JP2015136320A - 麹菌変異株 - Google Patents

Abstract

【課題】草本類バイオマスを用いた固体培養に適しており、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株、当該麹菌変異株から得られた形質転換体、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法の提供。【解決手段】アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株である、麹菌変異株；ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損しており、ウリジン要求性である、前記麹菌変異株；ウリジン要求性である前記麹菌変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体；前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記記載の形質転換体；前記いずれかに記載の形質転換体を固体培養する、糖化酵素の生産方法。【選択図】なし

Description

本発明は、固体培養に好適であり、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株、当該麹菌変異株から得られた形質転換体、及び、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法に関する。

地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。

稲わらやコーンストーバ等の固形のバイオマスの表面上で、糖化酵素を産生する麹菌を培養することにより、当該バイオマスを糖化処理することができる。麹菌により糖化能の高い糖化酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用いることにより、この糖化処理効率を向上させることができる。

一方で、麹菌等の微生物へ外来遺伝子を導入して形質転換する際には、目的の外来遺伝子が導入された微生物のみを選択的に選抜するために、宿主として、ｐｙｒＧ（オロチジンリン酸脱炭酸酵素）遺伝子やｓＣ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子等を欠損させた栄養要求性株を使用する方法が一般的に用いられている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。例えば、ｐｙｒＧ遺伝子欠損によりウリジン要求性となった株を宿主とし、目的の遺伝子とｐｙｒＧ遺伝子を組み合わせて導入した後にウリジン不含培地で培養すると、形質転換株のみが増殖するため、効率的に遺伝子組み換え菌を選抜することができる。

Nemoto，et.al.，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，2012，vol.76(8)，p.1477〜1483. Yamada，et.al.，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，1997，vol.61(8)，p.1367〜1369.

本発明は、草本類バイオマスを用いた固体培養に適しており、かつ遺伝子組換えの宿主として好適な麹菌変異株、当該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入した形質転換体、当該形質転換体を用いた糖化酵素の生産方法を提供することを目的とする。

本発明に係る麹菌変異株、形質転換体、及び糖化酵素の生産方法は、下記［１］〜［９］である。
［１］ アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株であることを特徴とする、麹菌変異株。
［２］ ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損しており、ウリジン要求性である、前記［１］の麹菌変異株。
［３］ アスペルギルス・オリゼＨ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７４９）である、前記［１］の麹菌変異株。
［４］ 前記［１］〜［３］のいずれかの麹菌変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
［５］ 前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［４］に記載の形質転換体。
［６］ 前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、前記［４］に記載の形質転換体。
［７］ ｐｙｒＧ遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、前記［４］〜［６］のいずれかの形質転換体。
［８］ 前記［４］〜［７］のいずれかの形質転換体を固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
［９］ 稲わら又はコーンストーバを用いて固体培養する、前記［８］の糖化酵素の生産方法。

本発明に係る麹菌変異株は、固体培養に適しており、かつ栄養要求性株であるため、外来遺伝子を導入する遺伝子組換えの宿主として好適である。このため、当該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体は、固体培養により効率よく糖化酵素を生産することができる。

参考例１において、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）に属する各株の酵素生産収率の測定結果を示した図である。 実施例１において、アスペルギルス・オリゼＨＯ１株を１２０時間培養した後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真図である。 実施例１において、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株を１２０時間培養した後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真図である。 実施例２において、アスペルギルス・オリゼＨＯ１株に各酵素遺伝子を導入した形質転換体から調製された酵素サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。

＜麹菌変異株＞
本発明に係る麹菌変異株は、アスペルギルス・オリゼＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手可能である。）（以下、「ＡＯＫ２７Ｌ株」と略すことがある。）の栄養素の合成等に関する遺伝子の機能を欠損させることにより、栄養要求性を獲得した変異株であることを特徴とする。後記参考例１に示すように、ＡＯＫ２７Ｌ株は、固体培養した際の酵素生産効率が、他のアスペルギルス・オリゼよりも優れている。つまり、本発明に係る麹菌変異株は、元々固体培養による酵素生産効率の高い株に栄養要求性を付与した株である。

また、本発明に係る麹菌変異株は、栄養要求性を備える。このため、本発明に係る麹菌変異株を遺伝子組み換えの宿主として用いることにより、効率的に遺伝子組み換え体を取得することができる。本発明に係る麹菌変異株が備える栄養要求性としては、ウリジン要求性が好ましい。

ＡＯＫ２７Ｌ株に栄養要求性を付与するためには、栄養素の合成等に関する遺伝子の全長又は一部を欠損させる。例えば、ＡＯＫ２７Ｌ株にウリジン要求性を付与するために、ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部を欠損させる。その他、ｓＣ遺伝子やｎｉａＤ遺伝子の全長又は一部を欠損させてもよい。ｐｙｒＧ遺伝子等の全長又は一部を欠損する方法は、特に限定されるものではなく、プロトプラスト−ＰＥＧ法、自然変異法等のように微生物の遺伝子組み換えにおいて公知の技術の中から適宜選択して用いることができる。

本発明に係る麹菌変異株は、要求される栄養素を添加させた培地（ウリジン要求性の場合には、ウリジンを添加させた培地）で培養する以外は、ＡＯＫ２７Ｌ株と同様の培地や培養条件により培養することができる。

＜形質転換体＞
本発明に係る麹菌変異株に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換体は、当該糖化酵素を非常に効率よく産生することができる。当該形質転換体の作製時に、当該糖化酵素遺伝子と共に、栄養要求性を付与するためにＡＯＫ２７Ｌ株から欠損させた遺伝子も導入することにより、栄養要求性の有無を指標として当該糖化酵素遺伝子導入株を効率よく取得することができる。

本発明に係る麹菌変異株がウリジン要求性の場合、本発明に係る形質転換体は、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする。ｐｙｒＧ遺伝子と糖化酵素遺伝子の両方を導入することにより、形質転換体はウリジン不含培地でも生育可能となる。このため、遺伝子導入後の麹菌をウリジン不含培地で培養することにより、形質転換体のみが選抜できる。

本発明に係る形質転換体としては、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子は、染色体外の染色体外遺伝子として保持されていてもよいが、糖化酵素の発現安定性の点から、染色体中に組み込まれているものがより好ましい。

例えば、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとを組み込んだ発現ベクターを、前記麹菌変異株に導入することにより、形質転換体が得られる。なお、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットを組み込んだ発現ベクターと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとを組み込んだ発現ベクターの両方を前記麹菌変異株に導入してもよいが、ウリジン要求性による選抜精度の点から、両遺伝子の発現カセットは１の発現ベクターに乗せて形質転換するほうが好ましい。

ここで、発現カセットとは、構造遺伝子を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、構造遺伝子と宿主細胞内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。また、ｐｙｒＧ遺伝子を発現させるための発現カセットと、糖化酵素遺伝子を発現させるための発現カセットとは、それぞれ別個の発現カセットであってもよく、１の発現カセット内に、ｐｙｒＧ遺伝子と糖化酵素遺伝子の両方を含んでいてもよい。

また、発現カセットを組み込む発現ベクターとしては、アスペルギルス・オリゼをはじめとする麹菌に対する形質転換に使用可能な公知のベクターの中から適宜選択して、必要に応じて適宜改変したものを用いることができる。

発現ベクターを本発明に係る麹菌変異株へ導入する形質転換方法は特に限定されるものではなく、アスペルギルス・オリゼをはじめとする麹菌に対する遺伝子導入を行う際に使用される各種方法により行うことができる。当該形質転換方法としては、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、ＰＥＧ−カルシウム法（Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99〜104（1989））、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法等が挙げられる。形質転換後に、ウリジン不含培地で培養することにより、発現カセットが導入された形質転換体のみを生育させて選抜する。

本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、一般的に植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスの糖化処理に使用される糖化酵素であることが好ましい。当該糖化酵素としては、例えば、グルコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）、グルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３１）等が挙げられる。本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせて導入させてもよい。

本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、糖化力の強い糖化酵素をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種、又は２種以上を組み合わせて導入させることが好ましい。

本発明に係る麹菌変異株に導入する糖化酵素遺伝子としては、耐熱性の高い糖化酵素であることも好ましい。セルロース系バイオマスに対する糖化処理は、比較的高温で行うことにより、糖化効率をより高められるためである。

＜糖化酵素の生産方法＞
本発明に係る糖化酵素の生産方法は、本発明に係る形質転換体を、草本類バイオマスを用いて固体培養することを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、元々固体培養において酵素生産収率の高いＡＯＫ２７Ｌ株を親株とするため、他のアスペルギルス・オリゼを親株として製造された形質転換体よりも、固体培養により糖化酵素を高収率で生産できる。

当該方法において基質として用いられる固体は、草本類バイオマスが好ましく、稲わら又はコーンストーバがより好ましい。

なお、本発明に係る形質転換体により生産された糖化酵素は、当該形質転換体を直接基質に接触させて糖化反応に用いてもよく、当該形質転換体から粗精製又は精製した糖化酵素として使用してもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［参考例１］
アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・アワモリの各株（ＲＩＢ４０株、ＲＩＢ１２８株、ＡＯＫ２０株、ＡＯＫ２Ｐ株、ＡＯＫ２７Ｌ株、ＡＯＫ６５株、ＡＯＫ１３９株、ＡＯＫ２１０株、ＡＯＫ２４１株、ＡＯＫ１５９７株、ＡＯＫ１５０５株、ＡＯＫ１５０６株、ＡＯＫ１５０８株、ＡＯＫ１５０９株、及びＡＯＫ１５１０株）（いずれも秋田今野商店より入手。）について、菌体外に分泌した全酵素量に基づいて酵素の生産収率を算出して比較した。ここで、「酵素の生産収率」とは、投入した炭素源当たりの生産酵素量であり、下記式により算出した。
式：［酵素の生産収率］＝［分泌した全酵素量］÷［投入したデキストリン量］

具体的には、まず、稲藁を目開き３ｍｍのメッシュを通過する大きさに粉砕し、乾燥質量に対して２５質量％の濃度のアンモニア水を１：１の質量比となるように混合した。得られた混合物を、常温（約２０℃）で１２０時間保持した後、減圧下で６０〜８０℃の温度に加熱することによりアンモニアを気化させて分離することにより、アンモニア処理イナワラを作製した。
これとは別に、各麹菌株を、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地（３質量／容量％ デキストリン、０．１質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．２質量／容量％ 塩化カリウム、０．０５質量／容量％ 硫酸マグネシウム、０．００１質量／容量％ 硫酸鉄、０．３質量／容量％ 硝酸ナトリウム）培地にて１週間培養し、胞子懸濁液を作製した。

アンモニア処理イナワラ（含水率：約１０％）１ｇに対してデキストリン（和光純薬工業社製）の１０％溶液を１ｍＬ加え、さらに２Ｍ 塩酸（和光純薬工業社製）を０．０８５ｍＬ加えてｐＨ６に調整することにより、ベースとなる基質サンプルを作製した。ｐＨは、基質サンプル１ｇに対して５ｍＬの超純水を加えて懸濁した溶液のｐＨを測定した。
次に、基質サンプル５ｇを５０ｍＬ容プラスチックチューブ（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製）に測り取り、１２１℃、１５分間の条件でオートクレーブ処理した。オートクレーブ後の基質サンプルに、１×１０^６個の胞子を植菌し、撹拌した後に滅菌シャーレ（旭硝子社製）に移し、３０℃、９５％ＲＨで４０時間培養した。また同時に、胞子を植菌しないサンプル（ネガティブコントロール）も同様に実施した。
培養後の基質全量を５０ｍＬ容プラスチックチューブに回収し、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）の０．５％溶液１５ｍＬを加えて撹拌し、４℃にて２時間静置した。静置後、４℃、１０，０００×ｇで１０分遠心し、上清を滅菌フィルター（メルク社製）により処理することにより、酵素液を取得した。
取得した酵素液１０μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られたバンドの強度より分泌された全酵素量を算出した。ネガティブコントロールをＨＰＬＣにより分析し、投入したデキストリン量を算出した。得られた全分泌酵素量と投入したデキストリン量から、前記式に基づいて酵素の生産収率を算出した。

各株の酵素の生産収率を図１に示す。この結果、ＡＯＫ２７Ｌ株は、スクリーニングに用いたアスペルギルス・オリゼの中で最も酵素生産能力が高く、一般的によく使用されている麹菌アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株と比べて約２倍も酵素生産能力が高かった。

［実施例１］
ＡＯＫ２７Ｌ株に対し、ｐｙｒＧ遺伝子をプロトプラスト−ＰＥＧ法による遺伝子組み換えにより欠損させ、ウリジン要求性を持つ固体培養で酵素生産性の高い麹菌アスペルギルス・オリゼＨＯ１株（以下、「ＨＯ１株」と略すことがある。）を得た。

具体的には、まず、ＡＯＫ２７Ｌ株（株式会社秋田今野商店より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いてｐｙｒＧ遺伝子の上流配列（配列番号３）を、プライマー３（配列番号４）及びプライマー４（配列番号５）を用いてｐｙｒＧ遺伝子の下流配列（配列番号６）を、それぞれＰＣＲにて増幅した後精製することにより、ｐｙｒＧ遺伝子の上流配列遺伝子断片と下流配列遺伝子断片を取得した。ＰＣＲは、市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ、東洋紡績社製）を用い、精製は市販の精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
これとは別に、プラスミドｐＲＩ９１０（タカラバイオ社製）を制限酵素Ｓｍａ Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
こうして得られた３つの遺伝子断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、プラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｙｒＧを取得した。
得られたプラスミドｐＲＩ−ＡｏΔｐｙｒＧを鋳型として、プライマー１及びプライマー４とＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２、東洋紡績社製）とを用いてＰＣＲ増幅し、前記精製キットを用いて精製し、麹菌形質転換用の遺伝子断片（ＡｏΔｐｙｒＧ断片）を取得した。

ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、ＡｏΔｐｙｒＧ断片を用い、ＡＯＫ２７Ｌ株を形質転換した。ＣＤ培地に、終濃度１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸一水和物（和光純薬工業社製）と終濃度２０ｍＭ ウリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加えたプレート培地（ウリジン含有ＣＤプレート培地）を作製し、形質転換処理物から当該プレート培地で生育できる株を選択し、ｐｙｒＧ遺伝子欠損株であるＨＯ１株を得た。図２及び３に、１２０時間培養後のウリジン含有ＣＤプレート培地の写真を示す。ウリジン含有ＣＤプレート培地上で培養したところ、このＨＯ１株（図２）は、親株であるＡＯＫ２７Ｌ株（図３）と同様に良好に増殖した。

なお、ＨＯ１株は、新たに作製された新株であり、固体培養に適しており、かつ効率的に遺伝子組換え可能であるという優れた特性を有する。そこで、出願人は、ＨＯ１株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に新規微生物として寄託した（寄託日：平成２５年１１月１２日）。受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０１７４９である。

［実施例２］
実施例１で製造したＨＯ１株に、アクレモニウム・セルロリティカスのセロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ１）遺伝子及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）遺伝子、サーモアスカス属菌のエンドキシラナーゼ（ＥＸ）遺伝子をそれぞれ導入し、各酵素を生産するＨＯ１株の形質転換体を構築した。

ＨＯ１株に、アクレモニウム・セルロリィティカス由来のＣＢＨ１遺伝子とアスペルギルス・オリゼ由来のｐｙｒＧ遺伝子を導入した形質転換体（ＣＢＨ１生産株）は、以下のようにして製造した。
まず、アクレモニウム・セルロリィティカスＨ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー２１（配列番号７）及びプライマー２２（配列番号８）を用いてセロビオハイドラーゼ（ｃｂｈ１）遺伝子（配列番号９）を、実施例１で製造したＨＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー２３（配列番号１０）及びプライマー２４（配列番号１１）を用いてｅｎｏＡプロモーター遺伝子（配列番号１２）を、同じくＨＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー２５（配列番号１３）及びプライマー２６（配列番号１４）を用いてｐｙｒＧ遺伝子（配列番号１５）を、それぞれＰＣＲにて増幅した後精製することにより、各遺伝子断片を取得した。ＰＣＲは、市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ、東洋紡績社製）を用い、精製は市販の精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
これとは別に、プラスミドｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）を制限酵素Ｓｍａ Ｉ（タカラバイオ社製）により３０℃で処理し、前記精製キットを用いて精製し、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。
こうして得られた４つの遺伝子断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）に形質転換し、プラスミドｐＰＰＤ１−ＣＢＨ１を取得した。
得られたプラスミドｐＰＰＤ１−ＣＢＨ１を鋳型として、プライマー２３及びプライマー２６とＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２、東洋紡績社製）とを用いてＰＣＲ増幅し、前記精製キットを用いて精製し、麹菌形質転換用の遺伝子断片（ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片）を取得した。

ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、ｐｙｒＧ−ＣＢＨ１断片を用い、ＨＯ１株を形質転換した。実施例１と同様に、ＣＤ培地に終濃度１ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸一水和物と終濃度２０ｍＭ ウリジンを加えた培地を作製し、形質転換処理物から当該培地で生育できる株を選択し、ＣＢＨ１生産株を得た。

得られたＣＢＨ１生産株を、ＣＤプレート培地にて１週間培養して胞子を形成させ、０．０１％ ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ ２０（和光純薬工業社製）を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。
次いで、５００ｍＬ容三角フラスコにＰＤ液体培地（２質量／容量％ デキストリン、１質量／容量％ ポリペプトン、０．１質量／容量％ カザミノ酸、０．５質量／容量％ リン酸２水素カリウム、０．０５質量／容量％ 硫酸マグネシウム、０．１質量／容量％ 硝酸ナトリウム）１００ｍＬを取り、これに前記胞子を最終胞子濃度１×１０^４／ｍＬとなるように植菌した。次に、３０℃で３日間の液体培養を行い、目的酵素であるＣＢＨ１が培地中に分泌発現されたＣＢＨ１生産株の培養液を得た。

ＨＯ１株に、アクレモニウム・セルロリィティカス由来のＢＧＬ遺伝子とアスペルギルス・オリゼ由来のｐｙｒＧ遺伝子を導入した形質転換体（ＢＧＬ生産株）は、プライマー２１及びプライマー２２を用いて得られたｃｂｈ１遺伝子断片に代えて、化学合成したアクレモニウム・セルロリィティカス由来のＢＧＬ遺伝子のＤＮＡ断片（タカラ株式会社により全合成した。）を鋳型とし、プライマー２７（配列番号１６）及びプライマー２８（配列番号１７）を用いたＰＣＲにより得られたＢＧＬ遺伝子の遺伝子断片（配列番号１８）を用いた以外は、ＣＢＨ１生産株と同様に製造した。

ＨＯ１株に、サーモアスカス属菌由来のＥＸ遺伝子とアスペルギルス・オリゼ由来のｐｙｒＧ遺伝子を導入した形質転換体（ＥＸ生産株）は、プライマー２１及びプライマー２２を用いて得られたｃｂｈ１遺伝子断片に代えて、化学合成したサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来のＥＸ遺伝子のＤＮＡ断片（タカラ株式会社により全合成した。）を鋳型とし、プライマー２９（配列番号１９）及びプライマー３０（配列番号２０）を用いたＰＣＲにより得られたＥＸ遺伝子（配列番号２１）の遺伝子断片を用いた以外は、ＣＢＨ１生産株と同様に製造した。

得られたＢＧＬ生産株及びＥＸ生産株を、ＣＢＨ１生産株と同様に培養することにより、目的酵素であるＢＧＬが培地中に分泌発現されたＢＧＬ生産株の培養液と、目的酵素であるＥＸが培地中に分泌発現されたＥＸ生産株の培養液とを、それぞれ得た。

ＣＢＨ１生産株、ＢＧＬ生産株、及びＥＸ生産株の培養液の上清（酵素サンプル）中の各酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。タンパク質濃度の基準とするために、１、２、及び５μｇのＢＳＡを同時に泳動した。酵素サンプル（１０μＬ）及びＢＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を図４に示す。この結果、ＣＢＨ１生産株の培養上清には分子量約７５ｋＤａのＣＢＨ１が含まれており、ＢＧＬ生産株の培養上清には分子量約１１０ｋＤａのＢＧＬが含まれており、ＥＸ生産株の培養上清には分子量約３０ｋＤａのＥＸが含まれていることが確認できた。

本発明に係る麹菌変異株は、固体培養に適しており、かつ効率的に遺伝子組換え可能である。また、当該麹菌変異株に糖化酵素遺伝子を導入して得られた形質転換体は、草本類バイオマスを用いた固体培養において当該糖化酵素の生産効率に優れている。このため、本発明は、例えば、セルロース系バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７４９

Claims (9)

1. アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＯＫ２７Ｌ株の栄養要求性変異株であることを特徴とする、麹菌変異株。
2. ｐｙｒＧ遺伝子の全長又は一部が欠損しており、ウリジン要求性である、請求項１に記載の麹菌変異株。
3. アスペルギルス・オリゼＨ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７４９）である、請求項１に記載の麹菌変異株。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の麹菌変異株に、ｐｙｒＧ遺伝子及び糖化酵素遺伝子が導入されたことを特徴とする、形質転換体。
5. 前記糖化酵素遺伝子が、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、β−グルコシダーゼ遺伝子、エンドキシラナーゼ遺伝子、アラビノフラノシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子、及びエンドグルカナーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項４に記載の形質転換体。
6. 前記糖化酵素遺伝子が、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属菌由来のエンドキシラナーゼ遺伝子、アクレモニウム・セルロリティカス由来のアラビノフラノシダーゼ遺伝子、及びアクレモニウム・セルロリティカス由来のグルクロニダーゼ遺伝子からなる群より選択される１種以上である、請求項４に記載の形質転換体。
7. ｐｙｒＧ遺伝子及び前記糖化酵素遺伝子が、染色体中に組み込まれている、請求項４〜６のいずれか一項に記載の形質転換体。
8. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の形質転換体を固体培養することを特徴とする、糖化酵素の生産方法。
9. 稲わら又はコーンストーバを用いて固体培養する、請求項８に記載の糖化酵素の生産方法。