WO2019017148A1 - グルコース測定方法およびグルコースセンサ - Google Patents

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WO2019017148A1
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glucose
xylose
gdh
electrode
activity
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泰裕 山崎
川井　淳
岸本　高英
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東洋紡株式会社
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to a glucose measurement method and a glucose sensor.
  • SMBG blood glucose
  • Typical biosensors of this type include devices in which an electrode and an enzyme reaction layer are formed on an insulating substrate.
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • GO glucose oxidase
  • PQQGDH pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
  • flavin-binding glucose dehydrogenase eg, flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (hereinafter, also referred to as "FADGDH”) (EC 1.1.99.10)), etc. Be done.
  • the glucose measurement method using GO is susceptible to dissolved oxygen in the measurement sample, and the dissolved oxygen affects the measurement result.
  • the method using PQQGDH is not affected by dissolved oxygen, but also acts on saccharides other than glucose such as maltose and lactose.
  • the method using FADGDH is not affected by dissolved oxygen and hardly acts on maltose and lactose.
  • D-xylose can be mentioned as sugars that are problematic for diabetic patients to measure blood glucose.
  • D-xylose is used in medical practice for xylose absorption, which assesses the ability to absorb carbohydrates from the small intestine. Therefore, when a diabetic patient is undergoing the test, blood glucose measurement using a glucose dehydrogenase having D-xylose activity may impair the accuracy of the measurement value.
  • Non-Patent Document 1 has been published by the US FDA as a method for evaluating the influence of contaminants.
  • the effect of D-xylose was measured by measuring the response value of a solution spiked with D-xylose at a concentration of 200 mg / dL with respect to a glucose solution, and against the response value in the condition without spikes. It is recommended to indicate the response value in the 95% confidence interval. Therefore, assessment of D-xylose activity on SMBG sensors is often performed using spike tests. Also, in order to ensure that there is no influence of D-xylose, the D-xylose concentration employed in the spike test may be set higher than the concentration described in Non-Patent Document 1 to perform performance evaluation.
  • Patent Document 1 accurately measures the amount of D-glucose by using FADGDH in which the activity of D-xylose is 2% or less when the activity to D-glucose is 100%. There is a description of the contents that can be done.
  • the object of the present invention is to find physicochemical properties of GDH which reflect practically no influence on D-xylose on a glucose sensor which has not been clarified until now. More specifically, by constructing a method for evaluating GDH in a water system, which reflects the activity of GDH on D-xylose in a glucose sensor, a glucose sensor and a glucose having a practically reduced influence on D-xylose in practice It is to provide a measurement method.
  • the present inventors conducted intensive studies in view of the above problems, and as a physicochemical property satisfying the absence of an effect on D-xylose when GDH is applied to a glucose sensor, the Michaelis constant of GDH on D-glucose It is found that it is important that the concentration is 100 mM or less (hereinafter also referred to as “Km”) and the Michaelis constant of GDH to D-xylose is 600 mM or more, and it is practically possible to use D
  • Km concentration of 100 mM or less
  • the Michaelis constant of GDH to D-xylose 600 mM or more
  • Item 1 A glucose measurement method using a glucose dehydrogenase having the following characteristics (1) and (2).
  • Km to D-glucose is 0.1 mM or more and 100 mM or less
  • Km to D-xylose is 600 mM or more and 3000 mM or less.
  • Item 2. The glucose measurement method according to Item 1, wherein Km of D-xylose of glucose dehydrogenase is 619 mM or more and 3000 mM or less.
  • Item 3. Item 2. The glucose measuring method according to item 1, wherein Km of D-xylose of glucose dehydrogenase is at least 736 mM and at most 3000 mM.
  • item 1-3 using the enzyme electrode provided with the glucose dehydrogenase.
  • glucose dehydrogenase has a response value to a solution in which 20 mM D-xylose is spiked to 10 mM D-glucose solution against a D-xylose acting response value (10 mM glucose solution in enzyme electrode method) 5.
  • Items 6 A glucose sensor provided with a glucose dehydrogenase having the following characteristics (1) and (2) on a carbon electrode or a metal electrode.
  • Km for D-glucose is 0.1 mM or more and 100 mM or less
  • Km for D-xylose is 600 mM or more and 3000 mM or less.
  • glucose dehydrogenase has a response value to a solution in which 20 mM D-xylose is spiked to 10 mM D-glucose solution against a D-xylose acting response value (10 mM glucose solution in enzyme electrode method) 7.
  • the glucose sensor according to item 6, wherein the ratio (%) of is 95% or more and 105% or less.
  • Item 8. 8 The glucose sensor according to item 6 or 7, further comprising a mediator on a carbon electrode or a metal electrode.
  • a method for producing a glucose sensor comprising the step of measuring the Michaelis constant (Km) for xylose of glucose dehydrogenase.
  • Km Michaelis constant
  • Item 10 A method for producing a sensor according to item 9, comprising the steps of measuring Km for xylose of a glucose dehydrogenase and selecting a glucose dehydrogenase having a Km of 600 mM or more.
  • the present invention it is possible to provide a glucose measurement method and a sensor for glucose measurement that can perform accurate blood glucose measurement without being particularly affected by D-xylose.
  • Example 1 it is a figure which shows the Michaelis constant (Km) with respect to D-xylose of GDH1-4, and D-xylose action property in the enzyme electrode method.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of having investigated the relationship of the reaction rate with respect to D-xylose density
  • Example 2 it is a figure which shows the relationship of the inverse number of a reaction rate to the inverse number of D-xylose concentration of GDH-5 and 6 (Lineweaver Burk plot).
  • One embodiment of the present invention is a method of measuring D-glucose by an enzyme electrode method using a glucose dehydrogenase having a Michaelis constant (Km) to D-xylose of 600 mM or more.
  • the glucose measurement method of the present invention is characterized by utilizing a glucose dehydrogenase that catalyzes the following reaction. D-glucose + electron acceptor (oxidized form) ⁇ D-glucono- ⁇ -lactone + electron acceptor (reduced form)
  • the glucose dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited, but a flavin-binding glucose dehydrogenase is preferred.
  • Flavin is a group of derivatives having a substituent at position 10 of dimethylisoalloxazine, and is not particularly limited as long as it is an enzyme having a flavin molecular species as a coenzyme.
  • Flavin compounds include flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin adenine mononucleotide (FMN) and the like, with FAD being particularly preferred.
  • the glucose dehydrogenase used in the present invention is characterized by having a sufficiently high affinity for D-glucose and a sufficiently low affinity for D-xylose. More specifically, Km for D-glucose is 100 mM or less as an affinity for D-glucose, and Km for D-xylose is 600 mM or more as an affinity for D-xylose.
  • Km for D-glucose is 100 mM or less as an affinity for D-glucose
  • Km for D-xylose is 600 mM or more as an affinity for D-xylose.
  • the characteristics other than Km for D-glucose and Km for D-xylose are not particularly limited.
  • the Km for D-glucose may be 100 mM or less, more preferably 90 mM or less.
  • the lower limit is not particularly limited because it is important that the Km for D-glucose is small, but the lower limit is not less than 0.1 mM, preferably not less than 1 mM, more preferably not less than 5 mM, still more preferably 10 mM. It is above.
  • the Km for D-xylose may be 600 mM or more, preferably 619 mM or more, more preferably 650 mM or more, 700 mM or more, 736 mM or more, 750 mM or more, or 819 mM or more, particularly preferably 850 mM or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 3 M or less as the upper limit of Km, as estimated from the solubility of D-xylose. More preferably, it is 2.5 M or less, 2 M or less, or 1.5 M or less. Particularly preferably, it is 1.3 M or less.
  • the other properties of the glucose dehydrogenase used in the present invention are not particularly limited.
  • the optimum temperature is preferably 35 ° C. to 65 ° C., more preferably 40 ° C. to 60 ° C., 45 ° C. to 55 ° C. Is more preferred.
  • the temperature stability is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and still more preferably 80% or more after treatment at 50 ° C. for 15 minutes.
  • the optimum pH is preferably 5.0 to 8.5, more preferably 5.5 to 8.0, and still more preferably 6.0 to 7.5.
  • the pH stability is preferably 2.5 to 10.0, more preferably 3.5 to 9.0, and still more preferably 4.5 to 8.0 under treatment conditions of 25 ° C. for 16 hours.
  • the sugar content is preferably 5% to 50%, more preferably 10% to 40%, and still more preferably 20% to 30%.
  • glucose dehydrogenase having the following properties other than Km for D-xylose as a basic property is preferable.
  • Optimal temperature 50-70 ° C
  • Temperature stability Remaining activity after treatment at 50 ° C for 15 minutes 80% or more
  • Optimal pH 6.5 to 7.5 pH stability 2.5 to 10.0 25 ° C, 16 hours
  • it may be a glucose dehydrogenase having the following properties.
  • Optimal temperature 45 to 50 ° C
  • Temperature stability 80% or more of remaining activity after treatment at 45 ° C for 15 minutes
  • Sugar content 20 to 50% Km 5 to 20 mM for D-glucose
  • the origin of the glucose dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited.
  • filamentous fungi such as Penicillium and Aspergillus, Talaromyces, Mucor, Mucor, Absidia, and Actinomucor. Microorganisms and the like.
  • Penicillium species include species such as Penicillium italicum and Penicillium lilacinoechinulatum.
  • species such as Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus terreus (Aspergillus terreus), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus flavus (Aspergillus Fluvus) and the like are exemplified.
  • Mucor As microorganisms classified into the mold family, Mucor, Actinomucor, Rhizoh Mucor, Circinella, Paracitella, Zygorinchus, Dicranophora, Spinelus Examples of such genera are Sporodiniera (Sporodiniella), Lysopath (Rhyzopus), Absidia (Absidia), Chlamidoabsidia and Thermomucor.
  • species such as Mucor guilliermondii, Mucor prainii, Mucor javanicus, Mucor hiemalis and Mucor circinelloides are exemplified. Be done.
  • the glucose dehydrogenase used in the present invention may be obtained by extracting and purifying one derived from a natural source, or information such as the amino acid sequence or the gene sequence encoding the amino acid sequence (eg, amino acid of SEQ ID NO: 5) If the sequence is known, it may be produced by genetic engineering based on the information.
  • the glucose dehydrogenase used in the present invention may be a naturally occurring enzyme, or one in which the amino acid sequence of the naturally occurring enzyme has been modified or a chemical modification or the like has been carried out by known genetic engineering techniques etc. It may be one (hereinafter, also collectively referred to as "modification").
  • one or several amino acid residues are substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 as long as it is a glucose dehydrogenase having a Michaelis constant for D-xylose of 619 mM or more.
  • the amino acid sequence may be deleted, inserted and / or added.
  • One aspect of the glucose measurement method of the present invention has the following characteristics (I) and / or (II).
  • (I) D-glucose is measured by an enzyme electrode method using a glucose dehydrogenase having a Michaelis constant (Km) for D-xylose of 619 mM or more.
  • D-xylose activity in enzyme electrode method (the ratio of the response value to a solution spiked with 20 mM D-xylose to 10 mM D-glucose solution relative to the response value to 10 mM D-glucose solution ( %) Is 80% or more and 120% or less, preferably 85% or more and 115% or less, more preferably 90% or more and 110% or less, and still more preferably 95% or more and 105% or less. Is 97% or more and 103% or less.
  • the activity of 200 mM D-xylose was 3.6% when the activity on 200 mM D-glucose was 100%. .
  • This result indicates that "the activity to D-xylose in the water system" is an index depending on the concentration of the substrate to be measured.
  • the glucose sensor of the present invention uses a glucose dehydrogenase having a Michaelis constant (Km) for D-xylose of 600 mM or more and 3000 mM or less and a Km for D-glucose of 0.1 mM or more and 100 mM or less. It is a feature.
  • Km Michaelis constant
  • the glucose sensor of the present invention includes, but is not limited to, the SMBG sensor as described above.
  • a computing device may be provided for calculating the blood glucose level from the signal intensity obtained in response to glucose, and a display for displaying the calculated blood glucose level.
  • the glucose sensor of the present invention may be of a type in which blood or a dilution liquid of blood to be a sample is dropped on a reaction layer, or a needle for perforating the skin of a subject and collecting blood. Alternatively, it may be a mode having a flow path for transporting blood, or capable of mounting these. Alternatively, it may be a sensor used for continuous glucose monitoring (CGM) or flash glucose monitoring (FGM) that can continuously measure blood glucose.
  • CGM continuous glucose monitoring
  • FGM flash glucose monitoring
  • D-glucose concentration can be measured, for example, as follows. That is, a sample containing D-glucose is added to a reaction layer connected to an electrode on a glucose sensor to cause a reaction, and a constant voltage is applied to the electrode. The current is monitored, and the current accumulated for a certain period of time from the start of voltage application is integrated, or the current value at a certain time point after a certain period of time from the start of voltage application is measured. Based on this value, the D-glucose concentration in the sample can be calculated according to the calibration curve created by the D-glucose solution of standard concentration.
  • Glucose dehydrogenase activity measurement method the activity of glucose dehydrogenase reduces 1 micromole of DCPIP in the presence of a substrate in the presence of a substrate according to a method using a reagent having the following composition:
  • the amount of enzyme is defined as 1 unit (U).
  • the above solutions are mixed to obtain 200 mM D-glucose, 0.068 mM DCPIP, 1.63 mM PMS, 0.1% Triton X-100,
  • the reaction reagent is prepared to be 35 mM PIPES buffer (pH 6.5).
  • ⁇ Measurement conditions First, 3 ml of the reaction reagent is preheated at 37 ° C. for 5 minutes. Add 0.1 ml of GDH solution to this and mix gently, then record the change in absorbance at 600 nm for 5 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C with water as a control, and change the absorbance per minute from the linear portion Measure ( ⁇ OD TEST ). In the blind test, a solvent dissolving GDH is added to the reagent mixture instead of the GDH solution, and the change in absorbance per minute ( ⁇ OD BLANK ) is similarly measured. From these values, GDH activity is determined according to the following equation. One unit (U) in GDH activity is defined as the amount of enzyme that reduces one micromole of DCPIP in one minute in the presence of 200 mM D-glucose.
  • Michaelis constant of glucose dehydrogenase for D-glucose is calculated in the present invention from a line weaver-Burk plot. Specifically, it can be calculated by measuring the reaction rate at four D-glucose concentrations of 30 mM, 50 mM, 100 mM and 200 mM in the method for measuring D-glucose dehydrogenase described in 1 above.
  • D-xylose activity in water system of glucose dehydrogenase is a substrate in the glucose dehydrogenase activity measurement method described in 1 above. Acquire the reactivity to glucose and D-xylose by two kinds of methods set to two levels of 50 mM and 200 mM, respectively, and evaluate by calculating the ratio of the reactivity to xylose to the reactivity to glucose . Reactivity to xylose is obtained under the following measurement conditions
  • the above solution is mixed to make 50 mM or 200 mM D-xylose, 0.068 mM DCPIP, 1.63 mM PMS, 0.1% Triton X-
  • the reaction reagent is prepared to be 100, 35 mM PIPES buffer (pH 6.5).
  • ⁇ Measurement conditions First, 3 ml of the reaction reagent is preheated at 37 ° C. for 5 minutes. Add 0.1 ml of GDH solution to this and mix gently, then record the change in absorbance at 600 nm for 5 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C with water as a control, and change the absorbance per minute from the linear portion Measure ( ⁇ OD TEST ). In the blind test, a solvent dissolving GDH is added to the reagent mixture instead of the GDH solution, and the change in absorbance per minute ( ⁇ OD BLANK ) is similarly measured. From these values, the reactivity to xylose is determined by the method described in 1 above.
  • the Michaelis constant for glucose dehydrogenase D-xylose is calculated from the Leinweaver-Burk plot in the present invention. Specifically, it can be calculated by changing the substrate from D-glucose to D-xylose in the glucose dehydrogenase activity measurement method described in 1 above, and measuring the reaction rates at various D-xylose concentrations.
  • the D-xylose concentration used for calculation can set an appropriate concentration according to the Michaelis constant of the enzyme, but in the present invention, if Km is between 0 mM and 100 mM, 30 mM, 50 mM, 100 mM and 200 mM 4 points, 4 points of 50 mM, 200 mM, 600 mM and 1000 mM if the Km is between 100 mM and 500 mM and 4 points of 50 mM, 200 mM, 600 mM and 1400 mM if the Km is between 500 mM and 1500 mM I assume.
  • FIG. 5 shows an example of the principle of the method of measuring D-glucose using an enzyme electrode.
  • Glucose dehydrogenase catalyzes a reaction of oxidizing the hydroxyl group of glucose to form glucono- ⁇ -lactone in the presence of a mediator (electron acceptor).
  • the electrochemical measurement method used for the electrode is not particularly limited, but various electrochemical measurement methods can be applied by using a general potentiostat, galvanostat or the like. Specific measurement methods include various methods such as amperometry, potentiometry, coulometry, etc. A method of measuring the current value generated when the reduced mediator is oxidized by the application of amperometry Is particularly preferred.
  • the applied voltage in this case is preferably 10 to 700 mV, more preferably 50 to 500 mV, and still more preferably 100 to 400 mV.
  • the measurement system may be a two-electrode system or a three-electrode system.
  • a carbon electrode may be used, or a metal electrode such as platinum, gold, silver, nickel, palladium or the like may be used.
  • a metal electrode such as platinum, gold, silver, nickel, palladium or the like.
  • a carbon electrode pyrolotic graphite carbon, glassy carbon (GC), carbon paste, PFC (plastic formed carbon) or the like can be used.
  • gold is particularly preferred.
  • glucose dehydrogenase is supported on the working electrode.
  • a method for immobilizing the enzyme on the electrode a method using a crosslinking reagent, a method of enclosing in a polymer matrix, a method of covering with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer and the like can be mentioned.
  • the carrier may be held via a functional group and a spacer connecting the functional group to the carrier.
  • it may be immobilized on a polymer or adsorbed on an electrode together with a mediator such as ferricyanide, ferrocene or a derivative thereof, or these may be used in combination.
  • FADGDH is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the reference electrode is not particularly limited, and common ones in electrochemical experiments can be applied, and examples thereof include a saturated calomel electrode, silver-silver chloride and the like.
  • the glucose concentration can be measured, for example, as follows. First, buffer solution is put in a thermostatic cell and maintained at a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate and the like can be used. As a working electrode, an electrode on which FADGDH is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. A constant voltage is applied to the carbon electrode, and after the current becomes steady, a sample containing D-glucose is added to measure an increase in the current. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve created with a standard concentration of D-glucose solution.
  • a printing electrode may be used to reduce the amount of solution required for measurement and to easily measure on a small scale.
  • the electrode is preferably formed on the insulating substrate.
  • the method of producing the printing electrode be such that the electrode is formed on the substrate by a printing technique such as photolithography technique, screen printing, gravure printing, flexo printing, or the like.
  • a material of the insulating substrate silicon, glass, ceramic, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester and the like can be mentioned, and it is more preferable to use one having high resistance to various solvents and chemicals.
  • the shape of the electrode is not particularly limited, and may be circular, oval, square or the like, but it is particularly preferable from the viewpoint of ease of mounting of the enzyme solution to be immobilized.
  • the radius is preferably 3 mm or less, more preferably 2.5 mm or less, and still more preferably 2 mm or less.
  • the volume for mounting the enzyme solution is preferably about 1 to 5 ⁇ L, and more preferably about 2 to 3 ⁇ L.
  • the immobilization reaction after mounting the enzyme solution is preferably performed by standing still under wet conditions.
  • the type of solution used for the enzyme reaction is not particularly limited, and a phosphate buffer such as PBS or a GOOD buffer such as TRIS, MOPS, PIPES, HEPES, MES, TES, etc. are exemplified. .
  • the pH of the buffer solution is preferably about 4.0 to 9.0, more preferably about 5.0 to 8.0, and still more preferably about 6.0 to 7.5.
  • the concentration of the buffer solution is preferably about 1 to 200 mM, more preferably about 10 to 150 mM, and still more preferably about 20 to 100 mM.
  • various substances, such as various organic acids, salts, and preservatives coexist as additives.
  • the reaction layer formed on the electrode may contain, in addition to GDH and the electron carrier, a reaction accelerator, a thickener, a stabilizer, a pH buffer and other components.
  • a mediator may be used to mediate electron transfer between the enzyme reaction and the electrode.
  • the type of applicable mediator is not particularly limited, but quinones, cytochromes, viologens, phenazines, phenoxazines, phenothiazines, ferricyanide, ferredoxins, ferrocene and derivatives thereof are exemplified. . More specifically, benzoquinone / hydroquinone, ferricyan / ferrocyanide (potassium or sodium salt), ferricinium / ferrocene and the like can be mentioned.
  • Phenazine methosulfate, 1-methoxy-5-methyl phenadium methyl sulfate, 2,6-dichlorophenol indophenol and the like may be used.
  • metal complexes such as osmium, cobalt and ruthenium.
  • a compound having low water solubility is used as a mediator, the use of an organic solvent may impair the stability of the enzyme itself or may inactivate the enzyme activity. Therefore, in order to enhance water solubility, a compound modified with a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol (PEG) may be used as a mediator.
  • PEG polyethylene glycol
  • the mediator concentration in the reaction system is preferably in the range of about 1 mM to 1 M, more preferably 5 to 500 mM, and still more preferably 10 to 300 mM. Further, the mediator may be immobilized on the electrode together with the enzyme by using modified products with various functional groups.
  • the reaction accelerator is not particularly limited, and examples thereof include polyglutamic acid.
  • the thickener is not particularly limited as long as it is a substance that can ensure the viscosity necessary to hold the applied composition on the reaction layer of the glucose sensor.
  • pullulan, dextran, polyethylene glycol, poly- ⁇ -glutamic acid, carboxymethylcellulose, polyvinyl pyrrolidone and clay are mentioned as suitable examples.
  • the clay those having a kaolinite structure or a pyrophyllite structure, for example, Pyrophyllite, Pyrica, Mica, Smectite, Smectite, Vermiculite, Chlorite, Kaolinite And halloysite.
  • smectite is mentioned as an example of a suitable thickener.
  • Smectites are further classified into montmorillonite (Montmorillonite), beidellite (Beidelite), nontronite (Nontronite), saponite (Saponite), hectorite and the like.
  • the smectite may be a synthetic smectite, and commercially available products such as, for example, “Lucentite” series (manufactured by Coop Chemical Co., Ltd.) can be obtained.
  • the amount of the thickener added to the composition is not particularly limited as long as the effect of enhancing the stability of the composition is recognized, but the concentration in the liquid state is preferably 0.01% to 5%. And more preferably 0.1% or more and 1% or less. Moreover, in solid composition by heating or lyophilization etc., preferable addition amount is 0.5% or more and 70% or less, More preferably, it is 4.5% or more and 30% or less.
  • Stabilizers include, but are not limited to, substances such as glycylglycine, sorbitol and adonitol.
  • the addition amount thereof is not particularly limited as long as the effect of enhancing the stability of the composition is recognized, but the concentration in a liquid state is preferably 0.1% to 10%, and more preferably 0. It is 2% or more and 2% or less.
  • a preferable addition amount is 1% to 80%, and more preferably 2% to 50%.
  • the combination is not particularly limited, but preferably glycylglycine and carboxymethylcellulose, glycylglycine and smectite, glycylglycine and polyvinylpyrrolidone, sorbitol and carboxymethylcellulose Roll, sorbitol and smectite, sorbitol and polyvinylpyrrolidone, adonitol and carboxymethylcellulose, adonitol and smectite, adonitol and polyvinylpyrrolidone.
  • glycylglycine and smectite sorbitol and smectite or adonitol and smectite.
  • surfactant etc. are mentioned.
  • Triton X-100, Tween 20, sodium deoxycholate, emulgen 430 and the like can be mentioned.
  • the composition of the reaction layer may be liquid or may be in a dried and solidified state.
  • a method of solidification a method of evaporating water by heating, a method of air-drying at a temperature above normal temperature, a method of evaporating water by placing in vacuum, a method of placing water in a frozen state to remove moisture And the like, but not limited thereto.
  • the electrochemical detection method is not particularly limited, but it is preferable to measure, as a signal, a change in current caused by the transfer of electrons mediated by the mediator as the enzyme reaction proceeds.
  • the sample to be subjected to the measurement is not particularly limited, and it may be a biological sample such as blood, body fluid or urine as well as an aqueous solution which may or may contain the enzyme substrate as a component.
  • An electrode sensor in which a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode were disposed on an insulating substrate was obtained by consignment manufacturing from Biodevice Technology Co., Ltd. (Nomi City, Ishikawa Prefecture).
  • this electrode sensor an electrode is printed on a 4.0 mm ⁇ 17 mm substrate.
  • 3 ⁇ L of an aqueous solution serving as a reagent layer was mounted on the working electrode (area of about 1.3 mm 2 ) of this sensor.
  • the aqueous solution to be the reagent layer has the following composition.
  • ⁇ Measurement conditions Prepare a solution spiked with 20 mM D-xylose to 10 mM glucose solution and 10 mM glucose solution. 5 ⁇ L of these sample solutions are dropped onto the above chip connected to the potentiostat with a micropipette, and a voltage of +300 mV is applied 5 seconds after the drop, and the current value is measured.
  • the ratio (%) of the response value to the solution spiked with 20 mM D-xylose relative to the response value to 10 mM glucose solution is defined as the activity to xylose in the enzyme electrode method. If this value is 100%, it indicates that there is no influence from D-xylose. As this value deviates from 100%, it is positively or negatively affected by D-xylose.
  • Example 1 Characteristic Comparison of Glucose Dehydrogenase The characteristics of four types of FADGDH (GDH 1 to 4 described later) were compared. The items to be compared and the measurement method of each item are as follows.
  • GDH-1 comprises the DNA sequence of SEQ ID NO: 8 of Patent No. 5277482 as Cryptococcus sp.
  • the recombinant expression was carried out using S-2 D11 strain (FERM BP-11482) (the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 8 of Patent No. 5277482 is SEQ ID NO: 1).
  • GDH-2 is a GDH having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of JP-A-2013-116102) as Cryptococcus sp.
  • the recombinant expression was carried out using S-2 strain D11 (FERM BP-11482).
  • GDH-3 is a GDH having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of Patent No. 4648993) as Cryptococcus sp. It was expressed by genetic recombination using S-2 D11 strain (FERM BP-11482).
  • GDH-4 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of JP-A-2015-146773) as an Aspergillus oryzae NS4 strain (Transformation System for Aspergillus oryzae with Double Auxotorophic Mutations, niaD and sC). It is expressed by genetic recombination using (Bioscience Biotechnology Biochemistry, 1997 Vol. 61, 1367-1369). The results of comparison of various enzyme characteristics in GDH 1 to 4 are shown in Table 1.
  • the enzymes listed in Table 1 have a Km for D-glucose of 14 to 82 mM, and the affinity for glucose is sufficiently high.
  • the results of GDH-2 and GDH-3 are taken up. These two types of GDH have low D-xylose activity in the aqueous system, and particularly 2% or less when the xylose activity (a) in the aqueous system with a substrate concentration of 50 mM is used as a scale of evaluation, useful enzymes
  • D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method as a measure of evaluation
  • the spike method exceeds 120%. It was a value. Therefore, it has been shown that the glucose measurement by the SMBG sensor may be greatly influenced by D-xylose.
  • the D-xylose activity (a) in the water system of GDH-4 is about 1 ⁇ 4 of the D-xylose activity (a) in the water system of GDH-1. If D-xylose activity (a) in a water system is a suitable indicator for evaluating the effect of DDH on D-xylose used on an SMBG sensor, the enzyme electrode method of GDH-1 and GDH-4 There should also be a noticeable difference in D-xylose activity (d) at However, the difference between D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method of GDH-1 and GDH-4 is about 10%, which is expected from the difference between D-xylose activity (a) in aqueous system I can not confirm the effect of
  • Km (b) to D-xylose of GDH-1 to 4 and D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method From the comparison of Km (b) for D-xylose of GDH-1 to 4 with D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method (Fig. 1), Km (b) for D-xylose and enzyme electrode method A certain correlation was expected between D-xylose activity (d) of
  • D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method decreases, and Km (b) on D-xylose of GDH-1 to 4 and xylose in the enzyme electrode method If a regression line is created from the activity (d), it is considered that the xylose activity (d) in the enzyme electrode method may be suppressed when the Km (b) for D-xylose becomes 619 mM or more.
  • Example 2 Acquisition and property comparison of GDH-5, GDH-6
  • Km (b) for D-xylose is 619 mM or more We searched for GDH.
  • Example 1 of JP-A-2015-84676 describes the construction of a FADGDH random mutation library using Saccharomyces yeast as a host. From the DNA encoding GDH described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a FADGDH random mutation library using as a host a Saccharomyces genus yeast consisting of 1000 strains by the method based on the method described in Example 1 of JP-A-2015-84676 It was constructed.
  • random mutations were introduced into the FADGDH gene by error prone PCR using pYESMh6754 (see JP 2013-116102) as a plasmid.
  • the GAL1 promoter and the CYC1 terminator are arranged on pYESMh6754 with the FADGDH gene interposed.
  • the introduction of random mutations was carried out according to the protocol attached to this product using Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech) using primers capable of complementary binding to the GAL1 promoter and the CYC1 terminator.
  • a DNA fragment containing the FADGDH gene into which mutations were introduced at a constant rate was obtained.
  • the obtained DNA fragment containing the FADGDH gene into which mutations have been introduced at a constant rate is treated with restriction enzymes KpnI and NotI, and mixed with vector pYES3 (Invitrogen) which is also treated with restriction enzymes KpnI and NotI.
  • the ligation was carried out by adding and incubating a mixture solution and an equal amount of ligation reagent (Toraybo's Larage Hi).
  • the ligated DNA was transformed into competent cells of Escherichia coli DH5 ⁇ strain (competent high DH5 ⁇ manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the protocol attached to this product to obtain the transformant.
  • the transformant was cultured in LB medium, the plasmid was extracted, and a random mutant plasmid library was obtained in which mutations were introduced at a fixed rate into the FADGDH gene inserted into the plasmid. Subsequently, transformation of a random mutation plasmid library was performed to Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (Invitrogen). About 2000 grown colonies were used as a FADGDH random mutation library using Saccharomyces as a host.
  • the transformant contained in the library constructed as described above was cultured by the method based on the method described in Example 2 of JP-A-2015-84676. That is, the FADGDH random mutation library having the constructed Saccharomyces host as a host is distributed to each culture cell of ScreenMates (Matrix Technology), and is transferred to a medium containing 3% yeast extract, 1% polypeptone, 3% galactose The cells were cultured and shake culture was performed at 25 ° C. for 60 hours. Next, the obtained culture broth was centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes to obtain a culture supernatant.
  • ScreenMates Microx Technology
  • modified GDH expected to have a low affinity for D-xylose was selected.
  • GDH-5 having a Km (b) of 819 mM for D-xylose by purifying the selected modified GDH and confirming the reaction rate to D-xylose at 50 mM, 200 mM, 600 mM and 1400 mM concentrations;
  • GDH-6 having a Km (b) of 1271 mM for D-xylose was obtained.
  • Figure 2 shows the relationship between GDH-5 and 6 reaction rates against D-xylose at 50 mM, 200 mM, 600 mM and 1400 mM concentrations.
  • Figure 2 shows the results of the Lineweaver-Burk plot that is the basis of the Michaelis constant (Km) calculation. Is shown in FIG.
  • D-xylose acting activity (c) in the enzyme electrode method of GDH-5 whose Km (b) for D-xylose is 819 mM and Km (b) for D-xylose is 1271 mM is It was 100 to 101%, and it was confirmed that almost no effect with D-xylose was observed.
  • a comparison of Km (b) to D-xylose of GDH-1 to 6 and D-xylose acting (c) by the enzyme electrode method is shown in FIG.
  • GDH-2 and GDH-5 are compared.
  • Table 2 GDH-2 and GDH-5 had D-xylose activity (a) of about 1% in an aqueous system with a substrate concentration of 50 mM, and when this point was used as a standard of evaluation, both D- It is treated as a useful enzyme in terms of xylose activity.
  • D-xylose activity (d) in the enzyme electrode method of GDH-2 and GDH-5.
  • GDH-2 has a D-xylose activity of 120% in the enzyme electrode method, and there is concern about the influence on D-xylose in glucose measurement with the SMBG sensor, while GDH-5 has D activity in the enzyme electrode method.
  • the xylose activity is 100%, and it can be said that the degree of influence of D-xylose on glucose measurement with the SMBG sensor is small.
  • DDH-xylose activity in each water system was also measured using GDH1 to 6 even when the substrate concentration was changed to 200 mM.
  • GDH-1 is 9.9%
  • GDH-2 is 4.9%
  • GDH-3 is 3.6%
  • GDH-4 is 4.6%
  • GDH-5 is 1.8%
  • GDH -6 was 1.6%.
  • the present invention makes it possible to provide a glucose measurement method and a glucose measurement sensor capable of accurate blood glucose measurement, and is expected to be widely used in accurate blood glucose level control in the field of diabetes medical care.

Abstract

ＦＡＤＧＤＨを用いたグルコースセンサにおいて、ＦＡＤＧＤＨのＤ－キシロースへの作用性を反映する、水系でのＦＡＤＧＤＨの評価方法を構築することにより、実用上Ｄ－キシロースに対する影響を低減させたグルコースセンサ及びグルコース測定方法を提供する。 キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）が６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下であり、かつ、グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下であるグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とする、及びグルコースを測定する方法及びグルコースセンサ。

Description

グルコース測定方法およびグルコースセンサ
本発明は、グルコース測定方法およびグルコースセンサに関する。
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）は、糖尿病患者自身が自己の血糖値を日常的に測定、管理し、血糖値をコントロールすることにより治療に活用する上で重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。この種の典型的なバイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成した装置が挙げられる。
バイオセンサに用いられるグルコース測定用酵素としては、グルコース脱水素酵素（以下、「ＧＤＨ」とも表す。）及びグルコースオキシダーゼ（以下、「ＧＯ」とも表す。）（ＥＣ　１．１．３．４）等が知られている。ＧＤＨは、必要とする補酵素の違いによって、さらに、ピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（以下、「ＰＱＱＧＤＨ」とも表す。）（ＥＣ　１．１．５．２（旧ＥＣ　１．１．９９．１７））や、フラビン結合型グルコース脱水素酵素（例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）（ＥＣ　１．１．９９．１０））等に分類される。
ＧＯを用いたグルコース測定方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすことが指摘されている。これに対し、ＰＱＱＧＤＨを用いた方法では溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用することが指摘されている。さらにＦＡＤＧＤＨを用いる方法では、溶存酸素の影響を受けず、かつ、マルトースやラクトースにもほとんど作用しないことが知られている。
糖尿病患者が血糖測定を行う上で問題となる糖として、マルトースやラクトース以外にＤ－キシロースもあげられる。Ｄ－キシロースは、医療現場においては小腸からの炭水化物吸収能を評価するキシロース吸収に用いられる。そのため糖尿病患者が該試験を受けている際に、Ｄ－キシロース作用性を有するグルコース脱水素酵素を用いて血糖測定を行うと、測定値の正確性を損ねる可能性がある。
特にＳＭＢＧセンサにおいて、夾雑物質による影響の評価方法については、米国ＦＤＡより非特許文献１が公開されている。非特許文献１によると、Ｄ－キシロースの影響は、グルコース溶液に対して２００ｍｇ／ｄＬの濃度でＤ－キシロースをスパイクした溶液での応答値を測定し、スパイクなしの条件での応答値に対して９５％信頼区間での応答値を示すことが推奨されている。
そのため、ＳＭＢＧセンサ上でのＤ－キシロース作用性に関する評価は、スパイク試験を用いて行われることが多い。また、Ｄ－キシロースの影響がないことを確実に担保するために、スパイク試験で採用するＤ－キシロース濃度は非特許文献１に記載の濃度よりも高く設定し性能評価を行う場合がある。
ところで、ＳＭＢＧセンサにおける実用上のＤ－キシロース作用性が、非特許文献１のようにスパイク試験で評価されることが多いのに対し、ＳＭＢＧセンサで使用するＦＡＤＧＤＨのＤ－キシロース作用性は、現状では、水系におけるＤ－キシロースへの作用性を主体として論じられていることが多い。例えば、特許文献１には、Ｄ－グルコースへの作用性を１００％とした際のＤ－キシロースの作用性が２％以下であるＦＡＤＧＤＨを用いることにより、正確にＤ－グルコース量を測定することができるとの内容の記載がある。
特許第４６４８９９３号
Ｓｅｌｆ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｏｖｅｒ－ｔｈｅ－Ｃｏｕｎｔｅｒ　Ｕｓｅ　：　Ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｔａｆｆ　２０１６年１０月１１日発行（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｒａｐｓ.ｏｒｇ／Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－Ｆｏｃｕｓ／Ｎｅｗｓ／２０１６／１０／０７／２５９６６／ＦＤＡ－Ｆｉｎａｌｉｚｅｓ－Ｔｗｏ－Ｇｕｉｄａｎｃｅ－Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ－ｏｎ－Ｂｌｏｏｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－Ｓｙｓｔｅｍｓ／）
上述の通り、ＳＭＢＧセンサで使用するＦＡＤＧＤＨのＤ－キシロース作用性の評価は、これまで水系におけるＤ－キシロースへの作用性を主体として論じられており、この評価方法に基づきＤ－キシロースへの作用性が低いとされるＦＡＤＧＤＨについて多くの報告がある。しかし、水系におけるＤ－キシロースへの作用性の低いＦＡＤＧＤＨが、必ずしもセンサ系においてもキシロースの影響を受けないとは限らないという問題がある。実際に、水系における評価方法が、実際にＳＭＢＧセンサに代表されるグルコースセンサおけるＤ－キシロースへの作用性を反映しているかという点に関しては、単純にそれぞれの基質に対する反応性を比較する以外に、グルコースセンサ上で実用上Ｄ－キシロースに対する影響がないことを反映するＧＤＨの理化学特性は、これまでには報告されていない。
本発明の課題は、これまで明らかにされていなかったグルコースセンサ上で実用上Ｄ－キシロースに対する影響がないことを反映するＧＤＨの理化学特性を見出すことにある。より具体的には、グルコースセンサにおけるＧＤＨのＤ－キシロースへの作用性を反映する、水系でのＧＤＨの評価方法を構築することにより、実用上Ｄ－キシロースに対する影響を低減させたグルコースセンサ及びグルコース測定方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った結果、ＧＤＨがグルコースセンサに適用された際にＤ－キシロースに対する影響がないことを満足する理化学特性として、Ｄ－グルコースに対するＧＤＨのミカエリス定数（以下、「Ｋｍ」とも表す。）が１００ｍＭ以下かつ、Ｄ－キシロースに対するＧＤＨのミカエリス定数が６００ｍＭ以上であることが重要であることを見出し、該特性を有するＧＤＨを用いることで、実用上Ｄ－キシロースの影響を受けないと言えるグルコースセンサを作製できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、以下に代表される発明が提供される。
項１．下記の特性（１）及び（２）を備えるグルコース脱水素酵素を用いるグルコース測定方法。
（１）Ｄ－グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下
（２）Ｄ－キシロースに対するＫｍが６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下
項２．グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するＫｍが６１９ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下である項１に記載のグルコース測定方法。
項３．グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するＫｍが７３６ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下である項１に記載のグルコース測定方法。
項４．グルコース脱水素酵素を備えた酵素電極を用いる項１から３のいずれかに記載のグルコース測定方法。
項５．グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（１０ｍＭのグルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対し２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％））が９５％以上、１０５％以下である項１から４のいずれかに記載のＤ－グルコースを測定する方法。
項６．下記の特性（１）及び（２）を備えるグルコース脱水素酵素が、カーボン電極または金属電極上に備わるグルコースセンサ。
（１）Ｄ－グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下
（２）Ｄ－キシロースに対するＫｍが６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下
項７．グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（１０ｍＭのグルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対し２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％））が９５％以上、１０５％以下である項６に記載のグルコースセンサ。
項８．カーボン電極または金属電極上に、さらに、メディエーターを備えた項６または７に記載のグルコースセンサ。
項９．グルコース脱水素酵素のキシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）を測定する工程を含むグルコースセンサの製造方法。
項１０．グルコース脱水素酵素のキシロースに対するＫｍを測定し、かつ、Ｋｍが６００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素を選択する工程を含む項９に記載のセンサの製造方法。
本発明により、特にＤ－キシロースによる影響を受けることなく、正確な血糖測定が可能なグルコース測定方法およびグルコース測定用センサの提供が可能となる。
実施例１において、ＧＤＨ１～４のＤ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性を示す図である。 実施例２において、ＧＤＨ－５及び６のＤ－キシロース濃度に対する反応速度の関係を検討した結果を示す図である。 実施例２において、ＧＤＨ－５及び６のＤ－キシロース濃度の逆数に対する反応速度の逆数の関係（ラインウィーバー・バークプロット）を示す図である。 実施例２において、ＧＤＨ１～６のＤ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性を示す図である。 酵素電極を用いてＤ－グルコースを測定する方法の原理の一例を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の態様の一つは、Ｄ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）が６００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素を用いて、酵素電極法によりＤ－グルコースを測定する方法である。
本発明のグルコース測定方法は、以下の反応を触媒するグルコース脱水素酵素を利用することを特徴とする。
Ｄ－グルコース　＋　電子受容体（酸化型）　→　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　電子受容体（還元型）
本発明に用いるグルコース脱水素酵素は特に限定されないが、フラビン結合型グルコース脱水素酵素が好ましい。フラビンは、ジメチルイソアロキサジンの１０位に置換基をもつ一群の誘導体であり、フラビン分子種を補酵素とする酵素であれば特に限定されるものではない。フラビン化合物としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが挙げられるが、ＦＡＤが特に好ましい。
本発明で用いるグルコース脱水素酵素はＤ－グルコースに対する親和性が十分に高く、Ｄ－キシロースに対する親和性が十分に低いことを特徴とする。より具体的には、Ｄ－グルコースに対する親和性として、Ｄ－グルコースに対するＫｍが１００ｍＭ以下であり、Ｄ－キシロースに対する親和性としてＤ－キシロースに対するＫｍが６００ｍＭ以上である。Ｄ－グルコースに対するＫｍおよびＤ－キシロースに対するＫｍ以外の特性については特に限定されない。例えば、Ｄ－グルコースに対するＫｍは、１００ｍＭ以下であればよく、さらに好ましくは９０ｍＭ以下である。Ｄ－グルコースに対するＫｍが小さいことが重要であるため、その下限については特に限定されるものではないが、０．１ｍＭより大きく、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上である。Ｄ－キシロースに対するＫｍは６００ｍＭ以上であればよく、好ましくは６１９ｍＭ以上、さらに好ましくは６５０ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、７３６ｍＭ以上、７５０ｍＭ以上、あるいは８１９ｍＭ以上であり、特に好ましくは８５０ｍＭ以上である。Ｄ－キシロースに対するＫｍが大きいことが重要であるため、その上限に関しては特に限定されるものではないが、Ｄ－キシロースの溶解度から推測し、Ｋｍの上限として３Ｍ以下であることが好ましい。より好ましくは２．５Ｍ以下、２Ｍ以下あるいは１．５Ｍ以下である。特に好ましくは１．３Ｍ以下である。
本発明で用いるグルコース脱水素酵素のその他の特性は特に限定されないが、例えば、至適温度は、３５℃から６５℃であることが好ましく、４０℃から６０℃がより好ましく、４５℃から５５℃がさらに好ましい。
温度安定性は、５０℃、１５分処理後の残存活性が７０％以上であることが好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましい。
至適ｐＨは、５．０から８．５であることが好ましく、５．５から８．０がより好ましく、６．０から７．５がさらに好ましい。
ｐＨ安定性は、２５℃、１６時間処理条件下で、２．５から１０．０であることが好ましく、３．５から９．０がより好ましく、４．５から８．０がさらに好ましい。
糖含有量は、５％から５０％であることが好ましく、１０％から４０％がより好ましく、２０％から３０％がさらに好ましい。
特には、基本的な特性として、Ｄ－キシロースに対するＫｍ以外には、以下のような性質を有するグルコース脱水素酵素が好ましい。
　　至適温度　　　５０～５５℃
　　温度安定性　　５０℃、１５分処理後の残存活性が８０％以上
　　至適ｐＨ　　　７．０付近
　　ｐＨ安定性　　４．０～８．０（２５℃、１６時間）
　　糖含有量　　　２０～５０％
　　Ｄ－グルコースに対するＫｍ　　　　　５０～７０ｍＭ
または、以下のような性質を有するグルコース脱水素酵素であってもよい。
　　至適温度　　　５０～７０℃
　　温度安定性　　５０℃、１５分処理後の残存活性が８０％以上
　　至適ｐＨ　　　６．５～７．５
　　ｐＨ安定性　　２．５～１０．０（２５℃、１６時間）
　　糖含有量　　　１０～４０％
　　Ｄ－グルコースに対するＫｍ　　　　　１０～９０ｍＭ
または、以下のような性質を有するグルコース脱水素酵素であってもよい。
　　至適温度　　　４５～５０℃
　　温度安定性　　４５℃、１５分処理後の残存活性が８０％以上
　　至適ｐＨ　　　６．０～６．５
　　ｐＨ安定性　　３．５～６．５（２５℃、１６時間）
　　糖含有量　　　２０～５０％
　　Ｄ－グルコースに対するＫｍ　　　　　５～２０ｍＭ
本発明で用いるグルコース脱水素酵素の由来は特に限定されない。例えば、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属などの糸状菌や、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、及びアクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属などのケカビ科に分類される微生物などが挙げられる。
ペニシリウム属では、ペニシリウム・イタリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｉｔａｌｉｃｕｍ）及びペニシリウム・リラシノエキヌラタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）などの種が例示される。また、アスペルギルス属では、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｆｌｕｖｕｓ）などの種が例示される。また、ケカビ科に分類される微生物としては、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）、リゾムコール（ＲｈｉｚｏｈＭｕｃｏｒ）シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）、パラシテラ（Ｐａｒａｓｉｔｅｌｌａ）、ザイゴリンカス（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）、ディクラノフォラ（Ｄｉｃｒａｎｏｐｈｏｒａ）、スピネラス（Ｓｐｉｎｅｌｌｕｓ）、スポロディニエラ（Ｓｐｏｒｏｄｉｎｉｅｌｌａ）、リゾパス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）、クラミドアブシジア（Ｃｈｌａｍｉｄｏａｂｓｉｄｉａ）及びサーモムコール（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ）などの属が例示される。ムコール属では、ムコール・ギリエルモンディ（Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）及びムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）などの種が例示される。
本発明で用いるグルコース脱水素酵素は、天然に由来するものを抽出・精製して得てもよいし、既にそのアミノ酸配列やアミノ酸配列をコードする遺伝子配列などの情報（例えば、配列番号５のアミノ酸配列）が知られている場合は、それらの情報に基づき、遺伝子工学的な手法により生産されたものであっても構わない。本発明で用いるグルコース脱水素酵素は、天然由来の酵素であってもよいし、公知の遺伝子工学的な手法等によって、天然由来酵素のアミノ酸配列が改変されたもの及び化学修飾等が施されたもの（以下、あわせて「改変体」ともいう。）であってもよい。
前記改変体の好ましい例としては、Ｄ－キシロースに対するミカエリス定数が６００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素である限りにおいて、配列番号５に記載のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を持つグルコース脱水素酵素が挙げられる。また、前記改変体の好ましい例としては、Ｄ－キシロースに対するミカエリス定数が６１９ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素である限りにおいて、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなるものであっても良い。
本発明のグルコース測定方法の一態様は、以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）の特性を有する。
（Ｉ）Ｄ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）が６１９ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素を用いて、酵素電極法により、Ｄ－グルコースを測定する。
（ＩＩ）酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対し２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％））が８０％以上１２０％以下であり、好ましくは８５％以上１１５％以下であり、さらに好ましくは９０％以上１１０％以下であり、さらに好ましくは９５％以上１０５％以下であり、さらに好ましくは９７％以上１０３％以下である。
これに対し、グルコース測定における基質特異性の評価基準として従来用いられてきた「水系におけるＤ－キシロースへの作用性」は現実には「酵素電極法でのＤ－キシロース作用性」との相関が見られないことがわかった。このような結果が生じた原因は、従来、ＦＡＤＧＤＨのＤ－グルコースに対するＤ－キシロースの作用性を、水系での任意の一点の基質濃度における作用性だけで表現してきたからであると考えられる。例えば、特許文献１記載のムコール・プライニ由来ＦＡＤＧＤＨのＤ－キシロース作用性は、その実施例によると５０ｍＭにて取得されており、１．４％とあるが、発明者らの検討では、測定に使用する基質濃度を２００ｍＭに変更して測定を行うと、水系では、２００ｍＭのＤ－グルコースへの作用性を１００％とした際の２００ｍＭのＤ－キシロースの作用性は３．６％であった。この結果は、「水系におけるＤ－キシロースへの作用性」が、測定に供する基質の濃度に依存する指標であることを示している。
本発明のグルコースセンサは、Ｄ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）が６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下であり、かつ、Ｄ－グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下であるグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするものである。
本発明のグルコースセンサとしては、特に限定されるものではないが、上述のようなＳＭＢＧセンサが挙げられる。グルコースに応答して得られたシグナル強度から血糖値を算出するための演算装置並びに算出された血糖値を表示するためのディスプレイを具備していてもよい。さらに本発明のグルコースセンサは、反応層上に検体となる血液もしくは血液の希釈液を滴下するタイプであってもよいし、被検者の皮膚を窄孔し血液を採取するための針及び／または血液を移送させる流路を具備するか、またはこれらを装着することが可能な態様であってもよい。あるいは、持続的に血糖を測定できるタイプのＣＧＭ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）やＦＧＭ（Ｆｌａｓｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）などに用いられるセンサであってもよい。
本発明において、Ｄ－グルコース濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち、グルコースセンサ上の電極に接続された反応層にＤ－グルコースを含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算するか、あるいは電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での電流値を測定する。この値を基に、標準濃度のＤ－グルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のＤ－グルコース濃度を計算することができる。
１．グルコース脱水素酵素活性測定法
本発明において、グルコース脱水素酵素の活性は、以下の組成からなる試薬を用いた方法に従い、基質存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１単位（Ｕ）として定義する。
＜試薬＞
５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む）
２４ｍＭ　ＰＭＳ溶液
２ｍＭ　２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液
上記溶液を混合して２００ｍＭ　Ｄ‐グルコース、０．０６８ｍＭ　ＤＣＰＩＰ、１．６３ｍＭ　ＰＭＳ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、３５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）となるように反応試薬を調製する。
＜測定条件＞
まず、反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。これにＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から、次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
２．グルコース脱水素酵素のＤ－グルコースに対するミカエリス定数
グルコース脱水素酵素のＤ－グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、本発明においてはラインウィーバー・バークプロットから算出する。具体的には、上記１記載のＤ－グルコース脱水素酵素活性測定法において３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭおよび２００ｍＭの４点のＤ－グルコース濃度における反応速度を測定することで算出できる。
３．グルコース脱水素酵素の水系でのＤ－キシロース作用性の評価方法
グルコース脱水素酵素の水系でのＤ－キシロース作用性は、上記１に記載のグルコース脱水素酵素活性測定法において、基質濃度を５０ｍＭ及び２００ｍＭの２水準に設定した２種類の方法で、それぞれグルコース及びＤ－キシロースに対する反応性を取得し、グルコースへの反応性に対するキシロースへの反応性の割合を算出することで評価する。キシロースに対する反応性は、以下の測定条件で取得する
＜試薬＞
５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む）
２４ｍＭ　ＰＭＳ溶液
２ｍＭ　２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ　Ｄ－キシロース溶液
上記溶液を混合して５０ｍＭまたは２００ｍＭ　Ｄ‐キシロース、０．０６８ｍＭ　ＤＣＰＩＰ、１．６３ｍＭ　ＰＭＳ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、３５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）となるように反応試薬を調製する。
＜測定条件＞
まず、反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。これにＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から、上記１に記載の方法によりキシロースに対する反応性を求める。
４．グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するミカエリス定数
グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は、本発明においてはラインウィーバー・バークプロットから算出する。具体的には、上記１記載のグルコース脱水素酵素活性測定法において基質をＤ－グルコースからＤ－キシロースに変更し、各種Ｄ－キシロース濃度における反応速度を測定することで算出できる。算出のために用いるＤ－キシロース濃度は、その酵素のミカエリス定数に応じて適切な濃度を設定できるが、本発明では、Ｋｍが０ｍＭ～１００ｍＭの間であれば、３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの４点、Ｋｍが１００ｍＭ～５００ｍＭの間であれば、５０ｍＭ、２００ｍＭ、６００ｍＭおよび１０００ｍＭの４点、Ｋｍが５００ｍＭ～１５００ｍＭの間であれば、５０ｍＭ、２００ｍＭ、６００ｍＭおよび１４００ｍＭの４点をプロットするものとする。
５．酵素電極法
本発明に用いる酵素電極法は特に限定されない。図５に酵素電極を用いてＤ－グルコースを測定する方法の原理の一例を示す。グルコース脱水素酵素は、メディエーター（電子受容体）の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。ＦＡＤＧＤＨがＤ－グルコースに作用する際に、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２（還元型）となるが、メディエーターとしてフェリシアン化物（例えば「Ｆｅ（ＣＮ）６」３－）を存在させると、ＦＡＤＨ２（還元型）はこれをフェロシアン化物（この場合「Ｆｅ（ＣＮ）６」４－）へと変換し、自らはＦＡＤ（酸化型）へと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質をメディエーターとすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
電極に用いる電気化学測定法は、特に限定されるものではないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法を適用することができる。具体的な測定手法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられるが、アンペロメトリーにより、還元されたメディエーターが印加により酸化される際に生ずる電流値を測定する方法が特に好ましい。この場合の印加電圧としては、１０～７００ｍＶが好ましく、５０～５００ｍＶがより好ましく、１００～４００ｍＶが更に好ましい。
測定システムとしては、二電極系であっても三電極系であってもよい。作用電極にはカーボン電極を用いてもよいし、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極を用いてもよい。カーボン電極の場合、パイロロティックグラファイトカーボン、グラッシーカーボン（ＧＣ）、カーボンペースト、ＰＦＣ（ｐｌａｓｔｉｃ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）などを用いることができる。金属電極の場合、金が特に好ましい。通常は、作用電極上にグルコース脱水素酵素が担持されてなる。酵素の電極への固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどが挙げられる。官能基および該官能基と該担体とを繋ぐスペーサーを介して担体に保持させてもよい。あるいはフェリシアン化物、フェロセンあるいはその誘導体のようなメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。一例として、グルタルアルデヒドを用いて、ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする方法である。参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀－塩化銀などが挙げられる。
グルコース濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極としてＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、Ｄ－グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のＤ－グルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
測定に必要な溶液の量を少なくし、小スケールで簡便に測定するために、印刷電極を用いてもよい。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。印刷電極の作製方法は、具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極が基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられるが、円形であることが、固定化する酵素溶液のマウントのしやすさの点から特に好ましい。また、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。酵素溶液をマウントする容量としては１～５μＬ程度が好ましく、２～３μＬ程度の量で行うのがより好ましい。酵素溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。
酵素反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液、あるいはＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液などが例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０～９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０～８．０程度、更に好ましくは６．０～７．５程度である。また、緩衝液の濃度としては、１～２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０～１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０～１００ｍＭ程度である。また、添加物として、各種の有機酸、塩、防腐剤などの物質を必要に応じて共存させることも可能である。
本発明のグルコースセンサの態様は特に限定されるものではないが、例えば、電極上にＧＤＨおよび電子伝達体を保持したチップを装着できる態様からなるものが好ましい。電極上に形成される反応層には、ＧＤＨおよび電子伝達体のほかに、反応促進剤、増粘剤、安定化剤、ｐＨ緩衝剤その他の成分を含んでいてもよい。
酵素反応と電極間の電子移動を仲介するために、メディエーターを用いてもよい。適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が例示される。より具体的には、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン化物（カリウムもしくはナトリウム塩）、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。フェナジンメトサルフェート、１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６－ジクロロフェノールインドフェノールなどを用いてもよい。その他にも、オスミウム、コバルト、ルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させたりする可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子により修飾された化合物をメディエーターとして用いてもよい。反応系におけるメディエーター濃度は、１ｍＭ～１Ｍ程度の範囲が好ましく、５～５００ｍＭがより好ましく、１０～３００ｍＭが更に好ましい。またメディエ－ターについても種々の官能基による修飾体を用いるなどして、酵素とともに電極上に固定化させて用いてもよい。
反応促進剤としては特に限定されないが、ポリグルタミン酸などが挙げられる。
増粘剤としては、塗布した組成物をグルコースセンサの反応層上に保持するに必要な粘性を担保できる物質であれば特に限定されない。例えばプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ－γ－グルタミン酸、カルボシキメチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよび粘土が好適な例として挙げられる。粘土としては、カオリナイト構造やパイロフィライト構造を持つもの、たとえば、パイロフィライト（Ｐｙｒｏｐｈｙｌｌｉｔｅ）、マイカ（Ｍｉｃａ）、スメクタイト（Ｓｍｅｃｔｉｔｅ）、バーミキュライト（Ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ）、クロライト（Ｃｈｌｏｒｉｔｅ）、カオリナイト（Ｋａｏｌｉｎｉｔｅ）、ハロイサイト（Ｈａｌｌｏｙｓｉｔｅ）などが挙げられる。これらの中でも、スメクタイトが好適な増粘剤の例として挙げられる。スメクタイトは、さらにモンモリロナイト（Ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、バイデライト（Ｂｅｉｄｅｌｉｔｅ）、ノントロナイト（Ｎｏｎｔｒｏｎｉｔｅ）、サポナイト（Ｓａｐｏｎｉｔｅ）、ヘクトライト（Ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）などに分類される。スメクタイトは合成スメクタイトであってもよく、例えば、「ルーセンタイト」シリーズ（コープケミカル株式会社製）などの市販品を入手できる。
増粘剤の組成中への添加量は、上記組成物の安定性を高める効果の認められる範囲であれば特に限定されないが、液体状での濃度として好ましくは０．０１％以上５％以下であり、より好ましくは０．１％以上１％以下である。また、加温または凍結乾燥等による固体状の組成においては、好ましい添加量は０．５％以上７０％以下であり、より好ましくは４．５％以上３０％以下である。
安定化剤としては特に限定されないが、例えばグリシルグリシン、ソルビトールおよびアドニトール（ａｄｏｎｉｔｏｌ）などの物質が挙げられる。その添加量は、上記組成物の安定性を高める効果の認められる範囲であれば特に限定されないが、液体状での濃度として好ましくは０．１％以上１０％以下であり、より好ましくは０．２％以上２％以下である。また、加温または凍結乾燥等を経ることによる固体状の組成においては、好ましい添加量は１％以上８０％以下であり、より好ましくは２％以上５０％以下である。
安定化剤と増粘剤とを組合せる場合、その組合せは特に限定されないが、好ましくはグリシルグリシンとカルボキシメチルセルロール、グリシルグリシンとスメクタイト、グリシルグリシンとポリビニルピロリドン、ソルビトールとカルボキシメチルセルロール、ソルビトールとスメクタイト、ソルビトールとポリビニルピロリドン、アドニトールとカルボキシメチルセルロール、アドニトールとスメクタイト、アドニトールとポリビニルピロリドンである。これら組合せの中で、より好適にはグリシルグリシンとスメクタイト、ソルビトールとスメクタイトまたはアドニトールとスメクタイトである。
その他の成分としては特に限定されないが、例えば、界面活性剤などが挙げられる。界面活性剤を用いる場合には、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、エマルゲン４３０等が挙げられる。
前記反応層の組成物は液状であってもよく、あるいは乾燥し固体化した状態であってもよい。固体化の方法としては、加温により水分を蒸発させる方法、常温以上の温度で風乾する方法、真空状態に置くことで水分を蒸発させる方法、凍結した状態で真空に置いて水分を除去する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
酵素反応は、所望の容量の反応溶液中に、所望の量の酵素とメディエーターを加えて混合された状態において、基質を含有する試料溶液、例えば血液を所定量加えると同時に測定を開始する。電気化学的な検出方法としては、特に限定されるものではないが、酵素反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化を、シグナルとして測定することが好ましい。測定に供する試料は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有するか含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行ってもよい。また、マイクロ流路デバイス等を用いることにより、微量解析に展開することも可能である。
６．酵素電極法におけるＤ－キシロース作用性の評価方法
酵素電極法におけるキシロースに対する反応性は、下記の方法で作製したセンサチップを用い、１０ｍＭのグルコース溶液に対し、２０ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬに相当）のＤ－キシロースをスパイクした溶液で評価する。なお、この条件は、非特許文献１に記載の条件を参考に、非特許文献１の推奨条件より厳しく設定したものである。
＜センサチップ作製＞
絶縁性基板に作用電極、対向電極および参照電極を配した電極センサを、有限会社バイオデバイステクノロジー（石川県能美市）より、委託製造により入手した。本電極センサは、４．０ｍｍ×１７ｍｍの基板上に電極が印刷されている。このセンサの作用電極（面積約１．３ｍｍ２）上に試薬層となる水溶液を３μＬマウントした。試薬層となる水溶液には、下記の組成からなる。
１０００Ｕ／ｍｌ　ＦＡＤ－ＧＤＨ
２００ｍＭ　フェリシアン化カリウム
５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー　（ｐＨ７．０）
これを５０℃で１０分加温することにより乾燥させ、ＦＡＤＧＤＨが１枚当たり３Ｕ固定化されたグルコースセンサチップを得る。
＜測定条件＞
１０ｍＭのグルコース溶液及び１０ｍＭのグルコース溶液に対し、２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液を調製する。ポテンショスタットに接続した上記チップに、これら試料溶液５μＬをマイクロピペットで滴下し、滴下から５秒後に＋３００ｍＶの電圧を印加、電流値を測定する。１０ｍＭのグルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのグルコース溶液に対し、２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％）を酵素電極法におけるキシロースに対する作用性と定義する。この値が１００％であれば、Ｄ－キシロースからの影響を全く受けないことを示す。この値が１００％から離れるほど、Ｄ－キシロースから正または負の影響を受けていることになる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞　グルコース脱水素酵素の特性比較
４種類のＦＡＤＧＤＨ（後述のＧＤＨ１～４）についてその特性を比較した。比較した項目および各項目の測定方法は、次の通りである。
（ａ）基質濃度５０ｍＭでの水系でのＤ－キシロース作用性
測定法：「３．グルコース脱水素酵素の水系でのＤ－キシロース作用性の評価方法」に記載の方法
（ｂ）水系でのＤ－キシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）
測定法：「４．グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するミカエリス定数」に記載の方法
（ｃ）水系でのＤ－グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）
測定法：「２．グルコース脱水素酵素のＤ－グルコースに対するミカエリス定数」に記載の方法
（ｄ）酵素電極法でのＤ－キシロース作用性
測定法：「６．酵素電極法におけるＤ－キシロース作用性の評価方法」に記載の方法
ＧＤＨ－１は特許第５２７７４８２号の配列番号８のＤＮＡ配列を特許第５５８８５７８号記載のクリプトコッカス　ｓｐ．　Ｓ－２　Ｄ１１菌株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４８２）を用いて遺伝子組み換え発現させたものである（特許第５２７７４８２の配列番号８がコードするアミノ酸配列は配列番号１である。）。ＧＤＨ－２は配列番号２のアミノ酸配列（特開２０１３－１１６１０２号の配列番号１記載のアミノ酸配列）を有するＧＤＨを特許第５５８８５７８号記載のクリプトコッカス　ｓｐ．　Ｓ－２　Ｄ１１菌株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４８２）を用いて遺伝子組み換え発現させたものである。
ＧＤＨ－３は配列番号３のアミノ酸配列（特許第４６４８９９３号の配列番号１記載のアミノ酸配列）を有するＧＤＨを特許５５８８５７８号に記載のクリプトコッカス　ｓｐ．　Ｓ－２　Ｄ１１菌株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４８２）を用いて遺伝子組み換えにより発現させたものである。ＧＤＨ－４は配列番号４のアミノ酸配列（特開２０１５－１４６７７３号の配列番号１記載のアミノ酸配列）を有するＧＤＨをアスペルギルス・オリゼ－ＮＳ４株（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｕｂｌｅ　Ａｕｘｏｔｏｒｏｐｈｉｃ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，　ｎｉａＤ　ａｎｄ　ｓＣ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７　Ｖｏｌ．６１，１３６７－１３６９））を用いて遺伝子組み換えにより発現させたものである。
ＧＤＨ１～４における各種酵素特性を比較した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表１に挙げた酵素は、Ｄ－グルコースに対するＫｍが１４～８２ｍＭであり、グルコースに対する親和性は十分に高い。まず、ＧＤＨ－２、ＧＤＨ－３の結果を採り上げる。これら２種類のＧＤＨは水系でのＤ－キシロース作用性が低く、特に基質濃度５０ｍＭでの水系でのキシロース作用性（ａ）を評価の尺度に用いた場合には２％以下となり、有用な酵素であるとの評価となるが、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）を評価の尺度に用いた場合はＧＤＨ－２、ＧＤＨ－３いずれの場合も、スパイク法で１２０％を超える値であった。したがって、ＳＭＢＧセンサによるグルコース測定に際しても、Ｄ－キシロースに対する影響を大きく受ける可能性が示された。
次に、ＧＤＨ－１、ＧＤＨ－４の結果を取りあげる。ＧＤＨ－４の水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）は、ＧＤＨ－１の水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）の１／４程度となっている。水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）が、ＳＭＢＧセンサ上で使用するＧＤＨのＤ－キシロースに対する影響を評価する上で適切な指標であるならば、ＧＤＨ－１とＧＤＨ－４の酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）にも顕著な差が見られるはずである。ところが、ＧＤＨ－１とＧＤＨ－４の酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）の差は１０％程度であり、水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）の差から期待されるほどの効果を確認できない。
ここで、ＧＤＨ－１～４のＤ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）に注目する。ＧＤＨ－１～４のＤ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）との比較（図１）から、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）との間には、一定の相関が期待された。
Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）に依存して酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）が減少し、ＧＤＨ－１～４のＤ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）と酵素電極法でのキシロース作用性（ｄ）から回帰直線を作成すると、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が６１９ｍＭ以上となった際に、酵素電極法でのキシロース作用性（ｄ）が抑えられる可能性が考えられた。
＜実施例２＞　ＧＤＨ－５、ＧＤＨ－６の取得及び特性比較
実施例１の結果から導かれた前記の仮説を検証するために、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が６１９ｍＭ以上となるＧＤＨを探索した。特開２０１５－８４６７６の実施例１には、サッカロマイセス属酵母を宿主とした、ＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーの構築について記載がある。配列番号５のアミノ酸配列記載のＧＤＨをコードするＤＮＡから、特開２０１５－８４６７６の実施例１記載の方法に基づく方法で、１０００株からなるサッカロミセス属酵母を宿主とした、ＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーを構築した。
すなわち、プラスミドとしてｐＹＥＳＭｈ６７５４（特開２０１３－１１６１０２参照）を用いて、エラープローンＰＣＲにより、ＦＡＤＧＤＨ遺伝子へのランダム変異の導入を実施した。ｐＹＥＳＭｈ６７５４上にはＦＡＤＧＤＨ遺伝子を挟んで、ＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターが配置されている。ＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターに相補的に結合可能な、プライマーを用い、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、当製品に添付のプロトコールに従ってランダム変異の導入を実施した。これにより、一定の割合で変異が導入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。次に、取得した一定の割合で変異が導入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及び、ＮｏｔＩにて処理し、同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで処理したベクターｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このように、ライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、プラスミド内に挿入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子内に一定の割合で変異が導入されたランダム変異プラスミドライブラリーを得た。続いて、サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）へ、ランダム変異プラスミドライブラリーの形質転換を行った。生育したコロニー約２０００株をサッカロマイセスを宿主としたＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーとした。
上記のように構築されたライブラリーに含まれる形質転換体を、特開２０１５－８４６７６の実施例２記載の方法に基づく方法で培養した。すなわち、構築されたサッカロマイセスを宿主としたＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーを、ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓ（マトリックス・テクノロジー社）の各培養セルに分注した、３％　酵母エキス、１％　ポリペプトン、３％　ガラクトースを含む培地に植菌し、２５℃にて６０時間の振とう培養を行った。次に、得られた培養液を、２０００ｒｐｍにて１５分間遠心し培養上清を得た。
培養上清の２００ｍＭと６００ｍＭ濃度でのＤ－キシロースに対する作用性の比較から、Ｄ－キシロースに対する親和性が低いことが期待される改変型ＧＤＨを選抜した。選抜した改変型ＧＤＨについて、精製を行い、５０ｍＭ、２００ｍＭ、６００ｍＭ、１４００ｍＭ濃度でのＤ－キシロースに対する反応速度を確認することによって、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が８１９ｍＭであるＧＤＨ－５及び、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が１２７１ｍＭであるＧＤＨ－６を取得した。ＧＤＨ－５及び６の５０ｍＭ、２００ｍＭ、６００ｍＭ、１４００ｍＭ濃度でのＤ－キシロースに対する反応速度の関係を検討した結果を図２に、ミカエリス定数（Ｋｍ）計算の根拠となるラインウィバー・バークプロットの結果を図３に示す。
Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が８１９ｍＭであるＧＤＨ－５及びＤ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が１２７１ｍＭであるＧＤＨ－６について、基質濃度２００ｍＭでの水系でのＤ－キシロース作用性、基質濃度５０ｍＭでの水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｃ）を測定し、ＧＤＨ１～４と比較を行った結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
その結果、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が８１９ｍＭであるＧＤＨ－５及び、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が１２７１ｍＭであるＧＤＨ－６の酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｃ）は１００～１０１％であり、Ｄ－キシロースとの作用がほぼ見られないことを確認した。ＧＤＨ－１～６のＤ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）と酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｃ）との比較を図４に示す。
図４に示される結果から、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が約７３６ｍＭ未満の範囲では、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が大きいほど酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）は小さくなる。Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が約７３６ｍＭ以上の領域において、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）はほぼ確認されず、Ｄ－キシロースによるグルコース測定への影響がみられない状態が維持されている。
ここで、ＧＤＨ－２とＧＤＨ－５を比較する。表２において、ＧＤＨ－２とＧＤＨ－５は、基質濃度５０ｍＭでの水系でのＤ－キシロース作用性（ａ）が１％程度であり、この点を評価の基準に用いた場合、共にＤ－キシロース作用性の面で有用な酵素という扱いになる。ところが、ＧＤＨ－２とＧＤＨ－５の酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（ｄ）には大きな乖離が見られることが明らかとなった。ＧＤＨ-２は、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性が１２０％となり、ＳＭＢＧセンサでのグルコース測定においてＤ－キシロースへの影響が懸念される一方、ＧＤＨ-５は、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性が１００％となり、ＳＭＢＧセンサでのグルコース測定においてもＤ－キシロースへの影響を受ける度合いが小さいといえる。
このように、水系でのＤ－キシロース作用性の評価だけでは、ＳＭＢＧセンサ上で使用するＧＤＨが、実用上Ｄ－キシロースに対する影響がないことを評価する理化学特性としては十分ではないことが示され、それに代わる指標として、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が有用であることが見出された。本実施例の結果によれば、Ｄ－キシロースに対するＫｍ（ｂ）が６１９ｍＭ以上であれば、ＳＭＢＧセンサ上で実用上Ｄ－キシロースに対する影響を受ける度合いが小さいことを満足する理化学特性を有するＧＤＨであるといえる。
このような現象が見られる理由として、以下のようなことが考えられる。
溶液中での酵素の反応速度が分単位の観察によって計算されるのに対し、酵素電極法に代表されるセンサ系では、秒単位あるいはミリ秒単位の変化を電流応答値として観察している。実施例１の結果より、Ｄ－キシロースに対する親和性が低い、すなわちＫｍが十分に大きい酵素を使用した酵素電極法においては、瞬間的に測り込まれるＤ－キシロース分解に由来の電流応答値が少なく抑えられるため、Ｄ－キシローススパイク条件下での電流応答値の変動が小さくなるであろうと推測された。
なお、ＧＤＨ１～６を用いて、それぞれの水系でのＤ－キシロース作用性を、基質濃度を２００ｍＭに変更した場合においても測定した。その結果は、ＧＤＨ－１が９．９％、ＧＤＨ－２が４．９％、ＧＤＨ－３が３．６％、ＧＤＨ－４が４．６％、ＧＤＨ－５が１．８％、ＧＤＨ－６が１．６％であった。
本発明により、正確な血糖測定が可能なグルコース測定方法およびグルコース測定用センサ等の提供が可能となり、糖尿病医療の現場における正確な血糖値の管理において広く利用されることが期待される。

Claims (10)

  1. 下記の特性（１）及び（２）を備えるグルコース脱水素酵素を用いるグルコース測定方法。
    （１）Ｄ－グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下
    （２）Ｄ－キシロースに対するＫｍが６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下
  2. グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するＫｍが６１９ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下である請求項１に記載のグルコース測定方法。
  3. グルコース脱水素酵素のＤ－キシロースに対するＫｍが７３６ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下である請求項１に記載のグルコース測定方法。
  4. グルコース脱水素酵素を備えた酵素電極を用いる請求項１から３のいずれかに記載のグルコース測定方法。
  5. グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（１０ｍＭのグルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対し２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％））が９５％以上、１０５％以下である請求項１から４のいずれかに記載のＤ－グルコースを測定する方法。
  6. 下記の特性（１）及び（２）を備えるグルコース脱水素酵素が、カーボン電極または金属電極上に備わるグルコースセンサ。
    （１）Ｄ－グルコースに対するＫｍが０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下
    （２）Ｄ－キシロースに対するＫｍが６００ｍＭ以上、３０００ｍＭ以下
  7. グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのＤ－キシロース作用性（１０ｍＭのグルコース溶液に対する応答値に対して、１０ｍＭのＤ－グルコース溶液に対し２０ｍＭのＤ－キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合（％））が９５％以上、１０５％以下である請求項６に記載のグルコースセンサ。
  8. カーボン電極または金属電極上に、さらに、メディエーターを備えた請求項６または７に記載のグルコースセンサ。
  9. グルコース脱水素酵素のキシロースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）を測定する工程を含むグルコースセンサの製造方法。
  10. グルコース脱水素酵素のキシロースに対するＫｍを測定し、かつ、Ｋｍが６００ｍＭ以上であるグルコース脱水素酵素を選択する工程を含む請求項９に記載のセンサの製造方法。
     
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7457801B2 (ja) 2019-10-15 2024-03-28 東友ファインケム株式会社 バイオセンサ

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS527482B2 (ja) 1972-05-08 1977-03-02
JP4648993B2 (ja) 2009-06-04 2011-03-09 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP4649993B2 (ja) 2005-01-12 2011-03-16 パナソニック株式会社 リチウム二次電池およびその製造方法
WO2013065770A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2013116102A (ja) 2011-10-31 2013-06-13 Toyobo Co Ltd 新規なグルコース脱水素酵素
JP5588578B2 (ja) 2012-05-17 2014-09-10 東洋紡株式会社 担子菌酵母変異体
JP2015084676A (ja) 2013-10-29 2015-05-07 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015146773A (ja) 2014-02-06 2015-08-20 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2017000137A (ja) * 2015-06-04 2017-01-05 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6093700B2 (ja) 2011-06-07 2017-03-08 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法
JP6079038B2 (ja) * 2011-08-11 2017-02-15 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素
WO2015099112A1 (ja) 2013-12-27 2015-07-02 キッコーマン株式会社 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP6856344B2 (ja) 2015-10-29 2021-04-07 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素およびその利用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS527482B2 (ja) 1972-05-08 1977-03-02
JP4649993B2 (ja) 2005-01-12 2011-03-16 パナソニック株式会社 リチウム二次電池およびその製造方法
JP4648993B2 (ja) 2009-06-04 2011-03-09 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2013116102A (ja) 2011-10-31 2013-06-13 Toyobo Co Ltd 新規なグルコース脱水素酵素
WO2013065770A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP5588578B2 (ja) 2012-05-17 2014-09-10 東洋紡株式会社 担子菌酵母変異体
JP2015084676A (ja) 2013-10-29 2015-05-07 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015146773A (ja) 2014-02-06 2015-08-20 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2017000137A (ja) * 2015-06-04 2017-01-05 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY BIOCHEMISTRY, vol. 61, 1997, pages 1367 - 1369

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7457801B2 (ja) 2019-10-15 2024-03-28 東友ファインケム株式会社 バイオセンサ

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