JP2016208915A - フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】糖尿病の血糖値センサーやバイオ燃料電池に用いるため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性（ＦＡＤＧＤＨ）の優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質の提供。
【解決手段】糸状菌由来のＦＡＤＧＤを有する野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、前記野生型タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの特定位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、前記特定位置は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の特定のアミノ酸配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の特定のアミノ酸配列の４３４番目に相当する位置である、変異型タンパク質。
【選択図】図１０

Description

本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質、該変異型タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。

グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）は、血糖センサ用の酵素として古くから利用されており、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有している。しかし、グルコースオキシダーゼを用いた測定では、血液中の溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。

一方、溶存酸素の影響を受けない酵素として、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用の酵素として知られている。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは、安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であるといった欠点があり、また、ＰＱＱＧＤＨは、基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するという欠点がある。

このため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、基質特異性にも優れた酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨは、ある程度の熱安定性を有している。しかし、グルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合や、保管時の環境温度が高温になる場合が考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は高い熱安定性を有していることが望ましい。

このため、特許文献１では、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させることにより、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性を有する変異型ＦＡＤＧＤＨが得られることが開示されている。また、特許文献２では、さらに熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨとして、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓなどの好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが開示されている。

国際公開第２００９／１１９７２８号 国際公開第２０１４／０４５９１２号

糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のＦＡＤＧＤＨであっても、基質親和性（グルコースに対する親和性）が低く、酵素活性が低いものは、グルコース測定に実用化することが難しいという問題があった。

本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。

〔１〕
糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
前記野生型タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの特定位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
前記特定位置は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列の４３４番目に相当する位置であることを特徴とする、変異型タンパク質。
〔２〕
前記野生型タンパク質の前記特定位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基以外のアミノ酸残基である、〔１〕に記載の変異型タンパク質。
〔３〕
前記グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基が疎水性のアミノ酸残基である、〔２〕に記載の変異型タンパク質。
〔４〕
前記他のアミノ酸残基が親水性のアミノ酸残基である、〔３〕に記載の変異型タンパク質。
〔５〕
前記親水性のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、〔４〕に記載の変異型タンパク質。
〔６〕
前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉである、〔２〕に記載の変異型タンパク質。
〔７〕
前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓであり、
前記野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔４〕に記載の変異型タンパク質。
〔８〕
前記糸状菌は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉであり、
前記野生型タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔４〕に記載の変異型タンパク質。
〔９〕
糖鎖が付加された、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の変異型タンパク質。
〔１０〕
〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の変異型タンパク質をコードする遺伝子。
〔１１〕
（Ａ） 糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する野生型タンパク質をコードする遺伝子において、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号２に記載の塩基配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号４に記載の塩基配列の１３００〜１３０２番目に相当する位置の少なくともいずれかの塩基が他の塩基に置換されてなる、塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
〔１２〕
〔１０または１１〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔１３〕
〔１０または１１〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。
〔１４〕
〔１０または１１〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１５〕
〔１３〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１６〕
〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
〔１７〕
〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ。
〔１８〕
〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
〔１９〕
〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたバイオ燃料電池。

本発明によれば、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することができる。

参考例１での縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。 Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。 図２に示す塩基配列におけるエクソンの構成を示す模式図である。 Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。 比較例１の確認試験におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。（ａ）はＣＢＢ染色した場合、（ｂ）はＰＡＳ染色した場合を示す。 比較例１の確認試験における吸収スペクトルを示す図である。 Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。 図７に示す塩基配列におけるエクソンの構成を示す模式図である。 Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。 評価試験における実施例１および比較例１のＦＡＤＧＤＨについての酵素活性の測定結果を示すグラフである。 評価試験における実施例２および比較例２のＦＡＤＧＤＨについての酵素活性の測定結果を示すグラフである。 評価試験の温度安定性評価における実施例１および比較例１のＦＡＤＧＤＨについての結果を示すグラフである。 評価試験の温度安定性評価における実施例２および比較例２のＦＡＤＧＤＨについての結果を示すグラフである。 Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの立体構造のモデリングを示す図である。 Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨとＫｍ値の低いＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列を対比して示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。実施形態２以降では実施形態１と共通の事柄についての記述を省略し、異なる点についてのみ説明する。特に、同様の構成による同様の作用効果については実施形態毎には逐次言及しない。

（実施形態１）
本実施形態の発明は、糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）活性を有する野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質である。野生型タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの特定位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている。特定位置は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列の４３４番目に相当する位置である。

図１４に、好熱性糸状菌の一種であるＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ：ＮＢＲＣ９１２９）に由来するＦＡＤＧＤＨの立体構造のモデリング結果を示す。この立体構造は、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（http://swissmodel.expasy.org/）によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのＦＡＤグルコースオキシダーゼの立体構造をもとにしてモデリングを行なったものである。また、糸状菌に由来するＦＡＤＧＤＨは、菌種が異なっても、アミノ酸配列の相同性が比較的高い。これらのことから、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの立体構造の概要を知る上で、図１４に示される立体構造を参照することができると考えられる）。なお、図１４には、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、およびそのイソアロキサジン環付近の活性部位（Ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）も模式的に示されている。

図１４に示されるＦＡＤＧＤＨの立体構造において、Ｍ１〜Ｍ６は、グルコースおよびＦＡＤの結合部位に比較的近いと考えられる位置である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨに相当するアミノ酸配列の番号としては、Ｍ１は１１７および１１８番目、Ｍ２は１３７番目、Ｍ３は２３１番目、Ｍ４は２５６番目、Ｍ５は４１７番目、Ｍ６は４３４番目である。なお、アミノ酸配列におけるアミノ酸の番号は、シグナルペプチドを含めたアミノ酸配列のＮ末端（アミノ末端）のメチオニン（Ｍ）から数えたアミノ酸の番号である。

本発明者らは、これらの位置のアミノ酸の種類が、基質親和性に与える影響が大きいと推測し、ＦＡＤＧＤＨの利点と高い耐熱性とを有する一方で、Ｋｍ（ミカエリス定数）の値が高いことが確認されている糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）に由来する野生型ＦＡＤＧＤＨに対して、これらの位置の各々において変異を導入し、基質親和性への影響を確認した。その結果、本発明者らは、４３４番目のアミノ酸に変異を導入することで、Ｋｍ値が大幅に低下することを見出した。

したがって、本実施形態の変異型タンパク質（変異型ＦＡＤＧＤＨ）は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有する。

図１５に、Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨと、Ｋｍ値の低いＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列を対比して示す。図１５において、Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来ＦＡＤＧＤＨであり、Ｋｍ値の低いＦＡＤＧＤＨは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ（ＮＢＲＣ６９９３）由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ（ＮＢＲＣ５８６１）由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓ（ＮＢＲＣ８１３２）由来ＦＡＤＧＤＨである。

なお、これらの糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、本発明者らによってその存在やアミノ酸配列等が確認されたものであり、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ以外は本願の出願時において公知のものではない。また、そのＫｍ値、酵素活性などの特性も本発明者らの実験により見出された知見である。

図１５に示されるように、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉに由来するＫｍ値の高いＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１および３）の４３４番目のアミノ酸残基は、それぞれロイシン（Ｌ）残基およびグリシン（Ｇ）残基である。これに対して、他の糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓ）に由来するＫｍ値の低いＦＡＤＧＤＨにおいて、Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の４３４番目に相当する位置のアミノ酸残基は、共通してグルタミン酸（Ｅ）残基である。

このことから、Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列の４３４番目に相当するアミノ酸残基の種類が、基質親和性に大きな影響を与える要因の１つであることが示唆される。

なお、図１５に枠囲みで示されるように、上記Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）のアミノ酸配列の４３４番目は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の４２７番目に相当し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の４２９番目に相当し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の４３１番目に相当する。また、ここで記載するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の番号は、全てシグナルペプチドを含めたアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン（Ｍ）から数えたアミノ酸の番号である。

そして、実施例で後述するように、本発明者らは、実際に上記Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨの４３４番目のアミノ酸残基（ロイシン（Ｌ）残基、グリシン（Ｇ）残基）を、当該位置に相当するＫｍ値の低いＦＡＤＧＤＨのアミノ酸残基であるグルタミン酸（Ｅ）残基に変更することで、Ｋｍ値が著しく低下する（すなわち、基質親和性が著しく向上する）ことを確認している。

したがって、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨにおいて、上記Ｋｍ値の高いＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）の４３４番目に相当する特定位置のアミノ酸残基の種類を変更することで、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨのＫｍ値を低下させる（すなわち、基質親和性を向上させる）ことができると考えられる。

また、図１５に示す対比から、上記特定位置のアミノ酸残基において、野生型タンパク質（野生型ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸残基がグルタミン酸残基以外のアミノ酸残基である場合に、野生型ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値が高くなると考えられるため、特にこのような場合に、上記特定位置のアミノ酸残基の種類を変更することでＦＡＤＧＤＨのＫｍ値を低下させることができると考えられる。

ここで、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基とは、グルタミン酸以外の１９種類のアミノ酸の残基であるが、好ましくは疎水性のアミノ酸残基である。一般に、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とでは、種々の特性が異なることが知られており、図１５に示すＫｍ値が高いＦＡＤＧＤＨの４３４番目のアミノ酸残基（Ｌ，Ｇ）は、いずれも疎水性のアミノ酸残基である。このことから、上記特定位置のアミノ酸残基が疎水性である場合に、野生型ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値が高くなると考えられるため、特にこのような場合に、上記特定位置のアミノ酸残基の種類を変更することでＦＡＤＧＤＨのＫｍ値をより有効に低下させることができると考えられる。

また、上記他のアミノ酸残基（変異型ＦＡＤＧＤＨの上記特定位置のアミノ酸残基）は、親水性のアミノ酸残基であることが好ましい。上述のとおり、野生型ＦＡＤＧＤＨの上記特定位置のアミノ酸残基が疎水性である場合に、野生型ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値が高くなると考えられるため、上記特定位置のアミノ酸残基を親水性のアミノ酸残基に変更することでＦＡＤＧＤＨのＫｍ値をより有効に低下させることができると考えられる。

ここで、親水性のアミノ酸残基は、グルタミン酸残基であることが好ましい。図１５に示すＫｍ値が低いことが見出されたＦＡＤＧＤＨは、上記特定位置のアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）残基であることから、上記特定位置のルタミン酸（Ｅ）残基に変更することでＦＡＤＧＤＨのＫｍ値を低下させる結果が期待できると考えられる。

上記の糸状菌の好適な例としては、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、または、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉが挙げられる。上記のとおり、これらに由来する野生型のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性を有しているものの、Ｋｍ値が高いことが見出されており、上記の変異型ＦＡＤＧＤＨに改変することで、熱安定性が高く、且つＫｍ値が低い有用なＦＡＤＧＤＨを得ることができる。

なお、糸状菌がＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓである場合、上記野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる。

糸状菌がＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉである場合、上記野生型タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる。

なお、配列番号１は、「野生型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。配列番号３は、「野生型のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。

シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１または３のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えた後、その少なくとも一部が切除される。

本実施形態の変異型タンパク質（変異型ＦＡＤＧＤＨ）は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要ないというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、極めて高い熱安定性を有し、かつ、従来よりも基質親和性が向上している。

また、本実施形態の変異型タンパク質は、Ｋｍの値が比較的小さいため、基質親和性（酵素と基質との親和性）が高いといえる。したがって、本実施形態の変異型タンパク質は、グルコース測定を短時間で実施できる点で有利である。

なお、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉともに、本実施形態の変異型タンパク質は、グルコースに対する基質特異性が極めて高く、特にマルトースに対する反応性が極めて低いため、グルコース測定の精度を高めることが可能となる。

本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。Ｋｍ値、ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。

（実施形態２）
本実施形態の発明は、上記実施形態１の変異型タンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、（Ａ） 糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する野生型タンパク質をコードする遺伝子において、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号２に記載の塩基配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号４に記載の塩基配列の１３００〜１３０２番目に相当する位置の少なくともいずれかの塩基が他の塩基に置換されてなる、塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。

配列番号２は、「野生型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。

配列番号４は、「野生型のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。

「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエクソンとし、そのエクソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。

本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１のタンパク質（アミノ酸配列）をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。

ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換すること等により、改変（変異型）タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ），ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー）、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する方法、あるいはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する方法が挙げられる。

（実施形態３）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態２の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして、宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。

宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えば、ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１；タカラバイオ）を用いても良い。

（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが使用できる。

本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態３の組換えベクターで形質転換された酵母および大腸菌が挙げられる。

（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。

所望のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態２の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして宿主に導入される。宿主については、上記実施形態４で説明した宿主と同様である。

こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培地温度は、微生物が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、宿主が酵母の場合、好ましくは２０℃以上３５℃以下であり、宿主が大腸菌の場合、好ましくは２０℃以上４２℃以下である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常、培養時間は６時間以上７２時間以下である。培地ｐＨは、菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、好ましくはｐＨ５．０以上９．０以下である。

ＦＡＤＧＤＨを生産する微生物を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合、濾過、遠心分離などにより、タンパク質を含有する溶液と微生物とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが微生物の体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により微生物を採取し、次いで、この微生物を機械的方法、または、リゾチームなどを用いた酵素的方法で破壊する。また必要に応じて、微生物を含む液中にＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤などを添加して、ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、溶液としてＦＡＤＧＤＨを分離採取する。

このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。

なお、ＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態２の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によってＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。

（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。

グルコース濃度測定試薬は、実施形態５の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。

グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。

固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。

（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。

恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（参考例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した糸状菌［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ：ＮＢＲＣ３２０１７）］を対象として、糸状菌（野生株）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。

購入した糸状菌は、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の糸状菌からＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。

なお、糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。このため、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。

常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。

本参考例では、縮重ＰＣＲ用のプライマーとして、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーである以下のプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。

縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’：配列番号５）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’：配列番号６）、または、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’：配列番号７）
を用いた。

アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’：配列番号８）、または、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’：配列番号９）
を用いた。

なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。

上記の糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーのいずれかと上記２種のアンチセンスプライマーのいずれかとの組み合わせを用いた６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。

その結果、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（ＮＢＲＣ３２０１７）のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、約１．５、また約１．６ｋｂのＤＮＡバンドが検出された（図１中の＊印）。なお、図１において、レーンＭはマーカーであり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。

縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓのゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。

（比較例１）
本比較例では、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（野生株）由来ＦＡＤＧＤＨをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。

（１）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（ＮＢＲＣ３２０１７）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行った。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。

その結果、ＢａｍＨＩのレーンから約７．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約７．０ｋＢのＢａｍＨＩ断片が、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。

次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−隣接領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｅａ）と、終始コドン近傍領域を含む３’−隣接領域のクローニングを試みた。ＢａｍＨＩで切断したＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲル電気泳動に供し、約７．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（タカラバイオ）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲの鋳型とした。

Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー３２０１７ＧＳＰ３（５’−ＧＡＣＧＴＴＧＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣ−３’）、および、プライマー３２０１７ＧＳＰ５（５’−ＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った結果、約６．０ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。

このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行ったところ、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−隣接領域と３’−隣接領域の増幅に成功したことが分かった。

次に、５’−隣接領域および３’−隣接領域の配列に基づいて設計したプライマー３２０１７ＧＳＰ９（５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴ−３’）と３２０１７ＧＳＰ１０（５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＴＣＡ−３’）を用いてＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることが分かった。

（２）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。

スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエクソンとイントロンを特定した。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエクソン（エクソン１；３４３ｂｐ、エクソン２；１２１８ｂｐ、エクソン３；２１５ｂｐ）から構成される１７７６ｂｐのＯＲＦ（５９２アミノ酸をコード）を含んでいた(図２の下線部および図３参照）。

図４に、このようにして特定されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７７９ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。

図４に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１６番目のアラニン（Ａｌａ１６）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図４に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。

（３）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより合成した。

まず、各エクソンをＰＣＲ増幅した。エクソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７ＧＳＰ１１（５’−ＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴ−３’）と３２０１７Ｅ１Ａ（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＣＴＣＧＴＧＣＣＡＣＣ−３’）を用いた。エクソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７Ｅ２Ｓ（５’−ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡ−３’）と３２０１７Ｅ２Ａ（５’−ＧＧＡＡＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’）を用いた。エクソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７Ｅ３Ｓ（５’−ＴＣＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴ−３’）と３２０１７ＧＳＰ１２（５’−ＧＡＣＣＴＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＴ−３’）を用いた。

増幅したエクソン１とエクソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエクソン３とをＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。

次に、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー３２０１７Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡ−３’）および３２０１７Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓよりＦＡＤＧＤＨ遺伝子をクローニングした際に含まれていた、シグナル配列（シグナルペプチドをコードする塩基配列）を含まない成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。

増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９（ｐＰＩＣ９＿３２０１７）に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。

（４）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０^−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０^−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。

培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行った。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ＭＷＣＯ１０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

（比較例１の確認試験）
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
比較例１で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ； サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行った。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ １０−２０％」（アトー）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。

また、別途、染色液として、ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｓｔａｉｎ）染色液を用いる以外は、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＰＡＳ染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。レーン１がタンパク質マーカーであり、レーン２が比較例１で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品である。なお、（ａ）がＣＢＢベースの染色液を用いた場合、（ｂ）がＰＡＳ染色液を用いた場合の結果である。図５（ａ）に示されるように、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことが分かった。また、図５（ｂ）に示されるように、これらの精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）であることが分かった。

（２）吸収スペクトル計測
比較例１で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）を、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際に測定した濃度測定値に基づいて希釈し、２ｍｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１５０ｍＭとなるように添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図６（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図６に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図６の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図６の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。

これらの結果から、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）にて発現し、精製されたＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）は、いずれも補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、酵母によって生産された本発明のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。

［実施例１］
本実施例では、図４に示されるＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの４３４番目のアミノ酸（図４において枠で囲んだＬ）をコードする１３００〜１３０２番目の塩基（図４において枠で囲んだＣＴＣ）が部位特異的導入法によりＧＡＡに置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ分泌発現型プラスミドの作製を行った。それ以外は、比較例１と同様にして、４３４番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

具体的には、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来野生型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９に連結したプラスミド（ｐＰＩＣ９_３２０１７）を鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）および変異導入用プライマーを用いてＰＣＲを行うことで、４３４番目のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換させた変異型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むプラスミド（ｐＰＩＣ９＿３２０１７Ｌ４３４Ｅ）を作製した。変異導入用プライマーには、３２０１７Ｌ４３４ＥＳ（５’−ＡＡＣＴＣＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴ−３’）、および、３２０１７Ｌ４３４ＥＡ（５’−ＣＣＡＧＴＡＴＴＣＣＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＧＴ−３’）を使用した。変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例１に記載した酵母における発現と組換え酵素の精製方法により作製した。

なお、作製した当該変異型ＦＡＤＧＤＨは、シグナルペプチドが切除された成熟型タンパク質であるが、上記アミノ酸配列における変異アミノ酸残基の番号（４３４番目）は、シグナルペプチドを含めたアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン（Ｍ）から数えたアミノ酸の番号である。すなわち、この「４３４番目」（ロイシン残基）は、シグナルペプチドを切除した成熟型タンパク質の４１８番目に相当する。

ただし、酵母発現を用いた本実施例では、発現遺伝子に酵母用の分泌シグナル配列が付加されている。この分泌シグナルペプチドは部分的に切断されるものの、実際に作製されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）はシグナルペプチドの一部（８アミノ酸残基）を含んでいる。このため、上述の配列番号１に記載のアミノ酸配列における４３４番目（ロイシン残基）は、酵母で実際に作製されるＦＡＤＧＤＨにおける４２６番目に相当する。

（比較例２）
本比較例のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）由来ＦＡＤＧＤＨは、特許文献２の実施例２と同様にして大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）、および大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ））を用いて製造した精製標品である。なお、特許文献２の実施例２は、基本的には比較例１と同様の方法を用いているが、組換え酵素の大腸菌による発現と精製は次に示す方法により行った。

シグナル配列を切除したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）のマルチクローニングサイトであるＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのサイトで連結することにより、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２）を作製した。

ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２を大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入した。発現型プラスミドを保有するＢＬＲ（ＤＥ３）をＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した（前培養）。本培養用ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に前培養液を１％植菌し、４時間ほど３７℃で好気的に培養した。その後、培地中に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、２５℃で約２０時間培養を続けた。

培養後の大腸菌を集菌し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をＰＢＳに懸濁した。ＰＢＳ緩衝液に懸濁 した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間、４℃）することにより、上清（全菌体画分）と沈殿（未破砕菌体）を分離した。全菌体画分をさらに遠心分離（１２０００ｇ、２０分間、４℃）し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ―Ｈｉｓ−ｔａｇ―（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＦＡＤＧＤＨを精製した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ ＭＷＣＯ１０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

なお、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図７に示す。Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエクソン（エクソン１；３４６ｂｐ、エクソン２；５９８ｂｐ、エクソン３；６１４ｂｐ、エクソン４；２２１ｂｐ）から構成される１７７９ｂｐのＯＲＦ（５９３アミノ酸をコード）を含んでいる(図７の下線部および図８参照）。図９に、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７８２ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。これらは、そのクローニング方法や解析方法とともに特許文献２に詳細に開示されている。

なお、本比較例のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは、比較例１と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析により電気泳動的に単一な精製標品であることが確認されている。また、吸収スペクトル分析により、補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されていることが確認されている。

［実施例２］
本実施例では、図９に示されるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの４３４番目のアミノ酸（図９において枠で囲んだＧ）をコードする１３００〜１３０２番目の塩基（図９において枠で囲んだＧＧＧ）のうち、１３０１番目と１３０２番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がともにアデニン（Ａ）に置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ発現型プラスミドの作製を行った。それ以外は、比較例２と同様にして、４３４番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

具体的には、シグナル配列を切除したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）のマルチクローニングサイトであるＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのサイトで連結したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２）を鋳型にして、実施例１に記載した部位特異的変異導入法により、４３４番目のグリシン（Ｇ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換させた変異型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むプラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｇ４３４Ｅ）を作製した。変異導入用プライマーとしては、３１２３２Ｇ４３４ＥＳ（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴ−３’）、および３１２３２Ｇ４３４ＥＡ（５’−ＣＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧ−３’）を使用した。変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例２に記載した大腸菌における発現と組換え酵素の精製方法により作製した。

なお、作製した当該変異型ＦＡＤＧＤＨは、シグナルペプチドが切除された成熟型タンパク質であり、Ｎ末端側に開始コドンに相当するメチオニン（Ｍ）が付加されたものであるが、上記アミノ酸配列における変異アミノ酸残基の番号（４３４番目）は、シグナルペプチド（１７アミノ酸残基）を含めたアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン（Ｍ）から数えたアミノ酸の番号である。すなわち、この「４３４番目」（グリシン残基）は、シグナルペプチドを切除した成熟型タンパク質の４１７番目に相当し、本実施例で実際に作製されタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）の４１８番目に相当する。

［評価試験］
実施例１（変異型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、実施例２（変異型のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎii由来ＦＡＤＧＤＨ）、比較例１（野生型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、および、比較例２（野生型のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎii由来ＦＡＤＧＤＨ）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（Ｋｍ値、酵素活性、基質特異性、温度安定性）に関する評価試験を行った。なお、本評価試験における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。

（酵素活性測定原理）
Ｄ−グルコース ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＦＡＤＧＤＨ
→ Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋ ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＰＩＰ
→ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。

（酵素活性の定義）
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。

具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤ_TEST、ΔＯＤ_BLANK）から以下の式により求められる。

ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤ_TEST−ΔＯＤ_BLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）

なお、式中の各定数は、
３．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３ ： ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ^−１・ｃｍ^−１）
０．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。

（活性測定方法）
（１） キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０） １．５ｍＬ
１Ｍ グルコース溶液 ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ 2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ） ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate（1-mPMS） ０．０２１ｍＬ
１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０６ｍＬ
Ｈ_２Ｏ ０．３９９ｍＬ
（２） ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３） ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_TEST）を算出する。
（４） 対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_BLANK）を算出する。

＜Ｋｍ、酵素活性＞
ここでは、酵素活性（反応速度）について検討した。具体的には、上記活性測定方法と同様にして、グルコース溶液の濃度を変化させて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の酵素活性を測定した。グルコース溶液の濃度を、０〜２Ｍの範囲で変化させた。実施例１および比較例１、ならびに、実施例２および比較例２の測定結果をそれぞれ図１０および図１１に示す。

さらに、上記測定結果に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の各々について、イーディー−ホフステープロット（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ ｐｌｏｔ）を作成した。イーディー−ホフステープロットにおいて、直線の傾きが−Ｋｍとなるため、グラフからＫｍを求めることができる。

イーディー−ホフステープロットから求めた実施例１、実施例２、比較例１および比較例２のＦＡＤＧＤＨ精製標品のＫｍ値を表１に示す。また、グルコース溶液の濃度（基質濃度）が３０ｍＭであるときの酵素活性を併せて表１に示す。なお、表１のＶmaxは、ＦＡＤ１μｍｏｌ当たりの最大活性を示している。

表１の結果から、本発明に係る実施例１および２の変異型タンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）のＫｍ値は、比較例１および２の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも著しく低くなっていることが分かる。なお、酵素のＫｍ値が小さいほど、酵素の基質親和性が高いことを意味する。

＜基質特異性＞
ここでは、ＦＡＤＧＤＨがグルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうかを確認した。まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように変更し、酵素活性を測定した。測定は、表２に示す４種類の糖類について行った。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、表２にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、「Ｎ．Ｄ．」（Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。

表２に示される結果から、実施例１の変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨと比べて、特にＤ−キシロースに対する反応性が低下しており、グルコースに対する基質特異性が向上していることが分かる。また、実施例２の変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例２の野生型ＦＡＤＧＤＨと比べて、Ｄ−キシロースに対する反応性は増加しているものの、グルコースに対する基質特異性が比較的高いものであることが分かる。

＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、実施例で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０^−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。

このＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜８０℃の範囲内の所定の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。なお、加熱の温度を変化させて各々の温度における残活性率を求め、温度と残存活性率との関係を示すグラフを作成した。結果を図１２および図１３に示す。

図１２および図１３に示されるように、実施例１および２の変異型ＦＡＤＧＤＨは、熱安定性（耐熱性）が極めて高いことが分かる。なお、グラフから求めた残活性率が５０％になる温度は、実施例１で７６．３℃、比較例１で７２．８℃であり、実施例２で５５．１℃、比較例２で５３．８℃であることから、実施例の変異型ＦＡＤＧＤＨの方が比較例の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも耐熱性が高くなっていると考えられる。

今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (19)

1. 糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
   前記野生型タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの特定位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されており、
   前記特定位置は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列の４３４番目に相当する位置であることを特徴とする、変異型タンパク質。
2. 前記野生型タンパク質の前記特定位置のアミノ酸残基がグルタミン酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異型タンパク質。
3. 前記グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基が疎水性のアミノ酸残基である、請求項２に記載の変異型タンパク質。
4. 前記他のアミノ酸残基が親水性のアミノ酸残基である、請求項３に記載の変異型タンパク質。
5. 前記親水性のアミノ酸残基がグルタミン酸残基である、請求項４に記載の変異型タンパク質。
6. 前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉである、請求項２に記載の変異型タンパク質。
7. 前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓであり、
   前記野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の変異型タンパク質。
8. 前記糸状菌は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉであり、
   前記野生型タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の変異型タンパク質。
9. 糖鎖が付加された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異型タンパク質。
10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異型タンパク質をコードする遺伝子。
11. （Ａ）糸状菌由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する野生型タンパク質をコードする遺伝子において、
    Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号２に記載の塩基配列、または、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号４に記載の塩基配列の１３００〜１３０２番目に相当する位置の少なくともいずれかの塩基が他の塩基に置換されてなる、塩基配列からなるＤＮＡ、
    （Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
    （Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
    のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
12. 請求項１０または１１に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
13. 請求項１０または１１に記載の遺伝子を含む形質転換体。
14. 請求項１０または１１に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
15. 請求項１３に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
16. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
17. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ。
18. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
19. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたバイオ燃料電池。