WO2015099112A1 - 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2015099112A1
WO2015099112A1 PCT/JP2014/084480 JP2014084480W WO2015099112A1 WO 2015099112 A1 WO2015099112 A1 WO 2015099112A1 JP 2014084480 W JP2014084480 W JP 2014084480W WO 2015099112 A1 WO2015099112 A1 WO 2015099112A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
flavin
glucose dehydrogenase
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/084480
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
康子 荒木
Original Assignee
キッコーマン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キッコーマン株式会社 filed Critical キッコーマン株式会社
Priority to JP2015555037A priority Critical patent/JP6526572B2/ja
Priority to US15/108,528 priority patent/US20160319246A1/en
Publication of WO2015099112A1 publication Critical patent/WO2015099112A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)

Definitions

  • the present invention relates to a flavin-binding glucose dehydrogenase having excellent thermal stability, a glucose measuring method using the same, and a method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase.
  • Blood glucose level (blood glucose level) is an important marker of diabetes.
  • an apparatus for self blood glucose measurement (Self Monitoring of Blood Glucose: SMBG) using an electrochemical biosensor is widely used.
  • enzymes using glucose as a substrate such as glucose oxidase (GOD)
  • GOD glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD nicotinamide dinucleotide
  • NADP nicotinamide dinucleotide phosphate
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD (P) -GDH has the problem that the stability of the enzyme is poor and the addition of a coenzyme is necessary, and PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose
  • sugar compounds other than glucose in the measurement sample affect the measurement value, and an accurate measurement value cannot be obtained. There is a point.
  • GDH of a type using a coenzyme other than the above has been attracting attention.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • FAD-GDH flavin adenine dinucleotide
  • FAD-GDH derived from the genus Aspergillus with reduced activity on D-xylose has also been disclosed (for example, see Patent Document 4).
  • the above enzyme has a characteristic of low reactivity with one or several sugar compounds other than D-glucose, it is reactive with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. Is not sufficiently low.
  • FAD-GDH found from the genus Mucor which is a kind of mold, has an excellent property that it has sufficiently low reactivity with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. (See, for example, Patent Document 5).
  • this GDH it is possible to accurately measure the glucose concentration without being affected by the sugar compounds even under conditions where maltose, D-galactose, and D-xylose are present (for example, Patent Documents).
  • Patent Document 5 discloses recombinant expression using E. coli and Neisseria gonorrhoeae using the fungal-derived FAD-GDH gene sequence, amino acid sequence, and fungal-derived FAD-GDH gene sequence.
  • Patent Document 6 has found a fungus-derived FAD-GDH (expressed in a yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces) having excellent substrate specificity and heat resistance.
  • Patent Document 7 discloses that the heat resistance of fungus-derived FAD-GDH is improved by introducing a site-specific mutation. However, assuming the possibility of being subjected to severe heat conditions at the time of production of the sensor chip, attempts to provide further thermal stability are continuously demanded.
  • JP 2007-289148 A Japanese Patent No. 4494978 International Publication No. 07/139013 JP 2008-237210 A Japanese Patent No. 4648993 International Publication No. 12/073986 Pamphlet International Publication No. 12/169512 Pamphlet
  • An object of the present invention is to provide FAD-GDH having thermal stability.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid represented by SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence at position 66 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence at position 68 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 70% It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the same amino acid sequence, and has one or more amino acid substitutions at a position corresponding to an amino acid selected from the group consisting of FAD-GDH characterized by:
  • the amino acid at the position corresponding to position 66 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is tyrosine;
  • the amino acid at the position corresponding to position 68 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is glycine;
  • the amino acid at the position corresponding to position 88 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is alanine;
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the asparagine residue at position 66 is substituted with tyrosine in the amino acid sequence constituting the protein having FAD-GDH activity represented below: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the asparagine residue at position 66 in the protein having the FAD-GDH activity consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the asparagine residue at position 68 in the amino acid sequence constituting the parent protein having FAD-GDH activity represented below is substituted with glycine: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the asparagine residue at position 68 in the protein having the FAD-GDH activity consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A protein comprising FAD-GDH activity consisting of amino acids deleted, substituted or added.
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the cysteine residue at position 88 in the amino acid sequence constituting the parent protein having FAD-GDH activity represented below is substituted with alanine: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the cysteine residue at position 88 in the protein having the FAD-GDH activity consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the threonine residue at position 158 in the amino acid sequence constituting the parent protein having FAD-GDH activity represented below is substituted with histidine: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the threonine residue at position 158 in the protein having the FAD-GDH activity consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a protein comprising FAD-GDH activity consisting of amino acids deleted, substituted or added.
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the glutamine residue at position 233 is substituted with arginine in the amino acid sequence constituting the protein having FAD-GDH activity represented below: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the glutamine residue at position 233 in the protein having the FAD-GDH activity consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the alanine residue at position 385 is substituted with threonine in the amino acid sequence constituting the protein having the flavin-binding glucose dehydrogenase activity shown below : 1 or the number of amino acids other than the amino acid residue at a position corresponding to the alanine residue at position 385 in the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having flavin-binding glucose dehydrogenase activity, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a protein having flavin-binding glucose dehydrogenase activity consisting of amino acids in which one amino acid is deleted, substituted or added.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the 391 leucine residue is substituted with isoleucine in the amino acid sequence constituting the protein having the flavin-binding glucose dehydrogenase activity shown below : 1 or the number of amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the leucine residue at position 391 in the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and having flavin-binding glucose dehydrogenase activity, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a protein having flavin-binding glucose dehydrogenase activity consisting of amino acids in which one amino acid is deleted, substituted or added.
  • FAD-GDH which is a modified protein in which the amino acid at the position corresponding to the leucine residue at position 557 is substituted with valine in the amino acid sequence constituting the protein having FAD-GDH activity represented below: 1 or several amino acids other than the amino acid residue at the position corresponding to the leucine residue at position 557 in the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having FAD-GDH activity, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A protein comprising FAD-GDH activity consisting of amino acids deleted, substituted or added.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is 70% or more identical, or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and 70 % FAD-GDH in which the amino acid at the position corresponding to the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence that is at least% identical is the amino acid residue described below:
  • the amino acid at the position corresponding to position 66 asparagine is tyrosine
  • the amino acid at the position corresponding to position 68 asparagine is glycine.
  • the amino acid at the position corresponding to cysteine at position 88 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to asparagine at position 66 is tyrosine
  • the amino acid at the position corresponding to asparagine at position 68 Is glycine
  • the amino acid at the position corresponding to cysteine at position 88 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to threonine at position 158 is histidine
  • the amino acid at the position corresponding to cysteine at position 88 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to glutamine at position 233 is arginine, or 88 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid at the position corresponding to the cysteine at position is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to leucine at position 557 is valine
  • the amino acid at the position corresponding to serine at position 559 is lysine.
  • the ratio of reactivity to D-xylose with respect to reactivity to D-glucose is 2% or less.
  • the specific activity after introducing the mutation is 60% or more compared to the specific activity before introducing the mutation.
  • (13) A FAD-GDH gene encoding the FAD-GDH described in any one of (1) to (12) above.
  • (14) A recombinant DNA, wherein the FAD-GDH gene according to (13) is inserted into a vector DNA.
  • (15) A host cell into which the recombinant DNA according to (14) has been introduced.
  • a method for producing FAD-GDH comprising the following steps: Culturing the host cell according to (15) above, Expressing a FAD-GDH gene contained in the host cell; and (a isolating FAD-GDH from the culture.
  • FAD-GDH having thermal stability can be provided.
  • the FAD-GDH of the present invention catalyzes a reaction in which a hydroxyl group of glucose is oxidized to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention is measured using this principle of action, for example, using the following system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. can do.
  • reaction 1 PMS (reduced form) is generated with the oxidation of glucose.
  • reaction 2 DCIP is reduced as PMS (reduced form) is oxidized.
  • the disappearance degree of this “DCIP (oxidized type)” is detected as the amount of change in absorbance at a wavelength of 600 nm, and the enzyme activity can be determined based on this amount of change.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention is measured according to the following procedure. Mix 2.05 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.6 mL of 1M D-glucose solution and 0.15 mL of 2 mM DCIP solution, and incubate at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the GDH activity is defined as 1 U as the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose at 37 ° C.
  • 3.0 is the reaction reagent + enzyme reagent solution volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution solution volume.
  • ML 1.0
  • cm optical path length of the cell
  • ⁇ A600 blank is the absorbance at 600 nm per minute when the reaction is started by adding the buffer used for enzyme dilution instead of the enzyme sample solution.
  • the amount of decrease, df represents the dilution factor.
  • the FAD-GDH of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or high identity with the amino acid sequence, for example, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, Preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the same amino acid sequence, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, One or more amino acid substitutions at positions corresponding to amino acids selected from positions 66, 68, 88, 158, 233, 385, 391 and 557 in the amino acid sequence of No. 1. It is characterized by having.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 66 described above is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 66 described above is substituted with tyrosine, and at position 68.
  • the amino acid substitution at the corresponding position is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 68 described above is substituted with glycine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 88 corresponds to the position 88 described above.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 158 is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 158 is substituted with histidine
  • the amino acid substitution at the position corresponding to the position is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 233 is substituted with arginine
  • the amino acid at the position corresponding to position 385 The substitution is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 385 is replaced with threonine
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 391 is the amino acid at the position corresponding to position 391 described above.
  • An amino acid substitution at the position corresponding to position 557 is a substitution in which the amino acid at the position corresponding to position 557 is replaced with valine.
  • the amino acid at position 66 without substitution according to the present invention is asparagine
  • the amino acid at position 68 is asparagine
  • the amino acid at position 88 is cysteine
  • the amino acid at position 158 is threonine.
  • the amino acid at position 233 is glutamine
  • the amino acid at position 557 is leucine.
  • FAD-GDH of the present invention more preferable examples include multiple mutants having a combination of a plurality of substitutions as described above.
  • the present invention includes a double mutant having two substitutions in combination as described above, a triple mutant having three substitutions in combination, a multiple mutant having many mutations in combination, and the like. By accumulating such mutations, FAD-GDH with further improved thermal stability can be produced.
  • substitutions at positions other than the above-mentioned various substitutions can be combined.
  • Such substitution positions are introduced in combination with the above-described substitution sites, even when those substitutions are introduced alone, even if they do not have a significant effect as in the above-mentioned substitution sites, It can be synergistic.
  • the FAD-GDH of the present invention in addition to the mutation that improves the thermal stability as described above, the mutation that improves the substrate specificity, the effect of improving the resistance to pH, a specific substance, etc.
  • known mutations aimed at producing different kinds of effects may be arbitrarily combined. Even when such different types of mutations are combined, those FAD-GDHs are included in the present invention as long as the effects of the present invention can be exhibited.
  • the FAD-GDH of the present invention first obtains a gene encoding an amino acid sequence close to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by an arbitrary method, and at a position equivalent to the predetermined position of SEQ ID NO: 1. It can also be obtained by introducing an amino acid substitution at any position.
  • the intended amino acid substitution introduction method include a method of introducing mutations at random or a method of introducing site-specific mutations at assumed positions.
  • Examples of the former method include error-prone PCR (Techniques, 1, 11-15, (1989)), XL1-Red competent cells (STRATAGENE) that are prone to errors in plasmid replication and prone to modification during propagation. There is a method of using.
  • a three-dimensional structure is constructed by crystal structure analysis of the target protein, amino acids that are expected to give the desired effect are selected based on the information, and a commercially available Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit is selected.
  • a site-specific mutation is introduced by selecting an amino acid that is expected to give a target effect using a three-dimensional structure of a known protein having high homology with the target protein. .
  • the position corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 here is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with SEQ ID NO: 1 (preferably 70% or more, more preferably 75% or more. , More preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more), and alignment with other FAD-GDH having an amino acid sequence. Means the same position in. Amino acid sequence identity should be calculated using GENETYX-Mac (Software Development, Inc.) maximum matching and search homology programs, or DNASIS Pro (Hitachi Soft) maximum matching, multiple alignment programs, etc. Can do.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as Lippmann-Person method, and FAD-GDH is used. Can be performed by giving maximum identity to the conserved amino acid residues present in the amino acid sequence.
  • FAD-GDH By aligning the amino acid sequence of FAD-GDH in this way, the position of the corresponding amino acid residue in each FAD-GDH sequence can be determined regardless of insertion or deletion in the amino acid sequence. Is possible. Corresponding positions are considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be estimated that they have a similar effect on the substrate specificity of the target FAD-GDH.
  • FAD-GDH of the present invention Various variations of the FAD-GDH of the present invention are assumed within the above-mentioned range of identity, but the enzymatic scientific properties of various FAD-GDH are the same as the FAD-GDH of the present invention described in the present specification. As long as they are all included in the FAG-GDH of the present invention.
  • FAD-GDH having such an amino acid sequence is FAD-GDH having high substrate specificity and sufficient thermal stability, and is industrially useful.
  • the amino acid at the position corresponding to position 66 is tyrosine
  • the amino acid at the position corresponding to position 68 is glycine, or the position 88.
  • the amino acid at the corresponding position is alanine
  • the amino acid at the position corresponding to position 158 is histidine
  • the amino acid at the position corresponding to position 233 is arginine
  • the position at the position corresponding to position 385 It is important that the amino acid is threonine, the amino acid at the position corresponding to position 391 is isoleucine, or the amino acid at the position corresponding to position 557 is valine, which is an artificial substitution operation. It is not important whether or not.
  • a desired substitution is performed there using a known technique.
  • these desired amino residues are introduced by substitution.
  • a desired protein is obtained by known total peptide synthesis, or when a gene sequence is totally synthesized to encode a protein having a desired amino acid sequence and a desired protein is obtained based on this, or In the case where, for example, one originally found as a natural type has such a sequence, the FAD-GDH of the present invention can be obtained without going through a step of artificial substitution.
  • the improvement in heat resistance in the present invention is evaluated under the conditions described in the activity measurement method and the thermal stability measurement method described in this specification.
  • the pH at the time of heat treatment in the present specification is 7.0, which was developed for the purpose of measuring glucose (blood glucose level) in blood by the FAD-GDH of the present invention. Is due to being near neutral. Thus, by performing evaluation under conditions as close as possible to practical use, it becomes possible to obtain more useful enzymes.
  • the FAD-GDH of the present invention has a residual activity of 50% or more after heat treatment at pH 7.0, 40 ° C. for 15 minutes under the reaction conditions described in the activity measurement method and thermal stability measurement method described herein. , Preferably 60% or more, more preferably 70% or more.
  • More preferable FAD-GDH of the present invention has a residual activity after heat treatment at pH 7.0, 45 ° C. for 15 minutes under the reaction conditions described in the activity measurement method and thermal stability measurement method described in the present specification. It is characterized by being 10% or more, 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more.
  • the ratio of reactivity to D-xylose with respect to reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)) and / or the ratio of reactivity to maltose with respect to reactivity to D-glucose (Mal / Glc) (%)) Is preferably 2% or less.
  • the specific activity is 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably compared to before introducing a predetermined mutation. Is preferably maintained at 85% or more, more preferably 90% or more.
  • the Km value is 100 mM or less, more preferably 90 mM or less.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene).
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method may be used.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted by the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989).
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • an appropriate probe DNA is synthesized, and using this, a FAD-GDH gene with high substrate specificity is selected from a chromosomal DNA or cDNA library, or Based on the above amino acid sequence, an appropriate primer DNA is prepared, and FAD-GDH having a high substrate specificity is encoded by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5′RACE method or 3′RACE method.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • a DNA containing the full length of the target FAD-GDH gene can be obtained by amplifying a DNA containing the gene fragment and ligating these DNA fragments.
  • FAD-GDH As a method for obtaining FAD-GDH having excellent thermal stability according to the present invention using known FAD-GDH as a starting material, mutations are introduced into the gene encoding FAD-GDH, which is the starting material, and various mutant genes are used. A method of selecting using the enzymatic scientific properties of the expressed FAD-GDH as an index may be employed. Mutation treatment of the starting FAD-GDH gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a method in which a FAD-GDH gene or a recombinant DNA in which the gene is incorporated is brought into contact with and acting on a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method, etc.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for contact and action are not particularly limited as long as conditions according to the type of drug to be used and the like can actually induce a desired mutation in the Mucor genus-derived FAD-GDH gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M. Even in the case of performing ultraviolet irradiation, it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, p24-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)
  • Eckstein method Nucleic Acids Res., 13, 8749 ( (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • a technique known as a general polymerase chain reaction can be used (Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified FAD-GDH gene having excellent thermal stability can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • the FAD-GDH of the present invention can also be obtained by modifying a known FAD-GDH.
  • known FAD-GDH-derived microorganisms include microorganisms that are classified into the subfamily Pleurotus, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably the family Pleurotus.
  • Specific examples include FAD-GDH derived from the genus Mucor, the genus Absidia, the genus Actinomucor, the genus Circinella, and the like.
  • microorganisms classified into the genus Mucor examples include Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii, Mucor heimalis f. Silvaticus, Mucor subtilissimus, Mucor dimorphosporus and the like. More specifically, Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii NBRC 9403, Mucor himalis f.
  • Circinella minor examples include Circinella minor, Circinella mucoloides, Circinella muscae, Circinella rigida, and Circinella simplex. More specifically, mention may be made of Circinella minor NBRC6448, Circinella mucoroides NBRC4453, Circinella muscae NBRC6410, Circinella rigida NBRC6411, Circinella simplex NBRC6412, Circinella umbellata NBRC4452, Circinella umbellata NBRC5842, Circinella RD055423 and Circinella RD055422. In addition, NBRC strain and RD strain are storage strains of NBRC (Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Biotechnology Center).
  • the FAD-GDH gene of the present invention obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and is compatible with each vector.
  • the host cell to be transformed can be transformed or transduced by conventional methods.
  • prokaryotic host cells examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli K-12, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 and the like ( Both are manufactured by Takara Bio Inc.). They are transformed or transduced to obtain host cells into which DNA has been introduced (transformants).
  • Escherichia coli K-12 Escherichia coli BL21 (DE3)
  • Escherichia coli JM109 Escherichia coli DH5 ⁇
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli C600 and the like
  • a method for transferring the recombinant vector into such a host cell for example, when the host cell is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed.
  • An electroporation method may be used.
  • commercially available competent cells for example, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • yeast An example of a eukaryotic host cell is yeast.
  • microorganisms classified as yeast include yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces, the genus Saccharomyces, the genus Pichia, the genus Candida, and the like.
  • the inserted gene may include a marker gene to enable selection of transformed cells. Examples of the marker gene include genes that complement the auxotrophy of the host, such as URA3 and TRP1.
  • the inserted gene preferably contains a promoter or other control sequence (for example, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.) capable of expressing the gene of the present invention in the host cell. Specific examples of the promoter include GAL1 promoter and ADH1 promoter.
  • a method for transformation into yeast known methods, for example, a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) and electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481). -484) and the like can be preferably used, but the present invention is not limited to this, and transformation may be performed using various arbitrary methods including a spheroplast method and a glass bead method.
  • eukaryotic host cells include mold cells such as the genus Aspergillus and the genus Trichoderma.
  • the inserted gene contains a promoter capable of expressing the gene of the present invention in the host cell (eg, tef1 promoter) and other regulatory sequences (eg, secretory signal sequence, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.). Is desirable.
  • the inserted gene may contain a marker gene for enabling selection of transformed cells, for example, niaD, pyrG.
  • the inserted gene may contain a homologous recombination region for insertion into an arbitrary chromosomal site.
  • a known method for example, a method using polyethylene glycol and calcium chloride after protoplast formation (Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)) is preferably used. Can do.
  • the FAD-GDH of the present invention is obtained by culturing the host cell producing the FAD-GDH of the present invention obtained as described above, expressing the FAD-GDH gene contained in the host cell, and then What is necessary is just to manufacture by isolating FAD-GDH.
  • Examples of the culture medium for culturing the host cells include yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, or one or more nitrogen sources such as soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, potassium monophosphate
  • One or more inorganic salts such as dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate were added, and saccharide raw materials, vitamins, etc. were added as necessary Things are used.
  • the initial pH of the medium is not limited, but can be adjusted to, for example, pH 6-9.
  • the culture is carried out at a culture temperature of 10 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 8 hours, aeration / agitation deep culture, shaking culture, and stationary. What is necessary is just to implement by culture
  • the FAD-GDH of the present invention is collected from the culture.
  • an ordinary known enzyme collecting means may be used.
  • the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone or the like is added thereto.
  • the fraction is collected and the precipitate is collected to obtain the FAD-GDH crude enzyme of the present invention.
  • the crude FAD-GDH enzyme of the present invention can be further purified using any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel or biogel; an adsorption elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel; an adsorption using hydroxyapatite Elution method; Sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane, hollow fiber membrane, etc.
  • the FAD-GDH enzyme preparation of the present invention can be obtained.
  • the present invention also discloses a glucose assay kit containing the FAD-GDH of the present invention, and blood glucose (blood glucose level) can be measured using the FAD-GDH of the present invention.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises a modified FAD-GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the glucose assay kit of the present invention contains, in addition to the modified FAD-GDH of the present invention, a buffer solution necessary for the assay, a mediator, and a glucose standard solution for preparing a calibration curve.
  • the modified FAD-GDH used in the glucose measurement method and glucose assay kit of the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or dissolved in an appropriate storage solution.
  • the glucose concentration can be measured, for example, as follows.
  • the reaction layer of the glucose assay kit includes FAD-GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis) as a reaction accelerator.
  • ADA N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole is retained.
  • a pH buffer and a coloring reagent are added as necessary.
  • a sample containing glucose is added to this and allowed to react for a certain time.
  • the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye that is polymerized and formed by receiving electrons from the electron acceptor or the electron acceptor that fades upon reduction is monitored.
  • the rate method from the rate of change of absorbance per time, in the case of the endpoint method, the calibration was made in advance using a standard concentration glucose solution from the change in absorbance up to the point when all the glucose in the sample was oxidized. Based on the calibration curve, the glucose concentration in the sample can be calculated.
  • DCPIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • glucose can be quantified by monitoring the decrease in absorbance at 600 nm.
  • PMS phenazine methosulfate
  • NTB nitrotetrazolium blue
  • the amount of diformazan produced is determined by measuring absorbance at 570 nm to calculate the glucose concentration.
  • the electron acceptor and the coloring reagent used are not limited to these.
  • the present invention also discloses a glucose sensor using the FAD-GDH of the present invention.
  • the electrode a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used, and the FAD-GDH of the present invention is immobilized on the electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof.
  • FAD-GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature.
  • As the mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • As the working electrode an electrode on which the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used.
  • a counter electrode for example, platinum electrode
  • a reference electrode for example, Ag / AgCl electrode
  • 1.5 U FAD-GDH of the present invention is immobilized on a glassy carbon (GC) electrode, and the response current value with respect to the glucose concentration is measured.
  • a glassy carbon (GC) electrode In the electrolytic cell, 1.8 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and 0.2 ml of 1M potassium hexacyanoferrate (III) aqueous solution (potassium ferricyanide) are added.
  • the GC electrode is connected to potentiostat BAS100B / W (manufactured by BAS), the solution is stirred at 37 ° C., and +500 mV is applied to the silver-silver chloride reference electrode.
  • a 1M D-glucose solution is added to these systems to a final concentration of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 mM, and a steady-state current value is measured for each addition.
  • This current value is plotted against a known glucose concentration (5, 10, 20, 30, 40, 50 mM) to create a calibration curve. Accordingly, glucose can be quantified with the enzyme-immobilized electrode using the FAD-linked glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the thermal stability and substrate specificity of the modified FAD-GDH were evaluated according to the methods of the following test examples unless otherwise specified.
  • Test example (1) Production of yeast transformants that express various modified FAD-GDH A set encoding a Mucor plaini-derived FAD-GDH gene (wild-type MpGDH gene) of SEQ ID NO: 2 according to the method described in Patent Document 7. A recombinant plasmid (pYES2C-Mp (wild type)) was obtained.
  • PCR reaction was carried out under the following conditions using a synthetic nucleotide for introducing each amino acid substitution, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • a part of the reaction solution after the treatment was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and it was confirmed that about 8 kbp of DNA was specifically amplified.
  • the amplified DNA was treated with a restriction enzyme DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then transformed into a competent cell of Escherichia coli JM109 strain (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. Subsequently, each obtained transformant was applied to an LB-amp agar medium and cultured.
  • the grown colonies were inoculated into an LB-amp liquid medium and cultured with shaking, and various plasmid DNAs containing about 8 kbp of amplified DNA (about 8 kbp) according to the attached protocol using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma). For example, pYE2C-Mp-N66Y / N68G, pYE2C-Mp-C88A and the like in Example 1 were isolated.
  • pYE2C-Mp wild type
  • pYES2C-Mp modified, for example, pYE2C-Mp-N66Y / N68G in Example 1, pYE2C-Mp-C88A etc.
  • Inv-Sc strain manufactured by Invitrogen
  • Yeast transformed strains Sc-Mp modified types such as Sc-Mp-N66Y / N68G and Sc-Mp-C88A in Example 1 strains to be expressed were obtained.
  • Substrate specificity evaluation The substrate specificity was also evaluated using various yeast culture supernatants collected according to the method of (2) above, similarly to the thermal stability. First, the substrate for the above activity measurement method was changed from D-glucose to maltose or D-xylose at the same molar concentration, and the activity against each substrate was measured. From these values, “reactivity ratio to maltose relative to reactivity to D-glucose (Mal / Glc (%))” and “reactivity to D-xylose relative to reactivity to D-glucose” The ratio (Xyl / Glc (%)) ”was calculated.
  • the (Mal / Glc (%)) and (Xyl / Glc (%)) of the wild type MpGDH expressed in the Sc-Mp (wild type) strain were 0.8% and 1.4%, respectively.
  • Such substrate specificity is very excellent as compared with other conventionally known FAD-GDH, and it is expected that D-glucose which is a measurement target substance can be measured with high accuracy.
  • PCR reaction was performed using the synthetic nucleotide combinations of SEQ ID NOs shown in Table 1 using pYE2C-Mp (wild type) as a template plasmid. Subsequently, E. coli strain JM109 was transformed with the vector containing the amplified DNA, and the base sequence of the DNA encoding MpGDH in the plasmid DNA retained by the grown colonies was determined, so that the sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • Asparagine at position 66 of the amino acid sequence is tyrosine
  • asparagine at position 68 is glycine
  • cysteine at position 88 is alanine
  • threonine at position 158 is histidine
  • glutamine at position 233 is arginine
  • leucine at position 557 is valine and 559 PYE2C-Mp-N66Y / N68G, pYE2C-Mp-C88A, pYE2C-Mp-T158H, pYE2C-Mp-Q233R, and pYE2C-Mp-L557V / S559K, which are recombinant plasmids in which the serine at the position is replaced with lysine I got it.
  • C88A means that C (Cys) at position 88 is replaced with A (Ala).
  • N66Y / N68G means that N (Asn) at position 66 is replaced with Y (Tyr), and N (Asn) at position 68 is replaced with G (Gly). It means having.
  • the modified enzyme having the thermostability improving mutation of the present invention as described in Table 1 does not negatively affect the substrate specificity of wild type FAD-GDH, and in some cases, wild type It has been found that those that exceed the substrate specificity of the enzyme can also be included.
  • the following multiple mutants were prepared, which were characterized in that they were further substituted with another amino acid substitution.
  • recombinant plasmids (pYE2C-Mp-C88A / N66Y / N68G, pYE2C-Mp-C88A / T158H, pYE2C-Mp-C88A / Q233R, pYE2C) encoding the above-described various modified MpGDH introduced with site-specific mutations.
  • Asparagine at position 66 in the amino acid sequence is tyrosine
  • asparagine at position 68 is glycine
  • leucine at position 391 is isoleucine
  • leucine at position 557 is valine
  • serine at position 559 is lysine
  • alanine at position 385 is threonine.
  • PYE2C-Mp-N66Y, pYE2C-Mp-N68G, pYE2C-Mp-L391I, pYE2C-Mp-L557V, pYE2C-Mp-S559K, pYE2C-Mp-A385T are recombinant plasmids encoding the substituted mutants. Acquired each.
  • recombinant plasmids (YE2C-Mp-N66Y, pYE2C-Mp-N68G, pYE2C-Mp-L391I, pYE2C-Mp-L557V, pYE2C-Mp) encoding the above-mentioned various modified MpGDHs into which site-specific mutations have been introduced.
  • the protein concentration was measured by GDH activity and absorbance at 280 nm (A280), and the specific activity (U / A280) in each mutant was measured. Thereafter, the ratio of specific activity in each mutant was calculated as “relative specific activity” when the specific activity before mutation introduction (wild type) measured in the same manner was set to 100, and used for evaluation of specific activity.
  • the relative specific activity calculated from the specific activity measured using the crude enzyme solution of this method was 125, but it was measured using a column of Superdex 200 10 / 300GL (GE Healthcare Bioscience). Since the relative specific activity of purified C88A was 119, it was determined that the relative specific activity value calculated by this method was correlated with the relative specific activity value measured with the purified enzyme.
  • T387A and I545T which are heat resistance-improving mutants described in Patent Document 7, have Xyl / Glc (%) lower than 2% and maintain high substrate specificity, but with respect to relative specific activity. Is less than 60%, indicating that the specific activity is significantly reduced.
  • V232E which is a heat-resistance improving mutant described in Patent Document 7, has a specific activity maintained higher than 100, and Xyl / Glc (%) is higher than 2%, which impairs high substrate specificity. I understand that.
  • N66Y / N68G, C88A, T158H, Q233R, L557V / S559K, L391I or A385T which are heat-resistant mutants of the present invention, all have a relative specific activity of 60% or more. As can be seen, the mutants all have Xyl / Glc (%) lower than 2% and maintain high substrate specificity.
  • the mutant of the present invention has improved thermal stability compared to the enzyme before the mutation is introduced, and has sufficient thermal stability.
  • FAD-GDH with such characteristics enables the amount of enzyme used to be reduced and the storage period to be extended when producing measuring reagents and measuring kits due to the low degree of enzyme thermal inactivation. It is expected that more practical measurement methods, measurement reagents, measurement kits, and sensors can be provided as compared with measurement methods and measurement reagents using known glucose measuring enzymes.
  • the FAD-GDH of the present invention having excellent thermal stability is considered to be very useful in the production process of a blood glucose sensor chip that is assumed to be subjected to heat drying.
  • the mutant enzymes with improved thermostability As disclosed in the present specification, the fungus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993 previously discovered by the present inventors Similarly, it was found that some of them also have high substrate specificity for glucose and can accurately measure D-glucose values even under conditions where sugar compounds such as D-xylose are contaminated. Furthermore, it was found that the mutants of the present invention maintained high specific activity. For applications to blood glucose sensors, enzymes with higher specific activity are desired. By using an enzyme having a high specific activity, the reactivity on the sensor is improved, and measurement in a shorter time becomes possible. Further, since advantages such as cost reduction by reducing the amount of enzyme to be used and noise reduction by contaminants are expected, development of an enzyme with high specific activity is very useful industrially.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、配列番号1記載のアミノ酸配列における６６位、６８位、８８位、１５８位、２３３位、３８５位、３９１位、または、５５７位に対応する位置におけるアミノ酸置換の１以上を有する、熱安定性を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供する。

Description

熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、熱安定性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、それを用いたグルコース測定方法およびフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
　血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
　一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ－ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
　近年、ＰＱＱ－ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ－ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ－ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ－キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ－ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５～３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
　上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２～５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１～３参照）、さらにＤ－キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ－ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。
　しかし、上記の酵素は、Ｄ－グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ－ＧＤＨは、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することが示されている（例えば、特許文献５参照）。このＧＤＨを用いれば、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能であり（例えば、特許文献５参照）、このような優れた基質特異性は、ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの実用上の優位性を示す特徴のひとつである。さらに、特許文献５においては、ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列、ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの遺伝子配列を利用した大腸菌及び麹菌を宿主とする組換え発現についても開示されている。
　ＦＡＤ－ＧＤＨの血糖センサーへの用途を考慮すると、センサーチップ作製時には酵素の加熱乾燥処理工程を含む場合があるため、耐熱性の高いＦＡＤ－ＧＤＨが求められる。このような目的に関しては、特許文献６において、優れた基質特異性及び耐熱性を有するケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ（チゴサッカロマイセス属の酵母で発現）等が見出されている。また、特許文献７は、部位特異的変異を導入することにより、ケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの耐熱性が向上することを開示している。
　しかしながら、センサーチップの作製時における過酷な熱条件に供する可能性を想定すると、さらなる熱安定性を付与する試みが継続的に求められている。
特開２００７－２８９１４８号公報 特許第４４９４９７８号公報 国際公開第０７／１３９０１３号 特開２００８－２３７２１０号公報 特許第４６４８９９３号公報 国際公開第１２／０７３９８６号パンフレット 国際公開第１２／１６９５１２号パンフレット
医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｓａｆｅｔｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局 Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　Ｉ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，　Ｔ．　Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２６５－２７６　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩ．　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２７７－２９３　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩＩ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３１７－３２７　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＶ．　Ｈｉｓｔｉｄｙｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｓ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３２８－３３５　（１９６７）．
　本発明は、熱安定性を有するＦＡＤ－ＧＤＨを提供することを課題とする。
　上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意検討を重ね、熱安定性を有するＦＡＤ－ＧＤＨを探索した結果、公知のＦＡＤ－ＧＤＨに変異を導入することにより、熱安定性を有するＦＡＤ－ＧＤＨが得られることを見出した。
　すなわち、本発明は以下に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のアミノ酸、および
配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位のアミノ酸。
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位に対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである、および
配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位に対応する位置のアミノ酸がバリンである。
（３）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がチロシンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（４）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がグリシンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（５）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（６）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（７）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸がアルギニンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（８）以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸がスレオニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（９）以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）以下に表されるＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がバリンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ－ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるＦＡＤ－ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである。
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、１５８位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、２３３位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、または
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５５７位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであし、かつ、５５９位のセリンに対応する位置のアミノ酸がリジンである。
（１２）以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）の性質を備え上記（１）～（１１）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨ：
（Ｉ）ｐＨ７．０、４０℃、１５分間の熱処理後に５０％以上の残存活性率を有する。
（ＩＩ）Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下である。
（ＩＩＩ）変異を導入した後の比活性が変異を導入する前の比活性と比べて６０％以上である。
（１３）上記（１）～（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨをコードするＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子。
（１４）上記（１３）に記載のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（１５）上記（１４）記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
（１６）ＦＡＤ－ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
上記（１５）に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、および
（ａ前記培養物からＦＡＤ－ＧＤＨを単離する工程。
（１７）上記（１）～（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
（１８）上記（１）～（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
（１９）上記（１）～（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー。
　本発明によれば、熱安定性を有するＦＡＤ－ＧＤＨを提供できる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１）　Ｄ－グルコ－ス　＋　ＰＭＳ（酸化型）
　　　　→　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型）　＋　ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　→　ＰＭＳ（酸化型）　＋　ＤＣＩＰ（還元型）
　（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位、６８位、８８位、１５８位、２３３位、３８５位、３９１位および５５７位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
　好ましくは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸がチロシンに置換される置換であり、６８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の６８位に対応する位置でのアミノ酸がグリシンに置換される置換であり、８８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンに置換される置換であり、１５８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の１５８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンに置換される置換であり、２３３位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２３３位に対応する位置でのアミノ酸がアルギニンに置換される置換であり、３８５位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の３８５位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニンに置換される置換であり、３９１位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の３９１位に対応する位置でのアミノ酸がイソロイシンに置換される置換であり、５５７位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の５５７位に対応する位置でのアミノ酸がバリンに置換される置換である。なお、配列番号１においては、本発明の置換を有さない６６位のアミノ酸はアスパラギンであり、６８位のアミノ酸はアスパラギンであり、８８位のアミノ酸はシステインであり、１５８位のアミノ酸はスレオニンであり、２３３位のアミノ酸はグルタミンであり、５５７位のアミノ酸はロイシンである。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体、３箇所組み合わせて有する３重変異体、さらに多数の変異を組み合わせて有する多重変異体等が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、熱安定性がさらに向上したＦＡＤ－ＧＤＨを作出することができる。
　また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上述のような、熱安定性を向上させる変異のほかに、基質特異性を向上させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ－ＧＤＨは本発明に包含される。
　後述のとおり、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
　目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１－１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１－Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と同一性（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ－ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ－Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各ＦＡＤ－ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性に関して類似した効果を有することが推定できる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＧ－ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ－ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ、十分な熱安定性を有するＦＡＤ－ＧＤＨであり、産業上有用である。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸がチロシンであること、または、６８位に対応する位置でのアミノ酸がグリシンであること、または、８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンであること、１５８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンであること、２３３位に対応する位置でのアミノ酸がアルギニンであること、３８５位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニンであること、３９１位に対応する位置でのアミノ酸がイソロイシンであること、または５５７位に対応する位置でのアミノ酸がバリンであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、配列番号１記載のタンパク質のように、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける熱安定性の向上）
　本発明における耐熱性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における熱処理時のｐＨは７．０であるが、これは本発明のＦＡＤ－ＧＤＨが血液中のグルコース（血糖値）を測定する目的で開発されたものであり、血液のｐＨが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、ｐＨ７．０、４０℃、１５分間熱処理後の残存活性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする。
　より好ましい本発明のＦＡＤ－ＧＤＨとしては、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、ｐＨ７．０、４５℃、１５分間熱処理後の残存活性が１０％以上、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする。
　また、上述のように熱安定性が向上していることに加えて、その他の酵素諸性質に関しても、実用により適した性能を兼ね備えていることが好ましい。例えば、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および／またはＤ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下であることが好ましい。例えば、比活性は所定の変異を導入する前と比べて、６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上を維持していることが好ましい。例えば、Ｋｍ値は１００ｍＭ以下であり、より好ましくは９０ｍＭ以下であることが好ましい。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ－ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　ついで、公知のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質として、本発明の熱安定性に優れたＦＡＤ－ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
　出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，　ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
　また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
　なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
　上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ－ＧＤＨの例）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを改変することにより取得することもできる。公知のＦＡＤ－ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ－ＧＤＨ等が挙げられる。
　Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、特許文献５に記載のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ　ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ　ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ　ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ　ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ　ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ　ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
　上述のように得られた本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
　原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ－１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
　真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５，　２５５－２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　（２００３）４８１－４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
　真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１８，　９９－１０４（１９８９））を好適に用いることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの製造）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ－ＧＤＨを単離することにより、製造すればよい。
　上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６～９に調整することができる。
　培養は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４～８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
　培養終了後、該培養物より本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を得る。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
　本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
　グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ－ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
　この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
　具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ－ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ　ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
　本発明において、改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの熱安定性および基質特異性の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。
［試験例］
（１）各種の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを発現する酵母形質転換体の作製
　特許文献７に記載の方法に準じ、配列番号２のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子（野生型ＭｐＧＤＨ遺伝子）をコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（野生型））を取得した。
　得られた組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、調製した反応液を９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５５℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
　上記処理後の反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することにより形質転換を行った。次いで、取得した形質転換体をそれぞれＬＢ－ａｍｐ寒天培地に塗布し、培養を行った。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、約８ｋｂｐの増幅されたＤＮＡを含む各種のプラスミドＤＮＡ（例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ等）を単離した。次いで、これらの各種プラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、それぞれの配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列における所定の位置のアミノ酸が置換されていることを確認した。このようにして、所定のアミノ酸が置換された改変型ＭｐＧＤＨをコードする酵母発現用ベクターｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ等）を取得した。
　その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）、および各種変異が導入されたｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ等）をＩｎｖ－Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、野生型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）株、および各種の改変型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ等）株をそれぞれ取得した。
（２）酵母発現ＦＡＤ－ＧＤＨの熱安定性評価
　酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ等）を、各々、５ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養する。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液を熱安定性の評価に用いた。
　ＦＡＤ－ＧＤＨの熱安定性評価は、まず、上述のように回収した評価対象のＦＡＤ－ＧＤＨを含む培養上清液を約１Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて希釈する。そして、この酵素溶液（０．１ｍｌ）を２本用意し、そのうち１本は４℃で保存し、もう１本には、４０℃、１５分間の加温処理を施した。
　加温処理後、各サンプルのＦＡＤ－ＧＤＨ活性を測定し、４℃で保存したものの酵素活性を１００としたときの、４０℃、１５分間処理後の活性値を「活性残存率（％）」として算出した。この活性残存率（％）を、各種ＦＡＤ－ＧＤＨの耐熱性評価の指標とした。
野生型ＭｐＧＤＨを発現するＳｃ－Ｍｐ（野生型）株の培養上清を用いて、野生型ＭｐＧＤＨの熱安定性を評価した結果、野生型ＭｐＧＤＨの４０℃、１５分熱処理後の残存活性率は４２．４％であった。よって、各種改変型ＭｐＧＤＨの熱処理後の残存活性率が４２．４％より高かった場合に、ＭｐＧＤＨの熱安定性が向上していると判断することができる。
（３）基質特異性評価
　基質特異性についても、熱安定性と同様に、上記（２）の方法に従って回収した各種酵母培養上清液を用いて評価を行った。まず、上述の活性測定法の基質をＤ－グルコースから同モル濃度のマルトースまたはＤ－キシロースとした系に変えてそれぞれの基質に対する活性を測定した。そして、これらの値から、「Ｄ－グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））」および「Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」を算出した。
　Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）株にて発現させた野生型ＭｐＧＤＨの（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））および（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））は、それぞれ０．８％、１．４％であった。このような基質特異性は、従来知られたその他のＦＡＤ-ＧＤＨと比較しても非常に優れており、測定目的物質であるＤ－グルコースを精度よく測定できることが期待される。
（各種改変型ＭｐＧＤＨの調製と熱安定性評価）
　上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表１に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６６位のアスパラギンがチロシン及び６８位のアスパラギンがグリシンに、８８位のシステインがアラニンに、１５８位のスレオニンがヒスチジンに、２３３位のグルタミンがアルギニンに、５５７位のロイシンがバリン及び５５９位のセリンがリジンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋを用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ１５８Ｈ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｑ２３３Ｒ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
　なお、例えば、表１において、「Ｃ８８Ａ」は８８位のＣ（Ｃｙｓ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。また、例えば、「Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ」は、６６位のＮ（Ａｓｎ）をＹ（Ｔｙｒ）、６８位のＮ（Ａｓｎ）をＧ（Ｇｌｙ）にそれぞれ置換すること、「／」はその両方の置換を有することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する６６位、６８位、８８位、１５８位、２３３位、５５７位、または５５９位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、またはＬ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ－ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
　さらに、これらの熱安定性が向上しているＦＡＤ－ＧＤＨは、高い基質特異性も維持されていることがわかった。すなわち、表１に記載するような本発明の熱安定性向上変異を有する改変型酵素は、野生型ＦＡＤ-ＧＤＨが有する基質特異性に対し負の影響を与えることなく、場合によっては、野生型酵素の基質特異性を上回るようなものも含み得ることがわかった。
（変異の組み合わせ導入に関する検討）
　次に、実施例２に示すような変異を多重的に有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａを鋳型プラスミドとし、表２に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、８８位のシステインがアラニンに置換されたことを特徴とし、さらに別のアミノ酸置換を兼ね備えた下記の多重変異体を作製した。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８８位のシステインがアラニンに置換され、６６位のアスパラギンがチロシンに置換され、かつ、６８位のアスパラギンがグリシンに置換された３重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、かつ、１５８位のスレオニンがヒスチジンに置換された２重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、かつ、２３３位のグルタミンがアルギニンに置換された２重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、５５７位のロイシンがバリンに置換され、かつ、５５９位のセリンがリジンに置換された３重変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋを、それぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ）を用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ株、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＣ８８Ａを導入した上に、さらにＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋのアミノ酸置換をそれぞれ組み合わせることで、耐熱性がより向上することが確認された。特に、Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ変異体では４５℃熱処理後の残存活性率が１０％以上、Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ変異体、及び、Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ変異体では４５℃熱処理後の残存活性率が３０％以上を保持しており、特に好ましい多重変異体であった。
　さらに、該多重変異体では高い基質特異性も維持または向上されていることがわかり、特にＣ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ及びＣ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈにおいては、野生型の基質特異性を上回ることがわかった。
（単変異における検討）
　次に、実施例３に示すような単変異を有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとし、表３に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６６位のアスパラギンがチロシンに、６８位のアスパラギンがグリシンに、３９１位のロイシンがイソロイシンに、５５７位のロイシンがバリンに、５５９位のセリンがリジンに、３８５位のアラニンがスレオニンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ５５９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ５５９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ）を用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｎ６６Ｙ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｉ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｌ５５７Ｖ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ５５９Ｋ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＮ６６Ｙ、Ｌ３９１Ｉ、Ｌ５５７Ｖ、Ａ３８５Ｔのアミノ酸置換をそれぞれ導入することで、耐熱性が向上することが確認された。また、単変異のＮ６８Ｇは、単独の変異導入では耐熱性が低下したが、Ｎ６６Ｙと組み合わせることで耐熱性効果を有することが確認された。
　さらに、これら変異体ではＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）がすべて２％以下であり、高い基質特異性も維持または向上されていることがわかった。
（各変異体における比活性Ｕ／Ａ２８０の測定）
　次に、実施例１及び３で取得した各変異体（Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ、Ｌ３９１Ｉ、Ａ３８５Ｔ）のタンパク質量あたりの活性（比活性）を測定した。具体的には、以下の操作を行った。実施例１及び３と同様にして取得した各変異体の酵母培養上清液を遠心式フィルターユニット(Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ　１０Ｋ、ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製)により濃縮後、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。濃縮した酵母培養上清液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認すると、ＦＡＤ－ＧＤＨに相当するバンド以外はほぼ見られないため、酵母培養上清液中にはほとんど夾雑タンパク質は存在していないことがわかった。よって、濃縮した該酵母培養上清液を用いて、ＧＤＨ活性及び２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によりタンパク質濃度を測定し、それぞれの変異体における比活性（Ｕ／Ａ２８０）を測定した。その後、同様にして測定した変異導入前（野生型）の比活性を１００としたときの各変異体における比活性の割合を「相対比活性」として算出し、比活性の評価に用いた。つまり、相対比活性が１００より大きいときは変異導入前より比活性が向上したとみなし、１００より小さいときには変異導入前より比活性が低下したとみなすことができる。なお、変異体Ｃ８８Ａについて、本方法の粗酵素液を用いて測定した比活性より算出した相対比活性は１２５であったが、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１０／３００ＧＬ（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のカラムにより精製したＣ８８Ａの相対比活性は１１９であることから、本方法により算出した相対比活性の値は、精製酵素で測定した相対比活性の値と相関していると判断した。
　また、特許文献７で記述されている、耐熱性が向上したケカビ由来ＦＡＤ-ＧＤＨの変異体Ｖ２３２Ｅ、Ｔ３８７Ａ、Ｉ５４５Ｔについても、上記と同様にして相対比活性を測定し、さらに試験例（２）、（３）に従って熱安定性及び基質特異性の評価を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４に示すとおり、特許文献７に記載の耐熱性向上変異体であるＴ３８７Ａ、Ｉ５４５ＴはＸｙｌ/Ｇｌｃ（％）が２％より低く、高い基質特異性は維持されているものの、相対比活性に関しては６０％を下回っており、比活性が著しく低下していることがわかる。また、特許文献７に記載の耐熱性向上変異体であるＶ２３２Ｅは、比活性が１００より高く維持されているもの、Ｘｙｌ/Ｇｌｃ（％）が２％より高く、高い基質特異性が損なわれていることがわかる。
　一方、本発明の耐熱性向上変異体であるＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ、Ｌ３９１ＩまたはＡ３８５Ｔでは、いずれも相対比活性が６０％以上に保持されており、さらに、前述のとおり、該変異体はＸｙｌ/Ｇｌｃ（％）がすべて２％より低く、高い基質特異性も維持されていることがわかる。
　上記の通り、本発明の変異体は、変異を導入する前の酵素と比較して熱安定性が向上し、十分な熱安定性を有することがわかった。このような特性を備えたＦＡＤ－ＧＤＨは、酵素の熱失活度合が少ないことにより、測定用試薬や測定用キットを製造する場合の酵素の使用量低減や保存期間の延長等を可能にし、公知のグルコース測定用酵素を用いた測定方法や測定試薬と比較して、より実用性の高い測定方法や測定試薬、測定キットやセンサの提供が可能となることが期待される。特に、加熱乾燥処理を施す場合が想定される血糖センサ用チップの作製工程等においては、熱安定性に優れた本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは非常に有用と考えられる。
　なお、本発明の熱安定性が向上した変異酵素の中には、本明細書中に開示するように、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨと同様、グルコースへの高い基質特異性も兼ね備え、Ｄ－キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にＤ－グルコース値を測定できるものも含まれていることがわかった。
　さらに、本発明の変異体は比活性も高く維持されていることがわかった。血糖センサへの用途においては、より比活性の高い酵素が望まれる。比活性の高い酵素を用いることで、センサ上での反応性が向上し、より短い時間での測定が可能になる。また、使用する酵素量の低減によるコストの削減や、夾雑物質によるノイズの低減等の利点も期待されることから、比活性の高い酵素の開発は、産業上非常に有用である。

Claims (19)

  1. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアミノ酸
    配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位のアミノ酸
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のアミノ酸
    配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８のアミノ酸
    配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位のアミノ酸、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のアミノ酸、および
    配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位のアミノ酸。
  2. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位に対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである、および
    配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位に対応する位置のアミノ酸がバリンである。
  3. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がチロシンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がグリシンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  6. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  7. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸がアルギニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  8. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸がスレオニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  9. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  10. 　以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がバリンに置換されたことを特徴とする改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
    配列番号１のアミノ酸配列において、５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
  11. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
    配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、１５８位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、２３３位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、または
    配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５５７位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであり、かつ、５５９位のセリンに対応する位置のアミノ酸がリジンである。
  12. 　以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）の性質を備える請求項１～１１のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
    （Ｉ）ｐＨ７．０、４０℃、１５分間の熱処理後に５０％以上の残存活性率を有する、
    （ＩＩ）Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下である。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
  14. 　請求項１３に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡ。
  15. 　請求項１４記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
  16. 　フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
    請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程、
    前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、および
    前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。
  17. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法。
  18. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
  19. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
PCT/JP2014/084480 2013-12-27 2014-12-26 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ WO2015099112A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015555037A JP6526572B2 (ja) 2013-12-27 2014-12-26 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
US15/108,528 US20160319246A1 (en) 2013-12-27 2014-12-26 Flavin-binding glucose dehydrogenase exhibiting improved heat stability

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013270871 2013-12-27
JP2013-270871 2013-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015099112A1 true WO2015099112A1 (ja) 2015-07-02

Family

ID=53478951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/084480 WO2015099112A1 (ja) 2013-12-27 2014-12-26 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20160319246A1 (ja)
JP (1) JP6526572B2 (ja)
WO (1) WO2015099112A1 (ja)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016076364A1 (ja) * 2014-11-12 2016-05-19 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JPWO2015129475A1 (ja) * 2014-02-28 2017-03-30 キッコーマン株式会社 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2017094776A1 (ja) * 2015-11-30 2017-06-08 キッコーマン株式会社 シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
WO2017195765A1 (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2018084165A1 (ja) * 2016-11-01 2018-05-11 株式会社カネカ 改変型酵素およびその利用
CN108251390A (zh) * 2017-08-18 2018-07-06 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种葡萄糖氧化酶突变体
WO2018230304A1 (ja) * 2017-06-14 2018-12-20 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
WO2019172400A1 (ja) 2018-03-08 2019-09-12 有限会社アルティザイム・インターナショナル フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質
KR20190135508A (ko) 2017-03-31 2019-12-06 기꼬만 가부시키가이샤 Fad-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019017148A1 (ja) 2017-07-19 2019-01-24 東洋紡株式会社 グルコース測定方法およびグルコースセンサ

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008237210A (ja) * 2006-11-14 2008-10-09 Toyobo Co Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2009084616A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
JP2010035448A (ja) * 2008-08-01 2010-02-18 Toyobo Co Ltd 基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2011068050A1 (ja) * 2009-12-05 2011-06-09 天野エンザイム株式会社 変異酵素及びその用途
JP2011139677A (ja) * 2010-01-08 2011-07-21 Unitika Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2012001976A1 (ja) * 2010-06-29 2012-01-05 有限会社アルティザイム・インターナショナル グルコース脱水素酵素
JP2012055229A (ja) * 2010-09-09 2012-03-22 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上するための方法
WO2012073986A1 (ja) * 2010-12-02 2012-06-07 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体
JP2012191882A (ja) * 2011-03-16 2012-10-11 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性を向上するための方法
WO2012169512A1 (ja) * 2011-06-07 2012-12-13 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法
WO2013065770A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013164477A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Roche Diagnostics Gmbh A glycosylated modified flavin adenine dinucleotide dependent glucose dehydrogenase

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4648993B2 (ja) * 2009-06-04 2011-03-09 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008237210A (ja) * 2006-11-14 2008-10-09 Toyobo Co Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2009084616A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
JP2010035448A (ja) * 2008-08-01 2010-02-18 Toyobo Co Ltd 基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2011068050A1 (ja) * 2009-12-05 2011-06-09 天野エンザイム株式会社 変異酵素及びその用途
JP2011139677A (ja) * 2010-01-08 2011-07-21 Unitika Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2012001976A1 (ja) * 2010-06-29 2012-01-05 有限会社アルティザイム・インターナショナル グルコース脱水素酵素
JP2012055229A (ja) * 2010-09-09 2012-03-22 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの比活性を向上するための方法
WO2012073986A1 (ja) * 2010-12-02 2012-06-07 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体
JP2012191882A (ja) * 2011-03-16 2012-10-11 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性を向上するための方法
WO2012169512A1 (ja) * 2011-06-07 2012-12-13 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法
WO2013065770A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013164477A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Roche Diagnostics Gmbh A glycosylated modified flavin adenine dinucleotide dependent glucose dehydrogenase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAMAOKA H. ET AL.: "Site directed mutagenesis studies of FAD-dependent glucose dehydrogenase catalytic subunit of Burkholderia cepacia", BIOTECHNOL. LETT., vol. 30, 26 June 2008 (2008-06-26), pages 1967 - 72 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2015129475A1 (ja) * 2014-02-28 2017-03-30 キッコーマン株式会社 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2016076364A1 (ja) * 2014-11-12 2016-05-19 キッコーマン株式会社 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JPWO2017094776A1 (ja) * 2015-11-30 2018-09-27 キッコーマン株式会社 シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
WO2017094776A1 (ja) * 2015-11-30 2017-06-08 キッコーマン株式会社 シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
US11208466B2 (en) 2015-11-30 2021-12-28 Kikkoman Corporation Cytochrome-fused glucose dehydrogenase and glucose measurement method
JP7042085B2 (ja) 2015-11-30 2022-03-29 キッコーマン株式会社 シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法
WO2017195765A1 (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP2022133274A (ja) * 2016-05-09 2022-09-13 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP7084867B2 (ja) 2016-05-09 2022-06-15 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JPWO2017195765A1 (ja) * 2016-05-09 2019-04-11 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
US11066690B2 (en) 2016-05-09 2021-07-20 Kikkoman Corporation Flavin-binding glucose dehydrogenase variant
WO2018084165A1 (ja) * 2016-11-01 2018-05-11 株式会社カネカ 改変型酵素およびその利用
JPWO2018084165A1 (ja) * 2016-11-01 2019-09-19 株式会社カネカ 改変型酵素およびその利用
KR20190135508A (ko) 2017-03-31 2019-12-06 기꼬만 가부시키가이샤 Fad-의존형 글루코오스 탈수소효소를 이용하는 연속적인 글루코오스 모니터링 방법
US11781167B2 (en) 2017-03-31 2023-10-10 Kikkoman Corporation Continuous glucose monitoring using an FAD-dependent glucose dehydrogenase
US11725193B2 (en) 2017-06-14 2023-08-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Modified glucose dehydrogenase
JP2019000020A (ja) * 2017-06-14 2019-01-10 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
WO2018230304A1 (ja) * 2017-06-14 2018-12-20 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
CN108251390A (zh) * 2017-08-18 2018-07-06 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种葡萄糖氧化酶突变体
WO2019172400A1 (ja) 2018-03-08 2019-09-12 有限会社アルティザイム・インターナショナル フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
US20160319246A1 (en) 2016-11-03
JP6526572B2 (ja) 2019-06-05
JPWO2015099112A1 (ja) 2017-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6911066B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法
JP6526572B2 (ja) 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP6184326B2 (ja) 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP5169991B2 (ja) 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP5969392B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体
JP4648993B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP7084867B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP6635913B2 (ja) 比活性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP6934720B2 (ja) 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP7165493B2 (ja) 保存安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ及び持続血糖測定
JP2022173549A (ja) グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14875094

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015555037

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15108528

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14875094

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1