JP2001017180A - 新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法 - Google Patents
新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法Info
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Abstract
おいて、所望のタンパク質を大量に発現させるための新
規なプロモーター、及びそれを用いた組換えベクター、
さらにこの組換えベクターを用いたタンパク質の発現方
法を見出すこと。 【解決手段】 アクレモニウム・セルロリティカスか
ら、最も高発現しているcbh1遺伝子のプロモーターを単
離した。このプロモーターの下流に異種遺伝子又は同種
遺伝子を連結した遺伝子発現用の組換えベクターを、ア
クレモニウム・セルロリティカスに導入することによ
り、異種遺伝子又は同種遺伝子のタンパク質の大量発現
が可能となった。
Description
タンパク質の発現に利用できる新規なプロモーター、及
びそれを用いたタンパク質の発現方法に関する。
ス(Acremonium cellulolyticus)は糖化力の強いセル
ラーゼを生産することが特徴であり(Yamanobe, T. et
al. Agric. Biol. Chem.(1987), 51, 65)、飼料用途
やサイレージ用途で、高い有用性を持つことが報告され
ている(特開平7-264994号、特許第2531595号、特開平7
-236431号)。また、含有されているセルラーゼ成分や
キシラナーゼ成分(Yamanobe, T. et al. Agric. Biol.
Chem.(1987), 51, 65、Yamanobe, T. et al. Agric.
Biol. Chem.(1988), 52, 2493、Yamanobe, T. and M
itsuishi, Y. Agric. Biol. Chem.(1989), 53, 335
9、Yamanobe, T. and Mitsuishi, Y. Agric.Biol. Che
m.(1990), 54, 301、Yamanobe, T. and Mitsuishi,
Y. Agric. Biol. Chem.(1990), 54, 309、 WO9839423
号)に関しても詳細な検討がなされている。
業上利用する場合は、その微生物が生産する様々な酵素
の混合物として利用されるが、ある用途に限った場合
は、特定の酵素成分がその用途に重要であると考えられ
ている。しかしながら、その作用は他の成分の存在下で
相乗的に高められ、各種の用途に応じて、特定の酵素成
分を増強しつつ、元来の酵素活性も合わせ持つ微生物を
育種することが望まれる。
手法により特定の酵素遺伝子を導入して過剰発現させる
ことである。アクレモニウム・セルロリティカスを宿主
として特定のタンパク質を過剰発現させることは、本糸
状菌の生産する酵素複合体の特徴を持つとともに、ある
用途に重要な作用を示すタンパク質の過剰発現が行える
ため、産業上極めて有用であると考えられる。
は、主に大腸菌や酵母菌を宿主としたタンパク質発現系
が利用されてきたが、最近では、糸状菌によるタンパク
質の発現系も幅広く利用されるようになってきている。
糸状菌による異種タンパク質の発現例としては、アスペ
ルギルス・ニデュランスにおけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼIプロモーターを用いたセルロモナス・フィミ由
来のエンドグルカナーゼの発現やアスペルギルス・ニガ
ーにおけるグルコアミラーゼプロモーターを用いたヒト
インターフェロンα-2の発現(特許2873002号、特許286
8179号)、トリコデルマ・リーセイにおけるセロビオヒ
ドロラーゼI(cbh1)遺伝子のプロモーターを用いたウ
シ由来のキモシンの発現(Harkki, A. et al. Biotechn
ology(1989), 7, 596)等、数多くの報告がなされて
いる(Cees, A.M.J.J.V.D.H. et al. More gene manipu
lations in fungi (1991), Academic press, Inc., 39
7)。
例としても、トリコデルマ・リーセイにおけるcbh1遺伝
子のプロモーターを用いたエンドグルカナーゼIの過剰
発現(Harkki, A. et al. Enzyme Microb. Technol. (1
991), 13, 227)等の報告がなされている。また、本発
明の宿主と同じ属のペニシリン生産菌、アクレモニウム
・クリソゲナムにおいても外来遺伝子の発現に関する報
告がなされている(特開昭61-158787号、特開昭64-8029
5号)。アクレモニウム・セルロリティカスにおける形
質転換も既に報告されており、セルラーゼACC2ゲノム遺
伝子を宿主に導入することにより、培養上清のACC2タン
パク質量が増加し、この形質転換体のアビセル分解活性
が向上した(WO9733982号)。
スにおけるACC2タンパク質の発現増加の程度は小さく、
プロモーターにとって異種遺伝子を連結し、発現させる
ことが可能な組換えベクターも開発されておらず、産業
上利用できるレベルには達していない。そのため、さら
に効率の良い発現系の構築が望まれていた。
ーター、ターミネーター等の転写に関わる因子、アミノ
酸コドンの種類等翻訳に関わる因子、タンパク質への糖
鎖付加、発現したタンパク質の細胞内での存在様式(分
泌過程における移動も含む)等の翻訳後に関わる因子、
遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテアーゼ等発
現タンパク質の安定性に関わる因子等、多くの因子によ
り影響を受ける。
因子は、プロモーターの選択である。遺伝子の効率的な
発現には、どのようなプロモーターを使用するかが極め
て重要であり、その宿主において、できるだけ転写効率
の高いプロモーターを利用することがタンパク質の生産
量を増加させるために必要である。
のタンパク質を大量に発現させるための新規なプロモー
ター、それを用いた遺伝子発現用の組換えベクター、こ
の組換えベクターを発現する糸状菌、及びこの組換えベ
クターを用いたタンパク質の発現方法を提供する。
を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスに
おいて、最も発現量の多いタンパク質をCBH1(エキソ-
1,4-β-グルカナーゼ)の相同タンパク質であると同定
し、それをコードする遺伝子(cbh1)及びそのプロモー
ター(配列表の配列番号3に示すcbh1プロモーター)を
単離した。
遺伝子発現用の組換えベクターを作製し、アクレモニウ
ム・セルロリティカスに導入し、得られた形質転換体
で、該プロモーターの下流に連結した遺伝子の機能を損
なうことなく効率的に発現させ、本発明を完成するに至
った。
ー。 (a)配列番号3に示す塩基配列を有するDNA。 (b)(a)の塩基配列を有するDNAとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ下流に連結した遺伝
子を発現させ得るDNA。 (2)(1)に記載のプロモーターを含有する組換えベ
クター。 (3)配列番号4に示す塩基配列からなるDNAを含有す
る組換えベクター。 (4)(2)又は(3)に記載の組換えベクターを含
み、かつプロモーターの下流に連結した遺伝子を発現す
る糸状菌。 (5)(4)に記載の糸状菌がアクレモニウム・セルロ
リティカスである糸状菌。 (6)(4)又は(5)に記載の糸状菌を用いるタンパ
ク質の発現方法。 に係るものである。
えば以下の方法によりアクレモニウム・セルロリティカ
スから単離することができる。
ノムDNAを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファー
ジベクター又はプラスミドベクターを用いて、アクレモ
ニウム・セルロリティカスのゲノムDNAからなるライブ
ラリーを作製する。
な条件下で培養後、その培養物を回収する。培養物中の
タンパク質を測定し、例えば電気泳動で分離し、最も大
量に発現しているタンパク質を抽出し、そのアミノ酸配
列を決定する。ここで用いる「培養物」とは、培養菌体
及び培養上清のいずれをも意味する。
ホモロジー検索を行った結果、アクレモニウム・セルロ
リティカスで最も大量に発現しているタンパク質は、糸
状菌のCBH1に相同性を示すことが分った。
配列の保存領域、又はアクレモニウム・セルロリティカ
スから精製したCBH1タンパク質の部分アミノ酸配列を元
に、適当なプライマーを合成し、それを用いてアクレモ
ニウム・セルロリティカス由来のゲノムDNAを鋳型とし
たpolymerase chain reaction(PCR)を行い、cbh1遺伝
子のDNA断片を増幅する。
DNA自動合成機等を用いて化学的にオリゴヌクレオチド
を合成することにより調製することができる。合成する
オリゴヌクレオチドの長さは、遺伝子増幅法のプライマ
ーとして使用できる範囲であれば特に限定されないが、
15〜55塩基程度が好ましい。
ゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。このよう
にして、cbh1遺伝子の全域並びにその5′上流域及び3′
下流域を単離することができる。このDNA断片の塩基配
列を決定した後、翻訳開始コドンより上流約1 kbを有す
るDNA断片をプロモーター、翻訳終始コドンより下流約1
kbを有するDNA断片をターミネーターとして遺伝子発現
用の組換えベクターの作製に用いる。
ター」とは、宿主染色体DNAに組込まれるもの、或いは
自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主
細胞内で、プラスミド状態で存在させるものである。
尚、宿主細胞内に存在する異種遺伝子又は同種遺伝子の
コピー数は、1コピーでも複数であっても良い。
質の効率的な分泌のため、CBH1タンパク質のシグナル配
列をコードするDNAをプロモーターの下流に付加するこ
ともできる。本発明のプロモーターは上述のようにして
決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列をも包含する。
定変異など)を用いて本発明の組換えベクターの各構成
(プロモーター、シグナル配列、ターミネーター)に関
して、付加、挿入、欠失又は置換等の改変を行ったDNA
断片も本発明に包含される。また、プロモーター、シグ
ナル配列及びターミネーターの塩基配列を各々単独で、
或いはいずれかを組合わせた形で(取り出して)使用す
る場合も本発明に包含される。
ーターとターミネーターは、例えばPCRにより適当な制
限酵素切断部位を導入し、プラスミドベクターに挿入し
た後、薬剤耐性や栄養要求性相補等の選択マーカー遺伝
子を連結して遺伝子発現用の組換えベクターを作製する
ことができる。
選択マーカー遺伝子としては、デストマイシン、ベノミ
ル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、G418、ブレオ
マイシン、フレオマイシン、フォスフィノスリシン等に
対する薬剤耐性遺伝子、pyrG、argB、trpC、niaD等の栄
養要求性相補遺伝子が挙げられる。
望の遺伝子を連結することにより、遺伝子産物であるタ
ンパク質を生産させ得る組換えベクターを作製すること
ができる。
質をコードする遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、常
法に従い行うことができる。所望のタンパク質をコード
する遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子を意味
し、異種遺伝子又は同種遺伝子のどちらでも良く、特に
これらに限定されるものではない。異種遺伝子又は同種
遺伝子としては、例えばアミラーゼ、リパーゼ、プロテ
アーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、キ
チナーゼ又はペプチド等をコードする遺伝子が挙げられ
る。また、異種遺伝子及び同種遺伝子は、いかなる手法
によって得られるものでも良い。
より、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、所望のタンパク質を著量生産させること
ができる。すなわち、本発明は、前記形質転換体を培地
にて培養し、得られる培養物から異種遺伝子又は同種遺
伝子の発現産物を採取することを特徴とする前記発現産
物の生産方法をも含むものである。
宿主として使用可能なアスペルギルス属、トリコデルマ
属、リゾプス属、ムコール属、ペニシリウム属等の任意
の糸状菌を用いることができ、特に限定されるものでは
ないが、好ましくはアクレモニウム属に属する糸状菌、
特に好ましくはアクレモニウム・セルロリティカスであ
る。
導入は、常法に従ってすることができ、例えばエレクト
ロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロ
バクテリウム法等が用いられ、特に限定されるものでは
ないが、好ましくはポリエチレングリコール法である。
培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことが
できる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源とし
ては、グルコース、シュークロース、セルロース、水
飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植
物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、
小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイ
ヨン、ペプトン、イーストエキス、硫酸アンモニウム、
硝酸カリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応
じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを
生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、
硫酸マグネシウム、燐酸一カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マ
ンガン、硫酸銅等を添加することも有効である。また、
必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等
の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することも
できる。さらに、菌の発育を助け、導入遺伝子の発現を
促進するような有機物及び無機物を適当に添加すること
ができる。
培地で行うことができ、液体培地では、好気的条件での
培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部培養法
により行うことができる。培地のpHは、例えば7〜8程度
である。培養温度は、糸状菌の培養に採用される通常の
条件、例えば温度15℃〜45℃、好ましくは15℃〜30℃、
培養日数は、1日〜10日間程度の条件で行うことができ
る。
は同種遺伝子発現産物を採取することにより、目的とす
る遺伝子発現産物であるタンパク質を取得することがで
きる。ここで用いる「遺伝子発現産物を採取する」と
は、培養菌体から遺伝子発現産物を抽出すること及び培
養菌体から遺伝子産物を精製すること、並びに培養上清
自体を回収すること及び培養上清から遺伝子発現産物を
精製すること、並びに培養菌体及び培養上清の両方から
抽出、回収及び精製の手法を用いることのいずれをも意
味する。
常法により菌体を磨砕処理、加圧破砕、超音波処理等に
より遺伝子発現産物を抽出することを意味し、「回収す
る」とは、特に限定はしないが、常法により培養上清を
ろ過、遠心分離等により固形部分を除去し、粗タンパク
質溶液を得ることを意味し、「精製する」とは、特に限
定はしないが、常法により塩析法、溶媒沈殿法、透析
法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法等、又はイオン交換、
疎水性、逆相、ゲルろ過、アフィニティー等の各種クロ
マトグラフィーの精製手法を組合わせ、目的遺伝子発現
産物を分離精製することを意味する。
てフェニルメタンスルホン酸、ロイペプチン、アンチパ
イン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
発明はこれらに限定されるものではない。
カスのcbh1遺伝子のクローニング
ーの作製 アクレモニウム・セルロリティカスY-94株(FERM BP-58
26)を(S)培地(2%ブイヨン、0.5%イーストエキス
及び2%グルコース)で32℃にて2日間培養し、遠心分離
により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結
後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体か
らISOPLANT(ニッポンジーン社)により、添付のプロト
コールに従いゲノムDNAを単離した。単離したゲノムDNA
をSau3AIにより部分分解した後、アガロースゲル電気泳
動により15〜20 kbのDNA断片を回収し、これをアルカリ
フォスファターゼで処理し、DNA断片の末端を脱リン酸
化した。このDNA断片をファージベクターのLambda DASH
II(ストラタジーン社)に挿入した。このようにして
得られた組換えファージベクターについて、Gigapack I
II Gold Packaging Extract(ストラタジーン社)によ
り、添付のプロトコールに従ってin vitroパッケージン
グを行った。その後、この組換えファージを大腸菌XL1-
Blue MRA (P2)株に感染させ、プレートにて培養しプラ
ークを形成させた。
94株において高発現するタンパク質の同定 アクレモニウム・セルロリティカスY-94株(FERM BP-58
26)において、高発現するタンパク質を同定し、そのプ
ロモーター及びターミネーター領域を遺伝子発現用の組
換えベクターに用いれば、所望のタンパク質を高発現さ
せることができると考えられた。そこで、このようなタ
ンパク質の同定を行った。
(FERM BP-5826)をセルラーゼ誘導培地(4%セルロー
ス、1%ペプトン、0.6%硝酸カリウム、0.2%尿素、0.1
6%塩化カリウム、0.12%硫酸マグネシム、1.2%燐酸一
カリウム、0.001%硫酸亜鉛、0.001%硫酸マンガン及び
0.001%硫酸銅(pH 4.0))で32℃にて7日間培養した。
培養物を遠心分離して得られた培養上清を電気泳動(So
dium Dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electroph
oresis(SDS-PAGE))した。SDS-PAGEは、電気泳動シス
テム(テフコ社)と12%のポリアクリルアミドゲルを用
い、添付のプロトコールに従って行った。
量に発現していることが明らかとなった。SDS-PAGE後の
ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、マルチフォ
ーII(ファルマシアバイオテク社)にて、添付のプロト
コールに従い、ポリビニリデンジフルオライド膜(Immo
bilon-PSQ、ミリポア社)に転写した。この膜をクーマ
シー・ブリリアント・ブルーR250(ナカライテスク社)
で染色した後、約70 kDaのタンパク質がブロットされて
いる部分を切り出した。ポリビニルピロリドン-40(シ
グマ社)にて、膜上のタンパク質未結合部分をブロック
し、Podell, D.N. et al. Biochem. Biophys. Res. Com
mun.(1978)81, 176の方法に従い、牛肝臓ピログルタ
メートペプチダーゼ(ベーリンガー・マンハイム社)処
理により、修飾N末端残基を除去した。
定は、プロテインシークエンサー Model 492(パーキン
エルマー社)を用い、添付のプロトコールに従って行っ
た。その結果、N末端アミノ酸配列を15残基決定し、BLA
ST(Altschul, S. F. et al.Nucleic Acids Res.(199
7), 25, 3389)を用いてホモロジー検索を行ったとこ
ろ、このタンパク質は糸状菌のCBH1に相同性を示すこと
が分った。
トを行い、CBH1タンパク質間で良好に保存された領域と
して、EMDIWEAとCDPDGCDを見出した。これらの配列を元
に、5′- GARATGGAYATHTGGGARGC -3′(配列番号7)及
び5′- TCRCANCCRTCNGGRTCRCA -3′(配列番号8)のプ
ライマーを合成した。これらのプライマーを用い、アク
レモニウム・セルロリティカスY-94株から単離したゲノ
ムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、50μlの反応液
中、ゲノムDNA50 ngを鋳型とし、1.25 unitのExTaq DNA
ポリメラーゼ(宝酒造社)、添付のバッファー、dNTP M
ixture及び10μMの上記プライマーを用い、以下の条件
で反応を行った。94℃ 3分間、(94℃ 1分間、65℃(1
サイクル毎に0.5℃下げる) 1分間、72℃ 1分間)×30
回、72℃ 3分間。この反応により約150 bpのDNA断片が
増幅し、このDNA断片をOriginal TA Cloning Kit(イン
ビトロジェン社)を用い、添付のプロトコールに従って
pCR2.1プラスミドベクターに挿入した。
の塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(パーキ
ンエルマー社)とABI PRISM 310 Genetic Analyzer(パ
ーキンエルマー社)を用いて、添付のプロトコールに従
い行った。その結果、単離したDNA断片の塩基配列は、
糸状菌のcbh1遺伝子と相同性を示し、目的とするCBH1タ
ンパク質をコードする遺伝子の一部であることが明らか
となった。
ニング ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプロー
ブは、PCRにより、フルオレセイン標識dUTPをDNA断片に
取り込ませることにより調製した。PCRは、50μlの反応
液中、100 ngのcbh1DNA断片が挿入されたpCR2.1プラス
ミドベクターを鋳型とし、1.25 unitのExTaq DNAポリメ
ラーゼ(宝酒造社)、添付のバッファー、0.2 mM dAT
P、0.2 mM dCTP、0.2 mM dGTP、0.02 mM dTTP、0.18 mM
フルオレセイン標識dUTP(FluoroGreen、アマシャム
社)及び10μMのプライマー(配列番号7及び配列番号
8)を用い、以下の条件で反応を行った。94℃ 2分間、
(94℃ 30秒間、55℃ 1分間、72℃ 1分間)×25回、72
℃ 3分間。この反応により、約150bpからなるフルオレ
セイン標識プローブが作製された。
形成されたプレート上に、Hybond-N+メンブレン(アマ
シャム社)をのせ、プラークを付着させた。このメンブ
レンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージ
DNAを1本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージ
DNAが吸着したメンブレンを、Hybridization BufferTab
lets(アマシャム社)を用いて調製したバッファーに入
れた後、60℃で1時間インキュベートした。これに、上
記のフルオレセイン標識プローブを熱変性して添加し、
60℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、
メンブレンを1×SSC(SSC:15 mMクエン酸三ナトリウ
ム、150 mM塩化ナトリウム)−0.1% SDS溶液で60℃、1
5分間洗浄し、さらに、0.2×SSC−0.1% SDS溶液で60
℃、15分間洗浄した。フルオレセイン標識プローブが結
合したプラークの可視化は、DIG洗浄ブロックバッファ
ーセット(ベーリンガー・マンハイム社)、アルカリフ
ォスファターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体
(Anti-fluorescein-AP、Fab fragments、ベーリンガー
・マンハイム社)、発色基質としてニトロブルーテトラ
ゾリウムクロライド(ベーリンガー・マンハイム社)及
びX-フォスフェート(ベーリンガー・マンハイム社)を
用い、添付のプロトコールに従って行った。このように
して選抜した陽性クローンから、プローブに相同な領域
の5′上流域及び3′下流域を含むDNA断片をHind IIIに
より約5 kbの断片として切り出し、pBluescript II KS+
(ストラタジーン社)に挿入した。
製し、幾つかのDNA断片に分けて、再度pBluescript II
KS+(ストラタジーン社)に挿入した。これらのDNA断片
の塩基配列の決定は、 pBluescript II KS+のマルチク
ローニングサイト近傍のシークエンス用プライマーや、
解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、
DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Seq
uencing Ready Reaction(パーキンエルマー社)とABI
PRISM 310 Genetic Analyzer(パーキンエルマー社)を
用いて、添付のプロトコールに従い行った。このように
してcbh1遺伝子の5′上流域及び3′下流域を含むHind I
IIサイトからKpn Iサイトまでの領域4270 bpの塩基配列
を決定した。この領域の塩基配列を、配列表の配列番号
1に示した。
ープンリーディングフレーム(ORF)を含み、このORFか
ら予測されるタンパク質のN末端から27アミノ酸残基以
降の配列は実施例1の2において決定した70 kDaのタン
パク質のN末端配列に一致し、本遺伝子はこのタンパク
質をコードすることが明らかとなった。また、本知見か
らこのORFの1〜26アミノ酸残基の配列は、本タンパク質
を細胞外に分泌させるためのシグナル配列であると考え
られた。本ORFから予測されるタンパク質に関してBLAST
を用いてホモロジー検索を行ったところ、ペニシリウム
・ジャンシネラムのCBH1(Q06886)に約64%の相同性を
示し、また、その全域に渡って相同性が見られたことか
ら、本遺伝子はイントロンを持たないと考えられた。一
方、本遺伝子のプロモーター領域の塩基配列に関してBL
ASTを用いてホモロジー検索を行ったが、有意な相同性
を示す塩基配列は見いだされなかった。
の構築 実施例1の4において作製した組換えpBluescript IIを
鋳型とし、A:5′- AGCATCCTGCAGCTCGTGAAAGCTGCCCTCA
CAA -3′(配列番号9)及び 5′- AGCATCGTTAACTGCTTCT
GACTGTTGCGGTTGATA -3′(配列番号10)、B:5′- AGCA
TCGTTAACACAATGTCTGCCTTGAACTCT -3′(配列番号11)及
び 5′- AGCATCAAGCTTGCTGAGCACCAGCTGTTGCCA -3′(配
列番号12)、C:5′- AGCATCAAGCTTGCTAGCGCATGCACTTCT
TTCTTCGCCTATTGATTGG -3′(配列番号13)及び 5′- AA
TTAACCCTCACTAAAGGG -3′(配列番号14)をプライマー
として、A、B、Cの各プライマー対を用いてそれぞれに
ついてPCRを行った。PCRは、50μlの反応液中、プラス
ミドDNA150 ngを鋳型とし、2.5 unitのKOD DNAポリメラ
ーゼ(東洋紡績社)、添付のバッファー、dNTP Mixtur
e、1 mM塩化マグネシウム及び0.5μMの上記プライマー
を用い、以下の条件で反応を行った。98℃ 30秒間、(9
8℃ 15秒間、65℃ 2秒間、74℃ 30秒間)×10回、74℃
1分間。各プライマーを用いて得られたPCR反応液をエタ
ノール沈殿し、PCR産物を回収した。これを制限酵素処
理(A:Pst IとHpa I;B:Hpa IとHindIII;C:Hind II
IとKpn I)した後、アガロースゲル電気泳動し、DNA断
片をアガロースゲルから回収した。Pst IとKpn Iで切断
後、アルカリホスファターゼ処理したpBluescript II K
S+とこれら3種の制限酵素処理済みのPCR断片(A、B、
C)をライゲーションし、プラスミドpCBHEXを作製し
た。プロモーター領域からなるDNA断片(A)の塩基配列
を配列表の配列番号3に示し、またpCBHEX中のA、B(シ
グナル配列)及びC(ターミネーター領域)が連結され
てなるDNA断片の配列を配列表の配列番号4に示した。
載のpMKD01からXba Iにより切り出したアスペルギルス
・ニデュランス由来のtrp Cのプロモーター及びターミ
ネーターを持つデストマイシン耐性遺伝子(DtR)を挿
入し、プラスミドpCBHEX/DtR2を作製した。pCBHEX/DtR2
の構造を図1に示す。
カス由来キシラナーゼの過剰発現 1.mRNAの単離とcDNAライブラリーの作製 アクレモニウム・セルロリティカスY-94株をセルラーゼ
誘導培地で32℃にて4日間培養し、遠心分離により菌体
を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と
乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体からISOGEN(ニッ
ポンジーン社)により、添付のプロトコールに従い全RN
Aを単離した。さらに全RNAから、mRNA Purification Ki
t(ファルマシア社)により、添付のプロトコールに従
い、mRNAを精製した。
NA Synthesis Kit(ファルマシア社)により、添付のプ
ロトコールに従い、cDNAを合成した。このcDNAをファー
ジベクターのLambda ZAP II(ストラタジーン社)に挿
入した。このようにして作製した組換えファージベクタ
ーについて、Gigapack III Gold Packaging Extract
(ストラタジーン社)により、添付のマニュアルに従っ
てin vitroパッケージングを行った。その後、この組換
えファージを大腸菌XL1-Blue MRF′株に感染させ、プレ
ートにて培養しプラークを形成させた。このようにして
作製したcDNAライブラリーは、5.5×105 plaque formin
g unitsであった。さらに、このcDNAライブラリーを、L
ambda ZAP IIに添付のプロトコールに従い増幅した。こ
の増幅したcDNAライブラリー中の組換えファージを大腸
菌XL1-Blue MRF′株に感染させ、プレートにて培養しプ
ラークを形成させた。
5′- TTAGCTGACGGTGATGGAAG -3′(配列番号16)をプラ
イマーとして用い、WO9811239号に記載の方法により抽
出したトリコデルマ・ビリデ MC300-1株(FERM BP-604
7)のゲノムDNAを鋳型として、PCRによりキシラナーゼ
遺伝子(XYN I、Trrnen, A. et al. Bio/Technology(1
992)10, 1461)を増幅した。PCRは、50μlの反応液
中、50 ngのゲノムDNAを鋳型とし、1.25 unitのExTaq D
NAポリメラーゼ(宝酒造社)、添付のバッファー、0.2
mM dATP、0.2 mM dCTP、0.2 mM dGTP、0.02 mM dTTP、
0.18 mMフルオレセイン標識dUTP(FluoroGreen、アマシ
ャム社)及び1μMの上記プライマーを用い、以下の条件
で反応を行った。94℃ 3分間、(94℃ 30秒間、55℃ 1
分間、72℃ 1分間)×35回、72℃ 3分間。この反応によ
り、約780 bpの塩基配列からなるフルオレセイン標識プ
ローブが作製された。
形成されたプレート上に、Hybond-N+メンブレン(アマ
シャム社)をのせ、プラークを付着させた。このメンブ
レンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージ
DNAを1本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージ
DNAが吸着したメンブレンを、Hybridization BufferTab
lets(アマシャム社)を用いて調製したバッファーに入
れた後、60℃で1時間インキュベートした。これに、上
記のフルオレセイン標識プローブを熱変性して添加し、
60℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、
メンブレンを1×SSC−0.1% SDS溶液で室温下15分間洗
浄し、さらに、0.2×SSC−0.1% SDS溶液で室温下15分
間洗浄した。フルオレセイン標識プローブが結合したプ
ラークの可視化は、DIG洗浄ブロックバッファーセット
(ベーリンガー・マンハイム社)、アルカリフォスファ
ターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体(Anti-flu
orescein-AP、Fab fragment、ベーリンガー・マンハイ
ム社)、発色基質としてニトロブルーテトラゾリウムク
ロライド(ベーリンガー・マンハイム社)及びX-フォス
フェート(ベーリンガー・マンハイム社)を用い、添付
のプロトコールに従って行った。このようにして選抜し
た陽性クローンからプラスミドベクターpBluescript SK
(-)へのin vivo excisionは、Lambda ZAP IIに添付の
プロトコールに従い実施した。
の塩基配列の決定は、pBluescriptSK (-)のマルチクロ
ーニングサイト近傍のシークエンス用プライマー、又は
解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、
DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Seq
uencing Ready Reaction(パーキンエルマー社)とABI
PRISM 310 Genetic Analyzer(パーキンエルマー社)を
用いて、添付のプロトコールに従い行った。このように
してアクレモニウム・セルロリティカスのキシラナーゼ
cDNAの1027 bpの塩基配列を決定し、この塩基配列を、
配列表の配列番号5に示した。本cDNAは849 bpの塩基配
列からなる1個のORFを含み、本キシラナーゼ遺伝子は2
9.5 kDaのタンパク質をコードすることが明らかとなっ
た。
LASTを用いてホモロジー検索を行ったところ、本キシラ
ナーゼはトリコデルマ・リーセイのキシラナーゼ I(P3
6218)に最も高い相同性を示した。また、本キシラナー
ゼは、そのC末端にトリコデルマ・リーセイのキシラナ
ーゼ Iには見られない62アミノ酸残基の配列が付加され
ており、これ以外の部分では、トリコデルマ・リーセイ
のキシラナーゼ Iに約59%の相同性を示した。
降の配列はWO9839423号のキシラナーゼ IのN末端配列に
一致していた。そのため、本キシラナーゼ遺伝子は、WO
9839423号のキシラナーゼ Iをコードしており、1〜39ア
ミノ酸残基まではシグナル配列であることが明らかとな
った。
クターの作成 アクレモニウム・セルロリティカスY-94株から単離した
ゲノムDNAを鋳型とし、5′- GGGAGGCCTAACACAATGGGCATC
TCATCTATTC -3′(配列番号17)及び 5′- GGGGCATGCCT
ATTGGCACTGACTGTAG -3′(配列番号18)をプライマーと
してPCRを行った。PCRは、50μlの反応液中、1.25 unit
のExTaq DNAポリメラーゼ(宝酒造社)、添付のバッフ
ァーとdNTP Mixture、50 ng ゲノムDNA及び1μMの上記
プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。94℃ 3
分間、(94℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間)×30
回、72℃ 3分間。こうして得られたPCR反応液をエタノ
ール沈殿し、PCR産物を回収した後、Stu IとSph Iで切
断し、pCBHEX/DtR2のHpa IとSph Iの間に挿入し、タン
パク質発現用プラスミドpCBHEX/DtR2/XYLを作製した。
において30℃で16時間培養し、3500rpm、10分間遠心す
ることにより集菌した。得られた菌体を0.5 Mシューク
ロースで洗浄し、0.45μmのフィルターで濾過したプロ
トプラスト化酵素溶液(10 mg/mlキチナーゼ、10 mg/ml
ザイモリアーゼ、30 mg/mlβ-グルクロニダーゼ及び0.5
M シュークロース)に懸濁した。30℃で60分〜90分間
振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿により
この懸濁液を濾過した後、2500 rpm、10分間遠心してプ
ロトプラストを回収し、SUTCバッファー(0.5 M シュー
クロース、10 mM 塩化カルシウム及び10 mMトリス-塩酸
(pH7.5))で洗浄した。以上のようにして調製したプ
ロトプラストを1 mlのSUTCバッファーに懸濁し、この10
0μlに対し10μgのDNA溶液(10μl)を加え、氷上に5分
間静置した。次に、400μlのPEG溶液(60% PEG4000、1
0 mM 塩化カルシウム及び10 mMトリス-塩酸(pH7.5))
を加え、氷中に20分間静置した後、10 mlのSUTCバッフ
ァーを加え、2500 rpm、10分間遠心した。遠心分離した
プロトプラストを1 mlのSUTCバッファーに懸濁した後、
4000 rpmで5分間遠心して、最終的に100μlのSUTCバッ
ファーに懸濁した。
グロマイシンB(500μg/ml)添加(A)培地(3.9%ポテ
トデキストロース寒天培地(日水製薬社)、17.1%シュ
ークロース及び 1%バクトアガー(pH 6.0))上に、
(A)軟寒天とともに重層し、30℃、5〜9日間培養後、
形成したコロニーを形質転換体とした。
質転換体におけるキシラナーゼの発現と酵素活性の測定 ハイグロマイシンBに対する耐性度の高いもの1株をセル
ラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をSDS-PAGEにより
解析したところ、キシラナーゼは親株より分泌量が向上
していた。
た。0.5 mlの2%キシラン(オート麦由来、アルドリッ
ヒ社)溶液(0.1 N 酢酸-酢酸ナトリウムバッファー(p
H 4.5))を50℃で10分間加熱した後、0.5 mlの培養上
清を添加し、50℃で30分間反応させた。これに、3 mlの
DNS溶液(10.6 g 3,5-ジニトロサリチル酸、19.8 g 水
酸化ナトリウムを1416 mlの精製水に溶解し、その後、3
06 g 酒石酸カリウム・ナトリウム、7.6 mlフェノール
(50℃で溶解)、8.3 g ピロ亜硫酸ナトリウムを溶解し
た溶液)を添加し、沸騰水中で5分間加熱した後、水に
入れ冷却した。精製水8 mlを添加した後、540 nmの吸光
度を測定した。ブランクは、0.5 mlの培養上清に3 mlの
DNS溶液を添加し混合した後、0.5 mlの2%キシラン溶液
を加え、沸騰水中で5分間加熱し水に入れ冷却したもの
を用いた。キシラナーゼ活性(u/ml)は、1 mlの培養上
清あたり1分間に生成したキシロースの量(μmol)とし
て表した。その結果を表1に示す。
比活性を示した。
ドグルカナーゼの過剰発現 1.エンドグルカナーゼ発現用の組換えベクターの構築 WO9811239号に記載のトリコデルマ・ビリデのエンドグ
ルカナーゼSCE3遺伝子の挿入されたプラスミドpUC-Eg3X
を鋳型とし、5′- GGGAGGCCTAACACAATGAACAAGTCCGTGGC
-3′(配列番号19)及び 5′- GGGGCATGCCTACAATCTTGCA
GAACACG -3′(配列番号20)をプライマーとしてPCRを
行った。PCRは、50μlの反応液中、プラスミドDNA150 n
gを鋳型とし、2.5 unitのKOD DNAポリメラーゼ(東洋紡
績社)、添付のバッファー、dNTP Mixture、1 mM塩化マ
グネシウム及び0.5μMの上記プライマーを用い、以下の
条件で反応を行った。98℃ 30秒間、(98℃ 15秒間、50
℃2秒間、74℃ 1分間)×10回、74℃ 1分間。こうして
得られたPCR反応液をエタノール沈殿し、PCR産物を回収
した後、Stu IとSph Iで切断し、pCBHEX/DtR2のHpa Iと
Sph Iの間に挿入し、蛋白質発現用プラスミドpCBHEX/Dt
R2/EG3を作製した。
カナーゼ遺伝子の宿主への導入 エンドグルカナーゼ遺伝子のアクレモニウム・セルロリ
ティカスへの導入は、実施例3の4の方法に従い行っ
た。
質転換体におけるトリコデルマ・ビリデ由来エンドグル
カナーゼの発現と酵素活性の測定 ハイグロマイシンBに対する耐性度の高いもの1株をセル
ラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をSDS-PAGEにより
解析したところ、エンドグルカナーゼは親株より分泌量
が向上していた。
実施例3の5に記載したDNS法に従い、基質としてキシ
ランの代わりにカルボキシメチルセルロースナトリウム
(CMC;n = 500、東京化成社)を用いて測定した。エン
ドグルカナーゼ活性(u/ml)は、1 mlの培養上清あたり
1分間に生成したグルコースの量(μmol)として表し
た。その結果を表2に示す。
の比活性を示し、本発明のプロモーターを用いることに
より、異種タンパク質の発現も可能であることが明らか
となった。
モーターの下流に所望のタンパク質をコードする遺伝子
を連結し、アクレモニウム・セルロリティカスに導入す
ることにより、所望のタンパク質を大量に発現させるこ
とが可能である。
図を示す。
Claims (6)
- 【請求項1】以下の(a)又は(b)のDNAを有するプロ
モーター。 (a)配列番号3に示す塩基配列を有するDNA。 (b)(a)の塩基配列を有するDNAとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ下流に連結した遺伝
子を発現させ得るDNA。 - 【請求項2】請求項1に記載のプロモーターを含有する
組換えベクター。 - 【請求項3】配列番号4に示す塩基配列からなるDNAを
含有する組換えベクター。 - 【請求項4】請求項2又は請求項3に記載の組換えベク
ターを含み、かつプロモーターの下流に連結した遺伝子
を発現する糸状菌。 - 【請求項5】請求項4に記載の糸状菌がアクレモニウム
・セルロリティカスである糸状菌。 - 【請求項6】請求項4又は請求項5に記載の糸状菌を用
いるタンパク質の発現方法。
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