WO2012001976A1 - グルコース脱水素酵素 - Google Patents

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WO2012001976A1
WO2012001976A1 PCT/JP2011/003741 JP2011003741W WO2012001976A1 WO 2012001976 A1 WO2012001976 A1 WO 2012001976A1 JP 2011003741 W JP2011003741 W JP 2011003741W WO 2012001976 A1 WO2012001976 A1 WO 2012001976A1
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glucose
protein
seq
acid sequence
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早出　広司
一茂 森
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有限会社アルティザイム・インターナショナル
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to glucose dehydrogenase (FAD-GDH) with flavin adenine dinucleotide as a coenzyme, its production and its use in the determination of glucose.
  • FAD-GDH glucose dehydrogenase
  • Blood glucose concentration is an important marker of diabetes.
  • GOD glucose oxidase
  • G6PDH glucose 6-phosphate dehydrogenase
  • PQQGDH glucose dehydrogenase
  • pyrroloquinoline quinone pyrroloquinoline quinone
  • PQQGDH has a high oxidation activity with respect to glucose and has the advantage of not requiring oxygen as an electron acceptor, but has low selectivity for glucose and high activity against maltose. It was a problem. Accordingly, there is a need for new enzymes that can be used as recognition elements for glucose sensors. Furthermore, it is desirable that the reactivity to xylose is low so that the blood glucose level can be accurately measured even during the xylose absorption test.
  • An object of the present invention is to provide a new enzyme having higher productivity and / or higher thermal stability than conventional glucose dehydrogenase.
  • the present inventor isolated a gene encoding a novel FAD-GDH derived from Botryothinia fuckeliana, and further replaced the specific amino acid residue, so that the productivity of recombinant expression in E. coli was remarkable. I found that it would increase. The inventor has also found that by substituting a specific amino acid residue of a fungal flavin adenine dinucleotide glucose dehydrogenase (FAD-GDH), its thermal stability is significantly increased.
  • FAD-GDH fungal flavin adenine dinucleotide glucose dehydrogenase
  • the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or one or more amino acid residues deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and In a protein having glucose dehydrogenase activity, N176K, N176R, N176E, N176S, N225K, N225E, N259K, N301K, N326K, N326E, N330K, N330S, N355K, N355E, S514G or S552C, or combinations of these amino acid mutations A protein having the same is provided.
  • the protein of the present invention further has one or more mutations selected from the group consisting of G53A, E166R, T168P, N487S, S490P, N492T, A496E, D500E, V502L and A505N.
  • the protein of the present invention is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, N176K / A496E / D500E / S514G / S552C, N176K / S514G / S552C, A protein having an amino acid mutation selected from the group consisting of S514G / S552C and G53A / S514G / S552C.
  • the protein of the present invention is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, N176K / N301K / N330K / S514G / S552C, N176R / N301K / N330K / S514G / S552C, N176R / N225E / N301K / N326E / N330K / N355E / S514G / S552C, N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, and E166R / T168P / N176R / N301K / N330K / S490P / D500E / S514G / S552C selected from the group consisting of amino acids It is.
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 deleted, substituted or inserted. And a protein having glucose dehydrogenase activity and having amino acid mutations of V149C and G190C.
  • the present invention relates to a fungus-derived glucose dehydrogenase, which is obtained by aligning the amino acid sequence with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a glucose dehydrogenase characterized in that amino acids at positions corresponding to V149 and G190 are both replaced with cysteine.
  • the fungal glucose dehydrogenase of the present invention has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 and 5-9, and corresponds to V149 and G190 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Both amino acids in the position are replaced with cysteine.
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or one or more amino acid residues deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a protein having an amino acid mutation of A150C / T192C, which is a protein having glucose dehydrogenase activity.
  • the present invention provides a gene encoding the glucose dehydrogenase of the present invention, a recombinant vector containing the gene, and a transformant or transductant transformed with the recombinant vector.
  • the present invention is also characterized by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a gene encoding the glucose dehydrogenase of the present invention, and collecting glucose dehydrogenase from the culture, A method for producing glucose dehydrogenase is provided.
  • the present invention provides a glucose analysis method characterized by measuring the glucose concentration in a sample using the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the present invention also provides a glucose assay kit comprising the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the present invention also provides an enzyme electrode in which the glucose dehydrogenase of the present invention is immobilized on the electrode surface, and a glucose sensor using the enzyme electrode as a working electrode.
  • the present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or one or more amino acid residues deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Dissolved using glucose dehydrogenase characterized in that it has glucose oxidase activity and has glucose dehydrogenase activity, and the reactivity to xylose is 20% or less of the reactivity to glucose A biosensor for measuring glucose that is not affected by oxygen is provided.
  • FIG. 1-1 shows an alignment of amino acid sequences of fungal glucose dehydrogenase.
  • the 149th amino acid residue V and 190th amino acid residue G of FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae TI strain, and amino acid residues corresponding to these amino acid residues are shown in bold.
  • Each abbreviation has the following meaning.
  • Aspca1_10864 Aspergillus carbonarius ITEM 5010; GenBank Aspca1_10864, Aspca1_33771: Aspergillus carbonarius ITEM 5010; GenBank Aspca1_33771, Bfu (AJ_555871): Botryothinia fuckeliana (GenBank AJ_555871), Ssc (XP_001584680): Sclenotinia sclerotiorum (GenBank XP_001584680), 40715 (XP_001394544): Aspergillus niger 40715 (GenBank XP — 001394544), 39269 (XP — 001391138): Aspergillus niger 39269 (GenBank XP — 001391138), AoT1 FADGDH: Aspergillus oryzae T1 FAD-GDH.
  • FIG. 1-2 shows alignment of amino acid sequences of fungal glucose dehydrogenase.
  • Fig. 1-3 shows alignment of amino acid sequences of fungal glucose dehydrogenase.
  • FIG. 2 shows a culture curve of an Escherichia coli transformant having the FAD-GDH gene derived from recombinant Botryotinia fukeliana.
  • FIG. 3 shows the thermal stability of wild-type and modified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • FIG. 4 shows the enzyme activity of wild-type and modified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • FIG. 5 shows the thermal stability of wild-type and modified FAD-GDH from Botryotinia fukeliana.
  • FAD-GDH from Botryotinia fukeliana
  • FAD-GDH possessed by Botryotinia fukeliana was identified. Its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 Although the genome sequence of Botryotinia fukeliana has been published, there has never been reported that Botryotinia fukeliana has FAD-GDH, and there has been no gene annotated as FAD-GDH.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been conventionally estimated to be glucose oxidase (GOD) (Rolke et al., Mol Plant Pathol. 5 (1), p.17-27, 2004).
  • GOD glucose oxidase
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has about 30 to 60% sequence identity with the amino acid sequence of a known fungal glucose dehydrogenase, such as glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae TI strain (GenBank ACW04779). .1) has about 57% amino acid identity.
  • the predicted signal sequence of natural FAD-GDH derived from Botryotinia fukeliana represented by SEQ ID NO: 1 is removed from the N-terminal to the 17th Ser.
  • An amino acid sequence added with Met was prepared.
  • Modified FAD-GDH from Botryotinia fukeliana The present inventor has obtained a modified FAD-GDH having an N176K, S514G or S552C mutation of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a double mutation of S514G / S552C, and a triple mutation of N176K / S514G / S552C, It has been found that modified FAD-GDH having a high productivity in Escherichia coli as compared with wild-type FAD-GDH, particularly having a triple mutation of N176K / S514G / S552C, shows high enzyme activity with high productivity.
  • the position of the amino acid mutation in the amino acid sequence of Botryotinia fukeliana-derived FAD-GDH is numbered with 1 as the first Met in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid mutation or substitution is expressed by indicating the original amino acid residue, the amino acid position, and the amino acid residue after substitution in this order. For example, “S514G” The 514th S is replaced with G. A combination of double or more mutations is represented by a “/” symbol.
  • an enzyme having high productivity in Escherichia coli means a unit of enzyme obtained per unit volume of culture solution when the enzyme is isolated from the culture after recombinant expression using Escherichia coli as a host. It means an enzyme molecule characterized by high activity per volume (U / L). If productivity is high, an enzyme can be produced recombinantly at a lower cost with a smaller culture apparatus.
  • the productivity of an enzyme is based on the amino acid sequence of the enzyme, such as differences in water solubility as a protein, differences in folding efficiency, differences in enzyme activity per unit protein, and differences in enzyme stability. Reflected comprehensively. Furthermore, the amino acid sequence of the enzyme is also involved in the rate of recombinant expression in the host per unit volume of the culture solution, the ease of forming inclusion bodies, the stability of the enzyme in the purification process, and the like.
  • N176K, N176R, N176E, N176S, N225K, N225E, N259K, N301K, N326K, N326E, N330K, N330S, N355K, N355E, S514G or S55G It is preferred to have multiple mutations in combination with one or more mutations selected from the group consisting of E166R, T168P, N487S, S490P, N492T, A496E, D500E, V502L and A505N.
  • N176K / S490P / D500E / S514G / S552C preferred are N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, G53A / N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, N176K / A496E / D500E / S514G / S552C, N176K / A496E / D / S514G / S552C, G53A / N176K / A496E / D500E / V502L / S514G / S552C, N176K / S514G / S552C, S514G / S552C and G53A / S514G / S552C, particularly preferred are N176K / D490P / S550P N176K / A496E / D500E / S
  • N176K / N301K / N330K / S514G / S552C is particularly preferred.
  • N176R / N301K / N330K / S514G / S552C is particularly preferred.
  • N176R / N225E / N301K / N326E / N330K / N355E / S514G / S552C is particularly preferred.
  • E166R / T168P / N176R / N301K / N330K / S490P / D500E / S514G / S552C is particularly preferred.
  • Modified FAD-GDH with improved thermal stability The present inventor replaces both the 149th amino acid residue V and the 190th amino acid residue G of FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae TI strain represented by SEQ ID NO: 4 with C, whereby wild type FAD-GDH It has been found that the thermal stability is remarkably increased as compared with the above.
  • the amino acid sequence of FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae TI strain is shown in SEQ ID NO: 3. In the present invention, for efficient recombinant expression in E.
  • thermostability refers to enzyme over time when enzyme activity is measured after incubation for a predetermined time at a high temperature (eg, 45 ° C., 50 ° C., 55 ° C., 60 ° C., etc.). It means that there is little reduction in activity.
  • Thermal stability is, for example, the rate of inactivation determined by the residual activity when incubated at a predetermined temperature for a predetermined time, or from the slope of a curve (inactivation curve) obtained by plotting enzyme activity against the incubation time. It can be represented by a constant and / or a half-life of enzyme activity.
  • the modified FAD-GDH of the present invention may have another mutation in addition to the mutation at the 149th and 190th amino acid residues of SEQ ID NO: 4 as long as it has glucose dehydrogenase activity.
  • one or more of the amino acid residues of SEQ ID NO: 4, for example 1 to 10, may be optionally replaced with other amino acid residues.
  • the present inventor further determined the amino acid residues at positions corresponding to the 149th and 190th amino acid residues of FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae TI for FAD-GDH derived from Botryotinia fukeliana and other fungi. In both cases, it was found that substitution of cysteine for the same increased thermal stability.
  • FIG. 1 Alignment of amino acid sequences of several FAD-GDHs derived from fungi is shown in FIG.
  • This figure shows a sequence in which a region presumed to be an N-terminal signal peptide is removed from the amino acid sequence of each enzyme and methionine is added to the N-terminus.
  • the amino acid residues corresponding to the 149th amino acid residue V and the 190th amino acid residue G of Aspergillus oryzae strain FAD-GDH are shown in bold.
  • the genes encoding the amino acid sequences described were fully synthesized and recombinantly expressed in E. coli, and confirmed to have GDH activity.
  • a person skilled in the art will also prepare an amino acid sequence alignment according to a conventional method in FAD-GDH derived from fungi other than the fungus illustrated in FIG. 1 to obtain the 149th position of Aspergillus oryzae strain FAD-GDH.
  • FAD-GDH with improved thermal stability can be obtained by understanding amino acid residues at positions corresponding to amino acid residue V and amino acid residue G at position 190 and replacing these residues with C. .
  • the expression “amino acid residue at a position corresponding to...” Refers to a specific protein of the reference protein when the amino acid sequence of the target protein is aligned with the amino acid sequence of the reference protein. It means an amino acid residue present at a position corresponding to an amino acid residue.
  • AlignX software Invitrogen ;, Lu, G., and Moriyama, E.N. (2004) provided by Vector NTI )
  • Vector NTI a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88) can be used with default parameters.
  • the FAD-GDH of the present invention can be produced by recombinant expression using techniques well known in the art.
  • the sequences of genes encoding natural FAD-GDH derived from Botryotinia fukeliana and FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae TI can be easily determined based on the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively.
  • the gene encoding FAD-GDH may be cloned from the genome of Botryotinia querkeriana or Aspergillus oryzae, may be produced by PCR using a series of chemically synthesized oligonucleotides, or an automated DNA synthesizer, etc. May be used for total synthesis. It is desirable that the gene sequence is appropriately designed or modified by selecting codons so that a higher expression level is achieved in the host organism to be used. The characteristics of codon usage in a particular host organism are well known in the art.
  • the base sequence encoding the amino acid residue to be substituted is replaced with the base sequence encoding the desired amino acid residue.
  • Various methods for such site-specific base sequence substitution are well known in the art, and can be performed, for example, by PCR using appropriately designed primers.
  • a gene encoding a modified amino acid sequence may be totally synthesized.
  • modified FAD-GDH preferably has at least 80% sequence identity with native FAD-GDH.
  • sequence identity is at least 85%, more preferably at least 90% and even more preferably at least 95%.
  • the gene thus obtained is inserted into an appropriate expression vector and transformed into an appropriate host (for example, E. coli).
  • an appropriate host for example, E. coli.
  • Many vectors and host systems for expressing foreign proteins are known in the art, and various hosts such as bacteria, yeast, and cultured cells can be used as the host. If it is desired to produce a glucose dehydrogenase with a sugar chain attached, eukaryotic cells are used as hosts.
  • the obtained transformant is cultured according to a conventional method, and FAD-GDH can be recovered from the cells or the culture solution.
  • E. coli transformants are cultured in a medium (hereinafter referred to as A medium) described as ZYP broth in F. William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005). . That is, in addition to 0.5% glycerol, 0.05% glucose, 0.2% alpha-lactose, 25 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KH 2 PO 4 , 100 mM NaHPO 4 , 1 mM MgSO 4 the is a medium plus.
  • the recombinant protein is expressed by culturing at 15 to 25 ° C., preferably about 20 ° C.
  • higher productivity can be obtained than when a conventional IPTG induction method is used.
  • higher productivity can be obtained by co-expressing the mutant enzyme of the present invention with chaperones GroEL and GroES, which are known to promote protein folding.
  • Co-expression with a chaperone for example, an expression vector containing the gene encoding the mutant enzyme of the present invention is introduced into E. coli together with a vector that expresses the GroEL and GroES genes under the induction of arabinose (for example, the commercially available chaperone vectors pGro7 and TaKaRa) Then, after the transformant has grown to some extent, arabinose is added to induce chaperone expression.
  • the recombinant FAD-GDH thus obtained can be used, for example, in gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, liquid chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, immunoprecipitation, gel electrophoresis. It can be purified using any of the purification techniques known in the art such as isoelectric focusing, dialysis and the like.
  • the FAD-GDH of the present invention has an action of catalyzing a reaction in which glucose is oxidized to produce gluconolactone using FAD as a coenzyme.
  • the glucose dehydrogenase activity of the FAD-GDH of the present invention can quantify the amount of FAD that is reduced as the glucose is oxidized by the dehydrogenase by a color reaction of the redox dye.
  • the color reagent include PMS (phenazine methosulfate), DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol), potassium ferricyanide, ferrocene, and the like.
  • the glucose oxidation activity of FAD-GDH of the present invention can be measured by quantifying hydrogen peroxide generated by the reaction between the dehydrogenase and the substrate.
  • the measurement of hydrogen peroxide can be performed, for example, by measuring the change over time in the absorbance of the dye produced using peroxidase, a Trinder reagent (TODB), and 4-aminoantipyrine.
  • TODB Trinder reagent
  • the selectivity of the FAD-GDH for glucose of the present invention is determined by measuring enzyme activity as described above using various sugars such as mannose, galactose, xylose, lactose and maltose as substrates, and using glucose as a substrate. It can be evaluated by examining the relative activity with respect to the activity.
  • the FAD-GDH of the present invention has a high selectivity for glucose, and in particular the reactivity with maltose and galactose was below the measurement limit. Therefore, the assay kit or enzyme sensor prepared using the FAD-GDH of the present invention has high selectivity for glucose measurement, and the test sample contains or may contain other sugars such as maltose. Also has the advantage that glucose can be detected with high sensitivity.
  • the FAD-GDH of the present invention is characterized by low reactivity with xylose. This provides the advantage that the blood glucose level can be measured accurately even when a xylose absorption test is performed.
  • the present invention also features a glucose assay kit comprising FAD-GDH according to the present invention.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises FAD-GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the kit includes the FAD-GDH of the present invention, plus buffers necessary for the assay, mediator, glucose standard solution for creating a calibration curve, and directions for use.
  • the FAD-GDH according to the present invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the present invention also provides an enzyme electrode having FAD-GDH according to the present invention immobilized on its surface, and a glucose sensor using this enzyme electrode.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode.
  • These electrodes may be electrodes formed by screen printing or the like if they are carbon electrodes, and electrodes formed by sputtering if they are gold or platinum electrodes.
  • Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with a representative electron mediator, or a combination thereof may be used.
  • FAD-GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of glucose concentration can be performed as follows. Put the buffer in a thermostatic cell and add a mediator to maintain a constant temperature.
  • a mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, a ruthenium complex, or the like can be used.
  • An electrode on which the FAD-GDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used as necessary.
  • a counter electrode for example, a platinum electrode
  • a reference electrode for example, an Ag / AgCl electrode
  • the FAD-GDH of the present invention is particularly useful for use in a blood glucose level assay device.
  • the assay device can have a structure similar to a commercially available amperometric biosensor test strip for blood glucose level measurement.
  • the assay device has two electrodes (working electrode and reference electrode) mounted on an insulator, a reagent port and a sample receiving part.
  • the reagent port contains the FAD-GDH and mediator of the present invention.
  • an aspect represented by the expression “comprising” is an aspect represented by the expression “essentially consistent of”. And an aspect represented by the expression “consisting of”.
  • Example 1 Preparation of recombinant gene for glucose dehydrogenase derived from Botryotinia quercherina (Bfu-GDH) and glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae (Ao-GDH) It is. From the N-terminal to the 17th Ser can be presumed to be a signal peptide. For example, a free access server SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/) can be used as a method for predicting a signal sequence cleavage site.
  • SignalP 3.0 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/
  • This server is operated by The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark, and based on the methodology described in the following paper, the possibility of the existence of a signal sequence for any amino acid sequence is confirmed. Search and predict the cleavage site. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Soren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10: 1-6, 1997.
  • the signal peptide from the N-terminal to the 17th Ser is predicted to be an amino acid sequence having a sequence after the 18th Thr downstream of the initiation methionine
  • a gene sequence having a codon suitable for recombinant production by E. coli was designed and synthesized.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by this gene (hereinafter referred to as Bfu-GDH) is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae TI strain is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the 23rd Lys from the N-terminal is presumed to be a signal peptide, so a gene encoding an amino acid sequence having a sequence after the 24th Asn downstream of the start methionine. The sequence was designed and fully synthesized.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by this gene (hereinafter referred to as Ao-GDH) is shown in SEQ ID NO: 4. E.
  • Example 2 Measurement of enzyme activity
  • the glucose dehydrogenase activity of the FAD-GDH of the present invention is determined by the absorbance at 600 nm of the discoloration of DCIP (2,2'-dichlorodiisopropyl ether) reduced by the reaction between the dehydrogenase and the substrate. This was done by quantifying the change over time.
  • the reaction conditions were as follows unless otherwise noted. Start the reaction by adding the substrate to the reaction solution containing the enzyme solution (10 mM potassium phosphate (pH 7.0) + 0.6 mM PMS + 0.06 mM DCIP concentration is the final concentration), and measure the change in absorbance at 600 nm did.
  • the final concentration of 50 mM glucose was used as the substrate, the amount of enzyme that reduced 1 ⁇ mol of DCIP was 1 Unit, and the activity value was calculated from the following formula.
  • the molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM ⁇ 1 cm ⁇ 1 .
  • Unit / ml ⁇ ABS / min ⁇ 1 / 16.3 ⁇ 10
  • the measurement of glucose oxidation activity of FAD-GDH of the present invention was carried out using hydrogen peroxide generated by the reaction of dehydrogenase and substrate using peroxidase, Trinder reagent (TODB), and 4-aminoantipyrine, and 546 nm of the generated dye. This was carried out by measuring the change in absorbance with time.
  • the reaction conditions were as follows unless otherwise noted. Start the reaction by adding the substrate to the reaction solution containing enzyme solution (10 mM potassium phosphate (pH 7.0) + 1.5 mM 4-aminoantipyrine + 1.5 mM TODB + 2 U / ml peroxidase, all concentrations are final) The change in absorbance at 546 nm was measured.
  • Example 3 Examination of culture conditions and preparation of crude enzyme preparation Production of Bfu-GDH using IPTG induction: Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the expression vector pET30c into which the gene encoding Bfu-GDH was inserted. The obtained transformant BL21 (DE3) / pET30c (Bfu-GDH) was inoculated into 3 mL LB medium and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. Thereafter, 1 ml of the preculture solution was inoculated into 100 mL of LB medium (kanamycin (Km) 50 ⁇ g / mL), and cultured at 37 ° C. in a conical flask with a baffle at 180 rpm.
  • LB medium kanamycin (Km) 50 ⁇ g / mL
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside; final concentration 1 mM
  • the cells were cultured at 20 ° C., and the cultivation was completed 14 hours after the start of the cultivation.
  • 300 ⁇ l of the culture solution was collected every few hours, 60 ⁇ l of bugbuster reagent (BugBuster Reagent) was added to the collected cells and shaken at 4 ° C. for 20 minutes to lyse the cells.
  • a medium LB medium + 0.5% glycerol, 0.05% glucose, 0.2% ⁇ -lactose, 25 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KH 2 PO 4 , 100 mM NaHPO 4 , 1 mM MgSO 4 (ZYP medium; F. (Modified from William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005)).
  • Bfu-GDH was expressed as a water-soluble enzyme having GDH activity.
  • the culture and enzyme production curves are shown in FIG. OD660 significantly increased 24 hours after the start of the culture, and stopped increasing at about 21 around 28 hours.
  • the enzyme activity increased from around 24 hours, and after 32 hours, it reached about 2200 U per liter of culture broth, and the increase stopped.
  • the protein concentration was 2.2 mg / ml after 24 hours and about 3.0 mg / ml after 36 hours, and the increase stopped.
  • Arabinose (final concentration 2 mM) was added at the start of culture, 12 hours and 24 hours later, and as a result of culturing each, OD660 increased significantly 24 hours after the start of culture. The increase stopped at about 27, about 28, and about 26, respectively.
  • the enzyme activity increased from around 24 hours, and after 40 hours, it became about 2500 U / L, 2600 U / L, and 1300 U / L per liter of the culture solution, respectively, and the increase stopped.
  • the protein concentrations were 1.8 mg / ml, 2.0 mg / ml, and 1.9 mg / ml after 24 hours, respectively.
  • Example 4 Evaluation of substrate specificity
  • the substrate specificity of the enzyme obtained using the medium A of Example 3 was measured using glucose, maltose, xylose and galactose as substrates.
  • the dehydrogenase activity of Bfu-GDH when glucose was 100% at a substrate concentration of 5 mM was not detectable with maltose and galactose, and 13% with xylose.
  • the dehydrogenase activity of xylose was 21% when the glucose of Ao-GDH was 100%. Therefore, it was shown that Bfu-GDH has lower enzyme activity against xylose than Ao-GDH which has already been reported.
  • Example 5 Mutagenesis into Bfu-GDH Site-directed mutagenesis was performed by the QuikChange (registered trademark) method.
  • QuikChange registered trademark
  • PCR amplification was performed using the pET30c-Bfu-GDH prepared in Example 1 as a template and primers for mutagenesis.
  • DpnI was added to the sample after PCR and incubated at 37 ° C. for 60 minutes to digest only the template DNA, and Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed using this sample.
  • plasmid was extracted from an arbitrarily selected clone, and it was confirmed that the target mutation was introduced by sequence analysis.
  • the obtained PCR fragment was digested with NdeI and HindIII (37 ° C., 2 hours), ligated with pET30c digested with the same restriction enzyme, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with this sample.
  • plasmids were extracted from arbitrarily selected clones, and the introduction of mutations was confirmed by sequence analysis.
  • transformants expressing the following mutant enzymes were obtained: Bfu-GDH (G53A), (N176K), N176R, N176E, N176S, (S514G), (S552C), (G53A / S514G), (S514G / S552C), (G53A / S514G / S552C).
  • S514G, S552C, or these double mutations S514G / S552C and (N176K), N176R, N176E, N176S, N225K, N259K, N301K, N326K, N330K, N355K, N487S, T488E, V489I, S490P, 4989 , E495D, A496E, E497K, F499V, D500E, V502L, T504A, and A505N were designed in various combinations to produce transformants expressing these mutant enzymes: N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, N176K / A496E / D500E / S514G / S552C, N176K / S514G / S552C, S514G / S552C, G53A / S514G / 552C.
  • Example 6 Production of Mutant Enzyme and Measurement of Activity Transformant BL21 (DE3) expressing each mutant enzyme was pre-cultured. Using a 300 ml baffled flask, 1% of the bacterium was grown on 60 ml of medium A, and cultured with shaking at 20 ° C. for 28 hours at 125 rpm. After collecting 50 ml of the medium, BugBuster (registered trademark) protein extraction reagent (Novagen) was added to 1 g of wet cells at a rate of 5 ml, suspended, and incubated at room temperature for 15 minutes with gentle shaking.
  • BugBuster registered trademark
  • the resulting supernatant was dialyzed overnight at 4 ° C. against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5). After completion of dialysis, centrifugation was performed and the supernatant was used as a crude purified enzyme preparation.
  • 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) was suspended at a rate of 1 m with respect to the insoluble fraction of 2 ml of the suspension.
  • Transformant BL21 (DE3) expressing each mutant enzyme was precultured, and 1 vol% was inoculated into 3 ml of A medium. After shaking culture at 37 ° C for 4 hours, shaking culture was performed at 20 ° C for 20 hours. After culturing, 2 ml of the medium was collected, 400 ⁇ l of BugBuster (registered trademark) was added, and after suspension, the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. Thereafter, centrifugation (15000 rpm / 4 ° C./20 minutes) was performed, and the obtained supernatant was used as a crudely purified enzyme preparation.
  • BugBuster registered trademark
  • GDH activity was measured using a DCIP (0.3 mM) / PMS (0.6 mM) system, using 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) as the buffer, and glucose (Glc; 1, 2, 4, 10, 20 as the substrate) , 40 mM), xylose (Xyl; 4,40 mM) was used.
  • the results are shown in Table 1.
  • the numerical values in the table are specific values (U / mg) and productivity (U / L), which are average values of data obtained several times under the same conditions using 40 mM glucose as a substrate.
  • the correlation between the substrate (glucose; 1,2,4,10,20,40 mM) concentration and activity was observed, and Michaelis Menten obtained from the saturation curve obtained therefrom. Constants (Km value) and apparent maximum activity (Vmax) were determined.
  • the activity values described in Table 1 and Table 2 of the priority application in this case had an error in the calculation of the activity value from the absorbance data. Tables 1 and 2 below show the correct values.
  • N176K, N176R, N176E, N176S, S514G and S552C mutants had increased productivity and enzyme activity compared to the control (Bfu-GDH). With the S514G / S552C double mutant, higher production and enzyme activity were obtained. The N176K, N176R, N176E, N176S, and mutants obtained extremely high productivity when combined with S514G / S552C.
  • the G53A mutant showed the same productivity as the control in the single mutant and the G53A / S514G double mutant, but the G53A / S514G / S552C composite mutant showed very high productivity.
  • the results for multiple mutants combining S514G and S514G / S552C with yet another mutation are shown in Table 2.
  • the numerical values in the table are specific values of specific data (U / mg) and productivity (U / L) of several times of data performed under the same conditions using 40 mM glucose as a substrate. Further, using the obtained crude purified enzyme, the correlation between the substrate (glucose; 1, 2, 4, 10, 20, 40 mM) concentration and activity was observed, and Michaelis Menten obtained from the saturation curve obtained therefrom. Constant (Km value) and apparent maximum activity (Vmax) were determined.
  • S514G single mutation and productivity higher than S514G / S552C were obtained in many multiple mutants.
  • N176K / S490P / D500E / S514G / S552C, N176K / A496E / D500E / S514G / S552C, N176K / S514G / S552C, S514G / S552C, G53A / S514G / S552C have very high productivity and enzyme It was.
  • the reactivity to xylose was 20% or less of glucose, or 15% or less. It was a high enzyme. Moreover, the activity with respect to maltose and galactose of these enzymes was not detected.
  • the composite mutants shown in Table 4 below had particularly high productivity / activity and stability.
  • Glu166Arg / Thr168Pro / Asn176Arg / Asn301Lys / Asn330Lys / Ser490Glu / Asp500Glu / Ser514Glys / Ser552Cys showed high Vmax / Km values and high thermal stability.
  • This enzyme had a residual activity of 100% after 10 minutes incubation in a 40 ° C. solution, and no inactivation was observed. A residual activity of less than 40% was observed even after 10 minutes at 45 ° C.
  • Example 7 Introduction of intramolecular SS bond into Ao-GDH
  • various mutants in which various amino acids of Ao-GDH were mutated to cysteine were prepared, and the enzyme activity and thermal stability were improved. Examined. Mutation introduction and enzyme activity were measured in the same manner as in Example 5.
  • the thermal stability test was conducted as follows. 200 ⁇ l of the above crude enzyme preparation was added to 800 ⁇ l of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) at 45 ° C., and immediately mixed, and immediately 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6. 5) 100 ⁇ l was added to 100 ⁇ l (final concentration diluted 10 times). After the addition, incubation was performed at 45 ° C. for 2, 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. After a predetermined time, it was quickly cooled in ice.
  • the GDH activity was measured using a DCIP (0.3 mM) / PMS (0.6 mM) system, using 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) as a buffer and Glc (40 mM) as a substrate.
  • the modified enzyme in which the 149th amino acid residue V and the 190th amino acid residue G of the Aspergillus oryzae TI-derived FAD-GDH represented by SEQ ID NO: 4 are both replaced with C is particularly high. It has been found to exhibit thermal stability as well as productivity. As shown in FIG. 3, in the case of Ao-GDH, the activity decreased with time, but V149C / G190C rapidly decreased to about 30% and then became constant at about 15%. Since a single mutation of V149C or G190C does not contribute to an increase in productivity / activity, it is presumed that this improvement in thermal stability is due to the formation of an SS bond in the molecule.
  • FIG. 4 shows SV curves of the wild-type enzyme, the V149C / G190C mutant enzyme, and the G190C mutant enzyme as a reference.
  • the Km value and Vmax value are shown in Table 6 below.
  • V149C / G190C mutant enzyme has higher enzyme activity than the wild type. It is currently unknown whether the activity of the substrate pocket has changed due to the formation of intramolecular S—S bonds and the activity has increased, or the apparent residual activity of the enzyme has been improved by improving the thermal stability.
  • Example 8 Introduction of intramolecular SS bond to Bfu-GDH and other fungal-derived GDH Based on the result of Example 7, amino acid residues A and 192 of the 150th amino acid of FAD-GDH derived from Botryotinia fukeliana represented by SEQ ID NO: 2
  • a modified enzyme A150C / T192C
  • both of amino acid residues T of the above were replaced with C was produced, it was found to exhibit high thermal stability.
  • multiple mutants were prepared by combining such mutations and several mutations that showed high productivity in Example 6, and the enzyme activity and thermal stability were similarly evaluated for these mutants.
  • Fig. 5 shows the thermal stability of the A150C / T192C mutant of Bfu-GDH.
  • A150C / T192C and multiple mutations containing this mutation were introduced into Bfu-GDH, the enzyme activity was equal or decreased, but an improvement in thermal stability was observed.
  • the heat treatment was performed at 45 ° C., the activity decreased immediately after that, but the rate of decrease in the activity thereafter slowed.
  • the introduction of these mutations did not affect the glucose / xylose selectivity.
  • genes encoding glucose dehydrogenase of Sclenotinia sclerotiorum and Aspergillus nigar 40715 having the sequence shown in FIG. 1 were synthesized (SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively) and expressed in E. coli. It was.
  • mutant enzymes into which A150C / T191C and Y150C / G191C mutations were introduced were also prepared, and the enzyme activity and thermal stability were similarly evaluated.
  • Example 6 Production and Evaluation of Enzyme Sensor Enzyme electrodes were produced using the Aspergillus oryzae TI-derived V149C / G190C mutant enzyme and the Botryotinia fukeliana-derived S514G / S552C mutant enzyme. 20 mg of carbon paste was added to 5 units of the modified FAD-GDH of the present invention and lyophilized. After this was mixed well, it was filled only on the surface of the carbon paste electrode already filled with about 40 mg of carbon paste, and was polished on a filter paper.
  • This electrode was treated in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 1% glutaraldehyde for 30 minutes at room temperature, and then treated in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 20 mM lysine for 20 minutes at room temperature. To block glutaraldehyde. This electrode was equilibrated in a 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) at room temperature for 1 hour or longer. The electrode was stored at 4 ° C.
  • the glucose concentration was measured using the prepared enzyme sensor. Using the enzyme sensor to which the modified FAD-GDH of the present invention was immobilized, glucose could be quantified in the range of 0.1 mM-5 mM.
  • the present invention is useful for measuring glucose concentration, particularly for measuring blood glucose level.

Abstract

　ボトリオチニア・フケリアナ由来のグルコース脱水素酵素において、特定のアミノ酸変異を導入することにより、大腸菌における生産性および熱安定性が顕著に高まった改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。また、真菌由来グルコース脱水素酵素において、２つの残基をＣｙｓに置換することにより、大腸菌における生産性および熱安定性が顕著に高まった改変型グルコース脱水素酵素を得ることができる。本発明のグルコース脱水素酵素は、キシロースに対して反応性が低い。

Description

グルコース脱水素酵素
関連する出願
　本出願は，日本特許出願２０１０－１４７７９９（２０１０年６月２９日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
　本発明はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ－ＧＤＨ）、その製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
　血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。これまで、グルコース濃度を測定するために、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）などを用いる酵素法が用いられてきた。しかしながら、ＧＯＤは電子受容体として酸素を必要とするため、被検試料中の溶存酸素の値が測定値に影響を及ぼすという欠点があり、Ｇ６ＰＤＨでは反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならず、検出系が複雑になるという問題点があった。また、ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有しており、電子受容体として酸素を必要としないという利点をもつが、グルコースに対する選択性が低く、マルトースに対しても高い活性を示すことが問題であった。したがって、グルコースセンサーの認識素子として用いることができる新たな酵素が求められている。さらに、キシロース吸収試験の実施中であっても血糖値を正確に測定できるよう、キシロースに対する反応性が低いことが望ましい。
　真菌がグルコース脱水素酵素を有することは古くから知られている（例えば、Biochim　biophys　Acta.　139(2),　p.265-276,　1967）。また、アスペルギルス属やペニシリウム属由来のグルコース脱水素酵素およびこれを用いるグルコース濃度の測定は、例えば以下の特許文献に開示されている（特開2007-289148、特開2008-178380、特開2008-035748、特開2008-035747、WO2007/11610、WO2004/058958、WO2006/101239、WO2007/139013）。しかし、真菌由来の酵素はその多くは糖蛋白質であり、機能発現には糖鎖修飾が必要である。特にグルコース酸化酵素などの細胞外分泌酵素においては糖鎖修飾が高度に行われていることから、これらの真菌由来の糖蛋白質を大腸菌を用いて組み換え生産することは極めて困難であった。真菌由来グルコース脱水素酵素も細胞外分泌蛋白質であることから、真菌由来グルコース脱水素酵素を大腸菌で組換え発現させることが難しく、発現できたとしてもその生産性が低いために、培養物単位容量あたりの酵素の収率がきわめて低いことが問題であった。
特開2007-289148 特開2008-178380 特開2008-035748 特開2008-035747 WO2007/11610 WO2004/058958 WO2006/101239 WO2007/139013
Rolke　et　al.,　Mol　Plant　Pathol.　5(1),　p.17-27,　2004
　本発明は、従来のグルコース脱水素酵素と比較して、さらに高い生産性および／または高い熱安定性を有する新たな酵素を提供することを目的とする。
　本発明者は、ボトリオチニア・フケリアナ（Botryothinia　fuckeliana）由来の新規ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子を単離し、さらにその特定のアミノ酸残基を置換することにより、大腸菌での組換え発現の生産性が顕著に高まることを見いだした。本発明者はまた、真菌由来フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ－ＧＤＨ）の特定のアミノ酸残基を置換することにより、その熱安定性が顕著に高まることを見いだした。
　すなわち、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の蛋白質はさらに、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ａ４９６Ｅ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２ＬおよびＡ５０５Ｎからなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する。特に好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。
　別の観点においては、本発明は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号４で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｖ１４９ＣおよびＧ１９０Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。
　また別の観点においては、本発明は、真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、そのアミノ酸配列を配列番号４で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたときに配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素を提供する。好ましくは、本発明の真菌由来のグルコース脱水素酵素は、配列番号２および５－９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられている。
　さらに別の観点においては、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ａ１５０Ｃ／Ｔ１９２Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。
　また別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、グルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。
　さらに別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素が電極表面に固定化されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
　さらに別の観点においては、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20％以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサーを提供する。
図１－１は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。図中、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇ、ならびにこれらのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は太字で示される。略号はそれぞれ次の意味である。Aspca1＿10864：Aspergillus　carbonarius　ITEM　5010;　GenBank　Aspca1＿10864、Aspca1＿33771：Aspergillus　carbonarius　ITEM　5010;　GenBank　Aspca1＿33771、Bfu　(AJ＿555871)：Botryothinia　fuckeliana　(GenBank　AJ＿555871)、Ssc(XP＿001584680)：Sclenotinia　sclerotiorum　(GenBank　XP＿001584680)、40715(XP＿001394544)：Aspergillus　niger　40715(GenBank　XP＿001394544)、39269(XP＿001391138)：Aspergillus　niger　39269(GenBank　XP＿001391138)、AoT1　FADGDH：Aspergillus　oryzae　T1　FAD-GDH。 図１－２は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。 図１－３は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。 図２は、組換えボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を有する大腸菌形質転換体の培養曲線を示す。 図３は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型および改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの熱安定性を示す。 図４は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型および改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの酵素活性を示す。 図５は、ボトリオチニア・フケリアナ由来の野生型および改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの熱安定性を示す。
ボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ
　本発明においては、ボトリオチニア・フケリアナのもつＦＡＤ－ＧＤＨが同定された。そのアミノ酸配列は配列番号１に示される。ボトリオチニア・フケリアナのゲノム配列は公開されているが、ボトリオチニア・フケリアナがＦＡＤ－ＧＤＨを有するという報告はこれまでになく、またＦＡＤ－ＧＤＨとしてアノーテーションされた遺伝子もなかった。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、従来はグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であると推定されていたが（Rolke　et　al.,　Mol　Plant　Pathol.　5(1),　p.17-27,　2004）、本発明者は、この蛋白質はＧＯＤではなくＧＤＨであることを初めて明らかにした。ＧＤＨは、ＧＯＤと異なり、グルコース測定において溶存酸素の影響を受けないため、グルコース計測用のバイオセンサーの認識素子として有用である。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、既知の真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列と約３０～６０％の配列同一性を有し、例えば、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来グルコース脱水素酵素（GenBank　ACW04779.1）とは約５７％のアミノ酸同一性を有する。
　本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号１で示されるボトリオチニア・フケリアナ由来の天然のＦＡＤ－ＧＤＨの推定シグナル配列であるＮ末端から１７番目のSerまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列（配列番号２）を作製した。
ボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨ
　本発明者は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ１７６Ｋ,Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃの変異、またはＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの二重変異,およびＮ１７６Ｋ/Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの三重変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが、野生型ＦＡＤ－ＧＤＨと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にＮ１７６Ｋ/Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの三重変異を有する改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、ボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号２のアミノ酸配列の１番目のMetを１として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「Ｓ５１４Ｇ」とは、５１４番目のＳがＧに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「／」の記号で表す。
　本明細書において用いる場合、大腸菌における生産性が高い酵素とは、大腸菌を宿主として組換え発現させて、その培養物から酵素を単離したときに、培養液単位容量あたりに得られる酵素の単位容量あたりの活性（Ｕ/Ｌ）が高いことを特徴とする酵素分子を意味する。生産性が高ければ、より小さい培養装置でより低いコストで、酵素を組換え製造することができる。酵素の生産性には、その酵素が有するアミノ酸配列に基づき、蛋白質としての水溶性の違い、フォ-ルディング効率の違い、さらには単位蛋白質あたりの酵素活性の違い、酵素の安定性の違いなどが総合的に反映される。さらに、培養液単位容量あたりの宿主における組換え発現の速度、インクルージョンボディを形成のしやすさ菌体内および精製工程における酵素の安定性などにも当該酵素のアミノ酸配列が関与している。
　さらに、ボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいて、Ｎ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃの変異と、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ，Ｓ４９０Ｐ，Ｎ４９２Ｔ，Ａ４９６Ｅ，Ｄ５００Ｅ，Ｖ５０２ＬおよびＡ５０５Ｎからなる群より選択される１またはそれ以上の変異とを組み合わせた多重変異を有することが好ましい。これらの多重変異酵素のうち、好ましいものはＮ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｖ５０２Ｌ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｖ５０２Ｌ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃであり、特に好ましいものはＮ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃである。とりわけ好ましいものは、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃである。
　また、これらのボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、キシロースに対するグルコースの選択性がより高かった。
熱安定性が向上した改変型ＦＡＤ－ＧＤＨ
　本発明者は、配列番号４で示されるアスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇの両方をＣで置き換えることにより、野生型ＦＡＤ－ＧＤＨと比較して熱安定性が顕著に高くなることを見いだした。アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号３に示される。本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号３で示されるアスペルギルス・オリゼ由来の天然のＦＡＤ－ＧＤＨの推定シグナル配列であるＮ末端から２３番目のLysまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列（配列番号４）を作製した。本明細書においては、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号４のアミノ酸配列の１番目のMetを１として番号付けする。
　本明細書において用いる場合、熱安定性とは、酵素を高温（例えば、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃など）で所定時間インキュベーションした後に酵素活性を測定したときに、経時的な酵素活性の低減が少ないことをいう。熱安定性は、例えば、所定温度で所定時間インキュベーションしたときの残存活性により、あるいは、インキュベーション時間に対して酵素活性をプロットして得られる曲線（失活曲線）の傾きから求めた失活の速度定数および／または酵素活性の半減期により表すことができる。
　本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、グルコース脱水素酵素活性を有する限り、配列番号４の１４９番目および１９０番目のアミノ酸残基の変異に加えて、さらに別の変異を有していてもよい。例えば、配列番号４のアミノ酸残基の１またはそれ以上、例えば１～１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。
　本発明者はさらに、ボトリオチニア・フケリアナならびに他の真菌に由来するＦＡＤ－ＧＤＨについても、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目および１９０番目のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を両方ともシステインに置換することにより、同様に熱安定性が高まることを見いだした。
　真菌由来のいくつかのＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。この図では、各酵素のアミノ酸配列からＮ末端のシグナルペプチドであると推定される領域を除去して、Ｎ末端にメチオニンが付加された配列が示される。アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当するアミノ酸残基は太字で示される。本発明においては、これらの酵素すべてについて、記載されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成し、大腸菌で組換え発現させて、ＧＤＨ活性があることを確認した。また、下記の実施例８に示されるように、これらの酵素についても、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当するアミノ酸残基を両方ともＣで置き換えることにより、熱安定性が向上した。これらの改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの中には、野生型の酵素と比較して酵素活性が低下したものもあるが、熱安定性が高まることにより酵素の精製や保存の間の失活が少なくなるため、工業的規模での生産性の観点からみてなお有益である。さらに、酵素活性や大腸菌における生産性を高める別の変異と組み合わせることにより、工業的規模での生産性の高い改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを開発することも可能である。
　当業者であれば、図１に例示される真菌以外の真菌に由来するＦＡＤ－ＧＤＨにおいても、定法にしたがってアミノ酸配列のアライメントを作製することにより、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当する位置のアミノ酸残基を理解し、これらの残基をＣで置き換えることにより、熱安定性が向上したＦＡＤ－ＧＤＨを得ることができる。本明細書において用いる場合、「・・・に相当する位置のアミノ酸残基」との表現は、目的とする蛋白質のアミノ酸配列を参照蛋白質のアミノ酸配列とアライメントさせたときに、参照蛋白質の特定のアミノ酸残基に対応する位置に存在するアミノ酸残基を意味する。アライメントは、当該技術分野において知られる多くのソフトウエアのいずれを用いてもよく、例えば、Vector　NTI　により提供されるAlignX　ソフトウエア　(Invitrogen;　,　Lu,　G.,　and　Moriyama,　E.　N.　(2004)　Vector　NTI,　a　balanced　all-in-one　sequence　analysis　suite.　Brief　Bioinform　5,　378-88)をデフォルトのパラメータで用いることができる。
ＦＡＤ－ＧＤＨの製造方法
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、当該技術分野においてよく知られる手法を用いて組換え発現により製造することができる。ボトリオチニア・フケリアナ由来の天然のＦＡＤ－ＧＤＨおよびアスペルギルス・オリゼＴＩ由来のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子の配列は、それぞれ配列番号２および４に記載されるアミノ酸配列に基づいて容易に決定することができる。ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子は、ボトリオチニア・フケリアナまたはアスペルギルス・オリゼのゲノムからクローニングしてもよく、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよく、または自動化DNA合成機などを用いて全合成してもよい。遺伝子配列は、用いる宿主生物においてより高い発現レベルが達成されるようにコドンを選択して、適宜設計または改変することが望ましい。特定の宿主生物におけるコドン使用の特徴は、当該技術分野においてよく知られている。
　本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子は、天然のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、所望のグルコース脱水素酵素活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部またはそれ以上が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。さらに、そのような改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは好ましくは天然のＦＡＤ－ＧＤＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は少なくとも８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、さらに好ましくは少なくとも９５％である。
　このようにして得た遺伝子を適当な発現のベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。糖鎖が結合したグルコース脱水素酵素の製造が望ましい場合には、真核生物細胞を宿主として用いる。得られた形質転換体を定法にしたがって培養し、細胞または培養液からＦＡＤ－ＧＤＨを回収することができる。
　本発明の１つの好ましい態様においては、大腸菌の形質転換体をF.　William　Studier　et.al.,　Protein　Expression　and　Purification　(2005)にZYP　brothとして記載されている培地（以下Ａ培地）にて培養する。すなわち、一般的に大腸菌の培地に用いられるLB培地にさらに0.5%　グリセロール、0.05%　グルコース、0.2%　アルファ－ラクトース、２５ｍＭ　(NH4)2SO4、１００ｍＭ　KH2PO4、１００ｍＭ　NaHPO4、1　mM　MgSO4を加えた培地である。
Ａ培地で、１５℃から２５℃、好ましくは約２０℃で培養して、組換え蛋白質を発現させる。このことにより、慣用のIPTG誘導法を用いた場合よりも、高い生産性を得ることができる。さらに、本発明の変異酵素を、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESと共発現させることにより、さらに高い生産性を得ることができる。シャペロンとの共発現は、例えば、本発明の変異酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、GroELおよびGroES遺伝子をアラビノース誘導下に発現するベクター（例えば市販のシャペロンベクターpGro7、TaKaRa）とともに大腸菌に導入して培養し、形質転換体がある程度増殖した後にアラビノースを加えてシャペロンの発現を誘導することにより行うことができる。
　このようにして得られた組換えＦＡＤ－ＧＤＨは、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈殿、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析などの当該技術分野において知られる精製手法の任意のものを用いて精製することができる。
酵素活性の測定方法
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、ＦＡＤを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素によるグルコースの酸化に伴って還元されるＦＡＤの量を、酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、ＤＣＩＰ（２，６－ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の測定は、例えば、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の吸光度の経時変化を測定することにより行うことができる。
グルコースに対する選択性
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨはグルコースに対する選択性が高く、特にマルトースおよびガラクトースに対する反応性は測定限界以下であった。したがって、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、被検試料にマルトース等の他の糖が含まれているかその可能性がある場合にも、高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
　さらに、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨはキシロースに対して反応性が低いという特徴を有する。このことは、キシロース吸収試験を実施している場合においても血糖値が正確に測定できるという利点を提供する。
グルコースアッセイキット
　本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＦＡＤ－ＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＦＡＤ－ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
グルコースセンサー
　本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ－ＧＤＨがその表面に固定化されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。これらの電極はカーボン電極であればスクリーンプリント印刷等によって作成される電極、および金、白金電極であればスパッタリングにより作成される電極でもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、ルテニウム錯体、などを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および必要に応じて参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、血糖値のアッセイ装置において用いるのに特に有用である。アッセイ装置は、一般に市販されている血糖値測定用のアンペロメトリーバイオセンサーテストストリップと同様の構造とすることができる。一例として、アッセイ装置は、絶縁体上に装着された２つの電極（作用極および参照極）、試薬ポートおよびサンプル受容部を有する。試薬ポートには、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨおよびメディエーターを入れる。血液サンプルなどのサンプルをサンプル受容部に加えると、サンプル中に含まれるグルコースがＦＡＤ－ＧＤＨと反応して電流が生じ、この電流の値から血中グルコース濃度（血糖値）を求めることができる。電気化学的検出の他、光学センサーを用いてグルコースを測定することもできる。
　本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially　consisting　of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting　of）」との表現により表される態様を包含する。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素(Bfu-GDH)およびアスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素(Ao-GDH)の組換え遺伝子の調製
　ボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号１に示される。Ｎ末端から１７番目のSerまではシグナルペプチドであると推定できる。例えば、シグナル配列切断部位を予測するための方法としてフリーアクセスサーバSignalP　3.0　Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）を活用できる。このサーバは,The　Center　for　Biological　Sequence　Analysis　at　the　Technical　University　of　Denmark　において運営されており、以下に記す論文に記載された方法論に基づき、任意のアミノ酸配列に対して、シグナル配列の存在の可能性を検索し、その切断部位を予想する。Identification　of　prokaryotic　and　eukaryotic　signal　peptides　and　prediction　of　their　cleavage　sites.　Henrik　Nielsen,　Jacob　Engelbrecht,　Soren　Brunak　and　Gunnar　von　Heijne.　Protein　Engineering,　10:1-6,　1997。SignalP　3.0　Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から１７番目のSerまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に１８番目のThr以降の配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質（以下Bfu-GDHと称する）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号３に示される。SignalP　3.0　Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から２３番目のLysまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に２４番目のAsn以降の配列を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質（以下Ao-GDHと称する）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。組換え生産の宿主としては大腸菌BL21(DE3)［F－,　ompT,　hsdSB(rB－　mB－),　gal(λcI　857,　ind1,　Sam7,　nin5,　lacUV5-T7gene1),　dcm(DE3)；Novagen］を用いた。遺伝子発現ベクターとしてはpET30c［kan,　lacI；Novagen］を、シャペロン共発現用ベクターとしてはpGro7［GroEL,　GroES；TaKaRa］　をそれぞれ用いた。
実施例２
酵素活性の測定
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるDCIP（２，２’－ジクロルジイソプロピルエーテル）の退色を600　nmでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10　mM　リン酸カリウム(pH7.0)＋0.6　mM　PMS＋0.06　mM　DCIP濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、600　nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50　mMグルコースを用い、1μmolのDCIPを還元させる酵素量を1Unitとし、以下の式より活性値を算出した。DCIPのpH　7.0におけるモル吸光係数は16.3　mM-1cm-1とした。
ユニット/ml　＝　ΔABS/min　×　1/　16.3　×10
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の546　nmにおける吸光度の経時変化を測定することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10　mM　リン酸カリウム　(pH7.0)＋1.5　mM　4-アミノアンチピリン＋1.5　mM　TODB＋2　U/ml　ペルオキシダーゼ、濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、546　nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50　mMグルコースを用い、1分間に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1　Unitとした。TODBのpH7.0におけるモル吸光定数には38　mM-1cm-1を用いた。以下に吸光度変化から活性値を算出する式を示す。
ユニット/ml　＝　ΔABS／min　×　2　/　38　×10
ユニット/mg　＝　Unit／ml／蛋白質mg/ml
実施例３
培養条件の検討及び粗精製酵素標品の調製
１．　IPTG誘導を用いたBfu-GDHの生産:　
　Bfu-GDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)を3　mL　LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、LB培地（カナマイシン（Km）50　μg/mL）100　mLに前培養液1　mlを植菌し、37　℃でバッフル付三角フラスコを用いて、180　rpmで振とう培養を行なった。培養液のOD660が0.6付近になった時点でIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド；終濃度1　mM)を添加して、Bfu-GDHの発現誘導を行った。添加後は20　℃で培養を行い、培養開始後14時間で培養を終えた。培養中、数時間ごとに培養液300　μlを回収し、集菌した菌体に60　μlのバグバスター試薬（BugBuster　Reagent）を加え、20分間、4　℃で振盪し、菌体を溶菌させた。その後、10　mM　リン酸カリウムを60　μl加え、遠心(16,000×g、4℃、20　分間)して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品として、酵素活性を測定した。酵素活性は菌体の濃度とともに上昇し、培養終了時には培養液1　Lあたり65　Uとなった。このとき、比活性は0.15　U/mgであり、菌体濃度はOD660＝4.0であった。
２．　Ａ培地を用いるBfu-GDHの生産:
　Ａ培地を用いるBfu-GDHの生産を行った。Bfu-GDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)を3　mL　LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、下記Ａ培地（Km　50　μg/mL）100　mLに前培養液1　mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120　rpmで振とう培養を行なった。
Ａ培地:　LB培地＋0.5%　グリセロール、0.05%　グルコース、0.2%　α-ラクトース、２５ｍＭ　(NH4)2SO4、１００ｍＭ　KH2PO4、１００ｍＭ　NaHPO4、1　mM　MgSO4　（ZYP培地；F.　William　Studier　et.al.,　Protein　Expression　and　Purification　(2005）を改変）。
　培養中、任意の時間ごとに培養液300　μlを回収し、集菌した菌体に60　μlのBugBuster　Reagentを加え、20分間、4　℃で振盪し、菌体を溶菌させた。10　mM　リン酸カリウムを60　μl加え、遠心(16,000×g、4℃、20　分間)して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品としてその活性を測定した。
　Bfu-GDHはGDH活性を有する水溶性酵素として発現された。培養、酵素生産曲線を図２に示す。培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、28時間を過ぎたころには約21で増加は止まった。酵素活性は24時間ごろから増加し、32時間後には培養液1　Lあたり約2200Uとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後には2.2　mg/mlであり、36時間後には約3.0　mg/mlとなり、増加は止まった。
　Ａ培地で培養することにより得られたボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素(Bfu-GDH)の粗精製酵素標品の酵素活性を測定した結果、グルコース脱水素酵素活性のみが確認され、グルコース酸化酵素活性は検出されなかった。これまで、ボトリオチニア・フケリアナ由来の当該遺伝子は既報の学術論文においてグルコース酸化酵素として報告されているが、本結果により、同遺伝子がコードしている蛋白質はグルコース脱水素酵素であることが初めて示され、実施例４に記されるように、キシロースに対する反応性が低い新しいグルコース脱水素酵素を調製する方法が開示される。培養開始後40時間において菌体量の増加だけではなく、単位タンパク質あたりの酵素の生産性が1.8U/mg　タンパク質となり、IPTG系の12倍に達していた。その結果として培養液１Lあたり2200Uの酵素生産量が得られ、IPTG系の34倍であった。すなわち、Ａ培地を用いるとIPTG系よりさらに効率的にBfu-GDHを組み換え生産できることがわかった。
３．Ａ培地ならびにシャペロンとの共発現によるBfu-GDHの生産:
　Bfu-GDHのコドン修正遺伝子を挿入したpET30cを用いて、シャペロンベクターpGro7が既に導入されている大腸菌BL21(DE3)/pGro7を形質転換した。pGro7は、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESをアラビノース誘導下に発現するベクターである。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)・pGro7を3　mL　LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、Km　50　μg/mL、クロラムフェニコール（Cm）50　μg/mLを含むA培地100　mLに前培養液1　mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120　rpmで振とう培養を行なった。pGro7の発現誘導はアラビノース(終濃度2　mM)の添加により行った。アラビノースの添加は培養開始時、培養開始12時間後、培養開始24時間後と添加時間を変えて検討を行った。培養中、任意の時間ごとに培養液300　μlを回収し、上記と同様の方法で粗精製酵素標品を調製した。
　アラビノース(終濃度2　mM)を培養開始時、12時間後、24時間後に添加し、それぞれ培養した結果、培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、32時間を過ぎたころにはOD660はそれぞれ約27、約28、約26となり増加は止まった。また、酵素活性は24時間ごろから増加し、40時間後にはそれぞれ培養液1　Lあたり約2500　U/L、2600　U/L、1300　U/Lとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後でそれぞれ1.8　mg/ml、2.0　mg/ml、1.9　mg/mlであった。アラビノースを培養開始時に添加した場合、36時間後には約3.2　mg/ml　で増加は止まったが、アラビノースを12時間後、24時間後に添加した場合、タンパク質濃度は48時間後まで徐々に増加していた。これらの結果は、シャペロンとの共発現によりBfu-GDHの生産性が向上したことを示す。
実施例４
基質特異性の評価
　上記実施例３のＡ培地を用いて得られた酵素について、グルコース、マルトース、キシロースおよびガラクトースを基質として基質特異性を測定した。その結果、基質濃度5　mMにおいてグルコースを100％とした時のBfu-GDHの脱水素酵素活性はマルトース、ガラクトースでは検出できず、キシロースでは13％であった。同じ条件でのAo-GDHのグルコースを100％とした時のキシロースの脱水素酵素活性は21％であった。よってBfu-GDHは既に報告されているAo-GDHよりキシロースに対する酵素活性が低いことが示された。
実施例５
Bfu-GDHへの変異導入
　部位特異的変異導入はQuikChange（登録商標）法により行った。QuikChange（登録商標）法では、実施例１で作製したpET30c-Bfu-GDHをテンプレートとし、変異導入用プライマーによりPCR増幅を行った。続いてPCR後の試料にDpnIを加え37℃、60分間インキュベートすることでテンプレートDNAのみを消化し、この試料を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。LB寒天培地(50　μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により目的の変異が導入されていることを確認した。得られたPCR断片をNdeI、HindIII消化(37　℃,2時間)し、同制限酵素消化したpET30cとライゲーションし、この試料を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。LB寒天培地(50　μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。
　このようにして、以下の変異酵素を発現する形質転換体を得た：Ｂｆｕ－ＧＤＨ（Ｇ５３Ａ）、（Ｎ１７６Ｋ）、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、（Ｓ５１４Ｇ）、（Ｓ５５２Ｃ）、（Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ）、（Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ）、（Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ）。さらに、Ｓ５１４Ｇ、Ｓ５５２Ｃ、またはこれらの二重変異Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃと、（Ｎ１７６Ｋ）、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２５９Ｋ、Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ４８７Ｓ、Ｔ４８８Ｅ、Ｖ４８９Ｉ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ｔ４９４Ａ、Ｅ４９５Ｄ、Ａ４９６Ｅ、Ｅ４９７Ｋ、Ｆ４９９Ｖ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２Ｌ、Ｔ５０４Ａ、Ａ５０５Ｎの変異とを種々に組み合わせた多重変異を設計し、これらの変異酵素を発現する形質転換体を作製した：Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ。
実施例６
変異酵素の生産および活性測定
　各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養した。300mlバッフル付きフラスコを用いＡ培地60ml　に対し1％量殖菌し、20℃、28時間、125rpmの条件で振とう培養を行った。培地50mlを集菌後、湿菌体1ｇに5mlの割合でBugBuster（登録商標）蛋白質抽出試薬（Novagen）を加え懸濁し、ゆるやかに振とうしながら室温で15分間インキュベートを行った。遠心（15K　rpm/4℃/20分間）により不溶性分画を除去後、得られた上清を20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)で4℃で一晩透析した。透析終了後に遠心を行い、その上清を粗精製酵素標品とした。不溶性分画は、懸濁液2ml分の不溶性分画に対し20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)を1mの割合で懸濁した。
　いくつかの多重変異酵素については、小スケールの発現系を用いた。各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養し、Ａ培地3ml　に1vol%量を殖菌した。37℃で4時間振とう培養後、20℃で20時間振とう培養を行った。培養後2mlの培地を集菌し400μlのBugBuster（登録商標）を加え懸濁後に室温で15分間振とうした。その後、遠心（15000rpm/4℃/20分間）を行い、得られた上清を粗精製酵素標品とした。
　GDH活性測定はDCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)を使用し、基質としてグルコース（Glc；1,2,4,10,20,40mM),　キシロース（Xyl；4,40mM)を使用した。
　結果を表１に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍg）および生産性（Ｕ／Ｌ）は40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；1,2,4,10,20,40mM）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍax）を求めた。なお、本件の優先権基礎出願の表１および表２に記載される活性の値は吸光度のデータから活性値を求める計算において誤りがあった。下記の表１および２では正しい値が示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｎ１７６Ｋ、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｓ５１４ＧおよびＳ５５２Ｃの変異体は、対照（Ｂｆｕ－ＧＤＨ）と比較して、生産性、酵素活性ともに増加していた。Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの二重変異体では、さらに高い生産量および酵素活性が得られた。Ｎ１７６Ｋ、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、変異体はＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとの複合変異体では非常に高い生産性が得られた。Ｇ５３Ａ変異体は、単独変異体およびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇの二重変異体では対照と同等の生産性を示したが、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ複合変異体では非常に高い生産性が得られた。
　Ｓ５１４ＧおよびＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとさらに別の変異を組み合わせた多重変異体についての結果を表２に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍｇ）および生産性（Ｕ／Ｌ）は４０ｍＭのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；１，２，４，１０，２０，４０ｍＭ）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍａｘ）を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示されるように、多くの多重変異体においてＳ５１４Ｇ単独変異およびＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃよりも高い生産性が得られた。特に、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃについては、非常に高い生産性ならびに酵素活性が認められた。
　野性型の酵素、ならびにこれらの変異体のグルコースに対する活性とキシロースに対する活性を調べたところ、キシロースへの反応性はグルコースの２０％以下、あるいは１５％以下であり、グルコースに対して基質特異性の高い酵素であった。また、これらの酵素のマルトースならびにガラクトースに対する活性は検出されなかった。
　同様にして、さらなる多重変異体を作成して、その活性を測定した。また、これらの酵素を含む溶液を40℃で10分放置した後の残存活性を測定することにより、熱安定性を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示されるように、Ａｓｎ１７６Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｎ２２５Ｇｌｕ，Ａｓｎ３２６Ｇｌｕ，Ａｓｎ３３９Ｌｙｓ／Ｓｅｒ，Ａｓｎ３５５Ｌｙｓ／Ｇｌｕと、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとの複合変異体が高い生産性および活性を有することが確認された。熱安定性については、Asn176Lys/Argでは６～８％程度、Asn225Gluでは4％程度の残存活性が観察された。
　次にこれらの活性向上に効果があった変異を組み合わせた変異酵素を構築し、生産性・活性ならびに安定性について検討した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらの変異の組み合わせの中で特に、Ａｓｎ１７６Ｌｙｓ／Ａｓｎ３０１Ｌｙｓ／Ａｓｎ３３０Ｌｙｓ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ａｓｎ１７６Ａｒｇ／Ａｓｎ３０１Ｌｙｓ／Ａｓｎ３３０Ｌｙｓ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＡｓｎ１７６Ａｒｇ／Ａｓｎ２２５Ｇｌｕ／Ａｓｎ３０１Ｌｙｓ／Ａｓｎ３２６Ｇｌｕ／Ａｓｎ３３０／Ａｓｎ３５５Ｇｌｕｓ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの３種が生産性・活性も高く、また安定性にも相乗効果が現れていることが確認できた。生産性はいずれの酵素も30.000U/L程度が達成され、みかけのVmax/Km値も向上している。安定性についても40℃溶液中10分放置後の残存活性は10～13%程度まで向上していた。
　さらに、種々の変異の組み合わせを作成して、生産性・活性および安定性を調べたところ、下記の表４に示す複合変異体が特に高い生産性・活性および安定性を持っていた。中でも、Ｇｌｕ１６６Ａｒｇ／Ｔｈｒ１６８Ｐｒｏ／Ａｓｎ１７６Ａｒｇ／Ａｓｎ３０１Ｌｙｓ／Ａｓｎ３３０Ｌｙｓ／Ｓｅｒ４９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ５００Ｇｌｕ／Ｓｅｒ５１４Ｇｌｙｓ／Ｓｅｒ５５２Ｃｙｓが高いＶｍａｘ／Ｋｍ値を示し、かつ高い熱安定性を示した。この酵素は40℃溶液中での10分インキュベーション後の残存活性が100％であり、失活が観察されなかった。45℃、10分後でも40％弱の残存活性が観察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例７
Ao-GDHへの分子内S-S結合の導入
　酵素の熱安定性の向上を目的として、Ao-GDHの種々のアミノ酸をシステインに変異させた各種変異体を作製し、その酵素活性および熱安定性を調べた。変異の導入および酵素活性の測定は実施例５と同様にして行った。
　熱安定性試験は次のようにして行った。45℃にした20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)　800μlに上記粗精製酵素標品を200μl　加え混和し、すぐに、予め45℃に加熱しておいた20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)　100μl　に対して100μlを加えた（終濃度10倍希釈）。添加後、45℃で2,　5,　10,　15,　20,　25,　または30分間のインキュベーションを行った。所定時間経過後、速やかに氷中で冷却した。GDH活性測定は、DCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM　リン酸カリウム緩衝液　(pH6.5)を使用し、基質はGlc（40mＭ）を使用した。
　その結果、配列番号４で示されるアスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇが両方ともＣで置き換えられている改変型酵素が、特に高い熱安定性ならびに生産性を示すことが見いだされた。図３に示されるように、Ao-GDHの場合には時間とともに活性が低下していったが、Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃは急速に３０％程度に低下したのち１５％程度で一定になった。Ｖ１４９ＣまたはＧ１９０Ｃの単独変異では生産性・活性の上昇には寄与しないことから、かかる熱安定性の向上は、分子内でＳ－Ｓ結合が形成されているためであると推定される。
　図４に、野生型酵素およびＶ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素ならびに参考としてＧ１９０Ｃ変異酵素のＳ－Ｖ曲線を示す。また、Ｋｍ値およびＶｍａｘ値を下記の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　これらの結果から、Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素は野生型と比較して酵素活性も高いことがわかる。分子内S-S結合の形成により基質ポケットの状態が変わって活性が上昇したのか、あるいは熱安定性が向上したことにより酵素の見かけ上の残存活性が向上したのかは、現在のところ不明である。
実施例８
Bfu-GDHおよび他の真菌由来GDHへの分子内S-S結合の導入
　実施例７の結果に基づいて、配列番号２で示されるボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ－ＧＤＨの１５０番目のアミノ酸残基Ａおよび１９２番目のアミノ酸残基Ｔが両方ともＣで置き換えられている改変型酵素（A150C/T192C）を作製したところ、高い熱安定性を示すことが見いだされた。さらに、かかる変異と、実施例６で高い生産性を示したいくつかの変異とを組み合わせた多重変異体を作製し、これらの変異体についても同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。
　図５にBfu-GDHのA150C/T192C変異体の熱安定性を示す。Bfu-GDHにA150C/T192Cおよびこの変異を含む多重変異を導入すると、酵素活性は同等もしくは低下していたが、熱安定性の向上が認められた。４５℃で熱処理すると、直後にはすべて活性が下がったが、その後活性低下速度が遅くなった。なお、これらの変異の導入によりグルコース／キシロースの選択性には影響が見られなかった。
　さらに、図１に示す配列を有するスクレノチニア・スクレロチオラム（Sclenotinia　sclerotiorum）およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus　nigar）40715のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を合成し（それぞれ配列番号７および８）、大腸菌で発現させた。また、それぞれA150C/T191CおよびY150C/G191Cの変異を導入した変異酵素も作製し、同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。
　作製した各変異体の熱安定性を、所定の測定時間における失活曲線から導き出される失活の速度定数（k　(min-1)）およびそこから計算される半減期（t1/2　(min)）で表した結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例６
酵素センサーの作製および評価
　アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素およびボトリオチニア・フケリアナ由来Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ変異酵素を用いて酵素電極を作製した。５ユニットの本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
　作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ－５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
　本発明は、グルコース濃度の測定、特に血糖値の測定に有用である。

Claims (17)

  1. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質。
  2. さらに、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ａ４９６Ｅ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２ＬおよびＡ５０５Ｎからなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する、請求項１記載の蛋白質。
  3. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
  4. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
  5. 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号４で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｖ１４９ＣおよびＧ１９０Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質。
  6. 真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、そのアミノ酸配列を配列番号４で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたときに配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素。
  7. 真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、配列番号２および５－９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素。
  8. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ａ１５０Ｃ／Ｔ１９２Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質。
  9. 請求項１－８のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子。
  10. 請求項９に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
  11. 請求項９に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
  12. 請求項１１に記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
  13. 請求項１－８のいずれかに記載の蛋白質を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法。
  14. 請求項１－８のいずれかに記載の蛋白質を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
  15. 請求項１－８のいずれかに記載の蛋白質が電極表面に固定化されている酵素電極。
  16. 作用極として請求項１５に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
  17. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20％以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサー。
     
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Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031664A1 (ja) * 2011-08-26 2013-03-07 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013051704A1 (ja) * 2011-10-05 2013-04-11 池田食研株式会社 グルコース脱水素酵素
WO2013118799A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素
WO2013118798A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素
JP2015084676A (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2015099112A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 キッコーマン株式会社 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015146773A (ja) * 2014-02-06 2015-08-20 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2016007191A (ja) * 2014-06-26 2016-01-18 株式会社村田製作所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
JP2016007192A (ja) * 2014-06-26 2016-01-18 株式会社村田製作所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
EP2799545A4 (en) * 2011-12-28 2016-01-20 Ultizyme Int Ltd GLUCOSE DEHYDROGENASE
US9260699B2 (en) 2011-10-31 2016-02-16 Toyobo Co., Ltd. Glucose dehydrogenase
JP2016075553A (ja) * 2014-10-06 2016-05-12 東洋紡株式会社 グルコースセンサによるグルコース測定方法
US9469844B2 (en) 2010-12-02 2016-10-18 Kikkoman Corporation Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same
JP2016208916A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質
JP2016208915A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質
JP2018046816A (ja) * 2017-09-15 2018-03-29 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2018230304A1 (ja) * 2017-06-14 2018-12-20 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
WO2019172400A1 (ja) 2018-03-08 2019-09-12 有限会社アルティザイム・インターナショナル フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質
US10913971B2 (en) 2015-04-09 2021-02-09 Toyobo Co., Ltd. Enzyme preparation for use in measurement of glucose
US11072809B2 (en) 2015-01-16 2021-07-27 Toyobo Co., Ltd. FAD-dependent glucose dehydrogenase

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6856344B2 (ja) 2015-10-29 2021-04-07 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素およびその利用
WO2017195765A1 (ja) 2016-05-09 2017-11-16 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
CN111593030B (zh) * 2020-04-17 2022-11-08 华东理工大学 化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用
CN114107355B (zh) * 2021-12-03 2024-04-23 浙江清肽生物科技有限公司 一种高效表达葡萄糖脱氢酶的工程菌的发酵方法及其应用
CN114958789B (zh) * 2022-05-23 2023-08-29 可孚医疗科技股份有限公司 一种葡萄糖脱氢酶突变体、其制备方法及其应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド
WO2007011610A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Acologix, Inc. Protein formulation for promoting hard tissue formation
JP2007289148A (ja) 2006-03-31 2007-11-08 Toyobo Co Ltd アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
WO2007139013A1 (ja) 2006-05-29 2007-12-06 Amano Enzyme Inc. フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素
JP2008035748A (ja) 2006-08-03 2008-02-21 Toyobo Co Ltd アスペルギルス属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2008035747A (ja) 2006-08-03 2008-02-21 Toyobo Co Ltd ペニシリウム属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2008154574A (ja) * 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法
JP2008178380A (ja) 2006-03-31 2008-08-07 Toyobo Co Ltd アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
JP2008237210A (ja) * 2006-11-14 2008-10-09 Toyobo Co Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2009273381A (ja) * 2008-05-13 2009-11-26 Toyobo Co Ltd 熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2011068050A1 (ja) * 2009-12-05 2011-06-09 天野エンザイム株式会社 変異酵素及びその用途
JP2011115156A (ja) * 2009-11-06 2011-06-16 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの温度依存性を改善する方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR002301A1 (es) * 1995-06-07 1998-03-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Un método para producir un polipéptido que tiene actividad hexosa oxidasa polipéptido asi obtenido molecula de dna recombinante alli utilizada celula microbiana que comprende dicha molecula metodos para preparar un producto alimenticio un forraje para animales un producto farmacéutico un producto cosmetico un producto para el cuidado dental y un producto horneado para reducir el contenido de azucar de un producto alimenticio para analizar el contenido de un azucar en una muestra o para preparar
US7553649B2 (en) * 2006-03-31 2009-06-30 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for producing glucose dehydrogenase from Aspergillus oryzae
US20080003628A1 (en) 2006-03-31 2008-01-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for enhancing stability of a composition comprising soluble glucose dehydrogenase (gdh)
US7494794B2 (en) * 2006-03-31 2009-02-24 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Glucose dehydrogenase
WO2008059777A1 (fr) 2006-11-14 2008-05-22 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Glucose déshydrogénase dépendante du flavine-adénine dinucléotide modifiée
EP2223996B1 (en) * 2007-11-28 2013-08-14 Amano Enzyme Inc. Transformant transfected with flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase gene and method for producing flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase using the same
JP5398004B2 (ja) * 2007-12-28 2014-01-29 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド
WO2007011610A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Acologix, Inc. Protein formulation for promoting hard tissue formation
JP2008154574A (ja) * 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法
JP2007289148A (ja) 2006-03-31 2007-11-08 Toyobo Co Ltd アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
JP2008178380A (ja) 2006-03-31 2008-08-07 Toyobo Co Ltd アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法
WO2007139013A1 (ja) 2006-05-29 2007-12-06 Amano Enzyme Inc. フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素
JP2008035747A (ja) 2006-08-03 2008-02-21 Toyobo Co Ltd ペニシリウム属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2008035748A (ja) 2006-08-03 2008-02-21 Toyobo Co Ltd アスペルギルス属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2008237210A (ja) * 2006-11-14 2008-10-09 Toyobo Co Ltd 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2009273381A (ja) * 2008-05-13 2009-11-26 Toyobo Co Ltd 熱安定性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP2011115156A (ja) * 2009-11-06 2011-06-16 Toyobo Co Ltd フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの温度依存性を改善する方法
WO2011068050A1 (ja) * 2009-12-05 2011-06-09 天野エンザイム株式会社 変異酵素及びその用途

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 139, no. 2, 1967, pages 265 - 276
DATABASE DATABASE UNIPROT [online] 31 October 2006 (2006-10-31), ROLKE Y. ET AL.: "Definition: Glucose oxidase", XP003031796, Database accession no. Q70Q36 *
F. WILLIAM STUDIER ET AL.: "ZYP broth", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, 2005
F. WILLIAM; STUDIER ET AL., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, 2005
HENRIK NIELSEN; JACOB ENGELBRECHT; SOREN BRUNAK; GUNNAR VON HEIJNE: "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites", PROTEIN ENGINEERING, vol. 10, 1997, pages 1 - 6
LU, G.; MORIYAMA, E.N.: "Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite", BRIEF BIOINFORM., vol. 5, 2004, pages 378 - 88
ROLKE ET AL., MOL. PLANT PATHOL., vol. 5, no. 1, 2004, pages 17 - 27
See also references of EP2589655A4 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9469844B2 (en) 2010-12-02 2016-10-18 Kikkoman Corporation Flavin-bound glucose dehydrogenases, a method for producing a flavin-bound glucose dehydrogenase, and yeast transformant used for the same
US8945359B2 (en) 2011-08-26 2015-02-03 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-binding glucose dehydrogenase
WO2013031664A1 (ja) * 2011-08-26 2013-03-07 池田食研株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013051704A1 (ja) * 2011-10-05 2013-04-11 池田食研株式会社 グルコース脱水素酵素
JP2013090620A (ja) * 2011-10-05 2013-05-16 Ikeda Shokken Kk グルコース脱水素酵素
US9260699B2 (en) 2011-10-31 2016-02-16 Toyobo Co., Ltd. Glucose dehydrogenase
US9512459B2 (en) 2011-12-28 2016-12-06 Ultizyme International Ltd. Glucose dehydrogenase
EP2799545A4 (en) * 2011-12-28 2016-01-20 Ultizyme Int Ltd GLUCOSE DEHYDROGENASE
WO2013118798A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素
JP2013176364A (ja) * 2012-02-09 2013-09-09 Toyobo Co Ltd 新規なグルコース脱水素酵素
JP2013176363A (ja) * 2012-02-09 2013-09-09 Toyobo Co Ltd 新規なグルコース脱水素酵素
WO2013118799A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素
US9404144B2 (en) 2012-02-09 2016-08-02 Toyobo Co., Ltd. Glucose dehydrogenase
JP2015084676A (ja) * 2013-10-29 2015-05-07 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JPWO2015099112A1 (ja) * 2013-12-27 2017-03-23 キッコーマン株式会社 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2015099112A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 キッコーマン株式会社 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015146773A (ja) * 2014-02-06 2015-08-20 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2016007191A (ja) * 2014-06-26 2016-01-18 株式会社村田製作所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
JP2016007192A (ja) * 2014-06-26 2016-01-18 株式会社村田製作所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
JP2016075553A (ja) * 2014-10-06 2016-05-12 東洋紡株式会社 グルコースセンサによるグルコース測定方法
US11072809B2 (en) 2015-01-16 2021-07-27 Toyobo Co., Ltd. FAD-dependent glucose dehydrogenase
US10913971B2 (en) 2015-04-09 2021-02-09 Toyobo Co., Ltd. Enzyme preparation for use in measurement of glucose
JP2016208916A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質
JP2016208915A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質
WO2018230304A1 (ja) * 2017-06-14 2018-12-20 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
JP2019000020A (ja) * 2017-06-14 2019-01-10 池田食研株式会社 改変型グルコース脱水素酵素
US11725193B2 (en) 2017-06-14 2023-08-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. Modified glucose dehydrogenase
JP2018046816A (ja) * 2017-09-15 2018-03-29 東洋紡株式会社 耐熱性に優れたフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2019172400A1 (ja) 2018-03-08 2019-09-12 有限会社アルティザイム・インターナショナル フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素とシトクロム分子との融合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012001976A1 (ja) 2013-08-22
US20130168263A1 (en) 2013-07-04
EP2589655A1 (en) 2013-05-08
JP5873796B2 (ja) 2016-03-01
US8999691B2 (en) 2015-04-07
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KR20130038914A (ko) 2013-04-18

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