか
し、セルロースは難分解性の物質であり、セルロース系
バイオマスの活用は実用にまでは至っていない。このセ
ルロースを効率よく加水分解し、そこからエネルギーを
取り出すための一連の反応を司るのがセルラーゼであ
る。従って、本酵素の特性を解明すること並びに本酵素
を効率よく生産することは、セルロース資源の有効活用
に関わる技術の根幹をなすものといえる。
【0003】またセルラーゼは、産業用酵素剤として市
販され、洗剤、繊維加工用製剤、飼料添加剤、消化剤と
いった種々の製品の主要成分として用いられている。よ
って、セルラーゼの特性解明はこのような実用面でも大
いに役立つものと期待されうる。
【0004】セルラーゼ系は、エンドグルカナーゼ、エ
キソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼの3種の酵素系
に大別され、これらのセルラーゼは、相互に作用しあ
い、相乗効果によりセルロースの分解を担っている。こ
れら切断様式の他にも、作用温度、作用pHなど様々な
特性を有するセルラーゼ成分が、多岐にわたる微生物に
よって生産されており、その利用目的に応じて酵素系が
選択されてきた。しかし、目的によっては微生物から得
られる酵素成分の組成が必ずしも適切ではない場合もあ
り、これを最適化するために、微生物の培養条件をコン
トロールする他、変異株の獲得や、酵素の分画といった
手段がとられている。
【0005】一方で、これらの酵素成分を遺伝子工学的
に単離し、利用することも試みられている。この方法に
よれば、極めて精製度の高い酵素を得ることが出来るた
め、その酵素の特性解明、およびその有効な利用が可能
になると考えられる。しかしながら、前述のようにセル
ラーゼは複合酵素系であることから個々のセルラーゼの
成分の特定は容易ではなく、全てのセルラーゼ遺伝子の
単離は未だなされていないのが現状である。
【0006】
【発明の概要】今般本発明者らは、フミコーラ・インソ
レンス(Humicola insolens )からセルラーゼの遺伝子
を単離し、その遺伝子から発現されるセルラーゼを得る
ことに成功した。従って、本発明は、セルラーゼおよび
前記セルラーゼをコードするDNA配列の提供をその目
的とする。また、本発明は、遺伝子組み換え操作によっ
て本発明によるセルラーゼを微生物中で発現させること
をその目的とする。
【0007】本発明によるタンパク質は配列表1に記載
されるアミノ酸配列の一部もしくは全部を有するもの、
である。本発明によるタンパク質は、また、配列表1に
記載されるアミノ酸配列の1〜429番の配列からなる
もの、および更に−22〜−1番の配列をそのN末端側
に有してなるものである。更に本発明によるDNA配列
は、上記アミノ酸配列をコードするもの、特に配列表2
に記載される塩基配列の一部または全部を有するもの、
である。
【0008】微生物の寄託 本発明によるセルラーゼ遺伝子を含むプラスミドpM3
−1(実施例5参照)で形質転換された大腸菌JM10
9株は、FERM P−14459の受託番号のもと工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【0009】
【発明の具体的説明】セルラーゼおよびその遺伝子 本発明によるタンパク質は、配列表1に記載される配列
の一部または全部を有するもの、である。また、前記タ
ンパク質の誘導体としては、例えばアミノ酸の付加、挿
入、削除、欠失または置換などの改変が生じた配列表1
に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質であっ
て、依然としてセルラーゼ活性を保持するものが挙げら
れる。
【0010】本発明によって提供されるタンパク質は、
また、配列表1に記載されるアミノ酸配列の1〜429
番までの配列からなるものである。また、この配列のN
末端に更に配列表1の−22〜−1番までのアミノ酸配
列を有するタンパク質も本発明に包含される。本発明に
よるこれらのタンパク質は、セルラーゼ活性を有し、特
に中性領域のpHにおいて活性を有する。
【0011】これらのタンパク質はH.インソレンスに
由来するものであり、この配列表1の1〜429番まで
の配列を有するタンパク質は成熟タンパク質であり、−
22〜−1番の配列はシグナルペプチドと考えられる。
【0012】なお、以下でこの配列表1に記載されるア
ミノ酸配列の1〜429番までの配列をセルラーゼNC
E1、その遺伝子をセルラーゼNCE1遺伝子と言う場
合がある。
【0013】本発明によれば、前記タンパク質のアミノ
酸配列をコードするDNA配列が提供される。このDN
A配列の典型的配列は、配列表2に記載される塩基配列
の一部または全部を有するものである。
【0014】配列表2に記載される塩基配列は、H.イ
ンソレンスの染色体DNAを表したものである。配列表
2に記載される塩基配列は、配列番号310のATGで
始まり、配列番号1893のTAAで終了するオープン
リーディングフレーム(読みとり枠)を有する。また、
配列番号376〜1890の塩基配列は429残基から
なる前記成熟タンパク質に対応する。更に、配列表2の
塩基配列中には4つのイントロンが存在することが確認
された(実施例7参照)。
【0015】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれ
ば、それをコードするDNA配列は容易に定まり、配列
表1に記載されるアミノ酸配列の全部または一部をコー
ドする種々の塩基配列を選択することができる。従っ
て、本発明による配列表1に記載されるアミノ酸配列の
一部または全部をコードするDNA配列とは、配列表2
に記載される一部または全部の塩基配列に加え、同一の
アミノ酸をコードする配列であって縮重関係にあるコド
ンを塩基配列として有する配列も意味するものとする。
【0016】本発明によるタンパク質をコードする遺伝
子の塩基配列は、これまでにクローン化され、そして塩
基配列が明らかにされたいかなるセルラーゼ遺伝子のそ
れと相違するものである。これは、核酸データベースG
enBank(登録商標)、R77.0、June,1
993に登録されているセルラーゼ遺伝子と比較するこ
とによって既に確認されている。
【0017】本発明によるDNAは、天然由来のもので
あっても、全合成したものであってもよい。また、天然
物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであっ
てもよい。DNAの典型的な取得方法としては、H.イ
ンソレンス由来の染色体ライブラリーまたはcDNAラ
イブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方
法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した
適当なDNAプローブを用いてスクリーニングを行う方
法、等が挙げられる。また、前記した寄託菌より得るこ
とも可能である。
【0018】本発明によるDNA配列は以下のようにし
て決定した。 (1)ゲノムDNAライブラリーの作製 H.インソレンスを培養し、集菌して菌体を得た。この
菌体より、全DNAをHoriuchi et al.,Journal of Bac
teriology(1988) 170,272 に記載される方法に準じて調
製した。得られたDNAを制限酵素で部分的に分解した
後、9〜23kbの断片を主体とするDNA断片を得
た。このDNAを基に、市販されているベクター・キッ
トを用いてゲノムDNAライブラリーを作製した。
【0019】(2)クローン化用DNAプローブの作成 H.インソレンスを培養し、セルラーゼ活性を指標とし
て、各種クロマトグラフィーおよび2次元電気泳動を用
いてセルラーゼを精製した。次いで、この精製セルラー
ゼをプロテアーゼによって分解し、アミノ酸配列をペプ
チドシークエンサーによって決定した。このアミノ酸配
列に基づいて、可能な塩基配列をすべて含むオリゴヌク
レオチドの混合物を調製し、これを基にしてPCR法に
よる増幅を行った結果、89塩基対のオリゴヌクレオチ
ドが得られ、これをプローブとして用いた。
【0020】(3)セルラーゼ遺伝子のクローン化 上記(1)により得られたDNAライブラリー(例え
ば、ファージDNAライブラリー)を大腸菌に感染さ
せ、生じたプラークをナイロンメンブランへブロット
し、アルカリ変性および中和処理を行った後、上記
(2)により得られたプローブとハイブリダイズさせて
陽性プラークを選択した。
【0021】(4)塩基配列の決定 上記のようにして選択されたクローン(計8個)のうち
1個についてDNAを調製し、常法に従い(例えば、D
NAシークエンサーを用いて)塩基配列を決定した。ま
た、塩基配列を基にN末端とC末端のオリゴヌクレオチ
ド・プライマーを合成し、PCR法によりcDNAの全
塩基配列を得た。鋳型は、H.インソレンス株から得た
mRNAに、逆転写酵素を働かせることにより合成した
cDNAを用いた。このcDNA全塩基配列と前記DN
A配列を比較することによってイントロン、読みとり枠
の存在が明らかになった(実施例7および配列表2参
照)。
【0022】発現ベクターおよび形質転換された微生物 また、本発明によれば、前記の本発明によるDNA配列
を、宿主微生物内で複製可能でかつそのDNA配列がコ
ードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現
ベクターが提供される。更に、本発明によれば、この発
現ベクターによって形質転換された微生物が提供され
る。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、
大腸菌、放線菌、酵母、カビなどを用いた系、および、
それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現
系などを用いることができる。本発明によるベクター構
築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されて
いるものを用いることができる。
【0023】本発明による発現ベクターは、これを実際
に宿主微生物に導入して所望のタンパク質を発現させる
ためには、前記の本発明によるDNA配列の他に、その
発現を制御するDNA配列や微生物を選択するための遺
伝子マーカー等を含んでいてもよい。配列表2の塩基配
列はこれらの制御配列なども含んでいると考えられるこ
とから、この塩基配列をそのまま利用することも場合に
よって有利であると考えられる。また、この発現ベクタ
ーは、セルラーゼをコードするDNA配列を反復した形
(タンデム)で含んでいてもよい。これらは常法に従い
発現ベクターに存在させてよく、このベクターによる微
生物の形質転換の方法も、この分野で慣用されているも
のを用いることができる。
【0024】この形質転換体を適当な培地で培養し、そ
の培養物から上記した本発明によるタンパク質を単離し
て得ることができる。従って、本発明の別の態様によれ
ば、前記の本発明による新規タンパク質の製造法が提供
される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する
微生物についてのそれと本質的に同様であってよい。ま
た、培養液からの本発明による新規タンパク質の回収、
精製も常法に従って行うことができる。
【0025】
【実施例】実施例1 セルラーゼNCE1の精製 H.インソレンス株を下記組成の(N)培地中で37℃
で培養した。(N)培地の組成:アビセル(5.0
%)、酵母エキス(2.0%)、ポリペプトン(0.1
%)、塩化カルシウム(0.03%) 、硫酸マグネシウ
ム(0.03%) 、pH 6.8。7日間培養の後、得
られた培養液を7000rpmで20分間遠心すること
により、菌体を除いた。得られた培養上澄を、凍結乾燥
後、5%(w/v) となるように25mMトリス塩酸緩
衝液(pH 9.0)に溶解し、陰イオン交換カラム
(monoQ(60/100),ファルマシアバイオテク
社製)に適用し、25mMトリス塩酸緩衝液(pH
9.0)で溶出した。このカラムに吸着しなかった画分
を、凍結乾燥後、10%(w/v)となるように50m
Mトリス塩酸緩衝液(pH9.4) に溶解し、フェニル
スーパーロースカラム(phenyl-superroseHR5/5,ファル
マシアバイオテク社製)に適用し、50mMトリス塩酸
緩衝液(pH 9.4)中、1.5〜0Mの濃度勾配を
かけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。この
うち、0.5〜0.4Mの濃度勾配のとき得られた画分
は、pHが中性の領域においてセルラーゼ活性を示すこ
とが確認された。クロマトグラフ処理したセルラーゼN
CE1は、 SDS-PAGE により分析した。電気泳動的に分
離されたタンパク質はクマーシーブルーR250で染色して
検出した。ゲルは単一の染色バンドを示し、酵素が純粋
であることを示していた。このタンパク質の見かけ分子
量は、既知のマーカータンパクの移動速度と比較するこ
とによって、約43kDであると算出された。
【0026】実施例2 セルラーゼNCE1の部分アミ
ノ酸配列 (1) N末端側アミノ酸残基の同定 実施例1と同様に電気泳動分離を行った後、マルチフォ
ーII電気泳動装置(ファルマシアバイオテク社製)を用
いて、PVDF膜(ミリポア社製)に、タンパク質を電
気的に写しとった。さらに、ポンソーS色素で染色した
後、43KDのタンパク質がブロットされている部分を
切り出し、水で洗浄後風乾した。これをプロテインシー
ケンサーModel 477A(ABI社製)に供し、N末端側ア
ミノ酸配列の決定を試みたが、エドマン分解により切り
出されるアミノ酸が得られず、N末端側アミノ酸が修飾
保護されていることが判明した。そこで、先の風乾物上
のタンパク質を、Podell,D.N. et al.,Biochem. Biophy
s.Res.Commun.(1978)81,176 に記載される方法に従っ
て、牛肝臓ピログルタメートペプチダーゼ(ベーリンガ
ー社製)を用いて処理することにより、修飾N末端アミ
ノ酸残基を除去し、次いで、水で洗浄し、風乾した後、
再度前記プロテインシーケンサーにより、N末端側アミ
ノ酸配列を5残基決定した。得られた配列は、グルタミ
ン―アラニン―グリシン―トレオニン―イソロイシンの
順序であった。
【0027】(2) ペプチドマッピング タンパク質内部のアミノ酸配列を決定するために、先の
風乾物をジチオスレイトールで還元後、ヨード酢酸を用
いてカルボキシメチル化した。その後、0.5%ポリビ
ニルピロリドン―40の100mM酢酸溶液で処理した
後、水洗を行った。これを、0.1%重炭酸アンモニウ
ム(pH8)緩衝液(10%アセトニトリルを含む)中
で、トリプシン(生化学工業社製)処理を行った。トリ
プシンはブロットされたセルラーゼNCE1の1/50
量、約20μgを添加し、37℃で一晩かけて分解を行
った。これを、Model 172 μプレパラティブHPLCシ
ステム(ABI社製)を用いてカラム(C8 220X2.1mm
)クロマトグラフィーを行った。溶離はアセトニトリ
ルグラジェント(0−35%)で行った。得られた2種
類のペプチドNo.5とペプチドNo.9に関して、気
相プロテインシーケンサーPSQ−1(島津製作所社
製)を用いてアミノ酸配列決定を行った。得られたペプ
チドのアミノ酸配列を以下に示す((X)は不明アミノ
酸残基を表す)。
【0028】実施例3 ゲノムDNAライブラリーの作
ゲノムDNAの単離はHoriuchi et al.,Journal of Bac
teriology(1988)170,272に記載される方法に従って行っ
た。まず、H.インソレンス株を前述(N)培地で2日
間培養し、遠心分離(3500rpm,10分)によっ
て菌体を回収した。得られた菌体をSDSで溶菌させ
て、フェノール処理、プロテイナーゼKおよびリボヌク
レアーゼA処理、さらにPEG沈殿化によりゲノムDN
Aを得た。次いで、H.インソレンスゲノムDNAをS
au3AIにより部分消化し、9−23kbの範囲の分
子を含有する画分とファージベクター, EMBL 3( ストラ
タジーン社製)のBamHI消化物とを4対1モル比、
125μg/mlの全DNA濃度において混合し、ライ
ゲーションキット(宝酒造社製)を用い、26℃で一晩
かけて連結させた。DNAをエタノール沈殿後、5μl
のTE緩衝液(10mMトリス塩酸(pH8.0)、1
mM EDTA)に溶解した。連結混合物の1.25μ
gを、Hohn,B., Method in Enzymology(1979)68,299-30
9 に記載されている方法に従って凍結したパッケージ成
分(アマシャム社製パッケージングキット)を用いて、
試験管内においてラムダヘッドにパッケージし、得られ
たファージをE. coli LE392 株上にプレートした。得ら
れた2×10個のファージライブラリーを用いて目的
遺伝子のクローン化を行った。
【0029】実施例4 PCR法による長鎖プローブの
作成 H.インソレンス株の全DNAを鋳型にし、PCR法を
用いてロングプローブの作成を行った。
【0030】(1) PCR用プライマーDNAの作成 プローブとしては実施例2の*印で示したアミノ酸に対
応するDNAを合成した。不明のアミノ酸(X)はシス
テインとし、これに対応するDNAを合成した。PCR
法で増幅されるDNAの塩基配列をより容易に決定する
ため、いずれのプライマーにも次に示すアンカーDNA
部分を合成し付加した。また、Maristella De O. Azeve
do et al.,J. General Microbiology(1990)136,2569-25
78に記載された内容により、ペプチドNo.9の方がペ
プチドNo.5に比較して、タンパク質のN末端により
近く位置すると判断された。作成したプライマーの塩基
配列は以下の通りである。 ペプチドNo.9より作成したプライマー 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT AA(CT)GGITG(CT)GA(CT)TA(CT)A
A-3' ペプチドNo.5より作成したプライマー 5'-CAGGAAACAGCTATGACC TTICC(AG)TA(AG)AA(AG)TC(CT)T
T-3' (I :イノシン) H.インソレンスゲノムDNA1μgに対し、プライマ
ーを各1μM加え、94℃で1分、55℃で2分、72
℃で3分を1サイクルとし40回反応を繰り返してPC
R法によるDNAの増幅を行った。その結果、89bp
のDNAが増幅した。
【0031】(2) PCR産物の塩基配列決定 PCR産物を電気泳動し、未反応物と目的物を分離した
後、目的物を含む寒天片を切り出し、SUPREC-01 フィル
ター付き遠心チューブ(宝酒造社製)により抽出し、エ
タノール沈殿法にて精製濃縮した。50ng相当の鋳型
をAmpli Taq cycle sequencing kit(宝酒造社製)にて
以下の5’末端アイソトープ標識したプライマーでサイ
クルシーケンスを行った。
【0032】(1)に用いたプライマー以外の新たに解
読されたDNAの塩基配列の結果は下記の通りである。 5'-C CCC TAC CGC ATG GGC AAC-3' 新たに判明した19bpの塩基配列から予想できるアミ
ノ酸のうちプロリンとチロシンおよびメチオニンの位置
が、先に求めた、ペプチドNo.9とペプチドNo.5
のアミノ酸配列順序と一致したので、以後この89bp
の増幅DNAを遺伝子クローン化のためのプローブとし
て使用した。
【0033】実施例5 セルラーゼNCE1遺伝子のク
ローン化 (1)プラークハイブリダイゼーションによるスクリー
ニング PCR法により増幅させた89bpのDNA断片を10
0ngとり、ECLダイレクトDNA/RNAラベリン
グ検出システム(アマシャム社製)に添付されている、
ラベリング溶液およびグルタルアルデヒドとを混合し、
あらかじめ、37℃で10分間反応させておいた。ファ
ージプラークは、HyBond N+ ナイロントランスファーメ
ンブラン(アマシャム社製)に写しとり、0.4N 水
酸化ナトリウムで変性後、5×SSCで洗浄し、乾燥さ
せDNAを固定した。キットに記載の方法に従って、1
時間のプレハイブリダイゼーション(42℃)の後、先
の標識化したプローブを添加し、4時間(42℃)ハイ
ブリダイゼーションを行った。ラベルの洗浄はキットの
方法に従った。まず、0.5×SSC(6M 尿素,
0.4% SDS)で42℃、20分間の洗浄を2回繰
り返し、次に、2×SSCで、室温下で5分間の洗浄を
2回行った。次に、添付されている検出溶液に1分間浸
したあと、Hyperfilm-ECL (アマシャム社製)に感光さ
せ8個の陽性クローンを得た。
【0034】(2)ファージDNAの調製 E. coli LE392 にファージを感染させ、8時間後ファー
ジ粒子を集め、Grossberger,D.,Nucleic Acids. Res.
(1987)15,6737に記載される方法により、プロテイナー
ゼKおよびフェノール処理後、エタノール沈殿により、
ファージDNAを分離した。
【0035】(3)目的遺伝子のサブクローン化 8種のファージDNAをBamHIで切断し、アガロー
ス電気泳動に供した。DNAをSouthern,E.M., J.Mol.B
iol.(1975) 98,503-517 に記載される方法により、ナイ
ロンメンブランに写しとり、先のプラークハイブリダイ
ゼーションと同一の条件で、89bpのプローブを用い
ハイブリダイズさせ、4.4kbの目的遺伝子を含むD
NA断片を検出した。その結果、3種のファージDNA
が同一サイズのBamHI断片を有していた。この4.
4kbのDNA断片をセファグラスバンドプレップキッ
ト(ファルマシアバイオテク社製)を用いて分離し、E.
coli JM109 を用いプラスミドpUC18のBamHI
部位にサブクローン化を行った。得られたプラスミドを
pM3−1とした(図1)。
【0036】(4)ゲノムDNAのサザンハイブリダイ
ゼーション H.インソレンスのゲノムDNAをBamHIで切断
後、アガロース電気泳動に供し、Southern,E.M., J.Mo
l.Biol.(1975) 98,503-517 に記載されている方法に従
い、ナイロンメンブランに写しとった。先のプラークハ
イブリダイゼーションと同一の条件で、89bpのプロ
ーブを用いハイブリダイズするDNA断片のサイズを求
めた。また同時に、3種類のファージDNAが有する
4.4kbの断片に関しても同一操作を行った。その結
果、クローン化した断片とゲノムDNAのBamHI切
断断片のサイズが同一であることを確認した。
【0037】実施例6 塩基配列の決定 塩基配列解析装置は、A.L.F. DNAシーケンサーII
(ファルマシアバイオテク社製)を用いた。シーケンシ
ングゲルは、レディミックスゲル(ファルマシアバイオ
テク社製)、またはハイドロリンクロングレンジャー
(AT Biochem社製)のアクリルアミド担体を使用した。
ゲル作成用各種試薬(N,N,N’,N’−テトラメチ
ルエチレンジアミン、尿素、過硫酸アンモニウム)はフ
ァルマシアバイオテク社製A.L.F グレードの試薬を用い
た。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシング
キットまたはオートサイクルシーケンシングキット(フ
ァルマシアバイオテク社製)を用いた。ゲル作成条件、
反応条件と泳動条件の各々は、各説明書の詳細を参照し
て設定された。
【0038】(1) 塩基配列解読用鋳型プラスミド
(以下単に「テンペレート」ということがある)の調製 テンペレートとして、pM3−1,pM5,pM7およ
びpM8を用いた。これらの構築方法は以下の通りであ
る。pM5はpM3−1(実施例5(3)参照)をSa
lIで切断し、500bpの消化断片をSalIで切断
したpUC118に連結し、クローン化した。pM7は
pM3−1をKpnIおよびEcoRVで切断し、1100
bpの消化断片をKpnIおよびSmalで切断したpU
C118に連結し、クローン化した。pM8はpM3−
1をBglIIおよびEcoRVで切断し、2300bp
の消化断片をBamHIおよびHincIIで切断したp
UC118に連結し、クローン化した。4.4kbBa
mHI断片の制限酵素地図とpM5、pM7およびpM
8との関係は図2に示す通りである。
【0039】(2)塩基配列の解読(I) 実施例4の89bpのPCR増幅断片の塩基配列からFI
TC標識シーケンシングプライマーDNA(WATA−0
1,WATA−02)を合成した。 WATA−01:5'-AACCC CTACC GCATG GGCAA CAA-3'
(23mer) WATA−02:5'-TTGTT GCCCA TGCGG TAGGG GTT-3'
(23mer) テンペレートとプライマーとの組み合わせをpM3−1
/WATA−01,pM3−1/WATA−02,pM
5/ユニバーサル,pM5/リバース,pM7/ユニバ
ーサル,pM7/リバース,pM8/ユニバーサル,p
M8/リバース(ユニバーサルおよびリバースの各プラ
イマーはキットに添付されているプライマーを示す)と
して、オートサイクルシーケンシングキットで反応させ
た。2μgのテンペレートおよびdNTPsと1pMの
プライマーおよびTthポリメラーゼを、94℃で36
秒、50℃で36秒、72℃で84秒を1サイクルとし
て25回反応を繰り返した。これらの産物をA.L.F.DN
AシーケンサーIIを用いて解読したところ、配列表2に
記す1〜350および645〜2285bpの塩基配列
が判明した。351−644bpの塩基配列は、下記W
ATA−03からなるシーケンシングプライマーを合成
し、pM8と反応させることにより1−2285bpの
塩基配列を連結した。 WATA−03:5'-GGCGA ACTCG TTGTT CATCA GGG-3'
(23mer)
【0040】(3)塩基配列解読(II) (2)の結果をもとに、WATA−11〜WATA−2
2からなるFITC標識シーケンシングプライマーDN
Aを合成し、これらプライマーとpM8とのオートリー
ドシーケンシングキットによる反応を行った。まず、1
0μgのプラスミドを2M水酸化ナトリウムでアルカリ
変性させ一本鎖プラスミドとし、エタノール沈殿により
回収した。これを各々のプライマーとアニーリングし、
T7ポリメラーゼで反応させた。 WATA−11:5'-GGCCG GAAGG AAATC TTGCT CAG-3'
(23mer) WATA−12:5'-ACAAG TGGAC CAGCC AGTGC AGC-3'
(23mer) WATA−13:5'-TCTGT ACTTC GTCGC CATGG AGG-3'
(23mer) WATA−14:5'-CAACA ACTGC GGTGG TACCT ACTC-3'
(24mer) WATA−15:5'-TTCGA TGACC GCAAC CGCTT CGC-3'
(23mer) WATA−16:5'-TCAGG TCGTC TGGTC CAACA TCC-3'
(23mer) WATA−17:5'-CAATC TCAAT ATGTA GCAGG ACG-3'
(23mer) WATA−18:5'-TGGAG TCGAG CCAGA GCATG TTG-3'
(23mer) WATA−19:5'-CCTGG ACGAA GAACT GAGAG AGC-3'
(23mer) WATA−20:5'-ACTCC CAAAC GTCGA TCTCA GCG-3'
(23mer) WATA−21:5'-TCATC AGGGT GAACA TCTGG TAC-3'
(23mer) WATA−22:5'-CGAGC ACCTC TTCCA GGTCA TCC-3'
(23mer) その結果、EcoRV−BglII断片のうち2285b
pの塩基配列を配列表2の様に決定した。
【0041】実施例7 イントロンの決定 イントロンの決定にはcDNAを合成し、この塩基配列
と染色体由来のそれとを比較することにより判定するの
が一般的である(Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Mo
lecular Cloning A laboratory manual", Cold Sprig H
arbor Laboratory Press(1989)) 。この方法に従い、以
下の様にイントロン領域を決定した。
【0042】(1)全RNAの調製 H.インソレンスをセルラーゼ誘導培地、好ましくは前
述(N)培地で2日間培養し、菌体を遠心分離(350
0rpm,10分)により回収した。そのうち2gの菌
体を滅菌水で洗い、液体窒素で凍結したままブレンダー
(日本精機社製ホモジナイザーAM-3)で粉砕した。これ
を4Mグアニジンチオシアン酸塩を含む変性溶液10m
l(4Mグアニジンチオシアン酸塩,25mMクエン酸
3ナトリウム,N−ラウリルサルコシン酸ナトリウム
0.5%,0.1Mメルカプトエタノール)に懸濁し
た。室温で数分攪拌した後、1mlの2M酢酸ナトリウ
ム(pH4.5)で中和し、10mlのTE飽和フェノ
ールを加えさらに攪拌した。ここに2mlのクロロホル
ム―イソアミルアルコール(24:1)を加え、よく攪
拌の後、遠心分離(3500rpm,10分)によりフ
ェノールで変成した菌体成分を除去した。上層(水層)
を吸い取り10mlのイソプロパノールで核酸を沈殿化
した。同沈殿を遠心分離(3500rpm,10分)で
核酸を回収し、70%エタノール―水で再遠心分離によ
り沈殿を洗った。同沈殿は、3.5mlのTE緩衝液に
溶解の後、880μlの10M塩化リチウム溶液を加
え、5℃で2時間冷却した後、遠心分離(12000r
pm,10分)により沈殿を回収した。同沈殿は70%
エタノール−水で洗い、これを全RNA画分とした。収
量は2.7mg,収率は0.14%であった。
【0043】(2)mRNAの調製 mRNAの調製はmRNAピュアリフィケーションキッ
ト(ファルマシアバイオテク社製)を用いて行った。ま
ず(1)で調製した全RNAのうち1mgを1mlのエ
リューションバッファーに溶解し、これに65℃,10
分の熱変性処理を加えた。氷中で急冷した後、0.2m
lのサンプルバッファーを加えた。この全量のRNA溶
液をオリゴ(dT)セルロースカラムに適用し、ハイソル
トバッファーで3回、ロウソルトバッファーで3回カラ
ムを洗浄した後、65℃に加温したエリューションバッ
ファーで溶出した。このカラム操作を2回繰り返し、m
RNA画分とした。収量は19.2μg、収率は2%で
あった。
【0044】(3)cDNAの合成 cDNA合成はタイムセーバーcDNA合成キット(フ
ァルマシアバイオテク社製)を使用した。まず、5μg
のmRNAを20μlのサンプルバッファーに溶解し
た。65℃,10分の熱処理後、ファーストストランド
合成ミックスにジチオスレイトール溶液、オリゴ(dT)
プライマーと共に添加し、37℃で1時間反応させた。
次に、この全量をセカンドストランドミックスに加え、
12℃で30分、次いで22℃で1時間反応させ、これ
をcDNAとした。
【0045】(4)cDNAのPCR法による増幅 合成したcDNAのうち1μgを鋳型とし、目的のcD
NAのみをPCR法により増幅した。上流および下流の
各プライマーDNAの配列は以下の通りである。 上流プライマー:5'-ATG CAG ATC AAG AGC TAC ATC C-3'
(22mer) 下流プライマー:5'-GAC GTT GAC GGT CGA GCC GAT G-3'
(22mer) アンプリタックPCRキット(宝酒造社製)を用い、1
μMの各プライマー、0.2mMのdNTPミックス、
1.25UnitのrTaqポリメラーゼの組成を用
い、熱変性を94℃で1分、アニーリングを50℃で2
分、および伸長を72℃で3分の1サイクルを40回繰
り返すことにより増幅した。増幅された断片はアガロー
スゲル電気泳動の結果、1.3kbpの大きさであっ
た。これを、エタノール沈殿化により濃縮し、pT7ブ
ルーT―ベクターキット(ノバジェン社製)によりクロ
ーン化した(プラスミド名:pPR1)。
【0046】(5)cDNAの塩基配列解析 シーケンシング反応は前述同様オートリードシーケンシ
ングキットを用いて行った。プラスミドpPR1を2M
水酸化ナトリウムでアルカリ変性し、エタノールで沈殿
化した。この一本鎖プラスミドをテンペレートとし、T
7ポリメラーゼで反応させた。プライマーはキット添付
のユニバーサルとリバース、前記合成プライマーWAT
A−13,WATA−14,WATA−15,WATA
−19,WATA−20,WATA−21を用いた。そ
れぞれの組み合わせで二回ずつ反応し、配列を解読し
た。その結果ゲノムDNAには880〜956bp(I
ntrone I)、1290〜1348bp(Int
rone II)、1593〜1648bp(Intro
ne III)と1780〜1835bp(Introne
IV)の計4つのイントロンが存在していることが判明
した。
【0047】配列表2において、イントロン配列の非翻
訳開始認識配列、その終了配列、およびイントロン内部
の調節配列は下記の通りであった(数字は配列表2の配
列番号である): IntroneI 880〜 885、 934〜 936、 921〜 9
27、 IntroneII 1290〜1295、1346〜1348、1333〜13
39、 IntroneIII 1593〜1598、1646〜1648、1630〜16
36、 IntroneIV 1780〜1785、1833〜1835、1819〜18
25。
【0048】実施例8 組み換えプラスミドの調製 H.インソレンスにNCE1遺伝子を再導入するため
に、まずA.ニデュランスtrpCの遺伝子のプロモー
ターとターミネーター(Mullaney E.J.,et al.,Mol.Ge
n.Genet.(1985)199,37-45) を用いてビアホラス耐性遺
伝子(bar:ThompsonC.J.,et al.,EMBO J.(1987)6,2519-
2523)をH.インソレンスで発現可能にした遺伝子を作
製した。これをNCE1遺伝子を含むプラスミドpM3
−1のXbaI部位に導入し、組み換えプラスミドpN
CE1を作製した。
【0049】実施例9 セルラーゼNCE1遺伝子の発
現(I) H.インソレンスを(S)培地中で37℃で培養した。
(S)培地の組成は実施例1の(N)培地にグルコース
(3.0 %)を加え、アビセルを除いたものである。
24時間培養後得られた菌体を3000rpm10分遠
心して菌体を集め、0.5Mシュークロースで1回洗浄
した。菌体を0.45μmのフィルターで濾過したプロ
トプラスト化酵素溶液(5mg/ml Novozyme234,5
mg/ml Cellulase Onozuka R-10 ,0.5M シュ
ークロース)10mlで懸濁しL字管に入れた。30℃
で約90分振盪し、プロトプラスト化させた。滅菌した
綿で濾過して2500rpmで10分遠心しプロトプラ
ストを回収し、更にSUTC緩衝液(0.5M シュー
クロース,10mM CaCl,10mMトリス塩酸
pH7.5)で1回洗浄した。その後、プロトプラス
トを1mlのSUTC緩衝液で懸濁し、このうち100
μlに対し1μg/μlのプラスミドpNCE1のDN
A溶液を10μl加え氷中に5分静置した。400μl
のPEG溶液(60%(w/v)PEG4000,10
mM CaCl,10mMトリス塩酸 pH7.5)
を加え、氷中に20分間静置し10mlのSUTC緩衝
液を加え、2500rpmで10分遠心し洗浄した。更
に1mlのSUTC緩衝液に懸濁した後、4000rp
mで5分間遠心してプロトプラストを集め、最終的に1
00μlのSUTC緩衝液に懸濁した。形質転換体を選
択するため、あらかじめビアラホス200μg/mlを
添加したYMG培地に懸濁したプロトプラストをのせた
(YMG培地の組成は、グルコース1%、酵母エキス
0.4%、モルトエキス0.2%、寒天1%、pH6.
8である)。その後、45℃程度に温めておいたYMG
培地(寒天0.6%)を2ml注ぎプロトプラストに重
層した。37℃で5日間培養した後、ビアラホスに耐性
を示すコロニーを釣菌し、アボーティブ株を除去した後
培養試験を行った。培養は、(N)培地中で37℃で5
日間行った。培養上清をSDS-PAGEに供したところ、NC
E1タンパク質が3〜5倍に発現増強していることが確
認された。
【0050】実施例10 セルラーゼNCE1遺伝子の
発現(II) セルラーゼNCE1遺伝子のプロモーターおよびターミ
ネーターをアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillu
s nidulans)で発現させるために、開始コドンの直ぐ上
流および終始コドンの直ぐ下流にBamHI消化部位を
以下のように部位指定変異により導入した。プラスミド
pM8をE.coli CJ236株に導入し、ヘルパ
ーファージM13K07を感染させた後、アンピリシ
ン、カナマイシンをそれぞれ150μg/ml、70μ
g/mlの濃度で含む20mlの2×YT液体培地
(1.6%バクトトリプトン、0.8%酵母エキス、
0.5%NaCl)で、37℃、16〜20時間培養
し、培養上清よりプラスミドpM8のssDNAを回収
した。このssDNAと2種の合成オリゴヌクレオチド
5'-CATCTTGTAAAGGATCCTGGTGAGATG-3' 、5'-GCAGAGCGGAT
CCTGATTTTGAGC -3' を用い、Mutan−Kキット(宝
酒造社製)を使用して部位指定変更処理を行なった。変
更が導入されたプラスミドpM8−1をBamHIで消
化し、1.6kbのDNA断片を回収した。プロモータ
ーおよびターミネーターとして、A・ニガー(A.ni
ger)α‐アミラーゼ遺伝子プロモーター(0.6k
bp)およびA.ニデュランスtrpC遺伝子ターミネ
ーター(0.74kbp)を、マーカー遺伝子として
A.ニデュランスargB遺伝子をそれぞれ含むA.ニ
デュランス用発現ベクターのBamHI部位に、上述の
DNA断片を挿入してプラスミドpNCE2を作製し
た。
【0051】このプラスミドpNCE2を用いて、A.
ニデュランスFGSC89株を以下のようにして形質転
換した。A.ニデュランスFGSC89株より分生子を
調製し、100mlのプロトプラスト形成用培地(2%
可溶性澱粉、1%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、
0.5%KHPO、0.05%MgSO)に植菌
し、37℃で20〜40時間培養した。菌体をG−1ガ
ラスフィルターで濾過して集菌し、フィルター上で1.
2M MgSOを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH5.8)で充分洗浄した。50mg Novo
zym 234、10mg β‐グルクロニダーゼを1
0mlの上述の緩衝液に溶解しておいた50ml容のチ
ューブにこの菌体を移し、30℃で1〜2時間ゆっくり
振盪してプロトプラストを形成させた。その後、G−2
ガラスフィルターで溶解しなかった菌糸を除き、ろ液を
遠心してプロトプラストを集めた。プロトプラストを2
回STC緩衝液(10mM トリス塩酸(pH7.
5)、10mM CaCl、1.2Mソルビトール)
で先浄した後、200〜500μlのSTC緩衝液に懸
濁した。このプロトプラスト懸濁液100μlを、10
μlのDNA溶液と混合し、氷中に5分間放置した後、
25μlのPEG溶液(60%PEG4000、10m
M トリス塩酸(pH7.5)、10mM CaC
)を混合してさらに氷中に20分間放置した。1.
25mlPEG溶液を加え室温に20分間放置した後、
10mlのSTC緩衝液でこれを希釈し、集菌し、20
0μlSTC緩衝液懸濁液とした。この懸濁液から一部
を採取し、重層用培地と混合して選択培地上に重層し
た。37℃で培養し、出現したコロニーを形質転換体と
した。プラスミドpNCE2による形質転換体を2%可
溶性澱粉を炭素源とする液体培地で培養し、その培養上
清について、4‐メチルウンベリフェリル−β−D−セ
ロビオシドを基質としてセルラーゼ活性を測定した結
果、親株の10〜200倍のセルラーゼ活性が検出され
た。
【0052】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:451 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列 Met Gln Ile Lys Ser Tyr -20 Ile Gln Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ala -15 -10 -5 Gln Gln Ala Gly Thr Ile Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Met Thr Trp 1 5 10 15 Lys Arg Cys Ser Gly Pro Gly Asn Cys Gln Thr Val Gln Gly Glu Val 20 25 30 Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asn Asn Gly Gln Asn Cys 35 40 45 Tyr Glu Gly Asn Lys Trp Thr Ser Gln Cys Ser Ser Ala Thr Asp Cys 50 55 60 Ala Gln Arg Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ser Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His 85 90 95 Glu Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Ala Asn Gln 100 105 110 Asn Lys Tyr Gln Met Phe Thr Leu Met Asn Asn Glu Phe Ala Phe Asp 115 120 125 Val Asp Leu Ser Lys Val Glu Cys Gly Ile Asn Ser Ala Leu Tyr Phe 130 135 140 Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser Asn Arg 145 150 155 160 Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Ala Arg 165 170 175 Asp Leu Lys Phe Ile Gly Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp Arg Pro 180 185 190 Ser Thr Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Pro Met Gly Ala Cys Cys 195 200 205 Ala Glu Ile Asp Val Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Phe Thr 210 215 220 Pro His Ala Cys Gly Ser Lys Asn Arg Tyr His Ile Cys Glu Thr Asn 225 230 235 240 Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Cys Asp 245 250 255 Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Lys Asp Phe 260 265 270 Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Thr Val Val 275 280 285 Ser Arg Phe Glu Arg Asn Arg Leu Ser Gln Phe Phe Val Gln Asp Gly 290 295 300 Arg Lys Ile Glu Val Pro Pro Pro Thr Trp Pro Gly Leu Pro Asn Ser 305 310 315 320 Ala Asp Ile Thr Pro Glu Leu Cys Asp Ala Gln Phe Arg Val Phe Asp 325 330 335 Asp Arg Asn Arg Phe Ala Glu Thr Gly Gly Phe Asp Ala Leu Asn Glu 340 345 350 Ala Leu Thr Ile Pro Met Val Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His 355 360 365 His Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Pro Pro Glu Lys Ala 370 375 380 Gly Leu Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val 385 390 395 400 Pro Ala Glu Val Glu Ala Gln Tyr Pro Asn Ala Gln Val Val Trp Ser 405 410 415 Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Val Asn Val 420 425
【0053】配列番号:2 配列の長さ:2285 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:H.インソレンス(Humicola insolens ) 配列の特徴 特徴を表す記号:sig peptide 存在位置 :310..375 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:mat peptide 存在位置 :376..1890 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:intron 存在位置 :880..936 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:intron 存在位置 :1290..1348 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:intron 存在位置 :1780..1863 特徴を決定した方法:E 特徴を表す記号:cleavage−site 存在位置 :240..245 他の情報 :SalI 特徴を表す記号:cleavage−site 存在位置 :603..608 他の情報 :SalI 特徴を表す記号:cleavage−site 存在位置 :760..765 他の情報 :SalI 特徴を表す記号:cleavage−site 存在位置 :1152..1157 他の情報 :KpnI 特徴を表す記号:cleavage−site 存在位置 :1267..1272 他の情報 :SalI 配列 TCTCCAATAA CGACGAAGCG ACTGTTGGCT GATCAATTAG CTGGCGATGG GTCTGTGGTA 60 TGGAACGTCG GCTGAGTCTT CCATCTCCCA CCGTAGACGT GTTCCGCGGA TCAAGGTCTC 120 CCGCTCCGTA ACCGCCCAGG TGGCTCGGTT CTTGATGATG GGAAAGGGGC CGACGGCAGT 180 ATAAAGAGCC ATGGAAGCAT CCCTCGAGGC CGGAAGGAAA TCTTGCTCAG CCACCCGCAG 240 TCGACTTGTC TATCGATCTG AGCAGCAGTT GACCGGTCTT CTCTGTCATC TCAGCAGCAG 300 TCTTTCAAG ATG CAG ATC AAG AGC TAC ATC CAG TAC CTG GCC GCG 345 Met Gln Ile Lys Ser Tyr Ile Gln Tyr Leu Ala Ala -20 -15 GCT CTG CCG CTC CTG AGC AGC GTC GCT GCC CAG CAG GCC GGC ACC ATC 393 Ala Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Ala Ala Gln Gln Ala Gly Thr Ile -10 -5 1 5 ACC GCC GAG AAC CAC CCC AGG ATG ACC TGG AAG AGG TGC TCG GGC CCC 441 Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Met Thr Trp Lys Arg Cys Ser Gly Pro 10 15 20 GGC AAC TGC CAG ACC GTG CAG GGC GAG GTC GTC ATC GAC GCC AAC TGG 489 Gly Asn Cys Gln Thr Val Gln Gly Glu Val Val Ile Asp Ala Asn Trp 25 30 35 CGC TGG CTG CAC AAC AAC GGC CAG AAC TGC TAT GAG GGC AAC AAG TGG 537 Arg Trp Leu His Asn Asn Gly Gln Asn Cys Tyr Glu Gly Asn Lys Trp 40 45 50 ACC AGC CAG TGC AGC TCG GCC ACC GAC TGC GCG CAG AGG TGC GCC CTC 585 Thr Ser Gln Cys Ser Ser Ala Thr Asp Cys Ala Gln Arg Cys Ala Leu 55 60 65 70 GAC GGT GCC AAC TAC CAG TCG ACC TAC GGC GCC TCG ACC AGC GGC GAC 633 Asp Gly Ala Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp 75 80 85 TCC CTG ACG CTC AAG TTC GTC ACC AAG CAC GAG TAC GGC ACC AAC ATC 681 Ser Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Ile 90 95 100 GGC TCG CGC TTC TAC CTC ATG GCC AAC CAG AAC AAG TAC CAG ATG TTC 729 Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Ala Asn Gln Asn Lys Tyr Gln Met Phe 105 110 115 ACC CTG ATG AAC AAC GAG TTC GCC TTC GAT GTC GAC CTC TCC AAG GTT 777 Thr Leu Met Asn Asn Glu Phe Ala Phe Asp Val Asp Leu Ser Lys Val 120 125 130 GAG TGC GGT ATC AAC AGC GCT CTG TAC TTC GTC GCC ATG GAG GAG GAT 825 Glu Cys Gly Ile Asn Ser Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp 135 140 145 150 GGT GGC ATG GCC AGC TAC CCG AGC AAC CGT GCT GGT GCC AAG TAC GGC 873 Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser Asn Arg Ala Gly Ala Lys Tyr Gly 155 160 165 ACG GGC GTACGTTCTC TCCGTCCCGC CCCTACCAAA AGTATGACTC GTGCTGACGT 929 Thr Gly TTG ACAG TAC TGC GAT GCC CAA TGC GCC CGT GAC CTC AAG TTC ATT GGC 978 Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Ala Arg Asp Leu Lys Phe Ile Gly 170 175 180 GGC AAG GCC AAC ATT GAG GGC TGG CGC CCG TCC ACC AAC GAC CCC AAC 1026 Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp Arg Pro Ser Thr Asn Asp Pro Asn 185 190 195 GCC GGT GTC GGT CCC ATG GGT GCC TGC TGC GCT GAG ATC GAC GTT TGG 1074 Ala Gly Val Gly Pro Met Gly Ala Cys Cys Ala Glu Ile Asp Val Trp 200 205 210 GAG TCC AAC GCC TAT GCT TAT GCC TTC ACC CCC CAC GCC TGC GGC AGC 1122 Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Phe Thr Pro His Ala Cys Gly Ser 215 220 225 230 AAG AAC CGC TAC CAC ATC TGC GAG ACC AAC AAC TGC GGT GGT ACC TAC 1170 Lys Asn Arg Tyr His Ile Cys Glu Thr Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr 235 240 245 TCG GAT GAC CGC TTC GCC GGC TAC TGC GAC GCC AAC GGC TGC GAC TAC 1218 Ser Asp Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr 250 255 260 AAC CCC TAC CGC ATG GGC AAC AAG GAC TTC TAT GGC AAG GGC AAG ACC 1266 Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Lys Asp Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr 265 270 275 GTC GAC ACC AAC CGC AAG TTC AC GTAAGTTCCC TGGCCGCCTC TTCGACGACG CAG 1322 Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Th 280 285 AATGTCCGGA TGCTGACCCA GAACAG C GTT GTC TCC CGC TTC GAG CGT AAC AGG 1376 r Val Val Ser Arg Phe Glu Arg Asn Arg 290 295 CTC TCT CAG TTC TTC GTC CAG GAC GGC CGC AAG ATC GAG GTG CCC CCT 1424 Leu Ser Gln Phe Phe Val Gln Asp Gly Arg Lys Ile Glu Val Pro Pro 300 305 310 CCG ACC TGG CCC GGC CTC CCG AAC AGC GCC GAC ATC ACC CCT GAG CTC 1472 Pro Thr Trp Pro Gly Leu Pro Asn Ser Ala Asp Ile Thr Pro Glu Leu 315 320 325 TGC GAT GCT CAG TTC CGC GTC TTC GAT GAC CGC AAC CGC TTC GCC GAG 1520 Cys Asp Ala Gln Phe Arg Val Phe Asp Asp Arg Asn Arg Phe Ala Glu 330 335 340 ACC GGT GGC TTC GAT GCT CTG AAC GAG GCC CTC ACC ATT CCC ATG GTC 1568 Thr Gly Gly Phe Asp Ala Leu Asn Glu Ala Leu Thr Ile Pro Met Val 345 350 355 CTT GTC ATG TCC ATC TGG GAT GAC GTATGTGGCA CCAACCTCCA ACCGGGCATG AG 1624 Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp 360 365 ACCTGTACTG ACGTGTCTTG ACAG CAC CAC TCC AAC ATG CTC TGG CTC GAC TCC 1678 His His Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser 370 375 AGC TAC CCG CCC GAG AAG GCC GGC CTC CCC GGT GGC GAC CGT GGC CCG 1726 Ser Tyr Pro Pro Glu Lys Ala Gly Leu Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro 380 385 390 TGC CCG ACC ACC TCT GGT GTC CCT GCC GAG GTC GAG GCT CAG TAC CCC 1774 Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gln Tyr Pro 395 400 405 AAT GC GTACGTTACT ACCGCCGCTG CATCTGCAAA AAATACCGGT GCTAACCATT GTG 1832 Asn Al 410 CAG T CAG GTC GTC TGG TCC AAC ATC CGC TTC GGC CCC ATC GGC TCG ACC 1881 a Gln Val Val Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr 415 420 425 GTC AAC GTC TAAGCTATCA CGGCTCAAAA TCAGCGCCCG CTCTGCTCGT CCTGTTCGGC 1940 Val Asn Val GCGCCAGTAG GGGGATATGG GGCATTTCTT TGTTCAAGCA TTTTTCTCTT CGTCCTGCTA 2000 CATATTGAGA TTGTGTATCG TATGCACGCG TACAAAGTAG AAACCATGAT CAAGTCTCAT 2060 TGAACTATAC TGCTGCTCCC AAGATTAATT ATGCCGTAAT GGTCTGTTTG CTTTTTTTTT 2120 TTTTTTTTTT TGGTGCACTT GATCGTGTGG CACATTGGCC GCTGTATGTA TGGCTTCCCT 2180 CAATCGCCGA CTGACTCAAA ACGGCAGTAC AACAGAAGCC CCATTGCATC AGAAGAGAGG 2240 TTTTATAATG CCATGAGGTG TTCTCAGATG AAAGACTTCG AGTAT 2285
【0054】配列番号:3 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Gln Ala Gly Thr Ile 1 5
【0055】配列番号:4 配列の長さ:9 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Met Xaa Xaa Lys Asp Phe Tyr Gly Lys 1 5
【0056】配列番号:5 配列の長さ:15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Phe Ala Gly Tyr Xaa Asp Ala Asn Gly Xaa Asp Tyr Asn Pro Tyr 1 5 10 15
【0057】配列番号:6 配列の長さ:35 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TGTAAAACGA CGGCCAGTAA YGGNTGYGAY TAYAA 35
【0058】配列番号:7 配列の長さ:34 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CAGGAAACAG CTATGACCTT NCCRTARAART CYTT 34
【0059】配列番号:8 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CCCCTACCGC ATGGGCAAC 19
【0060】配列番号:9 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 AACCCCTACC GCATGGGCAA CAA 23
【0061】配列番号:10 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TTGTTGCCCA TGCGGTAGGG GTT 23
【0062】配列番号:11 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 GGCGAACTCG TTGTTCATCA GGG 23
【0063】配列番号:12 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 GGCCGGAAGG AAATCTTGCT CAG 23
【0064】配列番号:13 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 ACAAGTGGAC CAGCCAGTGC AGC 23
【0065】配列番号:14 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TCTGTACTTC GTCGCCATGG AGG 23
【0066】配列番号:15 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 CAACAACTGC GGTGGTACCT ACTC 24
【0067】配列番号:16 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TTCGATGACC GCAACCGCTT CGC 23
【0068】配列番号:17 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TCAGGTCGTC TGGTCCAACA TCC 23
【0069】配列番号:18 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 CAATCTCAAT ATGTAGCAGG ACG 23
【0070】配列番号:19 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TGGAGTCGAG CCAGAGCATG TTG 23
【0071】配列番号:20 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 CCTGGACGAA GAACTGAGAG AGC 23
【0072】配列番号:21 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 ACTCCCAAAC GTCGATCTCA GCG 23
【0073】配列番号:22 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 TCATCAGGGT GAACATCTGG TAC 23
【0074】配列番号:23 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の情報:FITC標識 配列 CGAGCACCTC TTCCAGGTCA TCC 23
【0075】配列番号:24 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 ATGCAGATCA AGAGCTACAT CC 22
【0076】配列番号:25 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GACGTTGACG GTCGAGCCGA TG 22
【図面の簡単な説明】
【図1】プラスミドpM3−1の制限酵素地図を示した
図である。
【図2】4.4kb BamHI断片の制限酵素地図と
pM5、pM7およびpM8との関係を示した図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12N 9/42 C12R 1:66) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:645) (72)発明者 青 柳 薫 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株 式会社 薬品技術研究所内 (72)発明者 浜 谷 徹 埼玉県坂戸市千代田5−3−1 明治製 菓株式会社 生物科学研究所内 (72)発明者 平 山 匡 男 埼玉県坂戸市千代田5−3−1 明治製 菓株式会社 生物科学研究所内 (72)発明者 村 上 健 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株 式会社 薬品技術研究所内 (56)参考文献 Mol.Gen.Genet.,Vo l.243,No.3,(May 10, 1994),p.253−260 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/00 - 9/99 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ(G ENETYX) MEDLINE(STN) WPI(DIALOG)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列表1に記載されるアミノ酸配列の1〜
    429番の配列を有するタンパク質またはその誘導体。
  2. 【請求項2】配列表1の−22〜−1番の配列をN末端
    側に更に有してなる、請求項1に記載のタンパク質。
  3. 【請求項3】セルラーゼ活性を有する、請求項1または
    2に記載のタンパク質。
  4. 【請求項4】請求項1〜3いずれか一項に記載のタンパ
    ク質またはその誘導体をコードする、DNA。
  5. 【請求項5】DNAが配列表2に記載される塩基配列の
    一部または全部を有する、請求項4に記載のDNA。
  6. 【請求項6】DNAが配列表2の310〜1893番の
    塩基配列を有する、請求項5に記載のDNA。
  7. 【請求項7】請求項4〜6いずれか一項に記載のDNA
    を含んでなる、発現ベクター。
  8. 【請求項8】請求項7に記載の発現ベクターによって形
    質転換された微生物。
  9. 【請求項9】請求項8に記載の微生物を培養し、そして
    培養物から請求項1〜3いずれか一項に記載のタンパク
    質を採取することを含んでなる、請求項1〜3いずれか
    一項に記載のタンパク質の製造法。
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