JP2001017180A

JP2001017180A - 新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法

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Publication number: JP2001017180A
Application number: JP11191221A
Authority: JP
Inventors: Naoki Mido; 直樹御堂; Naomi Sumida; 奈緒美隅田; Kaoru Okakura; 薫岡倉; Takeshi Murakami; 健村上; Hitoshi Yamabe; 倫山辺
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1999-07-06
Filing date: 1999-07-06
Publication date: 2001-01-23
Anticipated expiration: 2019-07-06
Also published as: JP4257759B2

Abstract

(57)【要約】【課題】糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに
おいて、所望のタンパク質を大量に発現させるための新
規なプロモーター、及びそれを用いた組換えベクター、
さらにこの組換えベクターを用いたタンパク質の発現方
法を見出すこと。【解決手段】アクレモニウム・セルロリティカスか
ら、最も高発現しているcbh1遺伝子のプロモーターを単
離した。このプロモーターの下流に異種遺伝子又は同種
遺伝子を連結した遺伝子発現用の組換えベクターを、ア
クレモニウム・セルロリティカスに導入することによ
り、異種遺伝子又は同種遺伝子のタンパク質の大量発現
が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術の分野】本発明は、糸状菌における
タンパク質の発現に利用できる新規なプロモーター、及
びそれを用いたタンパク質の発現方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
ス（Acremonium cellulolyticus）は糖化力の強いセル
ラーゼを生産することが特徴であり（Yamanobe, T. et
al. Agric. Biol. Chem.（1987）, 51, 65）、飼料用途
やサイレージ用途で、高い有用性を持つことが報告され
ている（特開平7-264994号、特許第2531595号、特開平7
-236431号）。また、含有されているセルラーゼ成分や
キシラナーゼ成分（Yamanobe, T. et al. Agric. Biol.
Chem.（1987）, 51, 65、Yamanobe, T. et al. Agric.
Biol. Chem.（1988）, 52, 2493、Yamanobe, T. and M
itsuishi, Y. Agric. Biol. Chem.（1989）, 53, 335
9、Yamanobe, T. and Mitsuishi, Y. Agric.Biol. Che
m.（1990）, 54, 301、Yamanobe, T. and Mitsuishi,
Y. Agric. Biol. Chem.（1990）, 54, 309、 WO9839423
号）に関しても詳細な検討がなされている。

【０００３】一般に微生物の生産するセルラーゼ類を産
業上利用する場合は、その微生物が生産する様々な酵素
の混合物として利用されるが、ある用途に限った場合
は、特定の酵素成分がその用途に重要であると考えられ
ている。しかしながら、その作用は他の成分の存在下で
相乗的に高められ、各種の用途に応じて、特定の酵素成
分を増強しつつ、元来の酵素活性も合わせ持つ微生物を
育種することが望まれる。

【０００４】このために最良の方法は、遺伝子組換えの
手法により特定の酵素遺伝子を導入して過剰発現させる
ことである。アクレモニウム・セルロリティカスを宿主
として特定のタンパク質を過剰発現させることは、本糸
状菌の生産する酵素複合体の特徴を持つとともに、ある
用途に重要な作用を示すタンパク質の過剰発現が行える
ため、産業上極めて有用であると考えられる。

【０００５】微生物におけるタンパク質の発現系として
は、主に大腸菌や酵母菌を宿主としたタンパク質発現系
が利用されてきたが、最近では、糸状菌によるタンパク
質の発現系も幅広く利用されるようになってきている。
糸状菌による異種タンパク質の発現例としては、アスペ
ルギルス・ニデュランスにおけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼＩプロモーターを用いたセルロモナス・フィミ由
来のエンドグルカナーゼの発現やアスペルギルス・ニガ
ーにおけるグルコアミラーゼプロモーターを用いたヒト
インターフェロンα-2の発現（特許2873002号、特許286
8179号）、トリコデルマ・リーセイにおけるセロビオヒ
ドロラーゼＩ（cbh1）遺伝子のプロモーターを用いたウ
シ由来のキモシンの発現（Harkki, A. et al. Biotechn
ology（1989）, 7, 596）等、数多くの報告がなされて
いる（Cees, A.M.J.J.V.D.H. et al. More gene manipu
lations in fungi (1991）, Academic press, Inc., 39
7)。

【０００６】また、糸状菌による同種タンパク質の発現
例としても、トリコデルマ・リーセイにおけるcbh1遺伝
子のプロモーターを用いたエンドグルカナーゼＩの過剰
発現（Harkki, A. et al. Enzyme Microb. Technol. (1
991）, 13, 227)等の報告がなされている。また、本発
明の宿主と同じ属のペニシリン生産菌、アクレモニウム
・クリソゲナムにおいても外来遺伝子の発現に関する報
告がなされている（特開昭61-158787号、特開昭64-8029
5号）。アクレモニウム・セルロリティカスにおける形
質転換も既に報告されており、セルラーゼACC2ゲノム遺
伝子を宿主に導入することにより、培養上清のACC2タン
パク質量が増加し、この形質転換体のアビセル分解活性
が向上した（WO9733982号）。

【０００７】しかし、アクレモニウム・セルロリティカ
スにおけるACC2タンパク質の発現増加の程度は小さく、
プロモーターにとって異種遺伝子を連結し、発現させる
ことが可能な組換えベクターも開発されておらず、産業
上利用できるレベルには達していない。そのため、さら
に効率の良い発現系の構築が望まれていた。

【０００８】目的とするタンパク質の生産量は、プロモ
ーター、ターミネーター等の転写に関わる因子、アミノ
酸コドンの種類等翻訳に関わる因子、タンパク質への糖
鎖付加、発現したタンパク質の細胞内での存在様式（分
泌過程における移動も含む）等の翻訳後に関わる因子、
遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテアーゼ等発
現タンパク質の安定性に関わる因子等、多くの因子によ
り影響を受ける。

【０００９】これらのうち最も重要であり制御しやすい
因子は、プロモーターの選択である。遺伝子の効率的な
発現には、どのようなプロモーターを使用するかが極め
て重要であり、その宿主において、できるだけ転写効率
の高いプロモーターを利用することがタンパク質の生産
量を増加させるために必要である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】糸状菌において、所望
のタンパク質を大量に発現させるための新規なプロモー
ター、それを用いた遺伝子発現用の組換えベクター、こ
の組換えベクターを発現する糸状菌、及びこの組換えベ
クターを用いたタンパク質の発現方法を提供する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスに
おいて、最も発現量の多いタンパク質をCBH1（エキソ-
1,4-β-グルカナーゼ）の相同タンパク質であると同定
し、それをコードする遺伝子（cbh1）及びそのプロモー
ター（配列表の配列番号３に示すcbh1プロモーター）を
単離した。

【００１２】また、本発明のcbh1プロモーターを用いた
遺伝子発現用の組換えベクターを作製し、アクレモニウ
ム・セルロリティカスに導入し、得られた形質転換体
で、該プロモーターの下流に連結した遺伝子の機能を損
なうことなく効率的に発現させ、本発明を完成するに至
った。

【００１３】すなわち、本発明は、（１）以下の（a）又は（b）のDNAを有するプロモータ
ー。（a）配列番号３に示す塩基配列を有するDNA。（b）（a）の塩基配列を有するDNAとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ下流に連結した遺伝
子を発現させ得るDNA。（２）（１）に記載のプロモーターを含有する組換えベ
クター。（３）配列番号４に示す塩基配列からなるDNAを含有す
る組換えベクター。（４）（２）又は（３）に記載の組換えベクターを含
み、かつプロモーターの下流に連結した遺伝子を発現す
る糸状菌。（５）（４）に記載の糸状菌がアクレモニウム・セルロ
リティカスである糸状菌。（６）（４）又は（５）に記載の糸状菌を用いるタンパ
ク質の発現方法。に係るものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のcbh1プロモーターは、例
えば以下の方法によりアクレモニウム・セルロリティカ
スから単離することができる。

【００１５】アクレモニウム・セルロリティカスからゲ
ノムDNAを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファー
ジベクター又はプラスミドベクターを用いて、アクレモ
ニウム・セルロリティカスのゲノムDNAからなるライブ
ラリーを作製する。

【００１６】アクレモニウム・セルロリティカスを適当
な条件下で培養後、その培養物を回収する。培養物中の
タンパク質を測定し、例えば電気泳動で分離し、最も大
量に発現しているタンパク質を抽出し、そのアミノ酸配
列を決定する。ここで用いる「培養物」とは、培養菌体
及び培養上清のいずれをも意味する。

【００１７】上記タンパク質のアミノ酸配列を決定し、
ホモロジー検索を行った結果、アクレモニウム・セルロ
リティカスで最も大量に発現しているタンパク質は、糸
状菌のCBH1に相同性を示すことが分った。

【００１８】そこで、既知のCBH1タンパク質のアミノ酸
配列の保存領域、又はアクレモニウム・セルロリティカ
スから精製したCBH1タンパク質の部分アミノ酸配列を元
に、適当なプライマーを合成し、それを用いてアクレモ
ニウム・セルロリティカス由来のゲノムDNAを鋳型とし
たpolymerase chain reaction（PCR）を行い、cbh1遺伝
子のDNA断片を増幅する。

【００１９】ここで用いる「プライマー」とは、例えば
DNA自動合成機等を用いて化学的にオリゴヌクレオチド
を合成することにより調製することができる。合成する
オリゴヌクレオチドの長さは、遺伝子増幅法のプライマ
ーとして使用できる範囲であれば特に限定されないが、
15〜55塩基程度が好ましい。

【００２０】このDNA断片をプローブとして用い、前記
ゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。このよう
にして、cbh1遺伝子の全域並びにその5′上流域及び3′
下流域を単離することができる。このDNA断片の塩基配
列を決定した後、翻訳開始コドンより上流約1 kbを有す
るDNA断片をプロモーター、翻訳終始コドンより下流約1
kbを有するDNA断片をターミネーターとして遺伝子発現
用の組換えベクターの作製に用いる。

【００２１】ここで用いる「遺伝子発現用の組換えベク
ター」とは、宿主染色体DNAに組込まれるもの、或いは
自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主
細胞内で、プラスミド状態で存在させるものである。
尚、宿主細胞内に存在する異種遺伝子又は同種遺伝子の
コピー数は、１コピーでも複数であっても良い。

【００２２】また、組換えベクターには、生成タンパク
質の効率的な分泌のため、CBH1タンパク質のシグナル配
列をコードするDNAをプロモーターの下流に付加するこ
ともできる。本発明のプロモーターは上述のようにして
決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列をも包含する。

【００２３】また、遺伝子工学の慣行法（例えば部位指
定変異など）を用いて本発明の組換えベクターの各構成
（プロモーター、シグナル配列、ターミネーター）に関
して、付加、挿入、欠失又は置換等の改変を行ったDNA
断片も本発明に包含される。また、プロモーター、シグ
ナル配列及びターミネーターの塩基配列を各々単独で、
或いはいずれかを組合わせた形で（取り出して）使用す
る場合も本発明に包含される。

【００２４】上記の方法で単離したcbh1遺伝子のプロモ
ーターとターミネーターは、例えばPCRにより適当な制
限酵素切断部位を導入し、プラスミドベクターに挿入し
た後、薬剤耐性や栄養要求性相補等の選択マーカー遺伝
子を連結して遺伝子発現用の組換えベクターを作製する
ことができる。

【００２５】遺伝子発現用の組換えベクターに連結する
選択マーカー遺伝子としては、デストマイシン、ベノミ
ル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、G418、ブレオ
マイシン、フレオマイシン、フォスフィノスリシン等に
対する薬剤耐性遺伝子、pyrG、argB、trpC、niaD等の栄
養要求性相補遺伝子が挙げられる。

【００２６】さらに、本発明のプロモーターの下流に所
望の遺伝子を連結することにより、遺伝子産物であるタ
ンパク質を生産させ得る組換えベクターを作製すること
ができる。

【００２７】本発明のプロモーターへの所望のタンパク
質をコードする遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、常
法に従い行うことができる。所望のタンパク質をコード
する遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子を意味
し、異種遺伝子又は同種遺伝子のどちらでも良く、特に
これらに限定されるものではない。異種遺伝子又は同種
遺伝子としては、例えばアミラーゼ、リパーゼ、プロテ
アーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、キ
チナーゼ又はペプチド等をコードする遺伝子が挙げられ
る。また、異種遺伝子及び同種遺伝子は、いかなる手法
によって得られるものでも良い。

【００２８】このようにして得られた組換えベクターに
より、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、所望のタンパク質を著量生産させること
ができる。すなわち、本発明は、前記形質転換体を培地
にて培養し、得られる培養物から異種遺伝子又は同種遺
伝子の発現産物を採取することを特徴とする前記発現産
物の生産方法をも含むものである。

【００２９】使用される宿主としては、遺伝子組換えの
宿主として使用可能なアスペルギルス属、トリコデルマ
属、リゾプス属、ムコール属、ペニシリウム属等の任意
の糸状菌を用いることができ、特に限定されるものでは
ないが、好ましくはアクレモニウム属に属する糸状菌、
特に好ましくはアクレモニウム・セルロリティカスであ
る。

【００３０】宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの
導入は、常法に従ってすることができ、例えばエレクト
ロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロ
バクテリウム法等が用いられ、特に限定されるものでは
ないが、好ましくはポリエチレングリコール法である。

【００３１】また、形質転換体の培養も常法に従って、
培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことが
できる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源とし
ては、グルコース、シュークロース、セルロース、水
飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植
物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、
小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイ
ヨン、ペプトン、イーストエキス、硫酸アンモニウム、
硝酸カリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応
じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを
生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、
硫酸マグネシウム、燐酸一カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マ
ンガン、硫酸銅等を添加することも有効である。また、
必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等
の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することも
できる。さらに、菌の発育を助け、導入遺伝子の発現を
促進するような有機物及び無機物を適当に添加すること
ができる。

【００３２】培養方法は、これらの成分を選択的に含む
培地で行うことができ、液体培地では、好気的条件での
培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部培養法
により行うことができる。培地のpHは、例えば7〜8程度
である。培養温度は、糸状菌の培養に採用される通常の
条件、例えば温度15℃〜45℃、好ましくは15℃〜30℃、
培養日数は、1日〜10日間程度の条件で行うことができ
る。

【００３３】得られた培養物から異種遺伝子発現産物又
は同種遺伝子発現産物を採取することにより、目的とす
る遺伝子発現産物であるタンパク質を取得することがで
きる。ここで用いる「遺伝子発現産物を採取する」と
は、培養菌体から遺伝子発現産物を抽出すること及び培
養菌体から遺伝子産物を精製すること、並びに培養上清
自体を回収すること及び培養上清から遺伝子発現産物を
精製すること、並びに培養菌体及び培養上清の両方から
抽出、回収及び精製の手法を用いることのいずれをも意
味する。

【００３４】「抽出する」とは、特に限定はしないが、
常法により菌体を磨砕処理、加圧破砕、超音波処理等に
より遺伝子発現産物を抽出することを意味し、「回収す
る」とは、特に限定はしないが、常法により培養上清を
ろ過、遠心分離等により固形部分を除去し、粗タンパク
質溶液を得ることを意味し、「精製する」とは、特に限
定はしないが、常法により塩析法、溶媒沈殿法、透析
法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法等、又はイオン交換、
疎水性、逆相、ゲルろ過、アフィニティー等の各種クロ
マトグラフィーの精製手法を組合わせ、目的遺伝子発現
産物を分離精製することを意味する。

【００３５】また、これらの過程において、必要に応じ
てフェニルメタンスルホン酸、ロイペプチン、アンチパ
イン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。

【００３６】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳述するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

【００３７】実施例１アクレモニウム・セルロリティ
カスのcbh1遺伝子のクローニング

【００３８】1. ゲノムDNAの単離とゲノムライブラリ
ーの作製アクレモニウム・セルロリティカスY-94株（FERM BP-58
26）を（S）培地（2％ブイヨン、0.5％イーストエキス
及び2％グルコース）で32℃にて2日間培養し、遠心分離
により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結
後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体か
らISOPLANT（ニッポンジーン社）により、添付のプロト
コールに従いゲノムDNAを単離した。単離したゲノムDNA
をSau3AIにより部分分解した後、アガロースゲル電気泳
動により15〜20 kbのDNA断片を回収し、これをアルカリ
フォスファターゼで処理し、DNA断片の末端を脱リン酸
化した。このDNA断片をファージベクターのLambda DASH
II（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして
得られた組換えファージベクターについて、Gigapack I
II Gold Packaging Extract（ストラタジーン社）によ
り、添付のプロトコールに従ってin vitroパッケージン
グを行った。その後、この組換えファージを大腸菌XL1-
Blue MRA (P2)株に感染させ、プレートにて培養しプラ
ークを形成させた。

【００３９】２．アクレモニウム・セルロリティカスY-
94株において高発現するタンパク質の同定アクレモニウム・セルロリティカスY-94株（FERM BP-58
26）において、高発現するタンパク質を同定し、そのプ
ロモーター及びターミネーター領域を遺伝子発現用の組
換えベクターに用いれば、所望のタンパク質を高発現さ
せることができると考えられた。そこで、このようなタ
ンパク質の同定を行った。

【００４０】アクレモニウム・セルロリティカスY-94株
（FERM BP-5826）をセルラーゼ誘導培地（4％セルロー
ス、1％ペプトン、0.6％硝酸カリウム、0.2％尿素、0.1
6％塩化カリウム、0.12％硫酸マグネシム、1.2％燐酸一
カリウム、0.001％硫酸亜鉛、0.001％硫酸マンガン及び
0.001％硫酸銅（pH 4.0））で32℃にて7日間培養した。
培養物を遠心分離して得られた培養上清を電気泳動（So
dium Dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electroph
oresis（SDS-PAGE））した。SDS-PAGEは、電気泳動シス
テム（テフコ社）と12％のポリアクリルアミドゲルを用
い、添付のプロトコールに従って行った。

【００４１】その結果、約70 kDaのタンパク質が最も大
量に発現していることが明らかとなった。SDS-PAGE後の
ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、マルチフォ
ーII（ファルマシアバイオテク社）にて、添付のプロト
コールに従い、ポリビニリデンジフルオライド膜（Immo
bilon-P^SQ、ミリポア社）に転写した。この膜をクーマ
シー・ブリリアント・ブルーR250（ナカライテスク社）
で染色した後、約70 kDaのタンパク質がブロットされて
いる部分を切り出した。ポリビニルピロリドン-40（シ
グマ社）にて、膜上のタンパク質未結合部分をブロック
し、Podell, D.N. et al. Biochem. Biophys. Res. Com
mun.（1978）81, 176の方法に従い、牛肝臓ピログルタ
メートペプチダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社）処
理により、修飾N末端残基を除去した。

【００４２】このタンパク質のN末端アミノ酸配列の決
定は、プロテインシークエンサー Model 492（パーキン
エルマー社）を用い、添付のプロトコールに従って行っ
た。その結果、N末端アミノ酸配列を15残基決定し、BLA
ST（Altschul, S. F. et al.Nucleic Acids Res.（199
7）, 25, 3389）を用いてホモロジー検索を行ったとこ
ろ、このタンパク質は糸状菌のCBH1に相同性を示すこと
が分った。

【００４３】３．cbh1遺伝子の部分DNA断片の単離既知の糸状菌のCBH1タンパク質のマルチプルアライメン
トを行い、CBH1タンパク質間で良好に保存された領域と
して、EMDIWEAとCDPDGCDを見出した。これらの配列を元
に、5′- GARATGGAYATHTGGGARGC -3′（配列番号7）及
び5′- TCRCANCCRTCNGGRTCRCA -3′（配列番号8）のプ
ライマーを合成した。これらのプライマーを用い、アク
レモニウム・セルロリティカスY-94株から単離したゲノ
ムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、50μlの反応液
中、ゲノムDNA50 ngを鋳型とし、1.25 unitのExTaq DNA
ポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファー、dNTP M
ixture及び10μMの上記プライマーを用い、以下の条件
で反応を行った。94℃ 3分間、（94℃ 1分間、65℃（1
サイクル毎に0.5℃下げる） 1分間、72℃ 1分間）×30
回、72℃ 3分間。この反応により約150 bpのDNA断片が
増幅し、このDNA断片をOriginal TA Cloning Kit（イン
ビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールに従って
pCR2.1プラスミドベクターに挿入した。

【００４４】このようにしてクローニングしたDNA断片
の塩基配列の決定は、DNA Sequencing Kit dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction（パーキ
ンエルマー社）とABI PRISM 310 Genetic Analyzer（パ
ーキンエルマー社）を用いて、添付のプロトコールに従
い行った。その結果、単離したDNA断片の塩基配列は、
糸状菌のcbh1遺伝子と相同性を示し、目的とするCBH1タ
ンパク質をコードする遺伝子の一部であることが明らか
となった。

【００４５】４．cbh1遺伝子及びその周辺領域のクロー
ニングゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプロー
ブは、PCRにより、フルオレセイン標識dUTPをDNA断片に
取り込ませることにより調製した。PCRは、50μlの反応
液中、100 ngのcbh1DNA断片が挿入されたpCR2.1プラス
ミドベクターを鋳型とし、1.25 unitのExTaq DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファー、0.2 mM dAT
P、0.2 mM dCTP、0.2 mM dGTP、0.02 mM dTTP、0.18 mM
フルオレセイン標識dUTP（FluoroGreen、アマシャム
社）及び10μMのプライマー（配列番号7及び配列番号
8）を用い、以下の条件で反応を行った。94℃ 2分間、
（94℃ 30秒間、55℃ 1分間、72℃ 1分間）×25回、72
℃ 3分間。この反応により、約150bpからなるフルオレ
セイン標識プローブが作製された。

【００４６】実施例１の１において作製したプラークの
形成されたプレート上に、Hybond-N+メンブレン（アマ
シャム社）をのせ、プラークを付着させた。このメンブ
レンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージ
DNAを1本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージ
DNAが吸着したメンブレンを、Hybridization BufferTab
lets（アマシャム社）を用いて調製したバッファーに入
れた後、60℃で1時間インキュベートした。これに、上
記のフルオレセイン標識プローブを熱変性して添加し、
60℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、
メンブレンを1×SSC（SSC：15 mMクエン酸三ナトリウ
ム、150 mM塩化ナトリウム）−0.1％ SDS溶液で60℃、1
5分間洗浄し、さらに、0.2×SSC−0.1％ SDS溶液で60
℃、15分間洗浄した。フルオレセイン標識プローブが結
合したプラークの可視化は、DIG洗浄ブロックバッファ
ーセット（ベーリンガー・マンハイム社）、アルカリフ
ォスファターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体
（Anti-fluorescein-AP、Fab fragments、ベーリンガー
・マンハイム社）、発色基質としてニトロブルーテトラ
ゾリウムクロライド（ベーリンガー・マンハイム社）及
びX-フォスフェート（ベーリンガー・マンハイム社）を
用い、添付のプロトコールに従って行った。このように
して選抜した陽性クローンから、プローブに相同な領域
の5′上流域及び3′下流域を含むDNA断片をHind IIIに
より約5 kbの断片として切り出し、pBluescript II KS+
（ストラタジーン社）に挿入した。

【００４７】５．塩基配列の決定このようにして単離されたDNA断片の制限酵素地図を作
製し、幾つかのDNA断片に分けて、再度pBluescript II
KS+（ストラタジーン社）に挿入した。これらのDNA断片
の塩基配列の決定は、 pBluescript II KS+のマルチク
ローニングサイト近傍のシークエンス用プライマーや、
解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、
DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Seq
uencing Ready Reaction（パーキンエルマー社）とABI
PRISM 310 Genetic Analyzer（パーキンエルマー社）を
用いて、添付のプロトコールに従い行った。このように
してcbh1遺伝子の5′上流域及び3′下流域を含むHind I
IIサイトからKpn Iサイトまでの領域4270 bpの塩基配列
を決定した。この領域の塩基配列を、配列表の配列番号
1に示した。

【００４８】この塩基配列は1590 bpからなる１個のオ
ープンリーディングフレーム（ORF）を含み、このORFか
ら予測されるタンパク質のN末端から27アミノ酸残基以
降の配列は実施例１の２において決定した70 kDaのタン
パク質のN末端配列に一致し、本遺伝子はこのタンパク
質をコードすることが明らかとなった。また、本知見か
らこのORFの1〜26アミノ酸残基の配列は、本タンパク質
を細胞外に分泌させるためのシグナル配列であると考え
られた。本ORFから予測されるタンパク質に関してBLAST
を用いてホモロジー検索を行ったところ、ペニシリウム
・ジャンシネラムのCBH1（Q06886）に約64％の相同性を
示し、また、その全域に渡って相同性が見られたことか
ら、本遺伝子はイントロンを持たないと考えられた。一
方、本遺伝子のプロモーター領域の塩基配列に関してBL
ASTを用いてホモロジー検索を行ったが、有意な相同性
を示す塩基配列は見いだされなかった。

【００４９】実施例２遺伝子発現用の組換えベクター
の構築実施例１の４において作製した組換えpBluescript IIを
鋳型とし、Ａ：5′- AGCATCCTGCAGCTCGTGAAAGCTGCCCTCA
CAA -3′（配列番号9）及び 5′- AGCATCGTTAACTGCTTCT
GACTGTTGCGGTTGATA -3′（配列番号10）、B：5′- AGCA
TCGTTAACACAATGTCTGCCTTGAACTCT -3′（配列番号11）及
び 5′- AGCATCAAGCTTGCTGAGCACCAGCTGTTGCCA -3′（配
列番号12）、C：5′- AGCATCAAGCTTGCTAGCGCATGCACTTCT
TTCTTCGCCTATTGATTGG -3′（配列番号13）及び 5′- AA
TTAACCCTCACTAAAGGG -3′（配列番号14）をプライマー
として、A、B、Cの各プライマー対を用いてそれぞれに
ついてPCRを行った。PCRは、50μlの反応液中、プラス
ミドDNA150 ngを鋳型とし、2.5 unitのKOD DNAポリメラ
ーゼ（東洋紡績社）、添付のバッファー、dNTP Mixtur
e、1 mM塩化マグネシウム及び0.5μMの上記プライマー
を用い、以下の条件で反応を行った。98℃ 30秒間、（9
8℃ 15秒間、65℃ 2秒間、74℃ 30秒間）×10回、74℃
1分間。各プライマーを用いて得られたPCR反応液をエタ
ノール沈殿し、PCR産物を回収した。これを制限酵素処
理（A：Pst IとHpa I；B：Hpa IとHindIII；C：Hind II
IとKpn I）した後、アガロースゲル電気泳動し、DNA断
片をアガロースゲルから回収した。Pst IとKpn Iで切断
後、アルカリホスファターゼ処理したpBluescript II K
S+とこれら3種の制限酵素処理済みのPCR断片（A、B、
C）をライゲーションし、プラスミドpCBHEXを作製し
た。プロモーター領域からなるDNA断片（A）の塩基配列
を配列表の配列番号３に示し、またpCBHEX中のA、B（シ
グナル配列）及びC（ターミネーター領域）が連結され
てなるDNA断片の配列を配列表の配列番号４に示した。

【００５０】pCBHEXのXba I 部位に、WO9803667号に記
載のpMKD01からXba Iにより切り出したアスペルギルス
・ニデュランス由来のtrp Cのプロモーター及びターミ
ネーターを持つデストマイシン耐性遺伝子（DtR）を挿
入し、プラスミドpCBHEX/DtR2を作製した。pCBHEX/DtR2
の構造を図１に示す。

【００５１】実施例３アクレモニウム・セルロリティ
カス由来キシラナーゼの過剰発現１．mRNAの単離とcDNAライブラリーの作製アクレモニウム・セルロリティカスY-94株をセルラーゼ
誘導培地で32℃にて4日間培養し、遠心分離により菌体
を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と
乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体からISOGEN（ニッ
ポンジーン社）により、添付のプロトコールに従い全RN
Aを単離した。さらに全RNAから、mRNA Purification Ki
t（ファルマシア社）により、添付のプロトコールに従
い、mRNAを精製した。

【００５２】こうして得られたmRNAから、TimeSaver cD
NA Synthesis Kit（ファルマシア社）により、添付のプ
ロトコールに従い、cDNAを合成した。このcDNAをファー
ジベクターのLambda ZAP II（ストラタジーン社）に挿
入した。このようにして作製した組換えファージベクタ
ーについて、Gigapack III Gold Packaging Extract
（ストラタジーン社）により、添付のマニュアルに従っ
てin vitroパッケージングを行った。その後、この組換
えファージを大腸菌XL1-Blue MRF′株に感染させ、プレ
ートにて培養しプラークを形成させた。このようにして
作製したcDNAライブラリーは、5.5×10⁵plaque formin
g unitsであった。さらに、このcDNAライブラリーを、L
ambda ZAP IIに添付のプロトコールに従い増幅した。こ
の増幅したcDNAライブラリー中の組換えファージを大腸
菌XL1-Blue MRF′株に感染させ、プレートにて培養しプ
ラークを形成させた。

【００５３】２．キシラナーゼ遺伝子の単離 5′- ATGGTCTCCTTCACCTCCCT -3′（配列番号15）及び
5′- TTAGCTGACGGTGATGGAAG -3′（配列番号16）をプラ
イマーとして用い、WO9811239号に記載の方法により抽
出したトリコデルマ・ビリデ MC300-1株（FERM BP-604
7）のゲノムDNAを鋳型として、PCRによりキシラナーゼ
遺伝子（XYN I、Trrnen, A. et al. Bio/Technology（1
992）10, 1461）を増幅した。PCRは、50μlの反応液
中、50 ngのゲノムDNAを鋳型とし、1.25 unitのExTaq D
NAポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファー、0.2
mM dATP、0.2 mM dCTP、0.2 mM dGTP、0.02 mM dTTP、
0.18 mMフルオレセイン標識dUTP（FluoroGreen、アマシ
ャム社）及び1μMの上記プライマーを用い、以下の条件
で反応を行った。94℃ 3分間、（94℃ 30秒間、55℃ 1
分間、72℃ 1分間）×35回、72℃ 3分間。この反応によ
り、約780 bpの塩基配列からなるフルオレセイン標識プ
ローブが作製された。

【００５４】実施例３の１において作製したプラークの
形成されたプレート上に、Hybond-N+メンブレン（アマ
シャム社）をのせ、プラークを付着させた。このメンブ
レンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージ
DNAを1本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージ
DNAが吸着したメンブレンを、Hybridization BufferTab
lets（アマシャム社）を用いて調製したバッファーに入
れた後、60℃で1時間インキュベートした。これに、上
記のフルオレセイン標識プローブを熱変性して添加し、
60℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、
メンブレンを1×SSC−0.1％ SDS溶液で室温下15分間洗
浄し、さらに、0.2×SSC−0.1％ SDS溶液で室温下15分
間洗浄した。フルオレセイン標識プローブが結合したプ
ラークの可視化は、DIG洗浄ブロックバッファーセット
（ベーリンガー・マンハイム社）、アルカリフォスファ
ターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体（Anti-flu
orescein-AP、Fab fragment、ベーリンガー・マンハイ
ム社）、発色基質としてニトロブルーテトラゾリウムク
ロライド（ベーリンガー・マンハイム社）及びX-フォス
フェート（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、添付
のプロトコールに従って行った。このようにして選抜し
た陽性クローンからプラスミドベクターpBluescript SK
(-)へのin vivo excisionは、Lambda ZAP IIに添付の
プロトコールに従い実施した。

【００５５】プラスミドベクター中のキシラナーゼcDNA
の塩基配列の決定は、pBluescriptSK (-)のマルチクロ
ーニングサイト近傍のシークエンス用プライマー、又は
解析された塩基配列を元に作製したプライマーを用い、
DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Seq
uencing Ready Reaction（パーキンエルマー社）とABI
PRISM 310 Genetic Analyzer（パーキンエルマー社）を
用いて、添付のプロトコールに従い行った。このように
してアクレモニウム・セルロリティカスのキシラナーゼ
cDNAの1027 bpの塩基配列を決定し、この塩基配列を、
配列表の配列番号5に示した。本cDNAは849 bpの塩基配
列からなる１個のORFを含み、本キシラナーゼ遺伝子は2
9.5 kDaのタンパク質をコードすることが明らかとなっ
た。

【００５６】本ORFから予測されるタンパク質に関してB
LASTを用いてホモロジー検索を行ったところ、本キシラ
ナーゼはトリコデルマ・リーセイのキシラナーゼ I（P3
6218）に最も高い相同性を示した。また、本キシラナー
ゼは、そのC末端にトリコデルマ・リーセイのキシラナ
ーゼ Iには見られない62アミノ酸残基の配列が付加され
ており、これ以外の部分では、トリコデルマ・リーセイ
のキシラナーゼ Iに約59％の相同性を示した。

【００５７】一方、本キシラナーゼの40アミノ酸残基以
降の配列はWO9839423号のキシラナーゼ IのN末端配列に
一致していた。そのため、本キシラナーゼ遺伝子は、WO
9839423号のキシラナーゼ Iをコードしており、1〜39ア
ミノ酸残基まではシグナル配列であることが明らかとな
った。

【００５８】３．キシラナーゼ遺伝子発現用の組換えベ
クターの作成アクレモニウム・セルロリティカスY-94株から単離した
ゲノムDNAを鋳型とし、5′- GGGAGGCCTAACACAATGGGCATC
TCATCTATTC -3′（配列番号17）及び 5′- GGGGCATGCCT
ATTGGCACTGACTGTAG -3′（配列番号18）をプライマーと
してPCRを行った。PCRは、50μlの反応液中、1.25 unit
のExTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッフ
ァーとdNTP Mixture、50 ng ゲノムDNA及び1μMの上記
プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。94℃ 3
分間、（94℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間）×30
回、72℃ 3分間。こうして得られたPCR反応液をエタノ
ール沈殿し、PCR産物を回収した後、Stu IとSph Iで切
断し、pCBHEX/DtR2のHpa IとSph Iの間に挿入し、タン
パク質発現用プラスミドpCBHEX/DtR2/XYLを作製した。

【００５９】４．キシラナーゼ遺伝子の宿主への導入アクレモニウム・セルロリティカスY-94株を（S）培地
において30℃で16時間培養し、3500rpm、10分間遠心す
ることにより集菌した。得られた菌体を0.5 Ｍシューク
ロースで洗浄し、0.45μmのフィルターで濾過したプロ
トプラスト化酵素溶液（10 mg/mlキチナーゼ、10 mg/ml
ザイモリアーゼ、30 mg/mlβ-グルクロニダーゼ及び0.5
M シュークロース）に懸濁した。30℃で60分〜90分間
振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿により
この懸濁液を濾過した後、2500 rpm、10分間遠心してプ
ロトプラストを回収し、SUTCバッファー（0.5 M シュー
クロース、10 mM 塩化カルシウム及び10 mMトリス-塩酸
（pH7.5））で洗浄した。以上のようにして調製したプ
ロトプラストを1 mlのSUTCバッファーに懸濁し、この10
0μlに対し10μgのDNA溶液（10μl）を加え、氷上に5分
間静置した。次に、400μlのPEG溶液（60％ PEG4000、1
0 mM 塩化カルシウム及び10 mMトリス-塩酸（pH7.5））
を加え、氷中に20分間静置した後、10 mlのSUTCバッフ
ァーを加え、2500 rpm、10分間遠心した。遠心分離した
プロトプラストを1 mlのSUTCバッファーに懸濁した後、
4000 rpmで5分間遠心して、最終的に100μlのSUTCバッ
ファーに懸濁した。

【００６０】以上の処理をしたプロトプラストを、ハイ
グロマイシンB（500μg/ml）添加（A）培地（3.9％ポテ
トデキストロース寒天培地（日水製薬社）、17.1％シュ
ークロース及び 1％バクトアガー（pH 6.0））上に、
（A）軟寒天とともに重層し、30℃、5〜9日間培養後、
形成したコロニーを形質転換体とした。

【００６１】５．アクレモニウム・セルロリティカス形
質転換体におけるキシラナーゼの発現と酵素活性の測定ハイグロマイシンBに対する耐性度の高いもの1株をセル
ラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をSDS-PAGEにより
解析したところ、キシラナーゼは親株より分泌量が向上
していた。

【００６２】キシラナーゼ活性は、DNS法により測定し
た。0.5 mlの2％キシラン（オート麦由来、アルドリッ
ヒ社）溶液（0.1 N 酢酸-酢酸ナトリウムバッファー（p
H 4.5））を50℃で10分間加熱した後、0.5 mlの培養上
清を添加し、50℃で30分間反応させた。これに、3 mlの
DNS溶液（10.6 g 3,5-ジニトロサリチル酸、19.8 g 水
酸化ナトリウムを1416 mlの精製水に溶解し、その後、3
06 g 酒石酸カリウム・ナトリウム、7.6 mlフェノール
（50℃で溶解）、8.3 g ピロ亜硫酸ナトリウムを溶解し
た溶液）を添加し、沸騰水中で5分間加熱した後、水に
入れ冷却した。精製水8 mlを添加した後、540 nmの吸光
度を測定した。ブランクは、0.5 mlの培養上清に3 mlの
DNS溶液を添加し混合した後、0.5 mlの2％キシラン溶液
を加え、沸騰水中で5分間加熱し水に入れ冷却したもの
を用いた。キシラナーゼ活性（u/ml）は、1 mlの培養上
清あたり1分間に生成したキシロースの量（μmol）とし
て表した。その結果を表１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】このように、形質転換体は親株の約4倍の
比活性を示した。

【００６５】実施例４トリコデルマ・ビリデ由来エン
ドグルカナーゼの過剰発現１．エンドグルカナーゼ発現用の組換えベクターの構築 WO9811239号に記載のトリコデルマ・ビリデのエンドグ
ルカナーゼSCE3遺伝子の挿入されたプラスミドpUC-Eg3X
を鋳型とし、5′- GGGAGGCCTAACACAATGAACAAGTCCGTGGC
-3′（配列番号19）及び 5′- GGGGCATGCCTACAATCTTGCA
GAACACG -3′（配列番号20）をプライマーとしてPCRを
行った。PCRは、50μlの反応液中、プラスミドDNA150 n
gを鋳型とし、2.5 unitのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡
績社）、添付のバッファー、dNTP Mixture、1 mM塩化マ
グネシウム及び0.5μMの上記プライマーを用い、以下の
条件で反応を行った。98℃ 30秒間、（98℃ 15秒間、50
℃2秒間、74℃ 1分間）×10回、74℃ 1分間。こうして
得られたPCR反応液をエタノール沈殿し、PCR産物を回収
した後、Stu IとSph Iで切断し、pCBHEX/DtR2のHpa Iと
Sph Iの間に挿入し、蛋白質発現用プラスミドpCBHEX/Dt
R2/EG3を作製した。

【００６６】２．トリコデルマ・ビリデ由来エンドグル
カナーゼ遺伝子の宿主への導入エンドグルカナーゼ遺伝子のアクレモニウム・セルロリ
ティカスへの導入は、実施例３の４の方法に従い行っ
た。

【００６７】３．アクレモニウム・セルロリティカス形
質転換体におけるトリコデルマ・ビリデ由来エンドグル
カナーゼの発現と酵素活性の測定ハイグロマイシンBに対する耐性度の高いもの1株をセル
ラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をSDS-PAGEにより
解析したところ、エンドグルカナーゼは親株より分泌量
が向上していた。

【００６８】培養上清中のエンドグルカナーゼ活性は、
実施例３の５に記載したDNS法に従い、基質としてキシ
ランの代わりにカルボキシメチルセルロースナトリウム
（CMC；n = 500、東京化成社）を用いて測定した。エン
ドグルカナーゼ活性（u/ml）は、1 mlの培養上清あたり
1分間に生成したグルコースの量（μmol）として表し
た。その結果を表２に示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】このように、形質転換体は親株の約1.6倍
の比活性を示し、本発明のプロモーターを用いることに
より、異種タンパク質の発現も可能であることが明らか
となった。

【００７１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の新規プロ
モーターの下流に所望のタンパク質をコードする遺伝子
を連結し、アクレモニウム・セルロリティカスに導入す
ることにより、所望のタンパク質を大量に発現させるこ
とが可能である。

【００７２】

【配列表】 <110> Meiji Seika Kaisha, Ltd <120> New promoter for expressing protein products <130> PM1522 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4270 <212> DNA <213> Acremonium cellulolyticus <220> <221> CDS <222> (1366)..(2955) <223> cellobiohydrolase 1 precursor <220> <221> mat_peptide <222> (1444)..(2952) <220> <221> promoter <222> (1)..(1365) <220> <221> terminator <222> (2956)..(4270) <220> <221> sig_peptide <222> (1366)..(1443) <400> 1 aagcttggaa gctcgtgaaa gctgccctca caatgatcgt caagatgacg tagtttgact 60 gggtcgttcc tggataaggg ttagggtaaa tagggctcaa agtaccacgt gagtgtggaa 120 agataagccc taaccctaag gtcgtgtcgg acaaaaatta tcacttgacc aaaattggag 180 atccccttaa tggagctttt tggtaatggt ttgtataggg ttatgtgacg tccgtatcac 240 atgattttta tcccaacagg tcgatccccc tcttatagtt aatggacaac atataagtac 300 gtagcatctt agatagttcg tcagcgtcaa ctgaccaaag tccccgtgtt tcattttaat 360 ttgtcagact gcaagagtct cgaaacataa aaagatcgaa agttttgcct tattaggcta 420 tgagcatgaa tgtcggaaca atgccgttga ggctattccc aatttcggaa 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gag atc aga cgt tac tac gtt cag aac ggc gtt gtc atc ccc 2385 Leu Ser Glu Ile Arg Arg Tyr Tyr Val Gln Asn Gly Val Val Ile Pro 300 305 310 cag cct tcc tcc aag atc tcc gga atc agc gga aat gtc atc aac tcc 2433 Gln Pro Ser Ser Lys Ile Ser Gly Ile Ser Gly Asn Val Ile Asn Ser 315 320 325 330 gac tac tgc gct gct gaa atc tcc acc ttt ggc ggg act gcc tcc ttc 2481 Asp Tyr Cys Ala Ala Glu Ile Ser Thr Phe Gly Gly Thr Ala Ser Phe 335 340 345 agc aaa cac ggt ggc ttg aca aac atg gcc gct ggt atg gaa gct ggt 2529 Ser Lys His Gly Gly Leu Thr Asn Met Ala Ala Gly Met Glu Ala Gly 350 355 360 atg gtc ttg gtc atg agt ttg tgg gac gac tac gcc gtc aac atg ctc 2577 Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Val Asn Met Leu 365 370 375 tgg ctc gac agc acc tac cct aca aac gcg act ggt acc ccc ggt gcc 2625 Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Gly Thr Pro Gly Ala 380 385 390 gct cgt ggt acc tgc gct acc act tct ggg gac ccc aag acc gtt gaa 2673 Ala Arg Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ser Gly Asp Pro Lys Thr Val Glu 395 400 405 410 gca caa tcc ggc agc tcc tat gtc acc ttc tct gac att cgg gtt ggt 2721 Ala Gln Ser Gly Ser Ser Tyr Val Thr Phe Ser Asp Ile Arg Val Gly 415 420 425 cct ttc aat tct acg ttc agc ggt ggt tct agc acc ggt ggc agc act 2769 Pro Phe Asn Ser Thr Phe Ser Gly Gly Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr 430 435 440 act act acc gcc agc cgc acc acc acc acc tcg gcc tct tcc acc tct 2817 Thr Thr Thr Ala Ser Arg Thr Thr Thr Thr Ser Ala Ser Ser Thr Ser 445 450 455 act tcc agc acc tct act ggc act gga gtc gct ggt cac tgg ggt cag 2865 Thr Ser Ser Thr Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gly His Trp Gly Gln 460 465 470 tgt ggt ggc cag ggc tgg act ggt cct acc acc tgt gtt agt gga acc 2913 Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr 475 480 485 490 aca tgc acc gtc gtg aac cct tac tac tct caa tgt ttg taa 2955 Thr Cys Thr Val Val Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 495 500 attttcactt ctttcttcgc ctattgattg ggctatgaca aaattaggag agataggttg 3015 gacgttgtca agtcaaaatg taccgaacac gatgcgttga tatgctgcac 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cgaccgatgt 3915 gacattcaca tcaaaagttc ggttgtaagt agaccgcatt tcggaaaatg aagtctgggt 3975 gaaggcaacg gcagcattgt ttatcagaac tagacatctg ttagagaatt tctaaagccc 4035 gctcactcga gaatgaaata ggcttaccat ccagtctacc atatgttgtc tcgaccgcct 4095 tagcaaaagc aatgaggcta tcgtcgcgag tcacatcaac ctccataacg tcgatcttgg 4155 attgaacagc gagctctctc aaccgcttaa gtgcctgatt tccgtcttcc ttattccggc 4215 atcctaagat gaagtgatcg gatggactat gcagacttaa agcctggagg gtacc 4270 <210> 2 <211> 529 <212> PRT <213> Acremonium cellulolyticus <400> 2 Met Ser Ala Leu Asn Ser Phe Asn Met Tyr Lys Ser Ala Leu Ile Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Ala Thr Ala Gly Ala Gln Gln Ile Gly Thr Tyr Thr 20 25 30 Ala Glu Thr His Pro Ser Leu Ser Trp Ser Thr Cys Lys Ser Gly Gly 35 40 45 Ser Cys Thr Thr Asn Ser Gly Ala Ile Thr Leu Asp Ala Asn Trp Arg 50 55 60 Trp Val His Gly Val Asn Thr Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr 65 70 75 80 Trp Asn Ser Ala Ile Cys Asp Thr Asp Ala Ser Cys Ala Gln Asp Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser 100 105 110 Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser 115 120 125 Arg Thr Tyr Leu Met Ala Asp Asn Thr His Tyr Gln Ile Phe Asp Leu 130 135 140 Leu Asn Gln Glu Phe Thr Phe Thr Val Asp Val Ser His Leu Pro Cys 145 150 155 160 Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Thr Met Asp Ala Asp Gly Gly 165 170 175 Val Ser Lys Tyr Pro Asn Asn Lys Ala Gly Ala Gln Tyr Gly Val Gly 180 185 190 Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Ala Gly Gln 195 200 205 Ala Asn Val Glu Gly Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly 210 215 220 Ile Gly Asn His Gly Ala Cys Cys Ala Glu Leu Asp Ile Trp Glu Ala 225 230 235 240 Asn Ser Ile Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly 245 250 255 Leu Ser Val Cys Thr Thr Asp Ala Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp 260 265 270 Arg Tyr Ala Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr 275 280 285 Arg Leu Gly Val Thr Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Lys Thr Val Asp Thr 290 295 300 Thr Lys Pro Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Val Thr Asn Asp Gly Thr 305 310 315 320 Ser Thr Gly Ser Leu Ser Glu Ile Arg Arg Tyr Tyr Val Gln Asn Gly 325 330 335 Val Val Ile Pro Gln Pro Ser Ser Lys Ile Ser Gly Ile Ser Gly Asn 340 345 350 Val Ile Asn Ser Asp Tyr Cys Ala Ala Glu Ile Ser Thr Phe Gly Gly 355 360 365 Thr Ala Ser Phe Ser Lys His Gly Gly Leu Thr Asn Met Ala Ala Gly 370 375 380 Met Glu Ala Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ala 385 390 395 400 Val Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Gly 405 410 415 Thr Pro Gly Ala Ala Arg Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ser Gly Asp Pro 420 425 430 Lys Thr Val Glu Ala Gln Ser Gly Ser Ser Tyr Val Thr Phe Ser Asp 435 440 445 Ile Arg Val Gly Pro Phe Asn Ser Thr Phe Ser Gly Gly Ser Ser Thr 450 455 460 Gly Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ala Ser Arg Thr Thr Thr Thr Ser Ala 465 470 475 480 Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gly 485 490 495 His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys 500 505 510 Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Val Val Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys 515 520 525 Leu <210> 3 <211> 1354 <212> DNA <213> Acremonium cellulolyticus <220> <221> promoter <222> (1)..(1354) <400> 3 ctcgtgaaag ctgccctcac aatgatcgtc aagatgacgt agtttgactg ggtcgttcct 60 ggataagggt tagggtaaat agggctcaaa gtaccacgtg agtgtggaaa gataagccct 120 aaccctaagg tcgtgtcgga caaaaattat cacttgacca aaattggaga tccccttaat 180 ggagcttttt ggtaatggtt tgtatagggt tatgtgacgt ccgtatcaca tgatttttat 240 cccaacaggt cgatccccct cttatagtta atggacaaca tataagtacg tagcatctta 300 gatagttcgt cagcgtcaac tgaccaaagt ccccgtgttt cattttaatt tgtcagactg 360 caagagtctc gaaacataaa aagatcgaaa gttttgcctt attaggctat gagcatgaat 420 gtcggaacaa tgccgttgag gctattccca atttcggaaa tatgtatctt cattgctgtc 480 gacttgacga cagtcgataa aaggctcatc cggatagata agccagatca ctcattatgc 540 caatttctcc ggtgtctgaa aacgtatact acatacgtaa ctgatcttcg tggttgaaag 600 agtgtttctt ctcattctca tctgccgatg ccgagccaat tggaacaaac cccgcatatg 660 gtcctgaata tcaatcgcgg agatgcggag agtgagggag caacacaatt ttaaattagt 720 cagttttctc atgttctccg caatcttgca ggcttgggtc tggtaggttt atctctctct 780 tttcacaaca aggttgggcc attgtcagct tagcaagcgc gcagcaaagg gtgtcggtca 840 atgttcatgt cctccgcggt cactacaaaa cagcacgtgg ggaatgttgc tttccctgtt 900 gatgttcatg tgttgtcatt cccggcaaat cgactccaat taatatggta ggctcctgca 960 taatgcaagt ccttgagatg cagcttccgg cagatggacg tatagatcag ggactttgag 1020 gggctaaaac acttacccga gctaaaacat accataattt cgtttaatga ctttcgtctg 1080 gatggcagag gctgaaggtc gattatgagt gaaattggta tgaagccaca tacgccgata 1140 ctgtaacgct gtgccttcat ccgccttcta tcgcgccccg acattccgcg gtaccgcgat 1200 tatgaagaaa aacactcgta atgatgagga gatagttctt agctcttatt atttttgtct 1260 agctatggaa tgcaagttta gcactatata atggtggtgt ttcccttgaa gaattaggca 1320 ctatcaaccg caacagtcag aagcaatcga caca 1354 <210> 4 <211> 2766 <212> DNA <213> Acremonium cellulolyticus <220> <221> sig_peptide <222> (1361)..(1439) <220> <221> promoter <222> (1)..(1360) <220> <221> terminator <222> (1458)..(2766) <400> 4 ctgcagctcg tgaaagctgc cctcacaatg atcgtcaaga tgacgtagtt tgactgggtc 60 gttcctggat aagggttagg gtaaataggg ctcaaagtac cacgtgagtg tggaaagata 120 agccctaacc ctaaggtcgt gtcggacaaa aattatcact tgaccaaaat tggagatccc 180 cttaatggag ctttttggta atggtttgta tagggttatg tgacgtccgt atcacatgat 240 ttttatccca acaggtcgat ccccctctta tagttaatgg acaacatata agtacgtagc 300 atcttagata gttcgtcagc gtcaactgac caaagtcccc gtgtttcatt ttaatttgtc 360 agactgcaag agtctcgaaa cataaaaaga tcgaaagttt tgccttatta ggctatgagc 420 atgaatgtcg gaacaatgcc gttgaggcta ttcccaattt cggaaatatg tatcttcatt 480 gctgtcgact tgacgacagt cgataaaagg ctcatccgga tagataagcc agatcactca 540 ttatgccaat ttctccggtg tctgaaaacg tatactacat acgtaactga tcttcgtggt 600 tgaaagagtg tttcttctca ttctcatctg ccgatgccga gccaattgga acaaaccccg 660 catatggtcc tgaatatcaa tcgcggagat gcggagagtg agggagcaac acaattttaa 720 attagtcagt tttctcatgt tctccgcaat cttgcaggct tgggtctggt aggtttatct 780 ctctcttttc acaacaaggt tgggccattg tcagcttagc aagcgcgcag caaagggtgt 840 cggtcaatgt tcatgtcctc cgcggtcact acaaaacagc acgtggggaa tgttgctttc 900 cctgttgatg ttcatgtgtt gtcattcccg gcaaatcgac tccaattaat atggtaggct 960 cctgcataat gcaagtcctt gagatgcagc ttccggcaga tggacgtata gatcagggac 1020 tttgaggggc taaaacactt acccgagcta aaacatacca taatttcgtt taatgacttt 1080 cgtctggatg gcagaggctg aaggtcgatt atgagtgaaa ttggtatgaa gccacatacg 1140 ccgatactgt aacgctgtgc cttcatccgc cttctatcgc gccccgacat tccgcggtac 1200 cgcgattatg aagaaaaaca ctcgtaatga tgaggagata gttcttagct cttattattt 1260 ttgtctagct atggaatgca agtttagcac tatataatgg tggtgtttcc cttgaagaat 1320 taggcactat caaccgcaac agtcagaagc agttaacaca atgtctgcct tgaactcttt 1380 caatatgtac aagagcgccc tcatcttggg ctccttgctg gcaacagctg gtgctcagca 1440 agcttgctag cgcatgcact tctttcttcg cctattgatt gggctatgac aaaattagga 1500 gagataggtt ggacgttgtc aagtcaaaat gtaccgaaca cgatgcgttg atatgctgca 1560 catgtgccta gtatccattc gttcctattt atattaaatt gaaattttct tatccaatta 1620 ctgagctaaa acatacttca gcactgtaag cgccagccta agttatgcta tgttagactg 1680 tccggattcg gctggcactg gcttttgtga tccccagtat catgtaaagg tatccgcctg 1740 tttgttaggg ggtcttaaat gttgtataaa gtttcttgct aggctgttta tgcttgatag 1800 agaatatata tatatatcta gctgctatta atatccttgt ttcaatgtct tagacttcca 1860 aggttaccta cccgcgtgcg tggactaata caaacaatct cactcaagac aatcttatac 1920 aaactcggat tctggtcaat ccgttccttg gttatattgc taaaaaaact aggtagccca 1980 aaattccatc tcaagccgta taagaacttt caaattcacc atggtactct cacgggcgaa 2040 gcatctccgt cttccatctg ccaaaatcca ttaccaaaat cggaagtacc cgaatgtagc 2100 aaatgaacaa taactttcgc accatctagc ggatcctttg tgccacgata gttgttgaac 2160 gcagttttgc aatacccagg actaactgct tggatgataa cactctcatt cgccgggtct 2220 ttcccatatt cgaccgtgag catgttaagg gccgtctttg aggcgcagta cgcgatagta 2280 acagttggag gcagcttgcc agatgatgat aggcccaaag aaccccgtgt ggatgatacg 2340 tttattatgt ggcctcgagg cgactgacgc aaaagtggta ggaatagatc tatggtcatt 2400 gcgaccgatg tgacattcac atcaaaagtt cggttgtaag tagaccgcat ttcggaaaat 2460 gaagtctggg tgaaggcaac ggcagcattg tttatcagaa ctagacatct gttagagaat 2520 ttctaaagcc cgctcactcg agaatgaaat aggcttacca tccagtctac catatgttgt 2580 ctcgaccgcc ttagcaaaag caatgaggct atcgtcgcga gtcacatcaa cctccataac 2640 gtcgatcttg gattgaacag cgagctctct caaccgctta agtgcctgat ttccgtcttc 2700 cttattccgg catcctaaga tgaagtgatc ggatggacta tgcagactta aagcctggag 2760 ggtacc 2766 <210> 5 <211> 1027 <212> DNA <213> Acremonium cellulolyticus <220> <221> CDS <222> (52)..(900) <223> xylanase precursor <220> <221> mat_peptide <222> (169)..(897) <220> <221> sig_peptide <222> (52)..(168) <400> 5 ctaaacccat ataactctta gttgatcttt cacgtcattg acaaagcaat c atg ggc 57 Met Gly atc tca tct att ctt ctc tct gct ctg atc gcg ggg gga gcc ttg gct 105 Ile Ser Ser Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ala Leu Ala -35 -30 -25 ctg ccc gct gca gaa cct gtg tcg ttc gat atc cgg gat gaa aac atc 153 Leu Pro Ala Ala Glu Pro Val Ser Phe Asp Ile Arg Asp Glu Asn Ile -20 -15 -10 acc ctg gcg cgc cgc gct gag gcg atc aac tac aac caa aac tac att 201 Thr Leu Ala Arg Arg Ala Glu Ala Ile Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Ile -5 -1 1 5 10 gct agt ggt gcc aat gtt caa tac tcg ccc aac atc gct gcg ggt tct 249 Ala Ser Gly Ala Asn Val Gln Tyr Ser Pro Asn Ile Ala Ala Gly Ser 15 20 25 ttc tcc atc aac tac aat acg cag ggg gac ttt gtg gtg gga ctt ggt 297 Phe Ser Ile Asn Tyr Asn Thr Gln Gly Asp Phe Val Val Gly Leu Gly 30 35 40 tgg caa cca ggt gat gct aac ccc atc acc tac agc ggc tcc ttc tcg 345 Trp Gln Pro Gly Asp Ala Asn Pro Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Phe Ser 45 50 55 gcc tcg ggt gtt ggt atc ctt gcc gtg tac ggc tgg acc acc aac ccg 393 Ala Ser Gly Val Gly Ile Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asn Pro 60 65 70 75 ctc gtg gaa tac tat atc atg gag gtt cac gac gga tac cag act gtc 441 Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu Val His Asp Gly Tyr Gln Thr Val 80 85 90 ggc aca cac aag ggc act gtg acg agt gac ggc ggc acc tat gat atc 489 Gly Thr His Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile 95 100 105 tgg gag cac cag cag gtc aat cag ccg tcc att ctg ggc acc tcc acc 537 Trp Glu His Gln Gln Val Asn Gln Pro Ser Ile Leu Gly Thr Ser Thr 110 115 120 ttc aac cag tac atc tcg atc cgc caa agc ccc cgg acg agc ggt acg 585 Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Ile Arg Gln Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr 125 130 135 gtt acc gtg cag aac cac ttc aat gcc tgg gcg cag gcg ggc ttg aat 633 Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Gln Ala Gly Leu Asn 140 145 150 155 ctc ggc aca atg aac tac cag gtc ctg gca gtc gag agc tgg agc ggc 681 Leu Gly Thr Met Asn Tyr Gln Val Leu Ala Val Glu Ser Trp Ser Gly 160 165 170 agc ggc tct gga caa atc tcg ctc agc aag ggc act ggc ggt ggc acc 729 Ser Gly Ser Gly Gln Ile Ser Leu Ser Lys Gly Thr Gly Gly Gly Thr 175 180 185 acc acc acc aca ccc acg ggt ccc acc agc acg agc acc gct cct tcg 777 Thr Thr Thr Thr Pro Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser 190 195 200 agc gga ggt acc ggt gct gct caa tgg gga caa tgc gga gga att ggc 825 Ser Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gln Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly 205 210 215 tgg acc ggc ccg act acc tgc gtg tcc cct tat act tgc aag tac ttt 873 Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys Lys Tyr Phe 220 225 230 235 aac gct tac tac agt cag tgc caa tag gtagtcgatt 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Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Ile Arg Gln Ser Pro Arg Thr Ser 165 170 175 Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Gln Ala Gly 180 185 190 Leu Asn Leu Gly Thr Met Asn Tyr Gln Val Leu Ala Val Glu Ser Trp 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Ile Ser Leu Ser Lys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Gly Thr Thr Thr Thr Thr Pro Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ala 225 230 235 240 Pro Ser Ser Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gln Trp Gly Gln Cys Gly Gly 245 250 255 Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys Lys 260 265 270 Tyr Phe Asn Ala Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln 275 280 ＜210＞ 7 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 7 garatggaya thtgggargc 20 ＜210＞ 8 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 8 tcrcanccrt cnggrtcrca 20 ＜210＞ 9 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 9 agcatcctgc agctcgtgaa agctgccctc acaa 34 ＜210＞ 10 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 10 agcatcgtta actgcttctg actgttgcgg ttgata 36 ＜210＞ 11 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 11 agcatcgtta acacaatgtc tgccttgaac tct 33 ＜210＞ 12 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 12 agcatcaagc ttgctgagca ccagctgttg cca 33 ＜210＞ 13 ＜211＞ 49 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 13 agcatcaagc ttgctagcgc atgcacttct ttcttcgcct attgattgg 49 ＜210＞ 14 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 14 aattaaccct cactaaaggg 20 ＜210＞ 15 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 15 atggtctcct tcacctccct 20 ＜210＞ 16 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 16 ttagctgacg gtgatggaag 20 ＜210＞ 17 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 17 gggaggccta acacaatggg catctcatct attc 34 ＜210＞ 18 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 18 ggggcatgcc tattggcact gactgtag 28 ＜210＞ 19 ＜211＞ 32 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 19 gggaggccta acacaatgaa caagtccgtg gc 32 ＜210＞ 20 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞＜223＞ Description of Artificial Sequence:synthetic DNA ＜400＞ 20 ggggcatgcc tacaatcttg cagaacacg 29

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図にプラスミドpCBHEX/DtR2の制限酵素地
図を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者隅田奈緒美神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式会社薬品技術研究所内 (72)発明者岡倉薫神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式会社薬品技術研究所内 (72)発明者村上健神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式会社薬品技術研究所内 (72)発明者山辺倫茨城県つくば市東１−１−３工業技術院生命工学工業技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA20 BA12 BA80 CA01 CA04 CA09 CA20 DA11 EA04 FA02 FA07 GA11 GA19 GA21 GA27 HA12 HA13 4B064 AG01 CA05 CA19 CC01 CC24 DA10 DA16 4B065 AA58X AA58Y AA70Y AB01 AC14 AC15 BA02 BA10 BA25 BB01 BC01 BD14 BD50 CA24 CA31 CA41 CA55 CA57 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（a）又は（b）のDNAを有するプロ
モーター。（a）配列番号３に示す塩基配列を有するDNA。（b）（a）の塩基配列を有するDNAとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ下流に連結した遺伝
子を発現させ得るDNA。
【請求項２】請求項１に記載のプロモーターを含有する
組換えベクター。
【請求項３】配列番号４に示す塩基配列からなるDNAを
含有する組換えベクター。
【請求項４】請求項２又は請求項３に記載の組換えベク
ターを含み、かつプロモーターの下流に連結した遺伝子
を発現する糸状菌。
【請求項５】請求項４に記載の糸状菌がアクレモニウム
・セルロリティカスである糸状菌。
【請求項６】請求項４又は請求項５に記載の糸状菌を用
いるタンパク質の発現方法。