JPH0823971A - 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途 - Google Patents
新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途Info
- Publication number
- JPH0823971A JPH0823971A JP7135833A JP13583395A JPH0823971A JP H0823971 A JPH0823971 A JP H0823971A JP 7135833 A JP7135833 A JP 7135833A JP 13583395 A JP13583395 A JP 13583395A JP H0823971 A JPH0823971 A JP H0823971A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ascorbic acid
- asod
- gene
- ascorbate oxidase
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】Ｌ−アスコルビン酸の酸化反応を触媒する新し
い酵素、該酵素をコードする遺伝子、当該酵素の製造法
及びそれを含有してなる検査用試薬組成物、食品用添加
物、食品或いは臨床分野における試薬組成物を提供す
る。 【構成】Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素との反応によ
ってＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生成す
る反応を触媒し、尚かつ極めて優れた安定性を有する新
規なアスコルビン酸酸化酵素であり、ユウペニシリウム
（Eupenicillium）属に属する菌株を培養して当該酵素
を生産せしめ、これを採取することができる。該酵素
は、植物及び微生物由来のＡＳＯに比べ極めて優れた保
存安定性を有していることが特徴であり、液状測定試薬
への配合に非常に有効である。
い酵素、該酵素をコードする遺伝子、当該酵素の製造法
及びそれを含有してなる検査用試薬組成物、食品用添加
物、食品或いは臨床分野における試薬組成物を提供す
る。 【構成】Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素との反応によ
ってＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生成す
る反応を触媒し、尚かつ極めて優れた安定性を有する新
規なアスコルビン酸酸化酵素であり、ユウペニシリウム
（Eupenicillium）属に属する菌株を培養して当該酵素
を生産せしめ、これを採取することができる。該酵素
は、植物及び微生物由来のＡＳＯに比べ極めて優れた保
存安定性を有していることが特徴であり、液状測定試薬
への配合に非常に有効である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アスコルビン酸の
酸化反応を触媒する新しい酵素、より詳細には、Ｌ−ア
スコルビン酸と分子状酸素との反応によってＬ−デヒド
ロアスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒
し、尚かつ極めて優れた安定性を有する新規なＬ−アス
コルビン酸酸化酵素（以下、ＡＳＯＤという。）を提供
する。更に本発明は、微生物を用いた当該ＡＳＯＤの製
造法、該ＡＳＯＤをコードする遺伝子、当該遺伝子を含
んでなる形質転換体、これを用いたＡＳＯＤの製造法並
びに該ＡＳＯＤを含有してなる検査用試薬組成物、食品
用添加物、食品或いは臨床検査分野における試薬組成物
に関する。
酸化反応を触媒する新しい酵素、より詳細には、Ｌ−ア
スコルビン酸と分子状酸素との反応によってＬ−デヒド
ロアスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応を触媒
し、尚かつ極めて優れた安定性を有する新規なＬ−アス
コルビン酸酸化酵素（以下、ＡＳＯＤという。）を提供
する。更に本発明は、微生物を用いた当該ＡＳＯＤの製
造法、該ＡＳＯＤをコードする遺伝子、当該遺伝子を含
んでなる形質転換体、これを用いたＡＳＯＤの製造法並
びに該ＡＳＯＤを含有してなる検査用試薬組成物、食品
用添加物、食品或いは臨床検査分野における試薬組成物
に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスコルビン酸の酸化反応を触媒す
る酵素としては、アスコルビン酸に作用し、Ｌ−デヒド
ロアスコルビン酸と水を生ずる反応を触媒するアスコル
ビン酸酸化酵素（以下、ＡＳＯという。）やラッカーゼ
が知られており、国際生化学連合（I.U.B）の分類によ
れば、それぞれEC 1.10.3.3及びEC 1.10.3.2に分類され
る。
る酵素としては、アスコルビン酸に作用し、Ｌ−デヒド
ロアスコルビン酸と水を生ずる反応を触媒するアスコル
ビン酸酸化酵素（以下、ＡＳＯという。）やラッカーゼ
が知られており、国際生化学連合（I.U.B）の分類によ
れば、それぞれEC 1.10.3.3及びEC 1.10.3.2に分類され
る。
【０００３】上記のＡＳＯは、従来より各種植物に分布
することが知られており、カボチャ〔M. H. Lee and C.
R. Dawson（1973）J. Biol. Chem., 248, 6596頁〕及
びキュウリ〔T. Nakamura, N. Makino and Y. Ogura（1
968）J. Biochem., 64, 189頁〕などから単離されてい
る。
することが知られており、カボチャ〔M. H. Lee and C.
R. Dawson（1973）J. Biol. Chem., 248, 6596頁〕及
びキュウリ〔T. Nakamura, N. Makino and Y. Ogura（1
968）J. Biochem., 64, 189頁〕などから単離されてい
る。
【０００４】一方、微生物由来のＡＳＯとしてミロセシ
ウム ベルカリア（Myrothecium verrucaria）の菌糸
〔G. A. White and R. M. Krupka（1965）Arch. Biochi
m. Biphys., 110, 448頁 〕や胞子〔舟木ら（1987）日
本栄養食糧学会誌, 40, 47頁〕、アエロバクター アエ
ロゲネス（Aerobacter aerogenes）〔W. A. Volk and
J. L. Larssen（1963）Biochim. Biophys. Acta., 67,
576頁〕或いはアクレモニウム エスピー（Acremonium
sp.）HI-25〔S. Murao et al.（1992）Biosci. Biotech
nol. Biochem., 56, 847頁〕由来の報告がある。
ウム ベルカリア（Myrothecium verrucaria）の菌糸
〔G. A. White and R. M. Krupka（1965）Arch. Biochi
m. Biphys., 110, 448頁 〕や胞子〔舟木ら（1987）日
本栄養食糧学会誌, 40, 47頁〕、アエロバクター アエ
ロゲネス（Aerobacter aerogenes）〔W. A. Volk and
J. L. Larssen（1963）Biochim. Biophys. Acta., 67,
576頁〕或いはアクレモニウム エスピー（Acremonium
sp.）HI-25〔S. Murao et al.（1992）Biosci. Biotech
nol. Biochem., 56, 847頁〕由来の報告がある。
【０００５】これらのＡＳＯは食品分野や臨床検査分野
に広く使用されている。食品分野としては、例えばアス
コルビン酸と併用するなどして食品中の脱酸素等や水産
練り製品などの品質改良に使用される。
に広く使用されている。食品分野としては、例えばアス
コルビン酸と併用するなどして食品中の脱酸素等や水産
練り製品などの品質改良に使用される。
【０００６】また臨床検査分野としては、例えばパーオ
キシダーゼを利用した過酸化水素と色原体との共役呈色
反応を利用する分野において、その呈色反応を強力に妨
害するアスコルビン酸の影響回避のために用いられる。
通常の血清アスコルビン酸の濃度は１mg/dl以下で有り
余り問題とはならないが、例えば尿中アスコルビン酸濃
度は高い値となる。また、点滴補液などで大量のアスコ
ルビン酸を投与するときなどは血中濃度も上昇し、共存
するアスコルビン酸の影響は非常に大きい。
キシダーゼを利用した過酸化水素と色原体との共役呈色
反応を利用する分野において、その呈色反応を強力に妨
害するアスコルビン酸の影響回避のために用いられる。
通常の血清アスコルビン酸の濃度は１mg/dl以下で有り
余り問題とはならないが、例えば尿中アスコルビン酸濃
度は高い値となる。また、点滴補液などで大量のアスコ
ルビン酸を投与するときなどは血中濃度も上昇し、共存
するアスコルビン酸の影響は非常に大きい。
【０００７】アスコルビン酸の影響を除去するために
は、アルカリ処理、銅イオンや鉄イオンによる処
理、過ヨウ素酸による処理、ＡＳＯによる処理が行
われるが、通常はのＡＳＯを臨床検査用試薬に共存さ
せることによって解決している。
は、アルカリ処理、銅イオンや鉄イオンによる処
理、過ヨウ素酸による処理、ＡＳＯによる処理が行
われるが、通常はのＡＳＯを臨床検査用試薬に共存さ
せることによって解決している。
【０００８】更に、上記記載のＡＳＯ以外で、アスコル
ビン酸に作用する酵素として、Physarum polycephalum
（モジホコリカビ）から得られ、アスコルビン酸に作用
して過酸化水素を生成する作用を有する酵素も知られて
いる〔Plant physiology, 30, 58頁(1955)〕。しかしな
がら、本酵素については詳細な性質については検討され
ていない。
ビン酸に作用する酵素として、Physarum polycephalum
（モジホコリカビ）から得られ、アスコルビン酸に作用
して過酸化水素を生成する作用を有する酵素も知られて
いる〔Plant physiology, 30, 58頁(1955)〕。しかしな
がら、本酵素については詳細な性質については検討され
ていない。
【０００９】また、最近になって、トリコデルマ（Tric
hoderma）属又はモルティエレラ（Mortierella）属由来
で上記と同様の性質、即ちアスコルビン酸に作用して過
酸化水素を生成する作用を有するアスコルビン酸酸化酵
素も報告されている（特開平6-209770）。
hoderma）属又はモルティエレラ（Mortierella）属由来
で上記と同様の性質、即ちアスコルビン酸に作用して過
酸化水素を生成する作用を有するアスコルビン酸酸化酵
素も報告されている（特開平6-209770）。
【００１０】これらのアスコルビン酸に作用する酵素の
うちで、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と水を生じる反応
を触媒する上記の植物由来のＡＳＯ遺伝子はクローニン
グされている〔J. Ohkawa et. al.,Proc. Natl. Acid.
Sci. USA, 86, 1239(1989)〕。
うちで、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と水を生じる反応
を触媒する上記の植物由来のＡＳＯ遺伝子はクローニン
グされている〔J. Ohkawa et. al.,Proc. Natl. Acid.
Sci. USA, 86, 1239(1989)〕。
【００１１】しかし微生物由来のＡＳＯあるいはＬ−ア
スコルビン酸に作用し、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と
過酸化水素を生じる反応を触媒するＡＳＯＤの遺伝子に
関する報告はなされていない。
スコルビン酸に作用し、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と
過酸化水素を生じる反応を触媒するＡＳＯＤの遺伝子に
関する報告はなされていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】最近、臨床検査用測定
試薬の多くが、従来の凍結乾燥品から液状品へとかわり
つつある。液状品の品質補償期間は、10℃で１年間と言
われているが、液状の測定試薬に配合される各種酵素の
安定性の良否が、品質決定の第一要因であり、上記した
植物及び微生物由来のＡＳＯは、この液状測定試薬への
適用という点では、安定性に問題があった。
試薬の多くが、従来の凍結乾燥品から液状品へとかわり
つつある。液状品の品質補償期間は、10℃で１年間と言
われているが、液状の測定試薬に配合される各種酵素の
安定性の良否が、品質決定の第一要因であり、上記した
植物及び微生物由来のＡＳＯは、この液状測定試薬への
適用という点では、安定性に問題があった。
【００１３】本発明の目的は、安定性に優れた新規なア
スコルビン酸酸化酵素を提供することにある。また、当
該ＡＳＯＤの製造法及びそれを含有してなる臨床検査組
成物、食品添加物、食品或いは臨床分野における試薬組
成物を提供するものである。また、本発明のＡＳＯＤ
は、植物及び微生物由来のＡＳＯに比べ極めて優れた保
存安定性を有していることが特徴であり、液状測定試薬
への配合に非常に有効である。
スコルビン酸酸化酵素を提供することにある。また、当
該ＡＳＯＤの製造法及びそれを含有してなる臨床検査組
成物、食品添加物、食品或いは臨床分野における試薬組
成物を提供するものである。また、本発明のＡＳＯＤ
は、植物及び微生物由来のＡＳＯに比べ極めて優れた保
存安定性を有していることが特徴であり、液状測定試薬
への配合に非常に有効である。
【００１４】また、モジホコリカビ由来やトリコデルマ
属又はモルティエレラ属由来の、アスコルビン酸に作用
してＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素は、その溶液中
での安定性の点において満足できるものではなく、従来
の課題を解決するにはほど遠いものである。
属又はモルティエレラ属由来の、アスコルビン酸に作用
してＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素は、その溶液中
での安定性の点において満足できるものではなく、従来
の課題を解決するにはほど遠いものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規なア
スコルビン酸酸化酵素を得るために広く自然界にその給
源を求め、特に各種微生物起源の新規なアスコルビン酸
酸化酵素につき鋭意研究を重ねてきた。その過程で新た
に土壌から単離したユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属に属する菌株を培養することによって従来のＡＳ
Ｏとは異なり、アスコルビン酸に作用してＬ−デヒドロ
アスコルビン酸と過酸化水素を生ずる反応を触媒し、そ
の安定性が著しく良好な酵素を産生することを見い出す
と共に、この新規なＡＳＯＤを工業的に製造する方法を
確立し、ＡＳＯＤを単離し、精製し、その性質等の解明
に成功し、更に当該酵素を遺伝子工学的手法により大量
生産する方法をも確立した。
スコルビン酸酸化酵素を得るために広く自然界にその給
源を求め、特に各種微生物起源の新規なアスコルビン酸
酸化酵素につき鋭意研究を重ねてきた。その過程で新た
に土壌から単離したユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属に属する菌株を培養することによって従来のＡＳ
Ｏとは異なり、アスコルビン酸に作用してＬ−デヒドロ
アスコルビン酸と過酸化水素を生ずる反応を触媒し、そ
の安定性が著しく良好な酵素を産生することを見い出す
と共に、この新規なＡＳＯＤを工業的に製造する方法を
確立し、ＡＳＯＤを単離し、精製し、その性質等の解明
に成功し、更に当該酵素を遺伝子工学的手法により大量
生産する方法をも確立した。
【００１６】即ち、ユウペニシリウム属由来の染色体Ｄ
ＮＡよりＡＳＯＤをコードする遺伝子をクローニング
し、当該遺伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能をコ
ードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを得、当該プラ
スミドを有する形質転換体を創製し、当該形質転換体を
培養することによってＡＳＯＤを製造する方法を確立し
た。
ＮＡよりＡＳＯＤをコードする遺伝子をクローニング
し、当該遺伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能をコ
ードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを得、当該プラ
スミドを有する形質転換体を創製し、当該形質転換体を
培養することによってＡＳＯＤを製造する方法を確立し
た。
【００１７】更にまた、当該酵素はその安定性において
非常に優れた性質を持っている為、当該ＡＳＯＤの液状
試薬への利用等の応用面について鋭意検討し、本発明を
完成した。
非常に優れた性質を持っている為、当該ＡＳＯＤの液状
試薬への利用等の応用面について鋭意検討し、本発明を
完成した。
【００１８】本発明のＡＳＯＤの触媒するアスコルビン
酸の酸化反応は式１で示され、これまで示されている従
来の植物由来のＡＳＯの反応とは区別され、モジホコリ
カビ由来やトリコデルマ属又はモルティエレラ属由来の
酵素と同じ反応を触媒する。
酸の酸化反応は式１で示され、これまで示されている従
来の植物由来のＡＳＯの反応とは区別され、モジホコリ
カビ由来やトリコデルマ属又はモルティエレラ属由来の
酵素と同じ反応を触媒する。
【００１９】
【式１】
【００２０】本発明の第１は、Ｌ−アスコルビン酸を基
質とし、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生
ずる反応を触媒し、尚かつ安定性に優れた新規なＡＳＯ
Ｄを提供する。
質とし、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生
ずる反応を触媒し、尚かつ安定性に優れた新規なＡＳＯ
Ｄを提供する。
【００２１】本発明の第２は、上記のＡＳＯＤの製造法
を提供する。本発明の第３は、上記ＡＳＯＤをコードす
る遺伝子を提供する。本発明の第４は、上記ＡＳＯＤを
コードする遺伝子及び当該遺伝子の発現を促進するＤＮ
Ａ配列を含んでなる組み換え体ＤＮＡを有する形質転換
体を提供する。本発明の第５は、上記ＡＳＯＤをコード
する遺伝子及び当該遺伝子の発現を促進するＤＮＡ配列
を含んでなる組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体を培
養し、培養物よりＡＳＯＤを採取することを特徴とする
ＡＳＯＤの製造法を提供する。本発明の第６は上記のＡ
ＳＯＤを含有してなる試薬組成物を提供する。本発明の
第７は上記のＡＳＯＤを含有してなる食品添加物を提供
する。本発明の第８は上記のＡＳＯＤを含有してなるＬ
−アスコルビン酸測定用試薬組成物を提供する。
を提供する。本発明の第３は、上記ＡＳＯＤをコードす
る遺伝子を提供する。本発明の第４は、上記ＡＳＯＤを
コードする遺伝子及び当該遺伝子の発現を促進するＤＮ
Ａ配列を含んでなる組み換え体ＤＮＡを有する形質転換
体を提供する。本発明の第５は、上記ＡＳＯＤをコード
する遺伝子及び当該遺伝子の発現を促進するＤＮＡ配列
を含んでなる組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体を培
養し、培養物よりＡＳＯＤを採取することを特徴とする
ＡＳＯＤの製造法を提供する。本発明の第６は上記のＡ
ＳＯＤを含有してなる試薬組成物を提供する。本発明の
第７は上記のＡＳＯＤを含有してなる食品添加物を提供
する。本発明の第８は上記のＡＳＯＤを含有してなるＬ
−アスコルビン酸測定用試薬組成物を提供する。
【００２２】即ち、本発明は、Ｌ−アスコルビン酸１分
子と分子状酸素１分子からＬ−デヒドロアスコルビン酸
１分子と過酸化水素１分子を生成する反応を触媒し、Ｌ
−アスコルビン酸に作用し、Ｄ−アラボアスコルビン酸
には実質的には作用せず、至適pHが約６付近にあり、37
℃、16時間の処理で約pH３〜８の範囲で安定であり、至
適温度が約37℃付近にあり、pH6.8、16時間の処理で約5
0℃迄安定であり、37℃、１ヶ月における溶液の残存活
性が少なくとも50％であり、アジ化ナトリウムで実質的
に阻害されない性質を有する新規なアスコルビン酸酸化
酵素。
子と分子状酸素１分子からＬ−デヒドロアスコルビン酸
１分子と過酸化水素１分子を生成する反応を触媒し、Ｌ
−アスコルビン酸に作用し、Ｄ−アラボアスコルビン酸
には実質的には作用せず、至適pHが約６付近にあり、37
℃、16時間の処理で約pH３〜８の範囲で安定であり、至
適温度が約37℃付近にあり、pH6.8、16時間の処理で約5
0℃迄安定であり、37℃、１ヶ月における溶液の残存活
性が少なくとも50％であり、アジ化ナトリウムで実質的
に阻害されない性質を有する新規なアスコルビン酸酸化
酵素。
【００２３】ユウペニシリウム（Eupenicillium）属に
属する菌株より得ることができ、Ｌ−アスコルビン酸の
酸化反応を触媒する新規なアスコルビン酸酸化酵素。
属する菌株より得ることができ、Ｌ−アスコルビン酸の
酸化反応を触媒する新規なアスコルビン酸酸化酵素。
【００２４】ユウペニシリウム（Eupenicillium）属に
属する菌株より得ることができ、Ｌ−アスコルビン酸に
作用しＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生成
する反応を触媒し、Ｄ−アラボアスコルビン酸には実質
的には作用せず、至適pHが約６付近にあり、37℃、16時
間の処理で約pH３〜８の範囲で安定であり、至適温度が
約37℃付近にあり、pH6.8、16時間の処理で約50℃迄安
定であり、37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少な
くとも50％であり、アジ化ナトリウムで実質的に阻害さ
れない性質を有する新規なアスコルビン酸酸化酵素。
属する菌株より得ることができ、Ｌ−アスコルビン酸に
作用しＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生成
する反応を触媒し、Ｄ−アラボアスコルビン酸には実質
的には作用せず、至適pHが約６付近にあり、37℃、16時
間の処理で約pH３〜８の範囲で安定であり、至適温度が
約37℃付近にあり、pH6.8、16時間の処理で約50℃迄安
定であり、37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少な
くとも50％であり、アジ化ナトリウムで実質的に阻害さ
れない性質を有する新規なアスコルビン酸酸化酵素。
【００２５】ユウペニシリウム（Eupenicillium）属に
属する菌株を培養し、アスコルビン酸酸化酵素を生産せ
しめ、これを採取することを特徴とするアスコルビン酸
酸化酵素の製造法。
属する菌株を培養し、アスコルビン酸酸化酵素を生産せ
しめ、これを採取することを特徴とするアスコルビン酸
酸化酵素の製造法。
【００２６】図面の図６の制限酵素地図において矢印で
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：１
で示されるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子。
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：１
で示されるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列を
有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子。
【００２７】図面の図６の制限酵素地図において矢印で
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むアスコ
ルビン酸酸化酵素遺伝子。
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むアスコ
ルビン酸酸化酵素遺伝子。
【００２８】図面の図６の制限酵素地図において矢印で
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、そのＮ末端ア
ミノ酸配列が配列番号：１で示されるアスコルビン酸酸
化酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進
する機能を有するＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡ
を有する形質転換体を培養し、当該培養物よりアスコル
ビン酸酸化酵素を採取することを特徴とするアスコルビ
ン酸酸化酵素の製造法。
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、そのＮ末端ア
ミノ酸配列が配列番号：１で示されるアスコルビン酸酸
化酵素をコードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進
する機能を有するＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡ
を有する形質転換体を培養し、当該培養物よりアスコル
ビン酸酸化酵素を採取することを特徴とするアスコルビ
ン酸酸化酵素の製造法。
【００２９】図面の図６の制限酵素地図において矢印で
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４で示
されるアミノ酸配列を含むアスコルビン酸酸化酵素をコ
ードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進する機能を
有するＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形
質転換体を培養し、当該培養物よりアスコルビン酸酸化
酵素を採取することを特徴とするアスコルビン酸酸化酵
素の製造法。
示した部分に含まれるＤＮＡ断片であり、配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４で示
されるアミノ酸配列を含むアスコルビン酸酸化酵素をコ
ードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進する機能を
有するＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形
質転換体を培養し、当該培養物よりアスコルビン酸酸化
酵素を採取することを特徴とするアスコルビン酸酸化酵
素の製造法。
【００３０】図面の図７の制限酵素地図に示されるｃＤ
ＮＡ断片で、配列番号：１で示されるＮ末端アミノ酸を
コードする塩基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺
伝子。
ＮＡ断片で、配列番号：１で示されるＮ末端アミノ酸を
コードする塩基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺
伝子。
【００３１】図面の図７の制限酵素地図に示されるｃＤ
ＮＡ断片で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３及び配列番号：４で示されるアミノ酸をコードする塩
基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子。
ＮＡ断片で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３及び配列番号：４で示されるアミノ酸をコードする塩
基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子。
【００３２】図面の図７の制限酵素地図に示されるｃＤ
ＮＡ断片で、配列番号：１で示されるＮ末端アミノ酸を
コードする塩基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺
伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ
配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形質転換体を培
養し、当該培養物よりアスコルビン酸酸化酵素を採取す
ることを特徴とするアスコルビン酸酸化酵素の製造法。
ＮＡ断片で、配列番号：１で示されるＮ末端アミノ酸を
コードする塩基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺
伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ
配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形質転換体を培
養し、当該培養物よりアスコルビン酸酸化酵素を採取す
ることを特徴とするアスコルビン酸酸化酵素の製造法。
【００３３】図面の図７の制限酵素地図に示されるｃＤ
ＮＡ断片で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３及び配列番号：４で示されるアミノ酸をコードする塩
基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子と当該遺
伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含んで
なる組換えＤＮＡを有する形質転換体を培養し、当該培
養物よりアスコルビン酸酸化酵素を採取することを特徴
とするアスコルビン酸酸化酵素の製造法。
ＮＡ断片で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３及び配列番号：４で示されるアミノ酸をコードする塩
基配列を有するアスコルビン酸酸化酵素遺伝子と当該遺
伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含んで
なる組換えＤＮＡを有する形質転換体を培養し、当該培
養物よりアスコルビン酸酸化酵素を採取することを特徴
とするアスコルビン酸酸化酵素の製造法。
【００３４】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を配合してなる
試薬組成物。
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を配合してなる
試薬組成物。
【００３５】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、ユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属由来のアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる試
薬組成物。
なくとも50％であり、ユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属由来のアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる試
薬組成物。
【００３６】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有して成る
食品用添加剤。
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有して成る
食品用添加剤。
【００３７】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、ユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属由来のアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる食
品用添加剤。
なくとも50％であり、ユウペニシリウム（Eupenicilliu
m）属由来のアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる食
品用添加剤。
【００３８】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる
Ｌ−アスコルビン酸測定用試薬組成物。
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸素
からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ずる
反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有してなる
Ｌ−アスコルビン酸測定用試薬組成物。
【００３９】本発明はこれらを提供するものである。次
いでこれらの発明について詳細に説明する。
いでこれらの発明について詳細に説明する。
【００４０】本発明者らは、新規なアスコルビン酸酸化
酵素を生産する微生物を得るため、広く自然界に給源を
求め土壌から分離した菌株が新規なアスコルビン酸酸化
酵素を生産することを見いだした。
酵素を生産する微生物を得るため、広く自然界に給源を
求め土壌から分離した菌株が新規なアスコルビン酸酸化
酵素を生産することを見いだした。
【００４１】本発明者らが分離した菌株について、その
菌学的性質を、K. B. Raper & C. Thomの"A manual of
the Penicillia"に基づいて同定した結果、本菌はユウ
ペニシリウム ブレフェルディアム（Eupenicillium br
efeldianum）と同定され、ユウペニシリウム ブレフェ
ルディアム APC-9315と命名した。
菌学的性質を、K. B. Raper & C. Thomの"A manual of
the Penicillia"に基づいて同定した結果、本菌はユウ
ペニシリウム ブレフェルディアム（Eupenicillium br
efeldianum）と同定され、ユウペニシリウム ブレフェ
ルディアム APC-9315と命名した。
【００４２】以下、本菌の菌学的性質を記載する。 生育 麦芽寒天上での生育は比較的速く、１〜２mm菌高の白色
羊毛状菌糸は粗い。やがて菌糸は肉眼的に薄れ、基質表
面に密着して多量の子嚢果を形成する。集落は平坦で黄
色〜黄土色となる。集落裏面は淡褐色、Czapek寒天培地
での生育は遅く、集落は放射状に発展し、表面は白色菌
叢が密で、やがてフエルト状となる。集落の周辺は波状
で、茶褐色の子嚢が密集する。集落裏面は濃褐色で発育
根状菌糸が明確となり、40℃でさらにこれが顕著とな
る。MY40寒天培地では菌叢は重厚でジュウタン状、裏面
は濃褐色、オートミール寒天培地では粉状に多量の子嚢
果が形成し、集落の周辺は赤色を呈する。
羊毛状菌糸は粗い。やがて菌糸は肉眼的に薄れ、基質表
面に密着して多量の子嚢果を形成する。集落は平坦で黄
色〜黄土色となる。集落裏面は淡褐色、Czapek寒天培地
での生育は遅く、集落は放射状に発展し、表面は白色菌
叢が密で、やがてフエルト状となる。集落の周辺は波状
で、茶褐色の子嚢が密集する。集落裏面は濃褐色で発育
根状菌糸が明確となり、40℃でさらにこれが顕著とな
る。MY40寒天培地では菌叢は重厚でジュウタン状、裏面
は濃褐色、オートミール寒天培地では粉状に多量の子嚢
果が形成し、集落の周辺は赤色を呈する。
【００４３】形態 子嚢果 ：閉鎖型、表在性、肉色、球形〜楕円、直
径 80〜150(200)μm、殻壁、編み目様で堅い。 子嚢 ：直径６〜８μm、亜球〜卵型、８胞子、
消失性。 子嚢胞子 ：無色、球〜卵形、全面に短い刺状突起。 厚膜胞子 ：球形〜楕円形、直径４〜６μm。 分生子柄 ：10〜100 × ２〜３μm。 ペニシリ ：単輪生体だがその数はきわめて少ない。 フィアライド：８×３μm、殆ど１〜２本。 分生子 ：球形〜亜球形、２〜３μm、滑面、連鎖
はゆるく、もつれる。長さ50〜150μm。
径 80〜150(200)μm、殻壁、編み目様で堅い。 子嚢 ：直径６〜８μm、亜球〜卵型、８胞子、
消失性。 子嚢胞子 ：無色、球〜卵形、全面に短い刺状突起。 厚膜胞子 ：球形〜楕円形、直径４〜６μm。 分生子柄 ：10〜100 × ２〜３μm。 ペニシリ ：単輪生体だがその数はきわめて少ない。 フィアライド：８×３μm、殆ど１〜２本。 分生子 ：球形〜亜球形、２〜３μm、滑面、連鎖
はゆるく、もつれる。長さ50〜150μm。
【００４４】生理性状 カゼイン分解：＋ リトマスミルク（消化） 生育温度 ：14〜40℃（最適37℃） 生育pH ：2.5〜10.3（最適4.5〜6.5） 窒素の利用 ：ペプトン、尿素、燐酸二アンモン、硝酸
ナトリウム、クエン酸アンモンを良く利用する。硫酸ア
ンモン、塩化アンモンを利用する。 炭素の利用 ：グルコース、澱粉、サリシンをはじめ多
くの糖をよく利用する。マンニット、イヌリンはやや劣
る。
ナトリウム、クエン酸アンモンを良く利用する。硫酸ア
ンモン、塩化アンモンを利用する。 炭素の利用 ：グルコース、澱粉、サリシンをはじめ多
くの糖をよく利用する。マンニット、イヌリンはやや劣
る。
【００４５】尚、ユウペニシリウム ブレフェルディア
ム APC-9315は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所にFERM BP-5053として寄託されている。
ム APC-9315は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所にFERM BP-5053として寄託されている。
【００４６】本菌株以外のユウペニシリウム属に属する
菌株について、検討した結果、その他のユウペニシリウ
ムに属する菌株も本発明のＡＳＯＤを生産することを確
認した。その他のユウペニシリウム属に属する菌株とし
ては例えば、Eupenicilliumjavanicum IFO-31735、Eupe
nicillium alutaceum IFO-31728、Eupenicillium erube
scens IFO-31734等が挙げられる。
菌株について、検討した結果、その他のユウペニシリウ
ムに属する菌株も本発明のＡＳＯＤを生産することを確
認した。その他のユウペニシリウム属に属する菌株とし
ては例えば、Eupenicilliumjavanicum IFO-31735、Eupe
nicillium alutaceum IFO-31728、Eupenicillium erube
scens IFO-31734等が挙げられる。
【００４７】
【表１】
【００４８】特に、本発明者らが土壌から新たにスクリ
ーニングしたユウペニシリウム ブレフェルディアム A
PC-9315から著量の本発明のＡＳＯＤが生産される。
ーニングしたユウペニシリウム ブレフェルディアム A
PC-9315から著量の本発明のＡＳＯＤが生産される。
【００４９】ユウペニシリウム属に属する菌株を用いて
新規なＡＳＯＤを製造するための菌株の培養法として
は、液体培養、固体培養のいずれでも良いが、より好ま
しくは液体培養が利用できる。液体培養法としては例え
ば、以下のようにして行うことができる。
新規なＡＳＯＤを製造するための菌株の培養法として
は、液体培養、固体培養のいずれでも良いが、より好ま
しくは液体培養が利用できる。液体培養法としては例え
ば、以下のようにして行うことができる。
【００５０】使用できる培地としては、新規なＡＳＯＤ
を生産する微生物が生育可能な培地であれば、如何なる
ものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グ
リセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更
に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エ
キス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、
肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム
塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛
塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
を生産する微生物が生育可能な培地であれば、如何なる
ものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グ
リセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更
に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エ
キス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、
肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム
塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛
塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
【００５１】培地のpHは例えば約３〜９、好ましくは約
5.5〜6.5程度に調製し、培養温度は通常約10〜50℃、好
ましくは約25〜37℃程度で、１〜20日間、好ましくは３
〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培養
法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利
用できる。
5.5〜6.5程度に調製し、培養温度は通常約10〜50℃、好
ましくは約25〜37℃程度で、１〜20日間、好ましくは３
〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培養
法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利
用できる。
【００５２】また、固体培養法としては例えば、以下の
ように行うことができる。固体培養の培地としては、新
規なＡＳＯＤを生産する微生物が生育可能な培地であれ
ばいかなるものでも良い。例えば、小麦ふすま、米、大
豆、とうもろこし、稲わら、麦わら等を単独或いは２種
以上混合して使用することができる。また、カリウム
塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガ
ン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩類を添加することができ
る。
ように行うことができる。固体培養の培地としては、新
規なＡＳＯＤを生産する微生物が生育可能な培地であれ
ばいかなるものでも良い。例えば、小麦ふすま、米、大
豆、とうもろこし、稲わら、麦わら等を単独或いは２種
以上混合して使用することができる。また、カリウム
塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガ
ン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩類を添加することができ
る。
【００５３】培地の水分含量は例えば50〜300％、好ま
しくは80〜120％程度に調整し、培養温度は通常10〜50
℃、好ましくは25〜40℃で１〜30日間、好ましくは３〜
12日間程度培養する
しくは80〜120％程度に調整し、培養温度は通常10〜50
℃、好ましくは25〜40℃で１〜30日間、好ましくは３〜
12日間程度培養する
【００５４】得られた培養物より菌体を除去した培養ろ
液又は固体培養抽出液からＡＳＯＤを通常の手段で単離
し、本発明の新規なＡＳＯＤを得ことができる。
液又は固体培養抽出液からＡＳＯＤを通常の手段で単離
し、本発明の新規なＡＳＯＤを得ことができる。
【００５５】例えば培養ろ液から、ＡＳＯＤを単離精製
するには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン交換樹脂
を用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒドロキシ
ルアパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフィー等を
用い常法により処理して、精製ＡＳＯＤを得ることがで
きる。
するには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン交換樹脂
を用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒドロキシ
ルアパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフィー等を
用い常法により処理して、精製ＡＳＯＤを得ることがで
きる。
【００５６】更に、より具体的に本発明を詳述する。即
ち、新規なＡＳＯＤを生産する菌株としてユウペニシリ
ウム ブレフェルディアム APC-9315を使用し、液体培
地で培養して得られた精製した新規なＡＳＯＤの諸性質
について以下に詳述する。
ち、新規なＡＳＯＤを生産する菌株としてユウペニシリ
ウム ブレフェルディアム APC-9315を使用し、液体培
地で培養して得られた精製した新規なＡＳＯＤの諸性質
について以下に詳述する。
【００５７】(1) 至適pH：pH3.0〜8.0の範囲でブリトン
−ロビンソン（Britton-Robinson's）緩衝液を使用し、
30℃にて10分間反応させた場合の相対活性の結果を図１
に示す。本酵素は、約pH６付近に至適pHを有する。
−ロビンソン（Britton-Robinson's）緩衝液を使用し、
30℃にて10分間反応させた場合の相対活性の結果を図１
に示す。本酵素は、約pH６付近に至適pHを有する。
【００５８】(2) 至適温度：本酵素を100mM リン酸カリ
ウム緩衝液（pH5.5）中で種々の温度で10分間反応させ
た場合の相対活性の結果を図２に示す。本酵素は、pH5.
5において約37℃付近に至適温度を有する。
ウム緩衝液（pH5.5）中で種々の温度で10分間反応させ
た場合の相対活性の結果を図２に示す。本酵素は、pH5.
5において約37℃付近に至適温度を有する。
【００５９】(3) pH安定性：本酵素を種々のpHのブリト
ン−ロビンソン緩衝液中で37℃、16時間インキュベート
した後の残存活性を測定した結果を図３に示す。本酵素
は上記条件下で約pH３〜８の範囲で安定である。
ン−ロビンソン緩衝液中で37℃、16時間インキュベート
した後の残存活性を測定した結果を図３に示す。本酵素
は上記条件下で約pH３〜８の範囲で安定である。
【００６０】(4) 温度安定性：本酵素を100mM PIPES緩
衝液（pH6.8）中で種々の温度で16時間インキュベート
した後の残存相対活性を図４に示す。本酵素は、上記条
件下で約50℃以下で安定である。
衝液（pH6.8）中で種々の温度で16時間インキュベート
した後の残存相対活性を図４に示す。本酵素は、上記条
件下で約50℃以下で安定である。
【００６１】(5) 分子量：約135,000（Sephadex G-200
によるゲルろ過法）
によるゲルろ過法）
【００６２】(6) 阻害剤：各種阻害剤と共に37℃、２時
間インキュベートした後の残存相対活性を表２に示す。
本酵素は、アジ化ナトリウム、ジチオスレイトール、キ
レート剤のジエチルジチオカルバメートで実質的に阻害
されずヨード酢酸により阻害される。
間インキュベートした後の残存相対活性を表２に示す。
本酵素は、アジ化ナトリウム、ジチオスレイトール、キ
レート剤のジエチルジチオカルバメートで実質的に阻害
されずヨード酢酸により阻害される。
【００６３】
【表２】
【００６４】(7) 金属イオンの影響：各種金属イオンの
活性に及ぼす影響を表３に示す。
活性に及ぼす影響を表３に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】(8) Ｌ−アスコルビン酸に対するミハエリ
ス定数（Km値）：4.9×10-4Ｍ（分光光度法）
ス定数（Km値）：4.9×10-4Ｍ（分光光度法）
【００６７】(9) 基質特異性：Ｌ−アスコルビン酸を特
異的に酸化し、Ｄ−アラボアスコルビン酸には実質的に
作用せず、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル−マグネ
シウム塩、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、Ｌ
−アスコルビン酸−２，６−ジパルミテート等のアスコ
ルビン酸誘導体にも実質的に作用しない。又、ヒドロキ
ノン、ピロガロールは基質としない。
異的に酸化し、Ｄ−アラボアスコルビン酸には実質的に
作用せず、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル−マグネ
シウム塩、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、Ｌ
−アスコルビン酸−２，６−ジパルミテート等のアスコ
ルビン酸誘導体にも実質的に作用しない。又、ヒドロキ
ノン、ピロガロールは基質としない。
【００６８】(10)保存安定性：50mM PIPES緩衝液（pH6.
5）［0.02% デヒドロ酢酸、１mM EDTA含有］にＡＳＯＤ
を溶解し、37℃で保存し、残存相対活性を測定した。
5）［0.02% デヒドロ酢酸、１mM EDTA含有］にＡＳＯＤ
を溶解し、37℃で保存し、残存相対活性を測定した。
【００６９】対照として、アクレモニウム（Acremoniu
m）sp. HI-25由来（旭化成工業製）、キュウリ由来（天
野製薬製）のＡＳＯを使用した。その結果を図５に示
す。
m）sp. HI-25由来（旭化成工業製）、キュウリ由来（天
野製薬製）のＡＳＯを使用した。その結果を図５に示
す。
【００７０】その結果、本発明のＡＳＯＤを上記条件下
で保存した場合の保存安定性は極めて良好で、例えば上
記条件下での１ヶ月における残存活性は少なくとも50％
であり、対照として用いた他のＡＳＯと比べ際だった特
徴を有している。
で保存した場合の保存安定性は極めて良好で、例えば上
記条件下での１ヶ月における残存活性は少なくとも50％
であり、対照として用いた他のＡＳＯと比べ際だった特
徴を有している。
【００７１】例えば、アクレモニウム sp. HI-25由来の
ＡＳＯは１ヶ月後の残存活性は僅か５％程度とほとんど
失活している。また、キュウリ由来のＡＳＯは数日でほ
とんど活性を示さないほどに失活している。
ＡＳＯは１ヶ月後の残存活性は僅か５％程度とほとんど
失活している。また、キュウリ由来のＡＳＯは数日でほ
とんど活性を示さないほどに失活している。
【００７２】このように本願発明のＡＳＯＤの溶液での
安定性は、特別な安定化剤を加えることなく、単独で極
めて優れた安定性を有している。
安定性は、特別な安定化剤を加えることなく、単独で極
めて優れた安定性を有している。
【００７３】以上の結果をまとめ、更に既知酵素（アク
レモニウム エスピー HI-25由来、ミロセシウム ベ
ルカリアの胞子由来、特開平6-209770記載の酵素、キュ
ウリ由来）と比較した結果を表４に示す。
レモニウム エスピー HI-25由来、ミロセシウム ベ
ルカリアの胞子由来、特開平6-209770記載の酵素、キュ
ウリ由来）と比較した結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
【００７５】尚、ユウペニシリウム ブレフェルディア
ム APC-9315以外の菌株からもＡＳＯＤが精製できる。
得られたこれらのＡＳＯＤについても上記と同様にして
その性質を測定した結果、例えばEupenicillium javani
cum IFO 31735、Eupenicillium alutaceum IFO 31728、
Eupenicillium erubescens IFO 31734から上述と同様に
培養して得られた酵素は、至適pH、至適温度、pH安定
性、温度安定性、分子量、阻害剤、金属イオンの影響、
Ｌ−アスコルビン酸に対するミハエリス定数（Km値）、
基質特異性、保存安定性などの点で同様の性質を有して
いた。
ム APC-9315以外の菌株からもＡＳＯＤが精製できる。
得られたこれらのＡＳＯＤについても上記と同様にして
その性質を測定した結果、例えばEupenicillium javani
cum IFO 31735、Eupenicillium alutaceum IFO 31728、
Eupenicillium erubescens IFO 31734から上述と同様に
培養して得られた酵素は、至適pH、至適温度、pH安定
性、温度安定性、分子量、阻害剤、金属イオンの影響、
Ｌ−アスコルビン酸に対するミハエリス定数（Km値）、
基質特異性、保存安定性などの点で同様の性質を有して
いた。
【００７６】更に本発明のＡＳＯＤをコードする遺伝子
について詳述する。目的とする遺伝子をクローニングす
るためには、部分アミノ酸配列により推定したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングや抗体を用いたイムノスクリーニン
グなどの通常用いられてる方法が使用できる。あるいは
また、精製した蛋白質、或いは酵素法・化学法による蛋
白質の切断によって生じた内部ペプチドのＮ末端アミノ
酸配列のうち、異なる２ヶ所のアミノ酸配列をもとにオ
リゴヌクレオチドをデザインし、合成する。
について詳述する。目的とする遺伝子をクローニングす
るためには、部分アミノ酸配列により推定したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングや抗体を用いたイムノスクリーニン
グなどの通常用いられてる方法が使用できる。あるいは
また、精製した蛋白質、或いは酵素法・化学法による蛋
白質の切断によって生じた内部ペプチドのＮ末端アミノ
酸配列のうち、異なる２ヶ所のアミノ酸配列をもとにオ
リゴヌクレオチドをデザインし、合成する。
【００７７】これらオリゴヌクレオチドをセンスプライ
マー、アンチセンスプライマーとしたＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction）法により、ＤＮＡ断片を得ること
ができる。合成オリゴヌクレオチドとしては混合物或い
はイノシンを含んだものも使用できる［S. Ymaguchi, G
ene, 103巻, 61頁（1991）］。
マー、アンチセンスプライマーとしたＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction）法により、ＤＮＡ断片を得ること
ができる。合成オリゴヌクレオチドとしては混合物或い
はイノシンを含んだものも使用できる［S. Ymaguchi, G
ene, 103巻, 61頁（1991）］。
【００７８】得られたＤＮＡ断片をプローブとして、例
えばユウペニシリウム ブレフェルディアム APC-9315
のゲノムＤＮＡライブラリーからＡＳＯＤ遺伝子をＤＮ
Ａ断片として得ることができる。同様にしてユウペニシ
リウム属の他の菌株からもＡＳＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を得ることができる。ユウペニシリウム属の他の菌
株としては例えば表１に挙げた菌株が挙げられる。
えばユウペニシリウム ブレフェルディアム APC-9315
のゲノムＤＮＡライブラリーからＡＳＯＤ遺伝子をＤＮ
Ａ断片として得ることができる。同様にしてユウペニシ
リウム属の他の菌株からもＡＳＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を得ることができる。ユウペニシリウム属の他の菌
株としては例えば表１に挙げた菌株が挙げられる。
【００７９】更に上記遺伝子をクローニングした後、イ
ントロンを含まないｃＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により
得ることができる。ＰＣＲのプライマーには例えば、Ａ
ＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直下流の塩基
配列をもとにデザインし、合成したオリゴヌクレオチド
を用いることができる。かかるＤＮＡは、イントロン
（介在配列）を有する種々の塩基配列をも包含し得るも
のである。これらのイントロンの有無、配列及び挿入位
置は、遺伝子発現系の諸要素、例えば宿主細胞の種類等
に応じて当業者が容易に選択し得るものである。
ントロンを含まないｃＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により
得ることができる。ＰＣＲのプライマーには例えば、Ａ
ＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直下流の塩基
配列をもとにデザインし、合成したオリゴヌクレオチド
を用いることができる。かかるＤＮＡは、イントロン
（介在配列）を有する種々の塩基配列をも包含し得るも
のである。これらのイントロンの有無、配列及び挿入位
置は、遺伝子発現系の諸要素、例えば宿主細胞の種類等
に応じて当業者が容易に選択し得るものである。
【００８０】また、ＡＳＯＤをコードする遺伝子と当該
遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含ん
でなる組換えＤＮＡを有するプラスミドは、例えば上記
ＤＮＡ断片を当該遺伝子の発現を促進する機能を有する
ＤＮＡ配列を含むプラスミドに連結することにより得る
ことができる。ここで、当該遺伝子の発現を促進する機
能をコードするＤＮＡ配列は、使用する宿主微生物内で
機能するものであれば如何なるものでも使用できる。
遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含ん
でなる組換えＤＮＡを有するプラスミドは、例えば上記
ＤＮＡ断片を当該遺伝子の発現を促進する機能を有する
ＤＮＡ配列を含むプラスミドに連結することにより得る
ことができる。ここで、当該遺伝子の発現を促進する機
能をコードするＤＮＡ配列は、使用する宿主微生物内で
機能するものであれば如何なるものでも使用できる。
【００８１】本発明の上記プラスミドを有する形質転換
体は、例えば当該プラスミドを糸状菌、酵母などの宿主
微生物へ導入することにより、菌体内及び菌体外にＡＳ
ＯＤを生産する形質転換体として得ることができる。宿
主微生物としては、組み換えＡＳＯＤを生産する能力を
有するものであればいずれでも良いが、例えばユウペニ
シリウム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サッ
カロマイセス属、大腸菌、バチルス属、動物細胞などが
挙げられる。
体は、例えば当該プラスミドを糸状菌、酵母などの宿主
微生物へ導入することにより、菌体内及び菌体外にＡＳ
ＯＤを生産する形質転換体として得ることができる。宿
主微生物としては、組み換えＡＳＯＤを生産する能力を
有するものであればいずれでも良いが、例えばユウペニ
シリウム属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サッ
カロマイセス属、大腸菌、バチルス属、動物細胞などが
挙げられる。
【００８２】本発明のＡＳＯＤをコードする遺伝子と当
該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含
んでなる組換えＤＮＡを有する上記形質転換体の培養及
び培養物からのＡＳＯＤの製造法としては、例えばユウ
ペニシリウム属からのＡＳＯＤの製造法と同一の方法が
適用できる。
該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含
んでなる組換えＤＮＡを有する上記形質転換体の培養及
び培養物からのＡＳＯＤの製造法としては、例えばユウ
ペニシリウム属からのＡＳＯＤの製造法と同一の方法が
適用できる。
【００８３】即ち、本発明によりＡＳＯＤをコードする
遺伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮ
Ａ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する微生物を培養
することにより培養物よりＡＳＯＤを採取することが可
能となる。
遺伝子と当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤＮ
Ａ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する微生物を培養
することにより培養物よりＡＳＯＤを採取することが可
能となる。
【００８４】本発明において臨床検査用試薬組成物とは
パーオキシダーゼを用いた過酸化水素と色原体との共役
反応を用いて生体成分の測定を行う臨床検査用試薬組成
物をいう。当該試薬組成物において、本発明のＡＳＯＤ
を用い、試料中のＬ−アスコルビン酸の影響を回避する
ことができる。本発明のＡＳＯＤは各種の臨床検査用試
薬に適用できるが、特に本発明のＡＳＯＤが至適pHが中
性付近に有することより、中性付近で多く行われる各種
生体成分の測定に好適に利用できる。
パーオキシダーゼを用いた過酸化水素と色原体との共役
反応を用いて生体成分の測定を行う臨床検査用試薬組成
物をいう。当該試薬組成物において、本発明のＡＳＯＤ
を用い、試料中のＬ−アスコルビン酸の影響を回避する
ことができる。本発明のＡＳＯＤは各種の臨床検査用試
薬に適用できるが、特に本発明のＡＳＯＤが至適pHが中
性付近に有することより、中性付近で多く行われる各種
生体成分の測定に好適に利用できる。
【００８５】例えばコレステロール、中性脂肪、遊離脂
肪酸、リン脂質、尿酸、クレアチニン、無機リン、シア
ル酸の測定など、パーオキシダーゼの存在下で過酸化水
素と色原体との酸化縮合反応を利用する測定系にはすべ
てに適用できる。その場合、本発明のＡＳＯＤの使用量
は対象とする試料中のＬ−アスコルビン酸の濃度及び測
定系のスケールにもよるが、通常0.1〜100単位／assay
使用される。例えば、0.4ml系での反応では0.5〜10単位
／assay、好ましくは１〜５単位／assayが使用される。
肪酸、リン脂質、尿酸、クレアチニン、無機リン、シア
ル酸の測定など、パーオキシダーゼの存在下で過酸化水
素と色原体との酸化縮合反応を利用する測定系にはすべ
てに適用できる。その場合、本発明のＡＳＯＤの使用量
は対象とする試料中のＬ−アスコルビン酸の濃度及び測
定系のスケールにもよるが、通常0.1〜100単位／assay
使用される。例えば、0.4ml系での反応では0.5〜10単位
／assay、好ましくは１〜５単位／assayが使用される。
【００８６】更に、本発明のＡＳＯＤは保存安定性の項
で示したように既存のＡＳＯと比較して溶液の安定性の
点で非常に優れている。よって、臨床検査用試薬が液状
化試薬として使用される場合には安定性の面で非常に有
利である。即ち、従来のＡＳＯは安定性が劣っているた
め、試薬の保存期間中の失活のため、大過剰の添加が必
要となるために、結果としてコストが高くつき、さらに
は夾雑する物質の影響を受けやすくなるという欠点を有
することとなる。
で示したように既存のＡＳＯと比較して溶液の安定性の
点で非常に優れている。よって、臨床検査用試薬が液状
化試薬として使用される場合には安定性の面で非常に有
利である。即ち、従来のＡＳＯは安定性が劣っているた
め、試薬の保存期間中の失活のため、大過剰の添加が必
要となるために、結果としてコストが高くつき、さらに
は夾雑する物質の影響を受けやすくなるという欠点を有
することとなる。
【００８７】また、上記臨床検査用測定試薬は、保存中
の腐敗防止のためアジ化ナトリウムを使用することが多
い。植物由来或いは、Acremonium sp. HI-25由来のＡＳ
Ｏはアジ化ナトリウムにより活性が阻害されるため、防
腐剤の使用法に工夫を必要とする。
の腐敗防止のためアジ化ナトリウムを使用することが多
い。植物由来或いは、Acremonium sp. HI-25由来のＡＳ
Ｏはアジ化ナトリウムにより活性が阻害されるため、防
腐剤の使用法に工夫を必要とする。
【００８８】本発明の新規ＡＳＯＤは、アジ化ナトリウ
ムによる活性阻害は認められず、この点においても優位
性を示す。
ムによる活性阻害は認められず、この点においても優位
性を示す。
【００８９】本発明のＡＳＯＤの触媒する反応は過酸化
水素を生ずるが、これは、例えばパーオキシダーゼ存在
下、4-アミノアンチピリン又はその誘導体或いはフェノ
ール系化合物又はN,N-ジ置換アニリン系化合物の縮合反
応により、或いはカタラーゼを共存させることにより消
去することができる。
水素を生ずるが、これは、例えばパーオキシダーゼ存在
下、4-アミノアンチピリン又はその誘導体或いはフェノ
ール系化合物又はN,N-ジ置換アニリン系化合物の縮合反
応により、或いはカタラーゼを共存させることにより消
去することができる。
【００９０】現在多くの臨床検査試薬は、例えば２試薬
系の第１試薬で内在生の妨害物質消去のため、過酸化水
素の消去系を備えており、ＡＳＯＤの酸化反応により生
ずる過酸化水素は各種生体成分の測定値に影響はない。
系の第１試薬で内在生の妨害物質消去のため、過酸化水
素の消去系を備えており、ＡＳＯＤの酸化反応により生
ずる過酸化水素は各種生体成分の測定値に影響はない。
【００９１】このように、本発明の新規なＡＳＯＤは従
来のＡＳＯと比較して、保存安定性が非常に優れている
こと、アジ化ナトリウムによって阻害されないこと、中
性付近に至適pHを有していること等より臨床検査用試薬
への添加量を少なくすることができ、その結果としてコ
ストの削減や夾雑物質の影響を回避することも容易とな
る。
来のＡＳＯと比較して、保存安定性が非常に優れている
こと、アジ化ナトリウムによって阻害されないこと、中
性付近に至適pHを有していること等より臨床検査用試薬
への添加量を少なくすることができ、その結果としてコ
ストの削減や夾雑物質の影響を回避することも容易とな
る。
【００９２】更に従来のＡＳＯは４−アミノアンチピリ
ンとフェノールに代表される水素供与体の縮合反応の触
媒能を有しており、生体成分を酸化酵素／パーオキシダ
ーゼ系で測定する際、試薬ブランクが上昇するという問
題があった。
ンとフェノールに代表される水素供与体の縮合反応の触
媒能を有しており、生体成分を酸化酵素／パーオキシダ
ーゼ系で測定する際、試薬ブランクが上昇するという問
題があった。
【００９３】本発明のＡＳＯＤは既存の植物、或いは微
生物由来のＡＳＯと比較してこの試薬ブランクが低値を
示すことにより、生体成分の酸化酵素／パーオキシダー
ゼ系での測定により好適に利用できる。
生物由来のＡＳＯと比較してこの試薬ブランクが低値を
示すことにより、生体成分の酸化酵素／パーオキシダー
ゼ系での測定により好適に利用できる。
【００９４】また、本発明のＡＳＯＤは食品用にも使用
される。例えば、食品にＬ−アスコルビン酸が十分に含
まれる場合には、本発明のＡＳＯＤを添加する。また、
十分に含まれない又は含まれない食品に対してはＬ−ア
スコルビン酸若しくはその塩などと本発明のＡＳＯＤを
添加する。このことによってＡＳＯＤによってＬ−アス
コルビン酸が酸化され食品中の酸素が消費され、食品の
劣化を防ぐことができる。
される。例えば、食品にＬ−アスコルビン酸が十分に含
まれる場合には、本発明のＡＳＯＤを添加する。また、
十分に含まれない又は含まれない食品に対してはＬ−ア
スコルビン酸若しくはその塩などと本発明のＡＳＯＤを
添加する。このことによってＡＳＯＤによってＬ−アス
コルビン酸が酸化され食品中の酸素が消費され、食品の
劣化を防ぐことができる。
【００９５】また、同じように食品中にＬ−アスコルビ
ン酸とＡＳＯＤを共存させることにより食品中にデヒド
ロアスコルビン酸を生成させ、魚畜肉製品、水産練り製
品の品質を高めることができる。即ち、これらの製品の
品質を決定する重要な因子である粘着性やあし（のび）
と呼ばれる弾力性を蛋白質中のＳＨ基をＳ−Ｓ結合させ
ることにより改善することができる。
ン酸とＡＳＯＤを共存させることにより食品中にデヒド
ロアスコルビン酸を生成させ、魚畜肉製品、水産練り製
品の品質を高めることができる。即ち、これらの製品の
品質を決定する重要な因子である粘着性やあし（のび）
と呼ばれる弾力性を蛋白質中のＳＨ基をＳ−Ｓ結合させ
ることにより改善することができる。
【００９６】上記のような食品に対する使用量としては
ｇ当たり0.001単位以上であり、好ましくは0.01単位が
使用されうる。また、食品中のＬ−アスコルビン酸が不
足する場合にはＬ−アスコルビン酸又はその塩を添加す
ることもできその場合には食品に対して0.01〜1.0重量
％程度が添加される。
ｇ当たり0.001単位以上であり、好ましくは0.01単位が
使用されうる。また、食品中のＬ−アスコルビン酸が不
足する場合にはＬ−アスコルビン酸又はその塩を添加す
ることもできその場合には食品に対して0.01〜1.0重量
％程度が添加される。
【００９７】上記のように食品に対して本発明のＡＳＯ
Ｄを使用すると食品中に過酸化水素が生成するが、この
過酸化水素は加熱工程を含む食品製造においては分解さ
れ、必要に応じてカタラーゼ等を用いて分解することも
可能であり、食品安全面でも使用に問題はない。
Ｄを使用すると食品中に過酸化水素が生成するが、この
過酸化水素は加熱工程を含む食品製造においては分解さ
れ、必要に応じてカタラーゼ等を用いて分解することも
可能であり、食品安全面でも使用に問題はない。
【００９８】本発明のＡＳＯＤは、従来のＡＳＯと異な
り、Ｌ−アスコルビン酸に作用してＬ−アスコルビン酸
１モルから過酸化水素１モルを生成する反応を触媒す
る。この性質を利用して生成する過酸化水素を測定する
ことにより食品中或いは生体成分中のＬ−アスコルビン
酸濃度を測定することができる。
り、Ｌ−アスコルビン酸に作用してＬ−アスコルビン酸
１モルから過酸化水素１モルを生成する反応を触媒す
る。この性質を利用して生成する過酸化水素を測定する
ことにより食品中或いは生体成分中のＬ−アスコルビン
酸濃度を測定することができる。
【００９９】過酸化水素の測定にはパーオキシダーゼ存
在下、４−アミノアンチピリンとフェノール等の水素供
与体との縮合反応の利用、又はメタノール存在下、カタ
ラーゼを作用させ生成するホルムアルデヒドをホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、過酸
化水素電極を用いて測定する方法等が挙げられる。
在下、４−アミノアンチピリンとフェノール等の水素供
与体との縮合反応の利用、又はメタノール存在下、カタ
ラーゼを作用させ生成するホルムアルデヒドをホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、過酸
化水素電極を用いて測定する方法等が挙げられる。
【０１００】又、アスコルビン酸の還元力を利用したア
スコルビン酸測定系において既存のＡＳＯと同様にブラ
ンク側の反応に利用することもできる。
スコルビン酸測定系において既存のＡＳＯと同様にブラ
ンク側の反応に利用することもできる。
【０１０１】尚、本発明においてＡＳＯＤ活性の測定方
法は以下に示す通りである。10mM Na2HPO4 0.5ml，１mM
EDTAを含む0.2M KH2PO4 0.45ml、試料 0.1mlを混合
し、30℃，５分間プレインキュベートする。１mM EDTA
を含む0.001N HClにＬ−アスコルビン酸を10mMになるよ
うに溶解した基質 0.05mlを添加し、30℃，10分間イン
キュベーションを行った。0.2Ｎ HCl 3.0mlの添加で反
応を停止し、245nmにおける吸光度の減少を測定する。
法は以下に示す通りである。10mM Na2HPO4 0.5ml，１mM
EDTAを含む0.2M KH2PO4 0.45ml、試料 0.1mlを混合
し、30℃，５分間プレインキュベートする。１mM EDTA
を含む0.001N HClにＬ−アスコルビン酸を10mMになるよ
うに溶解した基質 0.05mlを添加し、30℃，10分間イン
キュベーションを行った。0.2Ｎ HCl 3.0mlの添加で反
応を停止し、245nmにおける吸光度の減少を測定する。
【０１０２】ＡＳＯＤの１単位は、１分間にＬ−アスコ
ルビン酸を１μmol分解する酵素量である。
ルビン酸を１μmol分解する酵素量である。
【０１０３】以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明
する。実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙
げたものであり、本発明に使用できるものであればこれ
らに限定されるものではない。また本発明は以下の実施
例に限定されるものではなく、本発明の技術分野におけ
る通常の変更をすることができる。
する。実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙
げたものであり、本発明に使用できるものであればこれ
らに限定されるものではない。また本発明は以下の実施
例に限定されるものではなく、本発明の技術分野におけ
る通常の変更をすることができる。
【０１０４】
【実施例】実施例１ ユウペニシリウム ブレフェルディアム APC
-9315の培養 グリセロール ２％（W/V）、ポリペプトン １％（W/
V）、魚肉エキス（和光純薬工業社製）２％（W/V）、K2
HPO4 0.2％（W/V）、MgSO4・７H2O 0.01％（W/V）、アデ
カノール（旭電化工業社製）0.001％（W/V）、pH6.0よ
りなる培地20Ｌを30Ｌ容のジャーファメンターに仕込
み、121℃で30分間殺菌した。他方、同組成培地を用
い、500ml容坂口フラスコで37℃，３日間予め振盪培養
しておいたユウペニシリウム ブレフェルディアム APC
-9315（FERM BP-5053）の培養液100mlを前記培地に無菌
的に植菌し、37℃で６日間通気攪拌培養（200rpm、ジャ
ー培養の通気量：１vvm）した。培養ろ液のＡＳＯＤ活
性は0.15unit／mlであった。
-9315の培養 グリセロール ２％（W/V）、ポリペプトン １％（W/
V）、魚肉エキス（和光純薬工業社製）２％（W/V）、K2
HPO4 0.2％（W/V）、MgSO4・７H2O 0.01％（W/V）、アデ
カノール（旭電化工業社製）0.001％（W/V）、pH6.0よ
りなる培地20Ｌを30Ｌ容のジャーファメンターに仕込
み、121℃で30分間殺菌した。他方、同組成培地を用
い、500ml容坂口フラスコで37℃，３日間予め振盪培養
しておいたユウペニシリウム ブレフェルディアム APC
-9315（FERM BP-5053）の培養液100mlを前記培地に無菌
的に植菌し、37℃で６日間通気攪拌培養（200rpm、ジャ
ー培養の通気量：１vvm）した。培養ろ液のＡＳＯＤ活
性は0.15unit／mlであった。
【０１０５】実施例２ ＡＳＯＤの精製 実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙 No.２を用いてろ
別し、培養ろ液12Ｌを得た。限外ろ過のモジュールを用
いて１Ｌ迄濃縮し、この濃縮液に1.5倍量の冷エタノー
ルを添加し、冷蔵室で一晩攪拌した。遠心分離により、
沈殿を回収し、10mM酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解した。
別し、培養ろ液12Ｌを得た。限外ろ過のモジュールを用
いて１Ｌ迄濃縮し、この濃縮液に1.5倍量の冷エタノー
ルを添加し、冷蔵室で一晩攪拌した。遠心分離により、
沈殿を回収し、10mM酢酸緩衝液（pH5.0）で溶解した。
【０１０６】予め、同緩衝液で平衡化させたDEAE-Sepha
roseに沈殿溶解液を供し、同緩衝液で洗浄して、DEAE-S
epharose未吸着画分を回収した。この画分を予め20mM酢
酸緩衝液（pH4.4）で平衡化させたS-Sepharoseに供し、
同緩衝液で十分洗浄した後、０〜200mM食塩のリニアグ
ラジェントにて溶出させる。活性画分を回収後、限外ろ
過のモジュールを用いて脱塩、濃縮する。更にこの濃縮
液を同緩衝液にて平衡化させたSephacryl S-200に供
し、ゲルろ過を行う。溶出してくる活性画分を回収後、
限外ろ過のモジュールにて脱塩、濃縮し、凍結乾燥によ
り粉末を得た。得られたＡＳＯＤ粉末の比活性は1,495u
nit／mgタンパク質であった。
roseに沈殿溶解液を供し、同緩衝液で洗浄して、DEAE-S
epharose未吸着画分を回収した。この画分を予め20mM酢
酸緩衝液（pH4.4）で平衡化させたS-Sepharoseに供し、
同緩衝液で十分洗浄した後、０〜200mM食塩のリニアグ
ラジェントにて溶出させる。活性画分を回収後、限外ろ
過のモジュールを用いて脱塩、濃縮する。更にこの濃縮
液を同緩衝液にて平衡化させたSephacryl S-200に供
し、ゲルろ過を行う。溶出してくる活性画分を回収後、
限外ろ過のモジュールにて脱塩、濃縮し、凍結乾燥によ
り粉末を得た。得られたＡＳＯＤ粉末の比活性は1,495u
nit／mgタンパク質であった。
【０１０７】実施例３ 酵素反応生成物の同定と化学量
論 20mM酢酸緩衝液（pH5.0）中に実施例２で得られたＡＳ
ＯＤ標品10UとＬ−アスコルビン酸（終濃度０−50mM）
を混合し、攪拌しながら充分に反応させる。得られた反
応液50μlと４−アミノアンチピリン（終濃度３mM）、
フェノール（同1.1mM）、パーオキシダーゼ（西洋ワサ
ビ由来：同24U）、トリトンＸ−100（同0.02％）を含む
100mMリン酸緩衝液（pH7.0）2.95mlを混合し、37℃にて
反応させたところ、501μmoleのＬ−アスコルビン酸の
消費に伴い、516μmoleの過酸化水素の生成が認められ
た。
論 20mM酢酸緩衝液（pH5.0）中に実施例２で得られたＡＳ
ＯＤ標品10UとＬ−アスコルビン酸（終濃度０−50mM）
を混合し、攪拌しながら充分に反応させる。得られた反
応液50μlと４−アミノアンチピリン（終濃度３mM）、
フェノール（同1.1mM）、パーオキシダーゼ（西洋ワサ
ビ由来：同24U）、トリトンＸ−100（同0.02％）を含む
100mMリン酸緩衝液（pH7.0）2.95mlを混合し、37℃にて
反応させたところ、501μmoleのＬ−アスコルビン酸の
消費に伴い、516μmoleの過酸化水素の生成が認められ
た。
【０１０８】又、メタノール存在下、生成する過酸化水
素にカタラーゼを作用させ、生じたホルムアルデヒドを
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼで定量し、Ｌ−アス
コルビン酸消費量と過酸化水素生成量に定量性が認めら
れた。
素にカタラーゼを作用させ、生じたホルムアルデヒドを
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼで定量し、Ｌ−アス
コルビン酸消費量と過酸化水素生成量に定量性が認めら
れた。
【０１０９】更に、同反応液中の生成物をHPLC法、ジニ
トロフェニルヒドロラジン比色法、ｏ−フェニレンジア
ミン蛍光法によりデヒドロアスコルビン酸と同定した。
蛍光法による測定の結果、61.0μmoleのＬ−アスコルビ
ン酸の消費に伴い、生成するデヒドロアスコルビン酸は
60.0μmoleであった。
トロフェニルヒドロラジン比色法、ｏ−フェニレンジア
ミン蛍光法によりデヒドロアスコルビン酸と同定した。
蛍光法による測定の結果、61.0μmoleのＬ−アスコルビ
ン酸の消費に伴い、生成するデヒドロアスコルビン酸は
60.0μmoleであった。
【０１１０】又、反応中の酸素消費量を酸素電極にて測
定したところ10μmoleのＬ−アスコルビン酸の消費に伴
い、9.5μmoleの酸素が消費された。
定したところ10μmoleのＬ−アスコルビン酸の消費に伴
い、9.5μmoleの酸素が消費された。
【０１１１】以上の結果より、本発明のＡＳＯＤはＬ−
アスコルビン酸１モルを１モルの酸素を水素受容体とし
て酸化し、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モルの
過酸化水素を生成する反応を触媒することが明らかとな
った。
アスコルビン酸１モルを１モルの酸素を水素受容体とし
て酸化し、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モルの
過酸化水素を生成する反応を触媒することが明らかとな
った。
【０１１２】実施例４ Eupenicillium javanicum IFO
31735、Eupenicillium alutaceum IF O 31728及びEupeni
cillium erubescens IFO 31734の培養 これらの菌株を実施例１に従って培養し、更に実施例２
に従って精製して得られたＡＳＯＤの比活性は各々1,35
6unit／mgタンパク質、1,631unit／mgタンパク質及び1,
567unit／mgタンパク質であり、これらの酵素は何れも
Ｌ−アスコルビン酸１モルを１モルの酸素を水素受容体
として酸化し、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する。
31735、Eupenicillium alutaceum IF O 31728及びEupeni
cillium erubescens IFO 31734の培養 これらの菌株を実施例１に従って培養し、更に実施例２
に従って精製して得られたＡＳＯＤの比活性は各々1,35
6unit／mgタンパク質、1,631unit／mgタンパク質及び1,
567unit／mgタンパク質であり、これらの酵素は何れも
Ｌ−アスコルビン酸１モルを１モルの酸素を水素受容体
として酸化し、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する。
【０１１３】実施例５ ＡＳＯＤ遺伝子のクローニング (1) 菌体の取得 グリセロール−ポリペプトン培地［２％グリセロール，
３％ポリペプトン，0.2% KH2PO4,0.01% MgSO4・7H2O,0.0
01% アデカノール （pH6.0）］にユウペニシリウム ブ
レフェルディアムAPC-9315（FERM BPー5053）を接種し、
37℃において48時間通気攪拌培養し、培養物をろ過して
菌体を得た。
３％ポリペプトン，0.2% KH2PO4,0.01% MgSO4・7H2O,0.0
01% アデカノール （pH6.0）］にユウペニシリウム ブ
レフェルディアムAPC-9315（FERM BPー5053）を接種し、
37℃において48時間通気攪拌培養し、培養物をろ過して
菌体を得た。
【０１１４】(2) 染色体ＤＮＡの調製 得られた湿菌体４ｇを液体窒素中で凍結し、そのまま、
液体窒素及び海砂を入れた乳鉢に移し、乳棒で微細な粉
末とした。
液体窒素及び海砂を入れた乳鉢に移し、乳棒で微細な粉
末とした。
【０１１５】得られた粉末を、３mgプロテイナーゼＫを
含む６mlのLysis緩衝液〔150mM EDTA・2Na，50mM トリス
−塩酸緩衝液（pH8.0），１％ザルコシン〕に懸濁後、6
5℃，５分間処理し、遠心分離により上清を得た。
含む６mlのLysis緩衝液〔150mM EDTA・2Na，50mM トリス
−塩酸緩衝液（pH8.0），１％ザルコシン〕に懸濁後、6
5℃，５分間処理し、遠心分離により上清を得た。
【０１１６】これに30μlのRNase A（10mg/ml）を加
え、37℃、20分処理してＲＮＡを分解した後、１倍量の
フェノール、１倍量のフェノール：クロロホルム（１：
１）及び１倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（24：１）でそれぞれ１回ずつ抽出した後、エタノール
沈降により得た沈殿を２mlのＴＥ〔150mM EDTA・2Na，50
mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）〕に溶解した。更に2.
2mlの20％ポリエチレングリコール8000-2.5M NaClを加
え、混合後、生じた沈殿物を遠心により集め、0.2mgの
染色体ＤＮＡを得、ＴＥに溶解した。
え、37℃、20分処理してＲＮＡを分解した後、１倍量の
フェノール、１倍量のフェノール：クロロホルム（１：
１）及び１倍量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（24：１）でそれぞれ１回ずつ抽出した後、エタノール
沈降により得た沈殿を２mlのＴＥ〔150mM EDTA・2Na，50
mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）〕に溶解した。更に2.
2mlの20％ポリエチレングリコール8000-2.5M NaClを加
え、混合後、生じた沈殿物を遠心により集め、0.2mgの
染色体ＤＮＡを得、ＴＥに溶解した。
【０１１７】(3) ｍＲＮＡの調製 シグイン（Chigwin）等の方法〔Biochemistry、18巻、5
294頁（1979）〕に従って全ＲＮＡを得た。即ち(2)で得
た粉末の半分量を20mlのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオ
イソシアネイト、５mMクエン酸ナトリウム、8.5％ザル
コシン、0.1Mβ−メルカプトエタノールを含有）に懸濁
し、10,000×ｇ、15分の遠心分離により、菌体破片及び
海砂を除いた。
294頁（1979）〕に従って全ＲＮＡを得た。即ち(2)で得
た粉末の半分量を20mlのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオ
イソシアネイト、５mMクエン酸ナトリウム、8.5％ザル
コシン、0.1Mβ−メルカプトエタノールを含有）に懸濁
し、10,000×ｇ、15分の遠心分離により、菌体破片及び
海砂を除いた。
【０１１８】得られた上清を、超遠心分離用チューブ
中、5.7Ｍの塩化セシウム溶液上に重層し、33,000rpm、
25℃、18時間の条件で超遠心分離して、沈澱物を得た。
この沈澱物を水に溶解し、0.025倍量の１Ｎ−酢酸及び
0.5倍量の冷エタノールを加え、混合後、生じた沈澱物
を遠心により集め、水に溶解し、不純物を遠心により除
去して全ＲＮＡを得た（約10mg）。この内の４mgをｍＲ
ＮＡを選択するために、オリゴ（dT）セルロース−スパ
ン−カラムキット（ファルマシア社製）に供し、ｍＲＮ
Ａ画分（80μｇ）を得た。
中、5.7Ｍの塩化セシウム溶液上に重層し、33,000rpm、
25℃、18時間の条件で超遠心分離して、沈澱物を得た。
この沈澱物を水に溶解し、0.025倍量の１Ｎ−酢酸及び
0.5倍量の冷エタノールを加え、混合後、生じた沈澱物
を遠心により集め、水に溶解し、不純物を遠心により除
去して全ＲＮＡを得た（約10mg）。この内の４mgをｍＲ
ＮＡを選択するために、オリゴ（dT）セルロース−スパ
ン−カラムキット（ファルマシア社製）に供し、ｍＲＮ
Ａ画分（80μｇ）を得た。
【０１１９】(4) 遺伝子ライブラリーの作成 (2)で得られた全ＤＮＡをBglIIで分解する。分解された
ＤＮＡを子牛の腸由来のアルカリフォスファターゼ（ベ
ーリンガー社製）を用いて脱リン酸し、Fricshaufらの
方法〔J. Mol. Biol.170巻、827-842頁（1987）〕に従
って、λDASHII（Strataene社製）のBam HIサイトにラ
イゲートした。
ＤＮＡを子牛の腸由来のアルカリフォスファターゼ（ベ
ーリンガー社製）を用いて脱リン酸し、Fricshaufらの
方法〔J. Mol. Biol.170巻、827-842頁（1987）〕に従
って、λDASHII（Strataene社製）のBam HIサイトにラ
イゲートした。
【０１２０】ライゲーション混合物はインビトロでパッ
ケージし、E. Coli XL1-Blue MRA(P2)（Strataene社
製）にトランスフェクションした。その結果、3.8×105
のインデペンデントクローンよりなるライブラリーが作
成できた。
ケージし、E. Coli XL1-Blue MRA(P2)（Strataene社
製）にトランスフェクションした。その結果、3.8×105
のインデペンデントクローンよりなるライブラリーが作
成できた。
【０１２１】(5) ＡＳＯＤの部分アミノ酸配列の決定 実施例２で得られた精製ＡＳＯＤタンパク質をエンドグ
リコシダーゼＨ処理し糖鎖を除去した。糖鎖除去ＡＳＯ
ＤをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、ＰＶＤＦ（Polyvinylidene difluoride）膜（MILLI
PORE社製）に電気的にブロッティングした。クマシーブ
リリアントブルー R-250で染色されたＡＳＯＤのバンド
を切り出し、エドマン法によるアミノ酸配列自動分析装
置（アプライド バイオシステムズ社製）を用いてＮ末
端からのアミノ酸配列（配列番号：１）を決定した。
リコシダーゼＨ処理し糖鎖を除去した。糖鎖除去ＡＳＯ
ＤをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、ＰＶＤＦ（Polyvinylidene difluoride）膜（MILLI
PORE社製）に電気的にブロッティングした。クマシーブ
リリアントブルー R-250で染色されたＡＳＯＤのバンド
を切り出し、エドマン法によるアミノ酸配列自動分析装
置（アプライド バイオシステムズ社製）を用いてＮ末
端からのアミノ酸配列（配列番号：１）を決定した。
【０１２２】次いで、糖鎖除去ＡＳＯＤを公知の方法
〔タンパク質 一次構造（新生化学実験講座 第一
巻）、92頁、日本生化学会編 （1990）〕に従って、Ｎ
−ヒドロキシルアミンにより分解した。ペプチド断片混
合液を上述したと同様の方法でＰＶＤＦ膜にブロッティ
ングし、クマシーブリリアントブルー R-250で染色され
た一つのペプチド（ペプチドＤ）のバンドを切り出し、
同様の方法でペプチドＤのＮ末端アミノ酸配列（配列番
号：２）を決定した。
〔タンパク質 一次構造（新生化学実験講座 第一
巻）、92頁、日本生化学会編 （1990）〕に従って、Ｎ
−ヒドロキシルアミンにより分解した。ペプチド断片混
合液を上述したと同様の方法でＰＶＤＦ膜にブロッティ
ングし、クマシーブリリアントブルー R-250で染色され
た一つのペプチド（ペプチドＤ）のバンドを切り出し、
同様の方法でペプチドＤのＮ末端アミノ酸配列（配列番
号：２）を決定した。
【０１２３】次いで得られた糖鎖除去ＡＳＯＤ［３mg/m
l,100mM リン酸緩衝液（pH8.0）］にリジルエンドペプ
チターゼ(Takara社製）を添加し、37℃，18時間反応さ
せて分解した。分解物をピュアシル（Puresil）C18カラ
ム（商品名：Waters Chromatography社製）を用いて逆
相ＨＰＬＣ法により精製した。ペプチド流量は1.0ml/
分，0.05%トリフルオロ酢酸中で０〜80％アセトニトリ
ルの直線勾配により溶出した。
l,100mM リン酸緩衝液（pH8.0）］にリジルエンドペプ
チターゼ(Takara社製）を添加し、37℃，18時間反応さ
せて分解した。分解物をピュアシル（Puresil）C18カラ
ム（商品名：Waters Chromatography社製）を用いて逆
相ＨＰＬＣ法により精製した。ペプチド流量は1.0ml/
分，0.05%トリフルオロ酢酸中で０〜80％アセトニトリ
ルの直線勾配により溶出した。
【０１２４】約34分のリテンション時間に溶出するペプ
チド（ペプチドL-34）と約39分に溶出するペプチド（ペ
プチドL-39）を分離し、エドマン法によりそれぞれのＮ
末端からのアミノ酸配列（配列番号：３及び配列番号：
４）を決定した。
チド（ペプチドL-34）と約39分に溶出するペプチド（ペ
プチドL-39）を分離し、エドマン法によりそれぞれのＮ
末端からのアミノ酸配列（配列番号：３及び配列番号：
４）を決定した。
【０１２５】(6) ＰＣＲ法に用いたプライマーＤＮＡの
合成 (5)で決定されたＡＳＯＤタンパク質のＮ末端部位のア
ミノ酸配列の３番目のプロリンから10番目のグリシンに
対応する塩基配列を予想し、オリゴヌクレオチドを合成
した。このオリゴヌクレオチドをＰＣＲのセンスプライ
マーとした。センスプライマーの配列を以下に示す。
合成 (5)で決定されたＡＳＯＤタンパク質のＮ末端部位のア
ミノ酸配列の３番目のプロリンから10番目のグリシンに
対応する塩基配列を予想し、オリゴヌクレオチドを合成
した。このオリゴヌクレオチドをＰＣＲのセンスプライ
マーとした。センスプライマーの配列を以下に示す。
【０１２６】 5'-CCT GCI GCT GTI TAT AAT GGT GG-3' （I：イノシン） C C C C C A A A G G G
【０１２７】同様にして、(5)で決定されたペプチドＤ
のＮ末端からのアミノ酸配列の６番目のプロリンから13
番目のアスパラギン酸に対応する塩基配列を予想し、オ
リゴヌクレオチドを合成した。このオロゴヌクレオチド
をＰＣＲのアンチセンスプライマーとした。アンチセン
スプライマーの配列を以下に示す。
のＮ末端からのアミノ酸配列の６番目のプロリンから13
番目のアスパラギン酸に対応する塩基配列を予想し、オ
リゴヌクレオチドを合成した。このオロゴヌクレオチド
をＰＣＲのアンチセンスプライマーとした。アンチセン
スプライマーの配列を以下に示す。
【０１２８】 3'-GGT CGI ACC ATA TGI ACT GCI CT-5' （I：イノシン） C G T A G
【０１２９】合成したＤＮＡはそれぞれ20μＭの濃度に
なるようにＴＥに溶解した。
なるようにＴＥに溶解した。
【０１３０】(7) ＡＳＯＤ遺伝子を含有する部分ＤＮＡ
断片の取得 ＡＳＯＤを含む特定のＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法によっ
て、単離増幅した〔Saiki, R. F. et al., Science、23
0巻、1350−1354頁（1985）〕、Mullia, K. B.及びFalo
ona,F. A., Methods in Enzymology、155巻、335−350
頁（1987）〕。
断片の取得 ＡＳＯＤを含む特定のＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法によっ
て、単離増幅した〔Saiki, R. F. et al., Science、23
0巻、1350−1354頁（1985）〕、Mullia, K. B.及びFalo
ona,F. A., Methods in Enzymology、155巻、335−350
頁（1987）〕。
【０１３１】(a) ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅 反応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のＤＮＡ Thermal Cycler（ＤＮＡ増
幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りで
ある。
製）を用い、同社のＤＮＡ Thermal Cycler（ＤＮＡ増
幅装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りで
ある。
【０１３２】 （終濃度） H2O 62.5 μｌ [10×]Reaction buffer 10 μｌ ［１×］ dNTPs, Mix 1.25 mM 16 μｌ 200 μＭ センスプライマー 5 μｌ ４ μＭ アンチセンスプライマー 5 μｌ ４ μＭ 染色体ＤＮＡ 1 μｌ AmpliTaqTMDNAポリメラーゼ 0.5 μｌ 2.5ｕ／TEST 100 μｌ
【０１３３】上記の反応液100μlを混合し、ミネラルオ
イル（Sigma社製）100μlを加えた。次に反応液の入っ
たチューブをＤＮＡ Thermal Cyclerにセットし、以下
の条件で反応を行った。
イル（Sigma社製）100μlを加えた。次に反応液の入っ
たチューブをＤＮＡ Thermal Cyclerにセットし、以下
の条件で反応を行った。
【０１３４】 94℃ 45秒 45℃ １分 72℃ ２分
【０１３５】この条件下で反応を30サイクル行った後、
更に72℃で５分間インキュベートした。
更に72℃で５分間インキュベートした。
【０１３６】(b) 増幅されたＤＮＡの回収 反応後、ミネラルオイルを除き、100μlのクロロホルム
を加え、混合し、15,000回転／分、２分間の遠心分離
（トミー精工社製）を行い、上清を100μl回収した。こ
のうち５μlを用い、１％アガロース電気泳動で回収さ
れたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果約400bp
のＤＮＡ断片が約２μg増幅されていることが判った。
を加え、混合し、15,000回転／分、２分間の遠心分離
（トミー精工社製）を行い、上清を100μl回収した。こ
のうち５μlを用い、１％アガロース電気泳動で回収さ
れたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果約400bp
のＤＮＡ断片が約２μg増幅されていることが判った。
【０１３７】残りの95μlを１％低融点アガロース電気
泳動にかけ、約400bpに相当するバンドを切り出し、65
℃で溶かした後、１倍量のフェノールを加え混合し、遠
心後、水層部分をさらにフェノール／クロロホルム及び
クロロホルムで順次処理した後、水層に３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを0.1倍量、エタノールを２倍量添加し、−80℃で1
5分間置いた。次に15,000回転/分、10分間、４℃の遠心
後、沈澱を20μlのＴＥに溶かした。この操作で約１μg
のＤＮＡ断片が回収された。
泳動にかけ、約400bpに相当するバンドを切り出し、65
℃で溶かした後、１倍量のフェノールを加え混合し、遠
心後、水層部分をさらにフェノール／クロロホルム及び
クロロホルムで順次処理した後、水層に３Ｍ酢酸ナトリ
ウムを0.1倍量、エタノールを２倍量添加し、−80℃で1
5分間置いた。次に15,000回転/分、10分間、４℃の遠心
後、沈澱を20μlのＴＥに溶かした。この操作で約１μg
のＤＮＡ断片が回収された。
【０１３８】このＤＮＡ断片にT4ＤＮＡポリメラーゼを
作用させて両末端を平滑化し、pUC19のSmaIサイトにサ
ブクローニングし、プラスミドpASO3を得た。このプラ
スミドを２本鎖のままポリエチレングリコールにより精
製し、アルカリで変性させた後、シーケナーゼシステム
（ＵＳＢ社製）を用いて、デオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーション法により5'-及び3'-部位の塩基配列
を決定した。
作用させて両末端を平滑化し、pUC19のSmaIサイトにサ
ブクローニングし、プラスミドpASO3を得た。このプラ
スミドを２本鎖のままポリエチレングリコールにより精
製し、アルカリで変性させた後、シーケナーゼシステム
（ＵＳＢ社製）を用いて、デオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーション法により5'-及び3'-部位の塩基配列
を決定した。
【０１３９】その結果、5'-及び3'-部位の塩基配列は部
分ＡＳＯＤのＮ末端の４位〜20位のアミノ酸配列及びペ
プチドＤの１位〜13位のアミノ酸配列をコードする塩基
配列とそれぞれ完全に一致した。
分ＡＳＯＤのＮ末端の４位〜20位のアミノ酸配列及びペ
プチドＤの１位〜13位のアミノ酸配列をコードする塩基
配列とそれぞれ完全に一致した。
【０１４０】このフラグメントは全長のゲノムＤＮＡク
ローンを分離するための遺伝子ライブラリーのスクリー
ニングにおいてプローブとして使用した。
ローンを分離するための遺伝子ライブラリーのスクリー
ニングにおいてプローブとして使用した。
【０１４１】(8) ＡＳＯＤ遺伝子を含有するファージの
分離 (7)(b)で得られた400bpのＰＣＲによる生産物をマルチ
プライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社製）
を用いて[α-32P]dCTPでラベルし、これをプローブとし
てユウペニシリウム ブレフェエルディアムAPC-9315か
らの7.5×104のインデペンデントファージからなる遺伝
子ライブラリーからＡＳＯＤ遺伝子を有するファージを
スクリーニングした。
分離 (7)(b)で得られた400bpのＰＣＲによる生産物をマルチ
プライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社製）
を用いて[α-32P]dCTPでラベルし、これをプローブとし
てユウペニシリウム ブレフェエルディアムAPC-9315か
らの7.5×104のインデペンデントファージからなる遺伝
子ライブラリーからＡＳＯＤ遺伝子を有するファージを
スクリーニングした。
【０１４２】即ち、プラークをナイロン膜Hybond N
+（アマシャム社製）にリフティングし、アルカリ固定
した後、このフィルターと上記のラベルした400bpのＤ
ＮＡ断片をハイブリダイズさせた。
+（アマシャム社製）にリフティングし、アルカリ固定
した後、このフィルターと上記のラベルした400bpのＤ
ＮＡ断片をハイブリダイズさせた。
【０１４３】その結果、14個のプラークがプローブにハ
イブリダイズした。それらのプラークから分離した14個
の組換え体ファージを制限酵素地図とサザンブロッティ
ングによって分析した。
イブリダイズした。それらのプラークから分離した14個
の組換え体ファージを制限酵素地図とサザンブロッティ
ングによって分析した。
【０１４４】これらのファージにはすべてに共通して、
400bpのＰＣＲ生成物と強くハイブリダイズする18kbp B
glII及び4.2kbp EcoRIの各フラグメントを有していた。
400bpのＰＣＲ生成物と強くハイブリダイズする18kbp B
glII及び4.2kbp EcoRIの各フラグメントを有していた。
【０１４５】(9) ＡＳＯＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片
の塩基配列の決定 4.2kbp EcoRI断片をpUC19のEcoRIサイトにサブクローニ
ングし、4.2kbp EcoRI断片が互いに逆方向に挿入された
プラスミドpASO3およびpASOR3を作成した。この4.2kbp
EcoRI断片の制限酵素地図を図６に示す。
の塩基配列の決定 4.2kbp EcoRI断片をpUC19のEcoRIサイトにサブクローニ
ングし、4.2kbp EcoRI断片が互いに逆方向に挿入された
プラスミドpASO3およびpASOR3を作成した。この4.2kbp
EcoRI断片の制限酵素地図を図６に示す。
【０１４６】この両プラスミドをエキソヌクレアーゼII
I、なた豆のヌクレアーゼを用いていくつかの欠失プラ
スミドを作成し、それらのプラスミドについて、(7)(b)
に記載の方法で塩基配列を決定した。決定した塩基配列
から予測されるアミノ酸配列には、精製したＡＳＯＤの
Ｎ末端から決定した20残基のアミノ酸配列、ペプチドＤ
の20残基のアミノ酸配列、及びペプチドL-34，L-39の各
12残基のアミノ酸配列が完全に含まれていた。ここで、
図６中の＊印をつけたSalI切断部位から下流のの塩基配
列は配列番号：５に示すとおりであった。
I、なた豆のヌクレアーゼを用いていくつかの欠失プラ
スミドを作成し、それらのプラスミドについて、(7)(b)
に記載の方法で塩基配列を決定した。決定した塩基配列
から予測されるアミノ酸配列には、精製したＡＳＯＤの
Ｎ末端から決定した20残基のアミノ酸配列、ペプチドＤ
の20残基のアミノ酸配列、及びペプチドL-34，L-39の各
12残基のアミノ酸配列が完全に含まれていた。ここで、
図６中の＊印をつけたSalI切断部位から下流のの塩基配
列は配列番号：５に示すとおりであった。
【０１４７】成熟ＡＳＯＤのＮ末端アミノ酸は＊印をつ
けたSalI切断部位の塩基配列がコードするValであっ
た。この成熟ＡＳＯＤのＮ末端アミノ酸であるValの上
流に、プレプロ領域と推定されるMetから始まる18アミ
ノ酸残基が見られた。図６の矢印はこのMetからＡＳＯ
ＤのＣ末端アミノ酸までをコードするＤＮＡ領域を示
す。
けたSalI切断部位の塩基配列がコードするValであっ
た。この成熟ＡＳＯＤのＮ末端アミノ酸であるValの上
流に、プレプロ領域と推定されるMetから始まる18アミ
ノ酸残基が見られた。図６の矢印はこのMetからＡＳＯ
ＤのＣ末端アミノ酸までをコードするＤＮＡ領域を示
す。
【０１４８】(10)ｃＤＮＡ断片の単離 (a) ＰＣＲのための鋳型１本鎖ｃＤＮＡの合成 (3)で得られたｍＲＮＡ（１μg）から下記の組成液20μ
l中で１本鎖ｃＤＮＡを調製した。
l中で１本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【０１４９】 20 mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.4） 2.5mM 塩化マグネシウム 50 mM 塩化カリウム 0.1μg／ml ＢＳＡ 5 mM ジチオスレイトール 0.5mM ｄＮＴＰ混液 0.025μg／ml オリゴd(T) 10単位 RNaseH- 逆転写酵素（商品名：SuperS
criptTM、ＢＲＬ社製）
criptTM、ＢＲＬ社製）
【０１５０】(b) ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅 (10)(a)で得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、(7)
(a)で述べたＰＣＲ法により増幅した。尚、センスプラ
イマーとして、
(a)で述べたＰＣＲ法により増幅した。尚、センスプラ
イマーとして、
【０１５１】 EX-1: 5'-ATT CTA GAC ATC ATG CGT TCC TAT ACT TTG-3'
【０１５２】アンチセンスプライマーとして、
【０１５３】 B-1 : 3'-CGT TGG CTC ACA ACA ACT ATC CTA GGT G-5'
【０１５４】の各オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機を
利用して合成した。これらの塩基配列は4.2kbp EcoRI断
片中のＡＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直上
流と終始コドンの直下流の塩基配列を部分的に決定し、
これらの配列情報をもとにデザインした。
利用して合成した。これらの塩基配列は4.2kbp EcoRI断
片中のＡＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直上
流と終始コドンの直下流の塩基配列を部分的に決定し、
これらの配列情報をもとにデザインした。
【０１５５】ＰＣＲの結果、約1.0kbpのｃＤＮＡ断片が
得られた。この断片をXbaI/BamHI消化後、pUC19のXbaI/
BamHIサイトにサブクローニングしてpAXB1を得た。この
約1.0kbpのXbaI/BamHI断片の制限酵素地図を図７に示
す。ここで両端のXbaI，BamHI両サイトはｃＤＮＡのク
ローニングに用いたＰＣＲプライマーの塩基配列由来で
ある。このＤＮＡ断片について(5)に従い塩基配列を決
定した。開始コドンから終始コドンまでの塩基配列は、
例えばEco47III部位近傍に見られたイントロンの配列以
外は、ゲノム遺伝子の塩基配列と一致した。
得られた。この断片をXbaI/BamHI消化後、pUC19のXbaI/
BamHIサイトにサブクローニングしてpAXB1を得た。この
約1.0kbpのXbaI/BamHI断片の制限酵素地図を図７に示
す。ここで両端のXbaI，BamHI両サイトはｃＤＮＡのク
ローニングに用いたＰＣＲプライマーの塩基配列由来で
ある。このＤＮＡ断片について(5)に従い塩基配列を決
定した。開始コドンから終始コドンまでの塩基配列は、
例えばEco47III部位近傍に見られたイントロンの配列以
外は、ゲノム遺伝子の塩基配列と一致した。
【０１５６】(11) ＡＳＯＤ発現カセットの構築 (10)で得たpAXB1を制限酵素XbaIおよびBamHIで処理後、
分解混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供し、約
1.0kbpのＤＮＡ断片を単離、精製した。このＤＮＡ断片
をpY1（特開平6-245777）のXbaI/BamHIサイトにクロー
ニングし、pAC1を得た。（図８）
分解混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供し、約
1.0kbpのＤＮＡ断片を単離、精製した。このＤＮＡ断片
をpY1（特開平6-245777）のXbaI/BamHIサイトにクロー
ニングし、pAC1を得た。（図８）
【０１５７】実施例６ ＡＳＯＤ遺伝子の酵母サッカロ
マイセス セレビシエでの発現 実施例５の(11)で得られたpAC1をHindIIIで部分消化
後、分解混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供
し、ＡＳＯＤの発現カセットである約2.1kbpのＤＮＡ断
片を単離、精製した。このＤＮＡ断片をサッカロマイセ
ス セレビシエの選択マーカーとなるLeu2遺伝子を有す
る形質転換プラスミドpL1（Biosci. Biotech. Bioche
m., 56, 315-319 (1992)）のHindIIIサイトに連結し、p
LAC1を得た（図９）。
マイセス セレビシエでの発現 実施例５の(11)で得られたpAC1をHindIIIで部分消化
後、分解混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供
し、ＡＳＯＤの発現カセットである約2.1kbpのＤＮＡ断
片を単離、精製した。このＤＮＡ断片をサッカロマイセ
ス セレビシエの選択マーカーとなるLeu2遺伝子を有す
る形質転換プラスミドpL1（Biosci. Biotech. Bioche
m., 56, 315-319 (1992)）のHindIIIサイトに連結し、p
LAC1を得た（図９）。
【０１５８】このpLAC1を用いて、サッカロマイセス
セレビシエSHY2株（ATCC 44770）を、伊藤らの方法〔J.
Bacteriol.，153巻、163-168頁（1983）〕により形質
転換した。得られた形質転換体をPYGal培地（２％ガラ
クトース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）50mlに
て30℃、３日間振とう培養した。
セレビシエSHY2株（ATCC 44770）を、伊藤らの方法〔J.
Bacteriol.，153巻、163-168頁（1983）〕により形質
転換した。得られた形質転換体をPYGal培地（２％ガラ
クトース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）50mlに
て30℃、３日間振とう培養した。
【０１５９】得られた培養上清液について、ＡＳＯＤ活
性を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はプラスミドpLAC1
を有する形質転換体の場合、0.3U/mlであった。対照と
して選択マーカー遺伝子を有するプラスミドpL1のみに
よる形質転換株を用い、上記と同様にして培養し、ＡＳ
ＯＤ活性の測定を行ったところ、活性は検出されなかっ
た。
性を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はプラスミドpLAC1
を有する形質転換体の場合、0.3U/mlであった。対照と
して選択マーカー遺伝子を有するプラスミドpL1のみに
よる形質転換株を用い、上記と同様にして培養し、ＡＳ
ＯＤ活性の測定を行ったところ、活性は検出されなかっ
た。
【０１６０】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッテ
ィング解析を行った。ウエスタンブロッティング解析に
は、精製ＡＳＯＤを用いてウサギで作製した抗ＡＳＯＤ
抗体を用いた。その結果、pLAC1による形質転換体の場
合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバン
ドが検出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体
と反応することを確認した。
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッテ
ィング解析を行った。ウエスタンブロッティング解析に
は、精製ＡＳＯＤを用いてウサギで作製した抗ＡＳＯＤ
抗体を用いた。その結果、pLAC1による形質転換体の場
合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバン
ドが検出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体
と反応することを確認した。
【０１６１】実施例７ ＡＳＯＤ遺伝子のペニシリウム
カマンベルチィーでの発現 ペニシリウム カマンベルチィーの選択マーカーとなる
ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を有する形質転換プラス
ミドpH1（特開平6-245776記載の方法で製する）を制限
酵素HindIIIで処理後、分解混合液を１％ 低融点アガロ
ース電気泳動に供し、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を
含む約2.2kbp ＤＮＡ断片を単離、精製した。このＤＮ
Ａ断片の両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し
た後、実施例５の(11)で得た組換えプラスミドpAC1の制
限酵素SspIサイトにクローニングし、pHAC1を得た（図
１０）。
カマンベルチィーでの発現 ペニシリウム カマンベルチィーの選択マーカーとなる
ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を有する形質転換プラス
ミドpH1（特開平6-245776記載の方法で製する）を制限
酵素HindIIIで処理後、分解混合液を１％ 低融点アガロ
ース電気泳動に供し、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を
含む約2.2kbp ＤＮＡ断片を単離、精製した。このＤＮ
Ａ断片の両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し
た後、実施例５の(11)で得た組換えプラスミドpAC1の制
限酵素SspIサイトにクローニングし、pHAC1を得た（図
１０）。
【０１６２】次にこのpHAC1を用いて、ペニシリウム
カマンベルチィーを、特開平6-245776に記載の方法に準
じて形質転換した。選択培地に生育してきた形質転換体
を大豆油培地（３％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3%NaN
O3、0.1%K2HPO4、0.05%KCl、0.05%MgSO4・7H2O、0.001%FeS
O4・12H2O）100mlにて30℃、７日間振とう培養した。
カマンベルチィーを、特開平6-245776に記載の方法に準
じて形質転換した。選択培地に生育してきた形質転換体
を大豆油培地（３％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3%NaN
O3、0.1%K2HPO4、0.05%KCl、0.05%MgSO4・7H2O、0.001%FeS
O4・12H2O）100mlにて30℃、７日間振とう培養した。
【０１６３】得られた培養液について、ＡＳＯＤ活性を
測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpHAC1による形質転換
株の場合14.9U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有す
るプラスミドpH1のみによる形質転換株を用い、上記と
同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は検出されなかった。
測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpHAC1による形質転換
株の場合14.9U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有す
るプラスミドpH1のみによる形質転換株を用い、上記と
同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は検出されなかった。
【０１６４】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pHAC1に
よる形質転換体の場合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量
のタンパク質のバンドが検出され、このタンパク質がＡ
ＳＯＤに対する抗体と反応することを確認した。
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pHAC1に
よる形質転換体の場合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量
のタンパク質のバンドが検出され、このタンパク質がＡ
ＳＯＤに対する抗体と反応することを確認した。
【０１６５】実施例８ ＡＳＯＤ遺伝子のアスペルギル
ス オリゼでの発現 アスペルギルス オリゼの選択マーカーとなるniaD遺伝
子を有する形質転換プラスミドpSTA14（Mol. Gen. Gene
t.,218巻、99-104頁(1989)）を制限酵素HindIII処理
後、分解混合液を１％ 低融点アガロース電気泳動に供
し、niaD遺伝子を含む約5.5kb ＤＮＡ断片を単離、精製
した。このＤＮＡ断片の両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑化した後、実施例５の(11)で得た組換えプラ
スミドpAC1の制限酵素SspIサイトにクローニングし、プ
ラスミドpNAC1を得た（図１１）。
ス オリゼでの発現 アスペルギルス オリゼの選択マーカーとなるniaD遺伝
子を有する形質転換プラスミドpSTA14（Mol. Gen. Gene
t.,218巻、99-104頁(1989)）を制限酵素HindIII処理
後、分解混合液を１％ 低融点アガロース電気泳動に供
し、niaD遺伝子を含む約5.5kb ＤＮＡ断片を単離、精製
した。このＤＮＡ断片の両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑化した後、実施例５の(11)で得た組換えプラ
スミドpAC1の制限酵素SspIサイトにクローニングし、プ
ラスミドpNAC1を得た（図１１）。
【０１６６】このpNAC1を用いて、アスペルギルス オ
リゼA01.1株（Mol. Gen. Genet.、218巻、99-104頁(198
9)）を、Unklesらの方法（Mol. Gen. Genet.、218巻、9
9-104頁 (1989)）に準じて形質転換した。選択培地に生
育してきた形質転換体を実施例７と同様の方法で培養し
た。
リゼA01.1株（Mol. Gen. Genet.、218巻、99-104頁(198
9)）を、Unklesらの方法（Mol. Gen. Genet.、218巻、9
9-104頁 (1989)）に準じて形質転換した。選択培地に生
育してきた形質転換体を実施例７と同様の方法で培養し
た。
【０１６７】得られた培養ろ液について、ＡＳＯＤ活性
を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpNAC1による形質転
換株の場合2.0U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有
するプラスミドpSTA14のみによる形質転換株を用い、上
記と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったと
ころ、活性は検出されなかった。
を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpNAC1による形質転
換株の場合2.0U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有
するプラスミドpSTA14のみによる形質転換株を用い、上
記と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったと
ころ、活性は検出されなかった。
【０１６８】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従い糖鎖除去後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティ
ング解析を行ったところ、pNAC1による形質転換体の場
合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバン
ドが検出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体
と反応することを確認した。
いて、実施例５の(6)に従い糖鎖除去後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティ
ング解析を行ったところ、pNAC1による形質転換体の場
合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバン
ドが検出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体
と反応することを確認した。
【０１６９】実施例９ ＡＳＯＤ遺伝子のアスペルギル
ス ニガーでの発現 実施例７に記載したpHAC1を用いて、アスペルギルス
ニガーを特開平6-245776に記載の方法に準じて形質転換
した。ただし重層するソフトアガー中のハイグロマイシ
ンＢ濃度は307.5μg/mlとした。選択培地に生育してき
た形質転換体を実施例７と同様の方法で培養した。
ス ニガーでの発現 実施例７に記載したpHAC1を用いて、アスペルギルス
ニガーを特開平6-245776に記載の方法に準じて形質転換
した。ただし重層するソフトアガー中のハイグロマイシ
ンＢ濃度は307.5μg/mlとした。選択培地に生育してき
た形質転換体を実施例７と同様の方法で培養した。
【０１７０】得られた培養ろ液について、ＡＳＯＤ活性
を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpHAC1による形質転
換株の場合0.2U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有
するプラスミドpH1のみによる形質転換株を用い、上記
と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は検出されなかった。
を測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpHAC1による形質転
換株の場合0.2U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有
するプラスミドpH1のみによる形質転換株を用い、上記
と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は検出されなかった。
【０１７１】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pHAC1に
よる形質転換体の場合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量
のタンパク質のバンドが検出され、このタンパク質がＡ
ＳＯＤに対する抗体と反応することを確認した。
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pHAC1に
よる形質転換体の場合にのみ、ＡＳＯＤと同様の分子量
のタンパク質のバンドが検出され、このタンパク質がＡ
ＳＯＤに対する抗体と反応することを確認した。
【０１７２】実施例１０ ＡＳＯＤ遺伝子のユウペニシ
リウム ブレフェルディアムでの発現 ユウペニシリウム ブレフェルディアムの選択マーカー
となるフレオマイシン耐性遺伝子を有する形質転換プラ
スミドpUT720を制限酵素EcoRI及びXbaIで処理後、分解
混合液を１％ 低融点アガロース電気泳動に供し、フレ
オマイシン耐性遺伝子を含む約3.1kbp ＤＮＡ断片を単
離、精製した。このＤＮＡ断片の両末端をT4ＤＮＡポリ
メラーゼにて平滑化し、実施例５の(11)で得た組換えプ
ラスミドpAC1の制限酵素SspIサイトにクローニングし、
プラスミドpPAC1を得た（図１２）。
リウム ブレフェルディアムでの発現 ユウペニシリウム ブレフェルディアムの選択マーカー
となるフレオマイシン耐性遺伝子を有する形質転換プラ
スミドpUT720を制限酵素EcoRI及びXbaIで処理後、分解
混合液を１％ 低融点アガロース電気泳動に供し、フレ
オマイシン耐性遺伝子を含む約3.1kbp ＤＮＡ断片を単
離、精製した。このＤＮＡ断片の両末端をT4ＤＮＡポリ
メラーゼにて平滑化し、実施例５の(11)で得た組換えプ
ラスミドpAC1の制限酵素SspIサイトにクローニングし、
プラスミドpPAC1を得た（図１２）。
【０１７３】次にこのpPAC1を用いて、ユウペニシリウ
ム ブレフェルディアムAPC-9315株（FERM BP-5053）を
以下の方法で形質転換した。
ム ブレフェルディアムAPC-9315株（FERM BP-5053）を
以下の方法で形質転換した。
【０１７４】ユウペニシリウム ブレフェルディアムの
胞子懸濁液（２×108）100μlを100mlのぶどう糖−ペプ
トン培地（栄研化学社製）に接種し37℃、48時間振とう
培養後、培養物をろ過し菌体を集めた。この菌体を10ml
のプロトプラスト化緩衝液［1.2Mソルヒ゛トール,10mM リン酸
緩衝液(pH6.0)］に懸濁し、ろ過することにより洗浄菌
体を集めた。
胞子懸濁液（２×108）100μlを100mlのぶどう糖−ペプ
トン培地（栄研化学社製）に接種し37℃、48時間振とう
培養後、培養物をろ過し菌体を集めた。この菌体を10ml
のプロトプラスト化緩衝液［1.2Mソルヒ゛トール,10mM リン酸
緩衝液(pH6.0)］に懸濁し、ろ過することにより洗浄菌
体を集めた。
【０１７５】この洗浄菌体を５mg/mlのライジング エ
ンザイム（Sigma Product number L-2265,Sigma社製）
を含むプロトプラスト化緩衝液に懸濁し、30℃で２時間
振とう後、ガラスフィルター３Ｇ２でろ過し、ろ液を20
00rpm，５分間の遠心分離に供し沈澱物を得た。この沈
澱物をソルビトール溶液［1.2Mソルヒ゛トール,50mM CaCl2,10m
M トリス塩酸緩衝液(pH7.5)］に懸濁し、沈澱物を回収し
た。この操作を再度繰り返し、プロトプラストを沈澱物
として回収した。
ンザイム（Sigma Product number L-2265,Sigma社製）
を含むプロトプラスト化緩衝液に懸濁し、30℃で２時間
振とう後、ガラスフィルター３Ｇ２でろ過し、ろ液を20
00rpm，５分間の遠心分離に供し沈澱物を得た。この沈
澱物をソルビトール溶液［1.2Mソルヒ゛トール,50mM CaCl2,10m
M トリス塩酸緩衝液(pH7.5)］に懸濁し、沈澱物を回収し
た。この操作を再度繰り返し、プロトプラストを沈澱物
として回収した。
【０１７６】沈澱物にプロトプラスト濃度が２×108／m
lとなるようにソルビトール溶液を加え、懸濁し、プロ
トプラスト溶液を得た。プロトプラスト溶液50μlに、
４μlのpPAC1溶液（１μg/μl）、6.25μlのＰＥＧ溶液
［50% PEG4000,50mM CaCl2,10mM トリス塩酸緩衝液,(pH7.
5)］を加え混合後、氷上に30分間静置した。次に0.5ml
のＰＥＧ溶液を加え、更に１mlのソルビトール溶液を加
え混合した。
lとなるようにソルビトール溶液を加え、懸濁し、プロ
トプラスト溶液を得た。プロトプラスト溶液50μlに、
４μlのpPAC1溶液（１μg/μl）、6.25μlのＰＥＧ溶液
［50% PEG4000,50mM CaCl2,10mM トリス塩酸緩衝液,(pH7.
5)］を加え混合後、氷上に30分間静置した。次に0.5ml
のＰＥＧ溶液を加え、更に１mlのソルビトール溶液を加
え混合した。
【０１７７】この混合液300μlを17mlの1.5％アガロー
スを含むＰＤ［2.4％ポテト−デキストロース−ブロス
（Difco社製）］からなるプレートにのせ、更に予め48
℃に保温しておいた0.7％アガロースを含むＰＤ３mlを
重層し、30℃、24時間放置後、1.54mg/mlのフレオマイ
シン（CAYLA社製）、0.7％アガロースを含むＰＤ３mlを
重層し、30℃、４日間放置し、プレート上に出現したコ
ロニーを1.5％アガロースを含むＰＤスラント培地に植
え継ぎ、形質転換株として保存した。
スを含むＰＤ［2.4％ポテト−デキストロース−ブロス
（Difco社製）］からなるプレートにのせ、更に予め48
℃に保温しておいた0.7％アガロースを含むＰＤ３mlを
重層し、30℃、24時間放置後、1.54mg/mlのフレオマイ
シン（CAYLA社製）、0.7％アガロースを含むＰＤ３mlを
重層し、30℃、４日間放置し、プレート上に出現したコ
ロニーを1.5％アガロースを含むＰＤスラント培地に植
え継ぎ、形質転換株として保存した。
【０１７８】選択培地に生育してきた形質転換株を２×
グリセロール−ポリペプトン培地［４％グリセロール，
６％ポリペプトン，0.4% KH2PO4,0.02% MgSO4・7H2O,0.0
01%アデカノール （pH6.0）]100mlに接種し、37℃、６
日間振とう培養した。
グリセロール−ポリペプトン培地［４％グリセロール，
６％ポリペプトン，0.4% KH2PO4,0.02% MgSO4・7H2O,0.0
01%アデカノール （pH6.0）]100mlに接種し、37℃、６
日間振とう培養した。
【０１７９】得られた培養液について、ＡＳＯＤ活性を
測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpPAC1による形質転換
株の場合18.5U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有す
るプラスミドpUT720のみによる形質転換株を用い、上記
と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は1.8u/mlであった。
測定したところ、ＡＳＯＤ活性はpPAC1による形質転換
株の場合18.5U/mlであった。選択マーカー遺伝子を有す
るプラスミドpUT720のみによる形質転換株を用い、上記
と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性の測定を行ったとこ
ろ、活性は1.8u/mlであった。
【０１８０】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pPAC1に
よる形質転換体、対照のpUT720による形質転換体とも
に、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバンドが検
出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体と反応
することを確認した。また、pPAC1による形質転換体の
シグナルはpUT720による形質転換体に比べ約10倍強いシ
グナルが得られた。
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pPAC1に
よる形質転換体、対照のpUT720による形質転換体とも
に、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバンドが検
出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体と反応
することを確認した。また、pPAC1による形質転換体の
シグナルはpUT720による形質転換体に比べ約10倍強いシ
グナルが得られた。
【０１８１】実施例１１ ＡＳＯＤ遺伝子のユウペニシ
リウム ブレフェルディアムでの発現 実施例５の(9)で得られたpASO3をEcoRIで消化後、分解
混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供し、ＡＳＯ
Ｄ遺伝子を含む約4.2kbpのＤＮＡ断片を単離、精製し
た。このＤＮＡ断片をユウペニシリウム ブレフェルデ
ィアムの選択マーカーとなるフレオマイシン耐性遺伝子
を有するpUT720（CAYLA社製）のEcoRIサイトにクローニ
ングしpASOE1を得た（図１３）。
リウム ブレフェルディアムでの発現 実施例５の(9)で得られたpASO3をEcoRIで消化後、分解
混合物を１％低融点アガロース電気泳動に供し、ＡＳＯ
Ｄ遺伝子を含む約4.2kbpのＤＮＡ断片を単離、精製し
た。このＤＮＡ断片をユウペニシリウム ブレフェルデ
ィアムの選択マーカーとなるフレオマイシン耐性遺伝子
を有するpUT720（CAYLA社製）のEcoRIサイトにクローニ
ングしpASOE1を得た（図１３）。
【０１８２】このpASOE1を用いて、ユウペニシリウム
ブレフェルディアムAPC-9315株を実施例１０に従って形
質転換した。
ブレフェルディアムAPC-9315株を実施例１０に従って形
質転換した。
【０１８３】形質転換株はいずれも、300μg/mlのフレ
オマイシンを含む培地においても良好に生育したのに対
し元株であるユウペニシリウム ブレフェルディアムAP
C-9315は40μg/ml以上のフレオマイシンを含む培地では
生育不能であった。この形質転換株が獲得したフレオマ
イシン耐性の性質は２回の単胞子分離後も安定に保持さ
れていた。
オマイシンを含む培地においても良好に生育したのに対
し元株であるユウペニシリウム ブレフェルディアムAP
C-9315は40μg/ml以上のフレオマイシンを含む培地では
生育不能であった。この形質転換株が獲得したフレオマ
イシン耐性の性質は２回の単胞子分離後も安定に保持さ
れていた。
【０１８４】形質転換株を実施例１０記載の方法で培養
した。得られた培養ろ液について、ＡＳＯＤ活性を測定
したところ、ＡＳＯＤ活性は、プラスミドpASOE1を有す
る形質転換体の場合、25.8U/mlであった。また、選択マ
ーカー遺伝子を有するプラスミドpUT720のみによる形質
転換株を用い、上記と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性
の測定を行ったところ、活性は1.4U/mlであった。
した。得られた培養ろ液について、ＡＳＯＤ活性を測定
したところ、ＡＳＯＤ活性は、プラスミドpASOE1を有す
る形質転換体の場合、25.8U/mlであった。また、選択マ
ーカー遺伝子を有するプラスミドpUT720のみによる形質
転換株を用い、上記と同様にして培養及びＡＳＯＤ活性
の測定を行ったところ、活性は1.4U/mlであった。
【０１８５】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pASOE1に
よる形質転換体、対照のpUT720による形質転換体とも
に、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバンドが検
出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体と反応
することを確認した。また、pASOE1による形質転換体の
シグナルはpUT720による形質転換体に比べ約18倍強いシ
グナルが得られた。
いて、実施例５の(6)に従って糖鎖除去後、実施例６と
同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウ
エスタンブロッティング解析を行ったところ、pASOE1に
よる形質転換体、対照のpUT720による形質転換体とも
に、ＡＳＯＤと同様の分子量のタンパク質のバンドが検
出され、このタンパク質がＡＳＯＤに対する抗体と反応
することを確認した。また、pASOE1による形質転換体の
シグナルはpUT720による形質転換体に比べ約18倍強いシ
グナルが得られた。
【０１８６】実施例１２ 血中のコレステロールの測定 血清中の全コレステロールの測定の際のアスコルビン酸
による干渉作用を除去するために実施例２で得られたＡ
ＳＯＤ、実施例１１で得られたＡＳＯＤ及びキュウリ由
来のＡＳＯを添加し、その効果を測定した。
による干渉作用を除去するために実施例２で得られたＡ
ＳＯＤ、実施例１１で得られたＡＳＯＤ及びキュウリ由
来のＡＳＯを添加し、その効果を測定した。
【０１８７】 （試薬−１）：ＡＳＯＤ（ＡＳＯ） 3.0 unit／ml コレステロールエステラーゼ 1.0 unit／ml パーオキシダーゼ 2.5 unit／ml フェノール 1.1 mM ピペラジン−N,N'−ビス（２−エタン スルホン酸）（PIPES）緩衝液（pH6.75） 30 mM トリトンＸ−100 0.1 ％
【０１８８】 （試薬−２）：コレステロールオキシダーゼ 5.0 unit／ml パーオキシダーゼ 25.0 unit／ml ４−アミノアンチピリン 2.2 mM PIPES緩衝液（pH6.75） 30 mM トリトンＸ−100 0.1 ％
【０１８９】ヒト管理血清（リピッドセーラムII，栄研
化学製）10μlに（試薬−１）2.25mlを添加し、37℃，
５分間インキュベーションした後、（試薬−２）0.75ml
を添加し、更に37℃，５分間インキュベーションを行っ
た。その後、500nmにおけるの吸光度を測定した。盲検
としてヒト血清の代わりに精製水を使用した。
化学製）10μlに（試薬−１）2.25mlを添加し、37℃，
５分間インキュベーションした後、（試薬−２）0.75ml
を添加し、更に37℃，５分間インキュベーションを行っ
た。その後、500nmにおけるの吸光度を測定した。盲検
としてヒト血清の代わりに精製水を使用した。
【０１９０】
【表５】
【０１９１】表５から明らかな様に、本発明のＡＳＯＤ
の添加により、キュウリ由来ＡＳＯと同様に、Ｌ−アス
コルビン酸による発色阻害を防止できる。形質転換体に
より生産されたＡＳＯＤを用いても同様の結果が得られ
ることが判る。
の添加により、キュウリ由来ＡＳＯと同様に、Ｌ−アス
コルビン酸による発色阻害を防止できる。形質転換体に
より生産されたＡＳＯＤを用いても同様の結果が得られ
ることが判る。
【０１９２】実施例１３ ＡＳＯＤ配合試薬の安定性 実施例１２で調製した（試薬−１）を37℃で20日間保存
し、用時調製した（試薬−２）を用いて実施例４と同様
にしてコレステロールの定量を行った。その結果、キュ
ウリ由来のＡＳＯを用いた場合と比べ明らかに本発明の
ＡＳＯＤを用いた試薬は安定性に優れている。同様に実
施例１１により得られたＡＳＯＤを用いて調製した試薬
についてもその安定性は優れている。
し、用時調製した（試薬−２）を用いて実施例４と同様
にしてコレステロールの定量を行った。その結果、キュ
ウリ由来のＡＳＯを用いた場合と比べ明らかに本発明の
ＡＳＯＤを用いた試薬は安定性に優れている。同様に実
施例１１により得られたＡＳＯＤを用いて調製した試薬
についてもその安定性は優れている。
【０１９３】
【表６】
【０１９４】実施例１４ 血中のトリグリセライドの測
定 血清中のトリグリセライド測定の際のアスコルビン酸に
よる干渉作用を除去するために実施例２で得られたＡＳ
ＯＤを添加し、その結果を測定した。
定 血清中のトリグリセライド測定の際のアスコルビン酸に
よる干渉作用を除去するために実施例２で得られたＡＳ
ＯＤを添加し、その結果を測定した。
【０１９５】 （試薬−１）：グリセロールキナーゼ ７ U／ml グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ 22 U／ml パーオキシダーゼ ２ U／ml ＡＳＯＤ（ＡＳＯ） ２ U／ml ＴＯＯＳ 1.5 mM ［N-Ethyl-N-(2-hydoxy-3-sulfoproryl)-3-methylaniline］ ＡＴＰ ３ mM 酢酸マグネシウム 10 mM EDTA・２Na １ mM 界面活性剤 0.1 ％ アジ化ナトリウム 0.02 ％ デヒドロ酢酸ナトリウム 0.02 ％ PIPES・NaOH buffer,pH6.6 20 mM
【０１９６】 （試薬−２）：リポプロテインリパーゼ 600 U／ml パーオキシダーゼ 12 U／ml ４−アミノアンチピリン ３ mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ mM 界面活性剤 0.1 ％ アジ化ナトリウム 0.02 ％ デヒドロ酢酸ナトリウム 0.02 ％ PIPES・NaOH buffer,pH6.6 70 mM
【０１９７】ヒト管理血清（リピッドセーラムII，栄研
化学）27μl、Ｌ−アスコルビン酸（50mg／ml）３μlに
試薬１（2.25ml）を添加し、37℃、５分間インキュベー
ションした後、試薬−２（0.75ml）を添加し、更に37
℃、５分間インキュベーションを行った。その後、555n
mにおける吸光度を測定した。Ｌ−アスコルビン酸の代
わりに精製水を使用し、対照とした。
化学）27μl、Ｌ−アスコルビン酸（50mg／ml）３μlに
試薬１（2.25ml）を添加し、37℃、５分間インキュベー
ションした後、試薬−２（0.75ml）を添加し、更に37
℃、５分間インキュベーションを行った。その後、555n
mにおける吸光度を測定した。Ｌ−アスコルビン酸の代
わりに精製水を使用し、対照とした。
【０１９８】
【表７】
【０１９９】表７の結果から明らかなように本発明のＡ
ＳＯＤにより、アスコルビン酸による発色阻害を防止で
きる。又、本発明のＡＳＯＤによるＬ−アスコルビン酸
酸化に伴って生成する過酸化水素は測定値に影響しない
ことがわかる。同様に実施例１１により得られたＡＳＯ
Ｄを用いて調製した試薬を用いても測定値には影響しな
いことを確認した。
ＳＯＤにより、アスコルビン酸による発色阻害を防止で
きる。又、本発明のＡＳＯＤによるＬ−アスコルビン酸
酸化に伴って生成する過酸化水素は測定値に影響しない
ことがわかる。同様に実施例１１により得られたＡＳＯ
Ｄを用いて調製した試薬を用いても測定値には影響しな
いことを確認した。
【０２００】実施例１５ Ｌ−アスコルビン酸の定量 種々の濃度のＬ−アスコルビン酸を含む20mM酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（pH4.0）10μlに本発明のＡＳＯＤ 4
0μl（0.5U）を添加し、37℃、10分間反応し、Ｌ−アス
コルビン酸を完全にデヒドロアスコルビン酸に変換す
る。
ナトリウム緩衝液（pH4.0）10μlに本発明のＡＳＯＤ 4
0μl（0.5U）を添加し、37℃、10分間反応し、Ｌ−アス
コルビン酸を完全にデヒドロアスコルビン酸に変換す
る。
【０２０１】次いで、３mM ４−アミノアンチピリン、
１mM フェノール、８U／ml パーオキシダーゼを含む100
mM リン酸緩衝液（pH7.0）2.95mlを添加し、37℃、５分
間反応させ、Ｌ−アスコルビン酸の酸化反応の際に生じ
る過酸化水素量を４−アミノアンチピリンとフェノール
の酸化縮合色素の505nmにおける吸光度にて測定した。
その結果を図１４に示す。
１mM フェノール、８U／ml パーオキシダーゼを含む100
mM リン酸緩衝液（pH7.0）2.95mlを添加し、37℃、５分
間反応させ、Ｌ−アスコルビン酸の酸化反応の際に生じ
る過酸化水素量を４−アミノアンチピリンとフェノール
の酸化縮合色素の505nmにおける吸光度にて測定した。
その結果を図１４に示す。
【０２０２】図において横軸はＬ−アスコルビン酸濃度
（mM）を縦軸は505nmにおける吸光度値を示す。図１４
より被検液のＬ−アスコルビン酸含有量と吸光度の比例
関係を利用して被検液中のＬ−アスコルビン酸量を良好
に測定できることが明らかである。また、実施例１１で
得られた酵素を用いても同様の結果が得られた。
（mM）を縦軸は505nmにおける吸光度値を示す。図１４
より被検液のＬ−アスコルビン酸含有量と吸光度の比例
関係を利用して被検液中のＬ−アスコルビン酸量を良好
に測定できることが明らかである。また、実施例１１で
得られた酵素を用いても同様の結果が得られた。
【０２０３】実施例１６ 食品中のアスコルビン酸の定
量 実施例１５に基づき、レモン果汁中のＬ−アスコルビン
酸量を測定した。同時にヒドラジン比色法による測定を
行い、測定対照とした。
量 実施例１５に基づき、レモン果汁中のＬ−アスコルビン
酸量を測定した。同時にヒドラジン比色法による測定を
行い、測定対照とした。
【０２０４】その結果、レモン果汁100ml中に含まれる
アスコルビン酸量は本発明の方法では37.0mg（実施例１
５の検量線より算出）、ヒドラジン比色法［（総アスコ
ルビン酸量）−（デヒドロアスコルビン酸量）］では3
5.9mgであった。
アスコルビン酸量は本発明の方法では37.0mg（実施例１
５の検量線より算出）、ヒドラジン比色法［（総アスコ
ルビン酸量）−（デヒドロアスコルビン酸量）］では3
5.9mgであった。
【０２０５】上記結果より本発明ＡＳＯＤを用いて食品
中のＬ−アスコルビン酸量は良好に測定できることが明
らかである。また、実施例１１で得られた酵素を用いて
も同様の結果が得られた。
中のＬ−アスコルビン酸量は良好に測定できることが明
らかである。また、実施例１１で得られた酵素を用いて
も同様の結果が得られた。
【０２０６】実施例１７ 他のユウペニシリウム属（表１）の菌株について、及び
実施例４及び実施例５〜実施例１１で得られた酵素につ
いて実施例１２〜実施例１６と同様にして、各種測定を
行った結果、同様の結果が得られた。
実施例４及び実施例５〜実施例１１で得られた酵素につ
いて実施例１２〜実施例１６と同様にして、各種測定を
行った結果、同様の結果が得られた。
【発明の効果】本発明によれば、新規なＡＳＯＤ及び該
ＡＳＯＤをコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を組
み込んだ形質転換体を培養することによりＡＳＯＤを大
量かつ安価に製造することもできる。本発明のＡＳＯＤ
を用いることによって、臨床検査試薬、特に液状試薬の
製造において、干渉物質除去の目的で添加されていた既
知のＡＳＯの不安定性に起因する種々の安定化剤の添
加、保存期間中の失活に対する過剰添加が不要となる。
即ち、更に本発明のＡＳＯＤは従来のＡＳＯと比較し
て、保存安定性が非常に優れていること、アジ化ナトリ
ウムによって阻害されないこと、中性付近に至適pHを有
していること等より臨床検査用試薬への添加量を少なく
することができ、その結果としてコストの削減や夾雑物
質の影響を回避することも容易となる。
ＡＳＯＤをコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を組
み込んだ形質転換体を培養することによりＡＳＯＤを大
量かつ安価に製造することもできる。本発明のＡＳＯＤ
を用いることによって、臨床検査試薬、特に液状試薬の
製造において、干渉物質除去の目的で添加されていた既
知のＡＳＯの不安定性に起因する種々の安定化剤の添
加、保存期間中の失活に対する過剰添加が不要となる。
即ち、更に本発明のＡＳＯＤは従来のＡＳＯと比較し
て、保存安定性が非常に優れていること、アジ化ナトリ
ウムによって阻害されないこと、中性付近に至適pHを有
していること等より臨床検査用試薬への添加量を少なく
することができ、その結果としてコストの削減や夾雑物
質の影響を回避することも容易となる。
【０２０７】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Asp Pro Ala Ala Val Tyr Asn Gly Gly Tyr Asn Ser Thr Lys 15 Asn Val Ala Leu Arg 20
【０２０８】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 配列 Gly Ile Ala Lys Ser Pro Ala Trp Tyr Thr Trp Arg Asp His Phe 15 Leu Leu Val Gly Pro 20
【０２０９】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 配列 Phe Thr Gln Trp Ala Ile Ser Ala Glu Gly Gln Lys 12
【０２１０】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 配列 Asn Gly Ser Asp Pro Phe Glu Val Ala Trp Tyr Lys 12
【０２１１】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 配列 GTC GAC CCT GCT GCC GTC TAC AAT GGA GGG 30 Val Asp Pro Ala Ala Val Tyr Asn Gly Gly 10
【図１】ＡＳＯＤの至適pHを示す。
【図２】ＡＳＯＤの至適温度を示す。
【図３】ＡＳＯＤのpH安定性を示す。
【図４】ＡＳＯＤの温度安定性を示す。
【図５】アスコルビン酸酸化酵素の保存安定性を示すグ
ラフである。
ラフである。
図中で黒丸は本願発明のＡＳＯＤの結果を示し、白丸は
アクレモニウムsp. HI-25由来のＡＳＯを示し、白三角
はキュウリ由来のＡＳＯを示す。
アクレモニウムsp. HI-25由来のＡＳＯを示し、白三角
はキュウリ由来のＡＳＯを示す。
【図６】ＡＳＯＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の制限酵
素地図を示す。
素地図を示す。
【図７】ＡＳＯＤをコードするｃＤＮＡの制限酵素地図
を示す。
を示す。
【図８】組換えプラスミドpAC1の構築手順を示す。
【図９】組換えプラスミドpLAC1の構築手順を示す。
【図１０】組換えプラスミドpHAC1の構築手順を示す。
【図１１】組換えプラスミドpNAC1の構築手順を示す。
【図１２】組換えプラスミドpPAC1の構築手順を示す。
【図１３】組換えプラスミドpASOE1の構築手順を示す。
【図１４】実施例１５のＬ−アスコルビン酸の検量線を
示す。
示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年６月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７６】更に本発明のＡＳＯＤをコードする遺伝子
について詳述する。目的とする遺伝子をクローニングす
るためには、部分アミノ酸配列により推定したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングや抗体を用いたイムノスクリーニン
グなどの通常用いられてる方法が使用できる。
について詳述する。目的とする遺伝子をクローニングす
るためには、部分アミノ酸配列により推定したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングや抗体を用いたイムノスクリーニン
グなどの通常用いられてる方法が使用できる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】あるいはまた、精製した蛋白質、或いは酵
素法・化学法による蛋白質の切断によって生じた内部ペ
プチドのＮ末端アミノ酸配列のうち、異なる２ケ所のア
ミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドをデザインし、
合成する。これらオリゴヌクレオチドをセンスプライマ
ー、アンチセンスプライマーとしたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によ
り、ＤＮＡ断片を得ることができる。合成オリゴヌクレ
オチドとしては混合物或いはイノシンを含んだものも使
用できる［Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，１０３巻，６１頁（１９９１）］。得られたＤＮ
Ａ断片をプローブとして、例えばユウペニシリウム ブ
レフェルディアムＡＰＣ−９３１５のゲノムＤＮＡライ
ブラリーからＡＳＯＤ遺伝子をＤＮＡ断片として得るこ
とができる。
素法・化学法による蛋白質の切断によって生じた内部ペ
プチドのＮ末端アミノ酸配列のうち、異なる２ケ所のア
ミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドをデザインし、
合成する。これらオリゴヌクレオチドをセンスプライマ
ー、アンチセンスプライマーとしたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によ
り、ＤＮＡ断片を得ることができる。合成オリゴヌクレ
オチドとしては混合物或いはイノシンを含んだものも使
用できる［Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，１０３巻，６１頁（１９９１）］。得られたＤＮ
Ａ断片をプローブとして、例えばユウペニシリウム ブ
レフェルディアムＡＰＣ−９３１５のゲノムＤＮＡライ
ブラリーからＡＳＯＤ遺伝子をＤＮＡ断片として得るこ
とができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７８】同様にしてユウペニシリウム属の他の菌株
からもＡＳＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることがで
きる。ユウペニシリウム属の他の菌株としては例えば表
１に挙げた菌株が挙げられる。
からもＡＳＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることがで
きる。ユウペニシリウム属の他の菌株としては例えば表
１に挙げた菌株が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７９】更に上記遺伝子をクローニングした後、イ
ントロンを含まないｃＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により
得ることができる。ＰＣＲのプライマーには例えば、Ａ
ＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直上流と終止
コドンの直下流の塩基配列をもとにデザインし、合成し
たオリゴヌクレオチドを用いることができる。これらの
イントロンの有無、配列及び挿入位置は、遺伝子発現系
の諸要素、例えば宿主細胞の種類等に応じて当業者か容
易に選択し得るものである。
ントロンを含まないｃＤＮＡを、例えばＰＣＲ法により
得ることができる。ＰＣＲのプライマーには例えば、Ａ
ＳＯＤ遺伝子のコード領域の開始コドンの直上流と終止
コドンの直下流の塩基配列をもとにデザインし、合成し
たオリゴヌクレオチドを用いることができる。これらの
イントロンの有無、配列及び挿入位置は、遺伝子発現系
の諸要素、例えば宿主細胞の種類等に応じて当業者か容
易に選択し得るものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１９】（４）遺伝子ライブラリーの作成 （２）で得られた全ＤＮＡをＢｇｌＩＩで分解する。分
解されたＤＮＡを子牛の腸由来のアルカリフォスファタ
ーゼ（ベーリンガー社製）を用いて脱リン酸し、Ｆｒｉ
ｃｓｈａｕｆらの方法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０
巻、８２７−８４２頁（１９８７）〕に従って、λＤＡ
ＳＨＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＢａｍ ＨＩ
サイトにライゲートした。
解されたＤＮＡを子牛の腸由来のアルカリフォスファタ
ーゼ（ベーリンガー社製）を用いて脱リン酸し、Ｆｒｉ
ｃｓｈａｕｆらの方法〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０
巻、８２７−８４２頁（１９８７）〕に従って、λＤＡ
ＳＨＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＢａｍ ＨＩ
サイトにライゲートした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２０】ライゲーション混合物はインビトロでパッ
ケージし、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ
（Ｐ２）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にトランスフェ
クションした。その結果、３．８×１０５のインデペン
デントクローンよりなるライブラリーが作成できた。
ケージし、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ
（Ｐ２）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にトランスフェ
クションした。その結果、３．８×１０５のインデペン
デントクローンよりなるライブラリーが作成できた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３２】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３８】このＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を作用させて両末端を平滑化し、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ
サイトにサブクローニングし、プラスミドｐＡＳ０１を
得た。このプラスミドを２本鎖のままポリエチレングリ
コールにより精製し、アルカリで変性させた後、シーケ
ナーゼシステム（ＵＳＢ社製）を用いて、デオキシヌク
レオチドチェーンターミネーション法により５’−及び
３’−部位の塩基配列を決定した。
を作用させて両末端を平滑化し、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ
サイトにサブクローニングし、プラスミドｐＡＳ０１を
得た。このプラスミドを２本鎖のままポリエチレングリ
コールにより精製し、アルカリで変性させた後、シーケ
ナーゼシステム（ＵＳＢ社製）を用いて、デオキシヌク
レオチドチェーンターミネーション法により５’−及び
３’−部位の塩基配列を決定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (13)
- 【請求項１】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が少
なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸１分子と分子
状酸素１分子からＬ−デヒドロアスコルビン酸１分子と
過酸化水素１分子を生成する反応を触媒する新規なアス
コルビン酸酸化酵素。 - 【請求項２】ユウペニシリウム（Eupenicillium）属に
属する菌株より得ることができ、Ｌ−アスコルビン酸の
酸化反応を触媒する新規なアスコルビン酸酸化酵素。 - 【請求項３】ユウペニシリウム（Eupenicillium）属に
属する菌株を培養し、アスコルビン酸酸化酵素を生産せ
しめ、これを採取することを特徴とするアスコルビン酸
酸化酵素の製造法。 - 【請求項４】図面の図６の制限酵素地図を有するＤＮＡ
断片中に含まれるアスコルビン酸酸化酵素遺伝子。 - 【請求項５】図面の図６の制限酵素地図を有するＤＮＡ
断片中に含まれるアスコルビン酸酸化酵素をコードする
遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤ
ＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形質転換
体。 - 【請求項６】図面の図６の制限酵素地図を有するＤＮＡ
断片中に含まれるアスコルビン酸酸化酵素をコードする
遺伝子と、当該遺伝子の発現を促進する機能を有するＤ
ＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡを有する形質転換体
を培養し、当該培養物よりアスコルビン酸酸化酵素を採
取することを特徴とするアスコルビン酸酸化酵素の製造
法。 - 【請求項７】図面の図７の制限酵素地図を有するアスコ
ルビン酸酸化酵素をコードするｃＤＮＡ。 - 【請求項８】図面の図７の制限酵素地図を有するアスコ
ルビン酸酸化酵素をコードするｃＤＮＡと、当該遺伝子
の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含んでなる
組換えＤＮＡを有する形質転換体。 - 【請求項９】図面の図７の制限酵素地図を有するアスコ
ルビン酸酸化酵素をコードするｃＤＮＡと、当該遺伝子
の発現を促進する機能を有するＤＮＡ配列を含んでなる
組換えＤＮＡを有する形質転換体を培養し、当該培養物
よりアスコルビン酸酸化酵素を採取することを特徴とす
るアスコルビン酸酸化酵素の製造法。 - 【請求項１０】形質転換体がサッカロマイセス（Saccha
romyces）属、ペニシリウム（Penicillium）属、アスペ
ルギルス（Aspergillus）属或いはユウペニシリウム（E
upenicillium）属に属する微生物である請求項６或いは
請求項９記載のアスコルビン酸酸化酵素の製造法。 - 【請求項１１】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が
少なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸
素からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ず
る反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を配合してな
る試薬組成物。 - 【請求項１２】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が
少なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸
素からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ず
る反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有して成
る食品用添加剤。 - 【請求項１３】37℃、１ヶ月における溶液の残存活性が
少なくとも50％であり、Ｌ−アスコルビン酸と分子状酸
素からＬ−デヒドロアスコルビン酸と過酸化水素を生ず
る反応を触媒するアスコルビン酸酸化酵素を含有してな
るＬ−アスコルビン酸測定用試薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13583395A JP3732868B2 (ja) | 1994-05-11 | 1995-05-08 | 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12311394 | 1994-05-11 | ||
| JP6-123113 | 1994-05-11 | ||
| JP13583395A JP3732868B2 (ja) | 1994-05-11 | 1995-05-08 | 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823971A true JPH0823971A (ja) | 1996-01-30 |
| JP3732868B2 JP3732868B2 (ja) | 2006-01-11 |
Family
ID=26460115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13583395A Expired - Fee Related JP3732868B2 (ja) | 1994-05-11 | 1995-05-08 | 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3732868B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998031829A1 (fr) * | 1997-01-20 | 1998-07-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procedes et reactifs permettant d'evaluer la teneur en acide ascorbique |
| JP2015136320A (ja) * | 2014-01-22 | 2015-07-30 | 本田技研工業株式会社 | 麹菌変異株 |
-
1995
- 1995-05-08 JP JP13583395A patent/JP3732868B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998031829A1 (fr) * | 1997-01-20 | 1998-07-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procedes et reactifs permettant d'evaluer la teneur en acide ascorbique |
| JP2015136320A (ja) * | 2014-01-22 | 2015-07-30 | 本田技研工業株式会社 | 麹菌変異株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3732868B2 (ja) | 2006-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0682116B1 (en) | Ascorbate oxidase, gene encoding the same, process for producing the same, and reagent composition using the same | |
| JP6460152B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
| Pease et al. | Heterogeneity and regulation of manganese peroxidases from Phanerochaete chrysosporium | |
| Hatzinikolaou et al. | A new glucose oxidase from Aspergillus niger: characterization and regulation studies of enzyme and gene | |
| JP6212852B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
| JP6079038B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
| JPWO2007139013A1 (ja) | フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 | |
| JP6465156B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
| Subramaniam et al. | Cloning and Characterization of a Thermostable Cellobiose Dehydrogenase fromSporotrichum thermophile | |
| Wohlschlager et al. | Comparative characterization of glyoxal oxidase from Phanerochaete chrysosporium expressed at high levels in Pichia pastoris and Trichoderma reesei | |
| US5783414A (en) | Expression system, integration vector and cell transformed by this integration vector | |
| Prasad et al. | Purification and properties of trehalase from the thermophilic fungus Humicola lanuginosa | |
| Samarntarn et al. | Production of alkaline protease by a genetically engineered Aspergillus oryzae U1521 | |
| Colas | Kinetic studies on β-fucosidases of Achatina balteata | |
| JPH0823971A (ja) | 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途 | |
| JP3732875B2 (ja) | アスコルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子 | |
| US5541094A (en) | Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant | |
| Angelova et al. | Effect of cultural conditions on the synthesis of superoxide dismutase by Humicola lutea 110 | |
| JP6186927B2 (ja) | 新規なグルコースオキシダーゼ及びそれをコードするポリペプチド配列 | |
| JP2000135079A (ja) | １，５―アンヒドログルシト―ル脱水素酵素 | |
| Lebeault et al. | Metabolism of alkane by yeast | |
| JP4816103B2 (ja) | グリセロールキナーゼ改変体 | |
| Pérez-Vicente et al. | Occurrence of an NADH diaphorase activity associated with xanthine dehydrogenase in Chlamydomonas reinhardtii | |
| Mustranta | Production of peroxidase by Inonotus weirii | |
| Brigida et al. | Characterization of an extracellular lipase from Yarrowia lipolytica |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050705 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050818 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051011 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051014 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091021 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101021 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111021 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121021 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |