JP6079038B2 - 新規なグルコース脱水素酵素 - Google Patents
新規なグルコース脱水素酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6079038B2 JP6079038B2 JP2012177497A JP2012177497A JP6079038B2 JP 6079038 B2 JP6079038 B2 JP 6079038B2 JP 2012177497 A JP2012177497 A JP 2012177497A JP 2012177497 A JP2012177497 A JP 2012177497A JP 6079038 B2 JP6079038 B2 JP 6079038B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fgdh
- glucose
- present
- glucose dehydrogenase
- circinella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
がこれまでに報告されているFADGDHのものとは異なる新規な酵素であることを突き止めた。
項1.下記の特性(1)及び(2)を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(1)分子量: SDS−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約70kDa
(2)Km値: D−グルコースに対するKm値が約20mM以下
項2.更に下記の特性(3)を備える、項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(3)基質特異性: D−グルコースに対する反応性を100%としたときのD−キシロースに対する反応性が1.7%以下である
項3.更に下記の特性(4)を備える、項1又は2に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(4)至適活性温度: 37〜45℃
項4.更に下記の特性(5)〜(7)から成る群より選択される1種以上の特性を備える、項1〜3のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
(5)至適活性pH: 6.5
(6)pH安定性: pH5〜7の範囲で安定
(7)温度安定性: 40℃以下で安定
項5.更に下記の特性(8)を備える、項1〜4のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(8)由来: シルシネラ(Circinella)属に分類される微生物に由来する
項6.シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及び
グルコース脱水素酵素を回収すること
を含む、項1〜5のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項7. 下記の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項8.以下の(A)〜(E)のいずれかのDNA:
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA、
(B)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA、
(C)配列番号2に示される塩基配列との相同性が80%以上である塩基配列からなり、
且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(D)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(E)配列番号2に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
項9.項8に記載のDNAを組み込んだベクター。
項10.項9に記載のベクターを含む形質転換体。
項11.項10に記載の形質転換体を培養することを含む、項7に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項12.項1〜5及び7のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項13.項1〜5及び7のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項14.項1〜5及び7のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
1−1.グルコース脱水素酵素活性
フラビン結合型グルコース脱水素酵素とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本明細書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、FGDHが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)、フェナジンメトサルフェート(PMS)、1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
<試薬>
・50mM PIPES緩衝液 pH6.5(0.1% TritonX−100を含む)
・24mM PMS溶液
・2.0mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
・1M D−グルコース溶液
上記PIPES緩衝液20.5mL、DCPIP溶液1.0mL、PMS溶液2.0mL、D―グルコース溶液5.9mLを混合して反応試薬とする。
<測定条件>
反応試薬3mLを37℃で5分間予備加温する。FGDH溶液0.1mLを添加し、緩やかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から(即ち、反応速度が一定になってから)1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はFGDH溶液の代わりにFGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってFGDH活性を求める。ここでFGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量である。
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.1×希釈倍率}/{16.3×0.1×1.0}
なお、式中の3.1は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。本書においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
本発明のFGDHは、下記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。上記(c)のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号16で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。
本発明のFGDHは、基質特異性に優れている。特に、本発明のFGDHは、D−グルコースに対する反応性を基準とした場合に、少なくともD−キシロースに対する反応性が有意に低い。より具体的に、本発明のFGDHは、同一濃度のD−グルコースに対する反応性を100%とした場合に、D−キシロースに対する反応性が1.7%以下であることが好ましく、より好ましくは1.6%以下であり、より好ましくは1.3%以下であり、更に好ましくは1.2%以下である。
本発明のFGDHは、本来の基質であるD−グルコースに対する親和性が高いことが好ましい。親和性が高いことにより、試料中のD−グルコースの濃度が低い場合であっても、上述する触媒反応を進めることができ、より正確なD−グルコース濃度の測定、より短時間での測定、及びより少ない酵素量での測定に資するからである。FGDHのD−グルコースに対する親和性は、Km値によって示される。Km値は、いわゆるミカエリス・メンテン式から求められる値であり、具体的には、上記1−1.に示す活性測定方法においてD−グルコースの濃度を変化させて各濃度における活性を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成することによって求めることができる。
他の実施形態において、本発明のFGDHの至適活性pHは、後述する実施例に示す通り、pH6.5であることが好ましい。ここで至適活性pHが6.5であるとは、典型的に至適活性pHが6.5付近であり、ある程度の許容可能な幅を有することを意味する。本明細書において、至適活性pHは、後述の実施例に示すように、酵素濃度100U/mLでPIPES−NaOHバッファーを用いて酵素活性を測定することで求められる。
他の実施形態において、本発明のFGDHの至適活性温度は、37℃〜45℃であることが好ましい。ここで「37℃〜45℃」とは、典型的に至適活性温度が37〜45℃付近であり、更にある程度の許容可能な幅を有することを意味する。他の観点から、本発明のFGDHは、45℃における酵素活性を基準(100%)として、50℃における酵素活性が60%以上であることが好ましく、65%以上であることがより好ましい。更に他の観点から、本発明のFGDHは、30℃〜50℃の範囲における酵素活性が、45℃における酵素活性を基準として、60%以上であることがより好ましく、65%以上であることがより好ましい。本明細書において、至適活性温度は、後述する実施例に示す通り、酵素濃度0.1U/mLでPIPES−NaOHバッファー(pH6.5)中における酵素活性を測定することにより求められる。
本明細書において、特定のpH条件の下、10U/mLの酵素を25℃で16時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して80%以上である場合に、当該酵素は、当該pH条件において安定であると判断する。本発明のFGDHは、pH5〜7の範囲で安定であることが好ましい。本発明のFGDHは、pH5〜7の範囲で安定である限り、更に、広い範囲(例えば、pH3〜7)で安定であってもよい。一実施形態において、本発明のFGDHは、pH5〜7の範囲又はこれよりも広い範囲(例えば、pH3.5〜7.5)で前記処理をした場合に、残存酵素活性が90%以上であることがより好ましい。
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中(例えば、酢酸カリウムバッファー(pH5.0))で100U/mLの酵素を15分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して実質的な低下が認められない(つまり約90%以上を維持する)とき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のFGDHは、0℃〜40℃において安定であることが好ましい。
他の実施形態において、本発明のFGDHを構成するポリペプチド部分の分子量は、SDS−PAGEで測定した場合に約70kDaであることが好ましい。「約70kDa」とは、SDS−PAGEで分子量を測定した際に、当業者が、通常70kDaの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のFGDHを意味する。微生物によって生産された本発明のFGDHが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態(即ち、「ポリペプチド部分」)にすることができる。実質
的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型FGDHに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、FGDHが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
代表的な本発明のFGDHは、シルシネラ属に帰属する微生物から単離された。よって、本発明のFGDHは、シルシネラ属に帰属する微生物に由来することが好ましい。本発明のFGDHが由来し得る具体的なシルシネラ属に分類される微生物種には、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Circinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellata等が含まれる。これらの種の属する具体的な菌株としては、Circinella minor NBRC644
8、Circinella mucoroides NBRC4453、Circinella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD055423及びCircinella RD055422等が挙げられる。この中でも、本発明のFGDHは、Circinella simplex NBRC6412及びCircinella RD055422に由来することが好ましい。
本発明のDNAは、上記1のFGDHをコードするDNAであり、具体的には以下の(A)〜(F)のいずれかである。
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2に示される塩基配列との相同性が80%以上である塩基配列をからなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(D)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含み、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(E)配列番号2に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
oratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)を参照して設定することができる。
て50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いる条件を挙げることができる。
とによって容易に取り除くことができる。
des NBRC4453、Circinella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD055423及びCircinella RD055422等が挙げられる。これらの中でもCircinella simplex NBRC6412及びCircinella RD055422が好ましい。
本発明のベクターは、上記2.で説明する本発明のFGDHをコードするDNAが組み込まれている。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子(キャリアー)であり、適当な宿主細胞内で本発明のDNAを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター(アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等)等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
本発明は、宿主細胞に本発明のDNAが導入された形質転換体に関する。本発明のDNAの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記3.で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のDNAを発現してFGDHを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
本発明のFGDHは、本発明のFGDHの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のFGDHを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記1.に示すシルシネラ属に帰属する野生型の微生物及び上記4.に示す形質転換体を好適に利用することができる。
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法を既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のFGDHを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のFGDHを用いてグルコースの濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のFGDHを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体(例えば、DCPIP)の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記1−1.に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従って、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のFGDHを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を揚げることができる。
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のFGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のFGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のFGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
本発明はまた、本発明のFGDHを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極等を用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー等があり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
独立行政法人製品評価技術基盤機構から、シルシネラ属に帰属する幾つかの菌株を入手した。L−乾燥標品の菌株は、アンプルを開封し、復元水100μLを注入し、乾燥菌体を懸濁した後、懸濁液を復元培地に滴下し、25℃で3日間から7日間、静置培養することで菌株を復元させた。復元水としては、滅菌水(オートクレーブで120℃、20分間処理した蒸留水)使用し、復元培地としては、DP培地(デキストリン 2.0%、ポリペプトン 1.0%、KH2PO4 1.0%、アガロース 1.5%)を使用した。グリセロールストックされた菌株は、100μlをDP寒天培地にプレーティングして復元させた。
小麦胚芽2g、水2mLを含む培地をオートクレーブで120℃、20分間、滅菌した固体培地に、実施例1で復元させたCircinella属の各菌株を一白金耳植菌し、25℃で3日間から7日間程度、静置培養した。培養後、2mMのEDTAを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を4mLを添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー(安井器械(株)製)で3,000rpm、3分間×2回の条件で破砕し、4℃、2,000×g、5分間の遠心分離して、回収した上清を粗酵素液とした。
実施例2で得た粗酵素液中のグルコース脱水素酵素活性を、上記1−1.に示したFGDH測定方法を用いて測定した。その結果を表1に示す。
50mLのDP液体培地を500mL坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めDPプレート培地で復元したCircinella simplex NBRC6412及びCircinella RD055422を別個に前培養培地に一白金耳植菌し、25℃、180rpmで3日間振とう培養し、種培養液とした。
実施例4で精製したCircinella simplex NBRC6412由来のFGDHを100℃、10分間、加熱処理して変性させた後、5UのN−グリコシダーゼF(ロシュ・ダイアグノスティクス製)で37℃、1時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。その後、実施例4と同様の方法でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定を行った。分子量マーカーは、実施例4と同じものを使用した(図2)。図2に示される結果から、精製したFGDHのポリペプチド部分の分子量は約70,000ダルトンであることが判明した。Circinella RD055422由来のFGDHについても、後述するように、そのアミノ酸配列が、Circinella simplex NBRC6412由来のFGDHのアミノ酸配列と1アミノ酸のみで相違することから、分子量は約70,000ダルトンである。
上述したFGDHの活性測定法に従い、基質としてD−グルコースを用いたときの活性と、比較対象の糖を用いたときの見かけの活性とを比較することにより、精製酵素の基質特異性を調査した。比較対象の糖としてはマルトース、D−ガラクトース、D−キシロースをそれぞれ使用した。基質濃度は50mMとした。結果を表2に示す。
実施例4で得られたFGDH酵素液(100U/mL)を用いて、至適pHを調べた。Circinella simplex NBRC6412由来のFGDHの至適pHは、緩衝溶液として50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.0−pH7.5)を用いて測定した。Circinella RD055422由来のFGDHの至適pHは、緩衝液として50mMの酢酸カリウム(pH5〜5.5)、MES−NaOH(pH5.5〜6.5)、リン酸カリウム(pH6.0〜8.0)を用いて測定した。結果を図3−1(NBRC6412)及び図3−2(RD055422)に示す。
実施例4で得られたFGDH酵素液(0.1U/mL)を用いて、至適温度を調べた。緩衝溶液には42mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)を用い、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃における見かけの活性を求めた。結果を図4−1(NBRC6412)及び4−2(RD055422)に示す。
実施例4で得られたFGDH酵素液(10U/mL)を用いて、pH安定性を調べた。100mM 酢酸−ナトリウム緩衝液(pH3.0−pH5.5図中四角黒色印でプロット)、100mM リン酸−カリウム緩衝液(pH5.5−pH7.5図中四角白色印でプロット)、100mM トリス−HCl緩衝液(pH7.5−pH9.0図中三角白色印でプロット)、100mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5−pH7.5図中三角黒色印でプロット)を用い、25℃、16時間処理した後の見かけの活性の残存率を測定した。結果を図5−1(NBRC6412)及び5−2(RD055422)に示す。
実施例4で得られたFGDH酵素液(100U/mL)を用いて、熱安定性を調べた。100mM酢酸カリウム緩衝液(pH5.0)を用いて、FGDH酵素液を各温度(4℃、30℃、40℃、50℃)で15分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図6−1(NBRC6412)及び6−2(RD055422)に示す。
上述したFGDHの活性測定法において、基質であるD−グルコースの濃度を変化させて見かけの活性測定を行い、Lineweaver−burk plotを作成し(図7−1(NBRC6412)及び図7−2(RD055422))Km値を算出した。その結果、本発明のFGDHのD−グルコースに対するKm値は、12.5mM(NBRC6412)及び8.3mM(RD055422)であることが判明した。
(1)染色体DNAの抽出
Circinella simplex NBRC6412をYG培地(Yeast Extract 1%、Glucose 2%)50mlを入れた坂口フラスコを用いて25℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約0.3gの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕し、Extraction buffer(1% hexadecyltrimethylammonium bromide、0.7M NaCl、50mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1% メルカプトエタノール)12mlに懸濁した。室温で30分回転撹拌を続けた後、等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)溶液を加えて攪拌、遠心分離(1,500g、5分、室温)して上清を得た。得られた上清に等量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離(1,500g、5分、室温)を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体DNAを遠心分離(20,000g、10分、4℃)して得られた沈殿を70%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。
配列番号3に示すAspergillus oryzae由来GDHのアミノ酸配列(特許4292486の配列表において配列番号4で示されるアミノ酸配列)やその他公知のアミノ配列を参考にして、比較的アミノ酸配列が保存されていると判断できる領域に基づいて、ミックス塩基を含有する縮重プライマー、degeF11、degeR13(配列番号4、5)を合成した。
上記(1)で調製した染色体DNAを鋳型として、DNAポリメラーゼKOD−Plus(東洋紡製)を用いて推奨する条件のもとでPCRを行った。プライマーには、上記(2)で作製したプライマー(配列番号4、5)を使用した。そのPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約1500bp程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたDNA断片を精製し、クローニングキットTarget Clone−Plus(東洋紡製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターpTA2にクローニングし、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)DH5α株コンピテントセル(東洋紡製)に形質転換し、形質転換体を取得した。
上記ようにして得られた、塩基配列に基づき、開始コドンを含むN末端方向の遺伝子配列取得のために、遺伝子の外側方向に向けた2種類のプライマー(配列番号8、9)を新たに設計した。このインバースPCR用プライマーを用い、上記(1)で得た染色体DNAを制限酵素HindIIIで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型としてDNAポリメラーゼKOD−Plus(東洋紡製)を用いて推奨する条件のもとで、Inverse PCRを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、開始コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。また、終止コドンを含むC末端方向の遺伝子配列取得のためには、上記記載のインバースPCR用プライマー(配列番号10、11)を用い、上記(1)で得たゲノムDNAを制限酵素EcoRIで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型として、上記記載、同様の方法でInverse PCRを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、終止コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。
N末端の決定は、公知の情報を最大限に活用し、アミノ酸配列の相同性、塩基配列の長さ等の観点から(4)で得られた配列と多角的な比較を行い、開始コドンを判断した。また、C末端の決定も同様の方法にて判断した。
(5)での判断結果に基づき、開始コドンの上流にアニーリングするプライマー、5UTR F1(配列番号12)及び終止コドンの下流にアニーリングするプライマー、3UTR R1(配列番号13)を設計した。
Circinella simplex NBRC6412をYG培地(Yeast Extract 1%、Glucose 2%)50mlを入れた坂口フラスコを用いて25℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約0.3gの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。続いて、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からmRNAを得た。これをテンプレートにReverTra−Ace(東洋紡社製)を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、逆転写を行い、cDNAを合成した。逆転写のプライマーには、(6)で作製した3UTR R1(配列番号13)を用いた。続いて、上記で合成したcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼKOD−Plus(東洋紡製)を用いて推奨する条件のもとでPCRを行った。プライマーには、上記(6)で作製したプライマー(配列番号12、13)を使用した。そのPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約2050bp程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたDNA断片の配列解析を、上記記載と同様にして行った。なお、ここでのcDNA配列解析には、3クローンの異なるプラスミド由来の塩基配列を解析した。なお、塩基配列の解析には、配列解析用プライマー(配列番号14,15)も使用した。このようにして、配列番号2に示すCircinella simplex NBRC6412由来のFGDHのcDNA配列を決定した。また、当該cDNA配列がコードする当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号1に示した。
上記(1)〜(7)と同じ作業をCircinella RD055422株についても実施して、RD055422株由来のFGDHのアミノ酸配列(配列番号16)及びcDNA配列(配列番号17)を決定した。
上記(7)で明らかにしたアミノ酸配列と公知のアスペルギルスオリゼ由来のFADGDH、アスペルギルス・テレウス由来のFADGDHとの同一性は各々35%及び34%であった。アミノ酸配列解析は、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、算出した。
実施例12で明らかにしたCircinella simplex由来FGDH遺伝子(配列番号2)又はCircinella RD055422株由来のFGDH遺伝子(配列番号17)を含む組み換えプラスミドpCSGDHを鋳型とし、N末端、C末端部分にそれぞれ制限酵素BamHI及びXhoIの切断部位を結合させた配列を有するプライマー(配列番号18及び配列番号19)を用いて、オープンリーディングフレームを含むDNA断片を増幅した。このDNA断片を制限酵素BamHI及びXhoIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpYES3(インビトロジェン社)と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬(東洋紡製ラーゲーションハイ)を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションしたDNAをエシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績製コンピテントハイDH5α)に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をLB培地で培養し、プラスミドを抽出した。このようにして、サッカロマイセス・セルビジエでの大量発現を可能とするように設計された発現ベクターを構築した。
続いて、サッカロマイセス・セルビジエINVSc1(インビトロジェン社)に形質転換した。なお、方法は、pYES3のマニュアルを参考にした。
得られた形質転換体は10L容ジャーファーメンター(BMS10−PI/バイオット)を使用して培養した。種培養は、マニュアルに記載の通り、実施し、本培養は(3% 酵母エキス、1% ポリペプトン、3% ガラクトース)培地にて、培地液量6.0L、攪拌数400rpm、温度25℃、通気量1.0vvmの条件で培養した。この培養液を粗酵素液として、GDH活性を確認したところ、本発明のFGDHが発現されていることが確認された。
にする。従って本発明のFGDHは血糖値の測定等に好適といえる。
Claims (8)
- 下記の特性(1)〜(3)を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(1)分子量: SDS−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約70kDa
(2)Km値: D−グルコースに対するKm値が約20mM以下
(3)基質特異性: D−グルコースに対する反応性を100%としたときのD−キシロースに対する反応性が1.7%以下である - 更に下記の特性(4)を備える、請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(4)至適活性温度: 37〜45℃ - 更に下記の特性(5)〜(7)から成る群より選択される1種以上の特性を備える、請求項1又は2に記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
(5)至適活性pH: 6.5
(6)pH安定性: pH5〜7の範囲で安定
(7)温度安定性: 40℃以下で安定 - 更に下記の特性(8)を備える、請求項1〜3のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
(8)由来: シルシネラ(Circinella)属に分類される微生物に由来する - シルシネラ属に分類される微生物を培養すること、及びグルコース脱水素酵素を回収することを含む、請求項1〜4のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012177497A JP6079038B2 (ja) | 2011-08-11 | 2012-08-09 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011175705 | 2011-08-11 | ||
JP2011175705 | 2011-08-11 | ||
JP2011222274 | 2011-10-06 | ||
JP2011222274 | 2011-10-06 | ||
JP2011222269 | 2011-10-06 | ||
JP2011222269 | 2011-10-06 | ||
JP2012177497A JP6079038B2 (ja) | 2011-08-11 | 2012-08-09 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013090621A JP2013090621A (ja) | 2013-05-16 |
JP6079038B2 true JP6079038B2 (ja) | 2017-02-15 |
Family
ID=47668578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012177497A Active JP6079038B2 (ja) | 2011-08-11 | 2012-08-09 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9487758B2 (ja) |
JP (1) | JP6079038B2 (ja) |
WO (1) | WO2013022074A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014002973A1 (ja) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | 東洋紡株式会社 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
WO2014038660A1 (ja) * | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 東洋紡株式会社 | 新規なグルコース脱水素酵素 |
JP6493212B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-04-03 | 東洋紡株式会社 | 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ |
JP6635913B2 (ja) * | 2014-02-28 | 2020-01-29 | キッコーマン株式会社 | 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
JP6529960B2 (ja) | 2014-03-21 | 2019-06-12 | 池田食研株式会社 | フラビン結合型グルコース脱水素酵素 |
JP6934720B2 (ja) * | 2014-11-12 | 2021-09-15 | キッコーマン株式会社 | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2016114334A1 (ja) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | 東洋紡株式会社 | Fad依存型グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2016163448A1 (ja) | 2015-04-09 | 2016-10-13 | 東洋紡株式会社 | グルコース測定用酵素製剤 |
WO2017122650A1 (ja) | 2016-01-14 | 2017-07-20 | 池田食研株式会社 | フラビン結合型グルコース脱水素酵素 |
EP3601589A4 (en) | 2017-03-31 | 2020-12-09 | Kikkoman Corporation | CONTINUOUS GLUCOSE MONITORING WITH A FAD-DEPENDENT GLUCOSE DEHYDROGENASE |
WO2019017148A1 (ja) * | 2017-07-19 | 2019-01-24 | 東洋紡株式会社 | グルコース測定方法およびグルコースセンサ |
US20210238562A1 (en) * | 2018-04-23 | 2021-08-05 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Flavin-conjugated glucose dehydrogenase |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004058958A1 (ja) | 2002-12-24 | 2004-07-15 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | 補酵素結合型グルコース脱水素酵素 |
EP2380980B1 (en) | 2005-03-25 | 2014-11-05 | Ikeda Food Research Co. Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
US20080003628A1 (en) | 2006-03-31 | 2008-01-03 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method for enhancing stability of a composition comprising soluble glucose dehydrogenase (gdh) |
JP2007289148A (ja) | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
WO2008059777A1 (fr) | 2006-11-14 | 2008-05-22 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Glucose déshydrogénase dépendante du flavine-adénine dinucléotide modifiée |
DE602007012130D1 (de) * | 2006-11-14 | 2011-03-03 | Toyo Boseki | Modifizierte flavin-adenin-dinucleotid-abhängige glucose-dehydrogenase |
WO2010053161A1 (ja) * | 2008-11-06 | 2010-05-14 | ユニチカ株式会社 | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ |
JP4648993B2 (ja) | 2009-06-04 | 2011-03-09 | キッコーマン株式会社 | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2011004654A1 (ja) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | 天野エンザイム株式会社 | ムコール属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ |
KR101814588B1 (ko) | 2009-12-05 | 2018-01-04 | 아마노 엔자임 가부시키가이샤 | 변이 효소 및 그 용도 |
-
2012
- 2012-08-09 WO PCT/JP2012/070385 patent/WO2013022074A1/ja active Application Filing
- 2012-08-09 JP JP2012177497A patent/JP6079038B2/ja active Active
-
2014
- 2014-02-10 US US14/176,701 patent/US9487758B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9487758B2 (en) | 2016-11-08 |
US20140154777A1 (en) | 2014-06-05 |
WO2013022074A1 (ja) | 2013-02-14 |
JP2013090621A (ja) | 2013-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6460152B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6212852B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6079038B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP4348563B2 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6465156B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP5435180B1 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6583503B2 (ja) | 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ | |
KR20130038914A (ko) | 글루코스 탈수소효소 | |
JPWO2007139013A1 (ja) | フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 | |
JP6311270B2 (ja) | 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2009119728A1 (ja) | 糸状菌由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(fadgdh) | |
JP6455134B2 (ja) | 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ | |
JPWO2014038660A1 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6342174B2 (ja) | 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6186927B2 (ja) | 新規なグルコースオキシダーゼ及びそれをコードするポリペプチド配列 | |
JP6390776B2 (ja) | 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150803 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160713 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161220 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170102 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6079038 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |