JP5799534B2 - フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性を向上するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）のアミノ酸配列を他のアミノ酸に置換して得られる安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨに関するものである。
本発明はまた、該改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、および、該形質転換体を培養して改変型ＦＡＤＧＤＨを製造する方法に関する。
さらに本発明は、該改変型ＦＡＤＧＤＨの、グルコース測定試薬等への種々の適用に関する。

血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。ＳＭＢＧに関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。

血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としては、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する選択性の高さや熱に対する安定性が高いという利点があった。しかしながら、グルコースオキシダーゼを利用したグルコースセンサはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、反応で生じたプロトンを血液中の溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。

このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））がグルコースセンサ用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。

そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼがグルコースセンサ用酵素としての応用が期待されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの物質特性およびＦＡＤＧＤＨを用いたグルコースセンサについて記載されている。特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ遺伝子配列並びにアミノ酸配列が記載されている。特許文献３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列並びに製造方法が記載されている。特許文献４にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸に置換することで得られる熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。特許文献５にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を置換することで得られる熱安定性および、又はキシロース作用性を改善した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。

ＷＯ２００４／０５８９５８ ＷＯ２００６／１０１２３９ 特開２００７−２８９１４８ 特開２００８−２３７２１０ ＷＯ２００８／０５９７７７

Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０

本発明の目的は、公知のグルコースセンサ用酵素と比較して、実用面において有利な血糖測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。さらに、詳しく述べれば遺伝子工学的手法により、ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を他のアミノ酸に置換することで得られる安定性の向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを提供することである。

特許文献３あるいは特許文献４に開示された公知のＦＡＤＧＤＨは溶存酸素の影響をうけず、グルコースに対して高い選択性を有することから、グルコースオキシダーゼやＰＱＱＧＤＨに変わる次世代のグルコースセンサ用酵素としての応用が期待されている。特に特許文献４にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸に置換することで熱に対する安定性や、幅広いpH域で活性を維持する改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
血糖センサ用ストリップの作製工程においては、ＦＡＤＧＤＨをストリップ上で加熱乾燥処理を施す場合がある。そのような場合、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が高いと、加熱処理時に酵素の失活が低減されるので有益である。特許文献４に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは改変前と比較して熱安定性が大幅に改善した。しかしながら加熱乾燥処理条件によっては、改変型ＦＡＤＧＤＨでも失活する危険性があり、耐熱性をさらに向上させる必要があった。

本発明者らは上記改変型ＦＡＤＧＤＨの欠点を克服するために鋭意研究を重ねた結果、特許文献４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、さらに安定性を向上させる部位を見出し、本発明に完成させた。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、３３９位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、３３９位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｃ）配列番号１または配列番号２の少なくともいずれかと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、「配列番号１の３３９位」、または、「配列番号２の３３９位」と同等の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
［項２］
項１に記載のタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［項３］
項１に記載のタンパク質において、３３９位のＰまたはそれと同等の位置におけるアミノ酸置換がＡ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｖであるタンパク質。
［項４］
項１記載のタンパク質において、３３９位のＰをＡ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｖに置換することで得られる、安定性が向上したタンパク質。
［項５］
項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［項６］
項５に記載の遺伝子を含むベクター。
［項７］
項６に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項８］
項７に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
［項９］
項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
［項１０］
項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
［項１１］
項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。

本発明により臨床検査薬用酵素として有用な、安定性の向上した新規な改変型ＦＡＤＧＤＨを創出し、工業的に大量に該ＦＡＤＧＤＨを生産できる。

アスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号３）を比較。 改変前のＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）とＰ３３９ＬのｐＨ安定性の比較。

以下に、本発明を詳細に説明する。

フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼはフラビンアデニンジヌクレオチド（以下、フラビンアデニンジヌクレオチドをＦＡＤとも記載する。）を補酵素として使用し、グルコースを選択的に酸化する酵素である。

本願明細書において、アミノ酸配列はアルファベット１文字または３文字で表記する。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば、「Ｐ３３９Ｌ」は３３９位（Ｎ末端から３３９番目）のプロリン（Ｐｒｏ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換することを意味する。また、「３３９Ｌ」は、変異の有無を問わず、３３９位（又は３３９番目）のアミノ酸がＬｅｕ（Ｌ）であることを示す。
なお、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４における、アミノ酸の表記はメチオニン（Ｍｅｔ）を１として番号付けされている。

本願発明の一実施形態は、以下の（ａ）または（ｂ）で表されるタンパク質である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、３３９位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、３３９位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。

ここで、配列番号１は、野生株のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列であり、配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列における１６３位のＧをＲに、および、５５１位のＶをＣに、それぞれ置換したことで熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列である。
これらのアミノ酸配列は、特許文献３または特許文献４により公知である。

３３９位のＰまたはそれと同等の位置におけるアミノ酸置換は、特に限定されないが、Ｐ３３９Ａ、Ｐ３３９Ｃ、Ｐ３３９Ｉ、Ｐ３３９ＬおよびＰ３３９Ｖからなる群のうちいずれかであることが好ましい。より好ましくはＰ３３９Ａ、Ｐ３３９Ｉ、Ｐ３３９ＬおよびＰ３３９Ｖである。もっとも好ましくはＰ３３９Ｌである。

また、本願発明の別の一実施形態は、以下の（ｃ）で表されるタンパク質である。
（ｃ）配列番号１または配列番号２の少なくともいずれかと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、「配列番号１の３３９位」、または、「配列番号２の３３９位」と同等の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているタンパク質。

「配列番号１または配列番号２の少なくともいずれかと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列」としては、例えば配列番号３あるいは配列番号４に示される、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列が例示される。このアミノ酸配列は、特許文献２により公知である。

本願明細書において、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。例えば、アスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号２）と、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号３）を、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて比較分析したところ、６３．０％の相同性がある（図１参照）。
また、本願明細書において、例えばあるアミノ酸配列における配列番号２の３３９位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列の一次構造（例えばアラインメント）を比較したとき、配列番号２の３３９位と対応する位置をもって同等と判断する。必要に応じてさらに立体構造の知見などを参照しても良い。
具体的には、アスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列とのアライメントの比較データより、本発明の３３９位と同等の位置とは、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨの３５９位のＰに相当する。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。

上記（ｃ）において、配列番号１または配列番号２の少なくともいずれかとのアミノ酸配列の相同性は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。

上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。

本願発明のタンパク質は、改変前よりも安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨである。

例えば、上記のタンパク質における、３３９位のＰまたはそれと同等の位置におけるアミノ酸置換がＬであるタンパク質は改変前ＦＡＤＧＤＨよりも安定性が向上している。

本願において、熱安定性とは加熱処理前の活性値を１００％とした場合の、加熱処理後の活性値の残存率である。これが表１、表２および表３における残存率である。この残存率が高いほど、改変前よりも熱安定性が向上していると判断される。

本願において、ｐＨ安定性とは酵素を様々なｐＨのバッファーに溶解した直後の活性値を１００％とした場合の、１６時間後の活性値の残存率である。この残存率が高いほど、改変前よりもｐＨ安定性が向上していると判断される。

なお、本願発明のタンパク質は、上記のタンパク質において、ＧＤＨ活性を有するものであって、さらに、安定性が向上しているものであれば、３３９位にアミノ酸置換を有し、さらに、それら以外の部位に１箇所以上（たとえば数箇所）のアミノ酸変異を有するものであっても良い。変異は、１若しくは数個の置換、欠失、挿入、さらにはその組合せであっても良い。

本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、種々の公知の手段で作製することが出来る。以下に、配列番号１で示されるアスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を他のアミノ酸に置換することで得られる安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
アスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨとしては配列番号１、または配列番号２で表されるタンパク質が例示できる。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号３、または配列番号４で表されるタンパク質が例示できる。

本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子である。

配列番号１や配列番号２で表されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子として、配列番号５や配列番号６で表される塩基配列が例示できる。また、配列番号３や配列番号４のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子として、配列番号７や配列番号８で表される塩基配列が例示できる。

本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子は、配列番号５、６、７または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号５、６、７または８に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列がストリンジェントな条件に相当すると考えられる。

本願発明の遺伝子は、たとえばＦＡＤＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。具体的には配列番号１及び２の３３９位のプロリンをロイシンに置換する場合は、配列番号５及び配列番号６記載の塩基配列における１０１５番目から１０１７番目のＣＣＴを、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧのいずれに改変しても良い。配列番号３の３５７位のプロリンをロイシンに置換する場合は、配列番号７記載の塩基配列における１０７５番目から１０７７番目のＣＣＣを、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧのいずれに改変しても良い。また、配列番号４の３３５位のプロリンをロイシンに置換する場合は、配列番号８に記載の塩基配列における１００３番目から１００５番目のＣＣＣを、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧのいずれに改変しても良い。

本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。

例えば、上記のＦＡＤＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＦＡＤＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＦＡＤＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。

上記のようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
また、以下に例示する方法によって進めることもできる。

作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。

ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α・などを宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリスなど酵母を宿主とする場合には、ｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが例示される。アスペルギルス・オリゼなどのカビを宿主とする場合には、ｐＵＳＡ、ｐＵＳＥなどが例示される。

宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α・；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。

本発明において、ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＦＡＤＧＤＨ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。

上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＦＡＤＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。

ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。

上記のようにして、一度選択されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＦＡＤＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。

なお、本発明のＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。

野生株由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。

培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は微生物が成育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは微生物が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。

培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＦＡＤＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。

上記のようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。

例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍｌを混合して反応試薬とする。

＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＦＡＤＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＡＤＧＤＨ溶液の代わりにＦＡＤＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝

なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

本発明における、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の測定は以下の計算式に従って求める。

残存率（％）＝（（熱処理後の活性値）／（熱処理前の活性値））×１００

本発明における、ＦＡＤＧＤＨのｐＨ安定性の測定は以下の計算式に従って求める。

残存率（％）＝（（ｐＨ処理１６時間後の活性値）／（ｐＨ処理直後の活性値））×１００

グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。

グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ 改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝子の作製
配列番号２の熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ（本明細書ではＭｕｔ１と記載することもある。）をコードする遺伝子（配列番号６）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ；ｐＨ６．５）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調整した。

実施例２ ３３９位のプロリンの改変
実施例１で使用したｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６を鋳型として、３３９位のプロリンを他のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてＰＣＲを行った。続いて、ＰＣＲ産物で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨを有したシングルコロニーを、アンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その後、１ｍｌの培養液を摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの当該部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定した。３３９位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｌ、３３９位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｖ、３３９位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ａ、３３９位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｃ、３３９位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｉと命名した。

実施例３ ３３９位のプロリンを他のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製と熱安定性の比較
実施例２で取得したｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｌ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｖ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ａ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｃ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｐ３３９Ｉで形質転換した大腸菌ＤＨ５α・をアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３０℃、１６時間培養しシングルコロニーを取得した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだ５ｍｌＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で１６時間振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。調製した粗酵素液を用いて、１００Ｕ／ｍｌに調整後、上述した活性測定法により熱安定性を測定した。表１にその結果を示す。５０℃、１５分処理後の残存率は、改変前のＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）が８３％であったのに対して、Ｐ３３９Ｌの残存率は９１％、Ｐ３３９Ｖの残存率は９０％、Ｐ３３９Ａの残存率は８８％、Ｐ３３９Ｃの残存率は８７％、Ｐ３３９Ｉの残存率は８５％に向上した。
表１は、改変前のＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）とＰ３３９Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｉ改変体との熱安定性の比較である。

実施例４ 改変型ＦＡＤＧＤＨの標品の作製と熱安定性の比較
実施例３で作製した改変型ＦＡＤＧＤＨの培養液から培養菌体を遠心分離で集菌した後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｐｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨの標品とした。

標品を１００Ｕ／ｍｌに調製し、上記の方法で３３９位のプロリンをロイシンに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を測定した。表２にその結果を示す。５０℃、１５分処理後の残存率は、改変前のＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）が８５％であったのに対して、Ｐ３３９Ｌの残存率は９１％に向上した。
表２は、様々な温度で１５分間処理したときのＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）とＰ３３９Ｌ改変体との熱安定性の比較である。

標品を１００Ｕ／ｍｌに調製し、上記の方法で３３９位のプロリンをロイシンに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を測定した。表３にその結果を示す。５０℃、３０分処理後の残存率は、改変前のＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）が７３％であったのに対して、Ｐ３３９Ｌの残存率は８５％に向上した。
表３は、５０℃で様々な時間で処理したときのＦＡＤＧＤＨ（Ｍｕｔ１）とＰ３３９Ｌ改変体との熱安定性の比較である。

実施例５ 改変型ＦＡＤＧＤＨの標品のｐＨ安定性の比較
実施例４で得た標品についてｐＨ安定性を測定した。ｐＨ４．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ４．５〜５．５：０．１Ｍ 酢酸バッファー、ｐＨ５．５〜７．５：０．１Ｍ リン酸バッファー、ｐＨ７．５〜９．０：０．１Ｍ トリス塩酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を測定値から、残存活性を評価した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図２に示す。図２に示すようにＰ３３９Ｌ改変体はｐＨ８での安定性が向上し、ｐＨ安定域が拡大していることが確認された。
図２は、改変前のＦＡＤＧＤＨ標品（Ｍｕｔ１）とＰ３３９Ｌ改変体標品とのｐＨ安定性の比較である。

本発明による安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを利用することにより、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の使用量の低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献すること大である。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）で表されるタンパク質。
   （ａ）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において、３３９位のアミノ酸がＡ、Ｃ、Ｉ、ＬおよびＶからなる群のうちいずれかに置換されているタンパク質。
   （ｂ）前記（ａ）のタンパク質において、３３９位以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ、５０ｍＭのリン酸緩衝液のみからなる溶液に溶解させたときの５０℃・１５分加熱処理後の残存活性が８５％以上であるタンパク質。
2. 請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
3. 請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
4. 請求項３記載のベクターで形質転換された形質転換体。
5. 請求項４に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタン
   パク質を採取することを特徴とする、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク
   質を生産する方法。
6. 請求項１に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
7. 請求項１に記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
8. 請求項１に記載のタンパク質を含むグルコース測定法。