JP2012019756A - フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子レベルで改変することで、改変前のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼよりも温度依存性が改善し且つ、キシロース作用性が低下した改変型FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、温度依存性が改善された改変型FADGDH、該改変型FADGDHをコードする遺伝子、該改変型FADGDHの製造法及び該改変型FADGDHのグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
また、特許文献1にはAspergillus terreus(アスペルギルス・テレウス)由来FADGDHの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献2にはAspergillus oryzae由来FADGDHが、特許文献3にはAspergillus oryzae由来FADGDHを改変し、熱安定性が向上した改変型FADGDHが記載されている。特許文献4にはAspergillus oryzae由来FADGDHおよびAspergillus terreus由来FADGDHを改変し、熱安定性およびキシロース作用性を改善した改変型FADGDHが記載されている。
しかし、酵素を用いた物質量の測定においては、基質である測定対象物質に対して十分量の酵素を用いることが当業者の常識であり、そうしている限り、多少の酵素活性の変動は測定値に殆ど影響を与えないはずである。
すなわち、環境温度による測定値のばらつきが起こる原因は、酵素に、環境温度による反応性の差異があると考えられるためで、酵素の添加濃度が低いことから、通常当業者が想定する反応系では起こり得ない幅の測定値のばらつきや異常が生じていると考えられた。
[項1]
以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質(以下、FADGDHとも記載)。
(1)配列番号1または配列番号2に記載のアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
(2)配列番号3または配列番号4に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
[項2]
項1に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
[項3]
項1または2に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
[項4]
項3に記載の遺伝子を含むベクター。
[項5]
項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項6]
項5に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
[項7]
項1または2に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
[項8]
項1または2に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
[項9]
項1または2に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
本願明細書において、アミノ酸配列はアスファベット1文字または3文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「G59A」は59位のG(Gly)がA(Ala)に置換することを意味する。なお、配列番号1、2において、アミノ酸の表記は、メチオニンを1として番号付けされている。
(1)配列番号1または配列番号2に記載のアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
(2)配列番号3または配列番号4に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
これらのアミノ酸配列は、特許文献1により公知である。
本願明細書においては、例えばあるアミノ酸配列における配列番号1の46位と同等の位置は、GENETYXソフトで配列の一次構造(例えばアラインメント)を比較したとき、配列番号1の46位と対応する位置をもって同等と判断する。必要に応じてさらに立体構造の知見などを参照しても良い。
なお、GENETYXソフトは、GENETYX CORPORATIONから販売されているGENETYX WIN Version 6.1のものを使用した。
本願において、温度依存性とは、温度変化に伴って酵素活性が変化することを意味する。温度依存性の改善とは酵素活性の変化が少なく、広い範囲で一定の酵素活性を示すことを意味する。
「温度依存性が改善されているか」を判断する方法は以下のとおりである。
(1)37℃、24時間処理後における活性値(U/ml)を測定し、これをAとする。
(2)25℃、24時間処理後における活性値(U/ml)を測定し、これをBとする。
(3)Aを100%としたときのBの相対値(%)を計算し、これをC(表1〜7における「温度依存性」)とする。
(4)野生型酵素(WT)のCの値を1とし、それぞれの改変型酵素の相対値を計算しなおす。これをD(表1〜7における「温度依存性比」)とする。
(5)野生型酵素(WT)においてA>Bであれば、改変型酵素がD>1であって値が大きいほど温度依存性は改善されていると判断する。野生型酵素(WT)においてA<Bであれば、改変型酵素がD<1であって値が小さいほど温度依存性は改善されていると判断する。
温度依存性が55%以上を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
温度依存性は、好ましくは60%以上であり、更に好ましくは65%以上であり、更に好ましくは70%以上であり、更に好ましくは75%以上である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
また、キシロース作用性とは、グルコースを基質とした場合の反応速度とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比%(グルコースを100%とする。)である。
次いで、野生型酵素(WT)のキシロ−ス作用性の値を1とし、それぞれの改変型酵素の相対比%を計算しなおす。これが表1〜7における「キシロース作用性比」)である。この値が小さいほど、キシロース作用性が低下していると判断される。
キシロースに対する反応性が8.0%以下を示すフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
キシロースに対する反応性は、好ましくは7.0%以下であり、更に好ましくは6.0%以下であり、更に好ましくは5.5%以下であり、更に好ましくは5.0%以下である。
これらの効果のある変異部位をさらに組合せることにより、相加・相乗効果が期待できる。
以下に、配列番号1、2で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のFADGDHを改変したFADGDH改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAが作成される。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。
Aspergillus terreus由来のFADGDHとしては、配列番号1、2で表されるタンパク質が例示できる。
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれかのアミノ酸、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
(a)タンパク質実験プロトコール第1巻 機能解析編,第2巻 構造解析編 (秀潤社) 西村善文,大野茂男 監修
(b)改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 (洋土社) 岡田雅人,宮崎香 編集
また、以下に例示する方法によって進めることもできる。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリーではエシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB101、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5αなどを用いることができる。
[試験例]
<試薬>
50mM PIPES緩衝液pH6.5(0.1% TritonX−100を含む)
24mM PMS溶液
2.0mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
1M D−グルコース溶液
上記PIPES緩衝液21.9ml、DCPIP溶液1.0ml、PMS溶液2.0ml、D―グルコース溶液4.5mlを混合して反応試薬とする。
反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。GDH溶液0.1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義している。また、25℃での活性値を測定する場合は、上記の37℃と表記した操作を25℃に変更して測定する。キシロースに対する反応性を測定する際は、上記の1M D−グルコース溶液の代わりに1M D−キシロースを使用すればよい。
活性(U/ml)=
{−(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.0×希釈倍率}/{16.3×0.1×1.0}
なお、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型FADGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型FADGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型FADGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型FADGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型FADGDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本発明のグルコース測定方法においては、例えば、上述の温度依存性が改善したFADGDHを用いることが好ましく、それによって、広い温度範囲で、より正確性・精密性の高い測定値を得ることが容易になる。
アスペルギルス・テレウス由来のFADGDH(配列番号2)をコードする遺伝子(配列番号4)を含む組み換えプラスミドpATGDH2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a;TOYOBO社製)を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天;pH7.3)に塗布した後、30℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン(50mg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl;pH7.3)を摂取し、30℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドpATGDH2を調製した。
このpATGDH2プラスミドを鋳型として、46番目のアスパラギンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号5の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをQuickChange Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて改変型FADGDHプラスミドを作製した。
実施例1で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を15mlのアンピシリンを含むTB液体培地に植菌して、25℃、64時間培養した。培養液全量を集菌した後、50mMのリン酸緩衝液(pH6.0)に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、25℃と37℃の反応温度で活性を測定することにより、37℃での活性測定値を100%とした場合の25℃での活性測定値の割合(%)を調べた。25℃における野生型の活性値は約50〜54%を示していた。野生型の活性値比率と比べて上昇しているものは温度依存性が改善されていると考えられた。
N46A、またはG49N、またはG49F、またはG49V、またはG49R、またはG49I、またはG49M、またはG49L、またはG49Q、またはG49D、またはG49C、またはG49W、またはG49T、またはG49E、またはG49K、またはG49A、またはG49S、またはY50K、またはY50I、またはY50V、またはY50Q、またはY50H、またはY50C、またはY50P、またはY50N、またはY50S、またはY50A、またはY50D、またはY50E、またはY50R、またはY50M、またはY50T、またはY50G、またはF54D、またはF54S、またはF54E、またはF54Q、またはF54C、またはF54N、またはF54T、またはF54A、またはF54Y、またはF54M、またはG55T、またはG55K、またはG55P、またはG55I、またはG55H、またはG55L、またはG55V、またはG55Y、またはG55M、またはG55W、またはR78S、またはR78P、またはR78F、またはR78Q、またはR78G、またはR78A、またはR78D、またはR78L、またはA104N、またはA104Y、またはA104W、またはA104P、またはA104M、またはA104Dのアミノ酸置換した改変型FADGDHにおいて温度依存性の顕著な改善効果が見られた。
実施例1で確認した野生型とは異なるアミノ酸種に部位特異的変異している形質転換株を15mlのアンピシリンを含むTB液体培地に植菌して、25℃、64時間培養した。培養液全量を集菌した後、50mMのリン酸緩衝液(pH6.0)に懸濁し、ガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、試験例に示した活性測定法を基本として、グルコースの代わりにキシロースを基質として、活性値を測定した。そして、グルコースを基質とした場合の活性値を100%として、キシロースを基質とした場合の活性値の割合(%)を調べた。野生型のキシロースに対する活性値比率(8.1〜10.0%)と比べて減少しているものが、キシロースに対する反応性が低下して、グルコースに対する特異性が向上していると考えた。
N46L、またはG49A、またはG49K、またはG49D、またはG49E、またはG49S、またはG49C、またはG49T、またはF54I、またはF54H、またはF54M、またはF54N、またはF54Y、またはG55D、またはR78Hのアミノ酸置換した改変型FADGDHにおいてキシロースの対する反応性が低下する顕著な改善効果が見られた。
G49A、またはG49K、またはG49D、またはG49E、またはG49S、またはG49C、またはG49T、またはF54M、またはF54N、またはF54Yのアミノ酸置換した改変型FADGDHにおいては、温度依存性と共に、キシロースの対する反応性が低下する2重の改善効果が見られた。
表2の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの49位のGを16種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
表3の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの50位のYを18種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
表4の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの54位のFを14種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
表5の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの55位のGを16種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
表6の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの78位のRを14種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
表7の右側4列は、アスペルギルス・テレウス由来のFAD−GDHの104位のAを14種の他のアミノ酸に置換した改変型FADGLDのキシロース作用性の比較である。
このpATGDH1プラスミドを鋳型として、先と同様の方法にて、配列番号1のアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれかの位置においてアミノ酸置換を有する改変型FADGDHプラスミドを作製した。
Claims (9)
- 以下のいずれかで示される、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質(以下、FADGDHとも記載)。
(1)配列番号1または配列番号2に記載のアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。
(2)配列番号3または配列番号4に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の46位、49位、50位、54位、55位、78位、104位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換されているアミノ酸配列を有する。 - 請求項1に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加(挿入)されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
- 請求項1または2に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項3に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
- 請求項1または2に記載のタンパク質を用いるグルコース測定法。
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