JP6342174B2 - 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Description
D−グルコース + 電子受容体(酸化型)
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + 電子受容体(還元型)
項1.
下記の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドを含むフラビン結合型グルコース脱水素酵素;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項2.
以下の(A)〜(F)のいずれかのDNA:
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA、
(B)配列番号2に示される塩基配列を有するDNA、
(C)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(D)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(E)配列番号2に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
項3.
項2に記載のDNAを組み込んだベクター。
項4.
項3に記載のベクターが導入されている形質転換体。
項5.
項2に記載のDNAを有する微生物を培養すること、及び得られる培養液を精製すること、を含む項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
項6.
微生物が、項4に記載の形質転換体である項5に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項7.
項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項8.
項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項9.
項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
項10.
配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない、項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
項11.
タラロマイセス・エスピーFKI−2725株以外の微生物によって、組換え発現で生産された、項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
項12.
配列番号2に示される塩基配列を有さない、項2に記載のDNA。
項13.
タラロマイセス・エスピーFKI−2725株以外の微生物における発現に適するようにコドンユーセージが最適化されている、項2に記載のDNA。
本発明における低温反応性とは、25℃での酵素活性、又は37℃での酵素活性と比較した5℃での酵素活性の相対値として評価される。各温度での酵素反応性は、下記2.記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素(FGDH)活性測定法に準じて、その反応温度を5℃、25℃、37℃に変更して測定される。FGDHは、25℃における酵素活性と比較して35%以上、37℃での酵素活性と比較して20%以上であることが好ましい。後述する実施例で測定された代表的なFGDHは、5℃での反応性が、25℃での反応性の39%を示し、37℃での反応性の25%を示す。
GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、GDHが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)、フェナジンメトサルフェート(PMS)、1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
<試薬>
1.5M D−グルコースを含む150mM リン酸緩衝液pH7.0(0.1% TritonX−100を含む)
3.1mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
上記D−グルコースを含むリン酸緩衝液20mL、DCPIP溶液10mL、を混合して反応試薬とする。
反応試薬3mLを37℃で5分間予備加温する。GDH溶液0.1mLを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、750nmの吸光度変化を5分記録する。反応時間をX軸、吸光度をY軸として測定結果をプロットし、直線部分から(即ち、反応速度が一定になってから)1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度1MのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量である。
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.1×希釈倍率}/{0.85×0.1×1.0}
本発明のFGDHは、下記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
本発明のFGDHは、下記4−1〜4−5のうち少なくとも1つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその2つ以上を備え、更に好ましくはその3つの特性を更に備え、より更に好ましくはその4つ以上を備え、一層好ましくはその5つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のFGDHは、上記4−1〜4−5の特性を如何なる組合せで備えていても良いが、上記4−1の特性を備えていることが好ましく、更には上記4−1の特性に加えて更に4−2〜4−5のうち少なくとも1つ以上の特性を備えていることが好ましい。
本発明のFGDHを構成するポリペプチド部分の分子量は、SDS−PAGEで測定した場合に約55kDaである。「約55kDa」とは、SDS−PAGEで分子量を測定した際に、当業者が、通常55kDaの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のFGDHを意味する。微生物によって生産された本発明のFGDHが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態(即ち、「ポリペプチド部分」)にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型FGDHに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、FGDHが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
本発明のFGDHの基質特異性は、同一濃度のD−グルコースに対する反応性を100%とした場合に、D−キシロースに対する反応性が同一濃度のD−グルコースに対する反応性を100%として、5%以下であることが好ましい。また、FGDHのD−ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のD−グルコースに対する反応性を100%として、1%以下であることが好ましい。更に、FGDHのマルトースに対する反応性は、同一濃度のD−グルコースに対する反応性を100%として、2%以下であることが好ましい。
本発明のFGDHは、後述する実施例に示す通り、pH6.0(リン酸緩衝液)において最も高い活性を示すことが好ましい。また、本発明のFGDHは、pH6.5〜7.0の範囲において、pH6.0(リン酸緩衝液)における活性を100%とした場合と比較して、80%以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のFGDHの至適活性pHは6.5〜8.0であり、好ましくはpH6.0である。
本明細書において、特定のpH条件の下、2U/mLの酵素を25℃で16時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の同じpH条件下での酵素活性と比較して90%以上である場合に、当該酵素は、当該pH条件において安定であると判断する。本発明のFGDHは、少なくともpH3.5〜6.5の範囲全体で安定であることが好ましい。
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中(例えば酢酸カリウムバッファー(pH5.0))で2U/mLの酵素を15分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して80%以上である場合に、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のFGDHは、少なくとも45℃以下(即ち、0℃〜45℃の温度範囲)において安定であることが好ましい。
一実施形態において、本発明のFGDHは、タラロマイセス・エスピーFKI−2725株に由来することが好ましい。タラロマイセス・エスピーFKI−2725株は、石垣島土壌より単離された菌株であり、北里生命科学研究所微生物資源センターで保管されている。該菌株は所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
本発明のDNAは、上記1.のFGDHをコードするDNAであり、具体的には以下の(A)〜(F)のいずれかである。
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列を有し、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(D)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(E)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加および/または逆位した塩基配列をNAであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明のベクターは、上記2.で説明する本発明のFGDHをコードするDNAが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子(キャリアー)であり、適当な宿主細胞内で本発明のDNAを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター(アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等)等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
本発明は、宿主細胞に本発明のDNAが導入された形質転換体に関する。本発明のDNAの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記7.で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のDNAを発現してFGDHを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
本発明のFGDHは、典型的には、本発明のFGDHの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のFGDHを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記5.に示すタラロマイセス・エスピーFKI−2725株及び上記8.に示す形質転換体を好適に利用することができる。
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のFGDHを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のFGDHを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のFGDHを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体(例えば、DCPIP)の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記2.に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従った、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のFGDHを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量はと特に制限されない。
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うFGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のFGDH、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、FGDHを含む試薬中には、安定化剤及び/又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、TritonX−100、Tween20、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び/又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。
本発明に従うFGDHを用いるグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、NADもしくはNADPといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFADGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、GDHの補酵素であるFADから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、N,N,N’,N’−テトラメチルフェニレンジアミン、1−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール、2,5−ジメチル−1,4−ベンゾキノン、2,6−ジメチル−1,4−ベンゾキノン、2,5−ジクロロ−1,4−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のGDH組成物中には、安定化剤及び/又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、TritonX−100、Tween20、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び/又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。
タラロマイセス・エスピーFKI−2725株からのGDHの取得
50mLのYPD培地(0.5重量%酵母エキス、1重量%ペプトン、2重量%グルコース)を500mL坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地を調製した。予めDPプレート培地で復元したタラロマイセス・エスピーFKI−2725株を前培養培地に一白金耳植菌し、25℃、180rpmで3日間振とう培養し、種培養液を得た。
温度依存性
実施例1で得られたTas−GDHについて上記2.に示したFADGDHの活性測定法に従い、5℃、25℃、37℃での活性を測定した。酵素濃度については最終濃度が17μg/mlとなるように調整した。
特許文献2の配列番号4のアミノ酸配列を麹菌で組み替え産生し、精製した酵素について上記2.に示したFADGDHの活性測定法に従い、5℃、25℃、37℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度3.8μg/mlとなるように調整した。
特許文献1の配列番号1のアミノ酸配列を酵母で組み替え産生し、精製した酵素を比較例2として調製し、上記2.に示したFADGDHの活性測定法に従い、5℃、25℃、37℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度4.7μg/mlで統一した。
温度安定性
実施例1で得られたTas−GDHの温度安定性を調べた。50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に2U/mlとなるようにTas−GDHを添加し、各温度(4℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)で15分間維持した後、上記2.に示したFADGDH活性測定方法を用いてGDH活性を測定し、処理前のGDH活性と比較して残存率を求めた。結果を図1に示す。
pH依存性
実施例1で得られたTas−GDHの至適pHを調べた。100mM酢酸カリウム緩衝液(pH5.0−5.5、図2中■印でプロット)100mM MES−NaOH緩衝液(pH5.5−6.4、図2中□印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.3−7.8、図2中▲でプロット)、100mMTris−HCl緩衝液(pH7.0−8.0、図2中△印でプロット)を用いた。それぞれのpHにおける37℃での活性を測定し、最も高い活性値を基準(100%)として、各pHにおける相対活性を求めた。結果を図2に示す。
pH安定性
実施例1で得られたTas−GDH酵素液(2U/mL)を用いて、pH安定性を調べた。100mM Glycine−NaOH緩衝液(pH2.5−3.5、図中■でプロット)、100mM 酢酸カリウム緩衝液(pH3.5−pH5.5:図3中□印でプロット)、100mM MES−NaOH緩衝液(pH5.5−pH6.5:図3中▲印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0−pH8.0:図3中△印でプロット)、100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5−pH9.0:図3中●印でプロット)を用い、25℃、16時間、各緩衝液中で酵素を維持した後のグルコースを基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の同じ緩衝液中での活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図2に示す。
基質特異性
実施例1で得られたTas−GDHについて上記2.に示したFADGDHの活性測定法に従い、D−グルコース、マルトース、D−ガラクトース、D−キシロースを基質とした場合の活性を測定した。D−グルコースを基質とした場合の活性を100%とし、それと比較した他の糖に対する活性を求めた。各糖の濃度は200mMとした。結果を表2に示す。なお、酵素濃度は、グルコースに対する活性を測定した場合は最終濃度10μg/mlとなるように調製し、他の糖に対する活性を測定した場合は、最終濃度1mg/mlとなるように調製した。結果を表2に示す。
SDS−PAGEによる分子量の推定
実施例1で得られたTas−GDHについて100℃、10分間、加熱処理して変性させた後、5Uのエンドグリコシダーゼ(Endo H:ニューイングランドバイオラボ社製)で37℃、1時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。次に、糖鎖を分解した酵素について、Nu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、主に55kDaにバンドが見られたため、それのバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化させた後LC/MS/MS解析による消化断片の分子量測定、およびMASCOT解析によるタンパク質の同定を行った。結果、55kDaのバンドから得られるペプチドが既知のFAD依存型GMCオキシドレダクターゼ様タンパク質と高いヒット率を示したため、このバンドがGDHであると推定した。
GDH遺伝子の取得
(1)Total―RNAの調製
タラロマイセス・エスピー・FKI−2725株をGDH生産培地(酵母エキス3.0重量%、グルコース3.0重量%、pH6.0)60mLに接種し、2日間、25℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて粉砕した。次いで、ホットフェノール法により、粉砕した菌糸体からTotal―RNAを得た。
実施例1で得られた精製Tas−GDHについてNu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをSimply Blue Safe Stain(Invitrogen社製)を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、MVGFTVHPDTLDR(配列番号3)およびAYYWPYEAR(配列番号4)であった。
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製した。上記(1)にて調製したタラロマイセス・エスピー・FKI−2725株のTotal−RNAをテンプレートとし、Smarter RACE cDNA Amplification kit(クロンテック社製)を用いて、そのプロトコールに従ってRT−PCRを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、100bp程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅DNA断片を精製し、Target clone−plus−(東洋紡社製)を用いて、pTA2(東洋紡社製)に前記増幅DNA断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドpTA−Th2725GDHpartialを構築した。
GDH遺伝子の組換え発現
実施例2で明らかにしたタラロマイセス・エスピーFKI−2725株由来FGDH遺伝子(配列番号2)をかずさDNA研究所提供のコドンユーセージデータベース(http://www.kazusa.or.jp/codon/)内の、サッカロマイセス・セレビシエ コドンユーセージテーブル(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi−bin/showcodon.cgi?species=4932)を元にコドンユーセージの至適化を行い、至適化遺伝子配列を取得した(配列番号5)。配列番号5では、SignalPにより輸送シグナルであることが予測された16アミノ酸残基分のDNAを除去すると共に、後の制限酵素処理のため制限酵素サイトを付加している。配列番号5に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを、外部機関に合成依頼し、pUCベクターに接続されたサッカロマイセス・セレビシエコドンユーセージ至適化遺伝子を取得した(pUC−Th2725GDH−Sc)。pUC−Th2725GDH−Scを制限酵素KpnI及びNotIで処理し、遺伝子領域を含むDNA断片を取得し、同じく制限酵素KpnI及びNotIで処理したベクターpYES3(インビトロジェン社)と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬(東洋紡製ラーゲーションハイ)を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このように、ライゲーションしたDNAをコンピテントハイDH5α(東洋紡製)に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体をLB培地で培養し、プラスミド(pYES3TasGDH)を抽出した。これを用いて、サッカロミセス・セレビシエINVSc1(インビトロジェン社)を定法で形質転換を実施した。
Claims (9)
- 下記の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドを含むフラビン結合型グルコース脱水素酵素;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。 - 以下の(A)〜(F)のいずれかのDNA:
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA、
(B)配列番号2に示される塩基配列を有するDNA、
(C)配列番号2に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(D)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(E)配列番号2に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 請求項2に記載のDNAを組み込んだベクター。
- 請求項3に記載のベクターが導入されている形質転換体。
- 請求項2に記載のDNAを有する微生物を培養すること、及び得られる培養液を精製すること、を含む請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
- 微生物が、請求項4に記載の形質転換体である請求項5に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
- 請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
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