JP6373088B2 - フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。

グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）は、血糖センサ用の酵素として古くから利用されており、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有している。しかし、グルコースオキシダーゼを用いた測定では、血液中の溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。

一方、溶存酸素の影響を受けない酵素として、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用の酵素として知られている。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは、安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であるといった欠点があり、また、ＰＱＱＧＤＨは、基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するという欠点がある。

このため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、基質特異性にも優れた酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨは、ある程度の熱安定性を有している。しかし、グルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合や、保管時の環境温度が高温になる場合が考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は高い熱安定性を有していることが望ましい。

このため、特許文献１では、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させることにより、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性を有するＦＡＤＧＤＨが得られることが開示されている。また、特許文献２では、さらに熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨとして、Ｔａｌａrｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓなどの好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが開示されている。

国際公開第２００９／１１９７２８号 国際公開第２０１４／０４５９１２号

本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。

〔１〕
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。

（ａ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ） 上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｄ） 上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。

〔２〕
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）由来である、〔１〕に記載のタンパク質。

〔３〕
糖鎖が付加された、〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質。

〔４〕
〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。

〔５〕
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。

（Ａ） 配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、および、
（Ｄ） 上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

〔６〕
〔４〕または〔５〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。

〔７〕
〔４〕または〔５〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。

〔８〕
〔４〕または〔５〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。

〔９〕
〔７〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。

〔１０〕
〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。

〔１１〕
〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。

〔１２〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。

〔１３〕
〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。

本発明によれば、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することができる。

実施例１での縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。 Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。 図２に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。 Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。 実施例３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。（ａ）はＣＢＢ染色した場合、（ｂ）はＰＡＳ染色した場合を示す。 実施例４のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。 実施例５の温度安定性評価におけるＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。 実施例５の温度依存性評価におけるＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。 実施例５の基質特異性評価における相対活性を示す図である。 実施例５のｐＨ安定性評価におけるＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。 実施例５のｐＨ依存性評価におけるＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。

（実施形態１）
本実施形態の発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ） 上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｄ） 上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。

なお、配列番号１は、「野生型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。

シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。

本実施形態のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要ないというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、極めて高い熱安定性を有している。グルコースに対する基質特異性が向上している。

また、本実施形態のタンパク質は、Ｋｍ値が大きいため、レートアッセイ法を用いたグルコース測定において有利である。また、本実施形態のタンパク質は、ｐＨ安定領域が広範囲であるという利点を有している。

また、本実施形態のタンパク質は、グルコースに対する基質特異性が極めて高く、特に２−デオキシ−グルコースに対する反応性が低いため、例えば２−デオキシ−グルコースが混在するような検体を測定する場合であっても、グルコース測定の測定精度を高めることが可能となる。

本実施形態のタンパク質は、好ましくは、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のタンパク質である。このタンパク質については、上述の本発明の効果を奏することが実際に確認されている。

本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。

（実施形態２）
本実施形態の発明は、上記実施形態１のタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。

（Ａ） 配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、および、
（Ｄ） 上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号２は、「野生型のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。

「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエキソンとし、そのエキソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。

また、本実施形態の遺伝子には、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。

ここで、ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、ハイブリダイズの条件としては、「０．０２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で４０〜７０℃」の条件が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温（２５℃）」の条件が挙げられる。ストリンジェントな条件では、配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることが好ましい。

本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１のタンパク質をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。

（実施形態３）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態３の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。

（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが使用できる。

本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態３の組換えベクターで形質転換された酵母が挙げられる。

（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。

所望のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態２の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主に導入される。宿主については、上記実施形態４で説明した宿主と同様である。

宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えば、ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
Ｃｅｌｌ ＢＬ２１；タカラバイオ株式会社）を用いても良い。

こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、酵母の場合、好ましくは２０〜３５℃程度であり、大腸菌の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。

培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。

このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤或
やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。

ＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態２の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によってＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。

（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。

グルコース濃度測定試薬は、実施形態５の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。

グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。

固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。

（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。

恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した糸状菌［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ：ＮＢＲＣ３２０１７）］を対象として、糸状菌からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。

購入した糸状菌は、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の糸状菌からＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。

なお、糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。このため、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。

常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。

本実施例では、縮重ＰＣＲ用のプライマーとして、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーである以下のプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なった。

縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’：配列番号３）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’：配列番号４）、または、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’：配列番号５）
を用いた。

アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’：配列番号６）、または、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’：配列番号７）
を用いた。

なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。

上記３種の糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーのいずれかと上記２種のアンチセンスプライマーのいずれかとの組み合わせを用いた６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。

その結果、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（ＮＢＲＣ３２０１７）のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、約１．５、また約１．６ｋｂのＤＮＡバンドが検出された（図１中の＊印）。なお、図１において、レーンＭはマーカーであり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。

縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓのゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。

（実施例２）
本実施例では、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。

（１）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（ＮＢＲＣ３２０１７）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。

その結果、ＢａｍＨＩのレーンから約７．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約７．０ｋＢのＢａｍＨＩ断片が、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。

次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。ＢａｍＨＩで切断したＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約７．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ
ＰＣＲの鋳型とした。

Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー３２０１７ＧＳＰ３（５’−ＧＡＣＧＴＴＧＣＴＣＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣ−３’）、および、プライマー３２０１７ＧＳＰ５（５’−ＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行なった結果、約６．０ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。

このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことがわかった。

次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー３２０１７ＧＳＰ９（５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴ−３’）と３２０１７ＧＳＰ１０（５’−ＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＧＴＣＡ−３’）を用いてＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。

（２）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。

スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエキソン（エキソン１；３４３ｂｐ、エキソン２；１２１８ｂｐ、エキソン３；２１５ｂｐ）から構成される１７７６ｂｐのＯＲＦ（５９２アミノ酸をコード）を含んでいた(図２の下線部および図３参照）。

図４に、このようにして特定されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。

図４に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１６番目のアラニン（Ａｌａ１６）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図４に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。

（３）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより合成した。

まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７ＧＳＰ１１（５’−ＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴ−３’）と３２０１７Ｅ１Ａ（５’−ＴＧＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＧＴ
ＡＣＴＣＧＴＧＣＣＡＣＣ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７Ｅ２Ｓ（５’−ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡ−３’）と３２０１７Ｅ２Ａ（５’−ＧＧＡＡＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３２０１７Ｅ３Ｓ（５’−ＴＣＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴ−３’）と３２０１７ＧＳＰ１２（５’−ＧＡＣＣＴＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＴ−３’）を用いた。

増幅したエキソン１とエキソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエキソン３とをＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。

次に、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー３２０１７Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡ−３’）および３２０１７Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。

増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。

（４）Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０^−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０^−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。

培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。

（実施例３）
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製され
たＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ； サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ １０−２０％」（アトー株式会社）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ
Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。

また、別途、染色液として、ＰＡＳ（Periodic acid−Schiff stain）染色液を用いる以外は、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＰＡＳ染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。レーン１がタンパク質マーカーであり、レーン２が実施例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品である。なお、（ａ）がＣＢＢベースの染色液を用いた場合、（ｂ）がＰＡＳ染色液を用いた場合の結果である。図５（ａ）に示されるように、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことがわかった。また、図５（ｂ）に示されるように、これらの精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）であることが分かった。

（実施例４）
＜吸収スペクトル計測＞
実施例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）を実施例３での濃度測定値に基づいて希釈し、２ｍｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１５０ｍＭとなるように添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図６（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図６に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図６の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図６の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。

これらの結果から、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）にて発現し、精製されたＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）は、いずれも補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、酵母によって生産された本発明のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。

（実施例５）
本実施例では、実施例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（酵母で発現し、精製された
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（温度安定性、温度依存性、酵素活性（反応速度）、基質特異性、ｐＨ安定性およびｐＨ依存性）に関する評価試験を行った。なお、本実施例における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。

［酵素活性測定原理］
Ｄ−グルコース ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＦＡＤＧＤＨ
→ Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋ ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＰＩＰ
→ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。

［酵素活性の定義］
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。

具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤ_TEST、ΔＯＤ_BLANK）から以下の式により求められる。

ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤ_TEST−ΔＯＤ_BLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）

なお、式中の各定数は、
３．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３ ： ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ^−１・ｃｍ^−１）
０．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。

［活性測定方法］
（１） キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０） １．５ｍＬ
１Ｍ グルコース溶液 ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ 2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ） ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate（1-mPMS） ０．０２１ｍＬ
１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０６ｍＬ
Ｈ_２Ｏ ０．３９９ｍＬ
（２） ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３） ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_TEST）を算出する。
（４） 対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間
あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_BLANK）を算出する。

＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０^−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。

このＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜８０℃の範囲内の数種の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。結果を図７（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図７において、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは６５℃でも約９０％の活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。なお、天然のＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓは糖鎖付加をする真核生物であるため、天然の酵素も高い熱安定性を示すことが推測される。

これらの結果から、本発明のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質は、熱安定性に優れていることが分かる。なお、特許文献２における比較的熱安定性の高いＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨについての同様の熱安定性試験の結果と比べても、本発明のＦＡＤＧＤＨは極めて高い熱安定性を有していることが分かる。

＜温度依存性＞
ここでは、酵素活性の温度依存性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、４℃〜７０℃の範囲で酵素活性を測定し、３７℃での活性を１００（％）としたときの相対活性を求めた。結果を図８（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図８に示されるように、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの活性は、６５℃〜７０℃でピークとなっていた。

＜酵素活性（反応速度）＞
ここでは、酵素活性（反応速度）について検討した。具体的には、実施例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法のグルコース溶液の濃度を０、０．３、１．０、２．９、９．７、２９．０および９６．８ｍＭに変化させた以外は、同様にして酵素活性を測定した。また、比較として好熱性糸状菌であるＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨについて同様に酵素活性を測定した。

測定結果に基づいて、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのそれぞれについて、ラインウィーバーバークプロット（Lineweaver-Burke plot）を作成した。ラインウィーバーバークプロットにおいて、直線のＸ切片が−１／Ｋｍとなるため、グラフからＫｍを求めることができる。

ラインウィーバーバークプロットから求めた実施例２のＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）のＫｍ値は、２．２×１０^３ｍＭであった。一方、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨに対するアミノ酸の相同性が７０％未満）のＫｍ値は、２．６ｍＭであった。この結果から、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）は、Ｋｍが極めて高いことが分かる。なお、一般にＫｍ値が大きい程、酵素と基質が結合し難いと考えられているが、これは、酵素を用いたレート
アッセイ（ｒａｔｅ ａｓｓａｙ）によりグルコース濃度を測定するような場合には有利であり、高感度な測定が可能となる。

＜基質特異性＞
ここでは、ＦＡＤＧＤＨがグルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうかを確認した。まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように変更し、酵素活性を測定した。測定は、図９に示す１５種類の糖類について行った。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、図９にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、０．０と表記した。また、図９中の「ＮＴ」は測定を行っていないことを意味する。

比較として、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕ由来のＦＡＤＧＤＨについても同様の相対活性を算出し、図９に示した。なお、比較のために用いたＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨは、特許文献２の実施例７と同様にしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて製造した精製標品である。なお、実施例２のＦＡＤＧＤＨとＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨとの間のアミノ酸配列の相同性は、５５．３％であった。

図９に示す結果において、実施例２のＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来）は、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨと比べて、Ｄ−グルコース以外の糖類に対する反応性が低く、グルコースに対する基質特異性が向上していることが分かる。特に２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよびＤ−マンノースに対する反応性が低下しており、血中に２−デオキシ−Ｄ−グルコースまたはＤ−マンノースが存在するような場合でも、グルコースの高精度な測定が可能であることが分かる。

＜ｐＨ安定性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ安定性の評価を行った。まず、実施例で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（酵母で発現し、精製されたＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて各精製標品を水で希釈することで、酵素活性が１４Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。

これらのＦＡＤＧＤＨ溶液に対して、所定のｐＨに調整された０．１ＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液を等量混合し、ｐＨを２．０〜１１．０の範囲で変化させた複数の酵素溶液を調製し、各酵素溶液の調製直後の酵素活性を測定した。次に、各試料溶液を２５℃で２０時間インキュベートした後に酵素活性を測定して、インキュベート前の酵素活性に対するインキュベート後の酵素活性の割合（残活性率）を求めた。結果を図１０（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図１０において、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの活性は、ｐＨ２．０〜１１．０の広範囲にわたって安定であった。

＜ｐＨ依存性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ依存性の評価を行った。上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．２Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。ｐＨを４．０〜９．０の範囲で変化させた複数の酵素活性測定溶液を調製し、それぞれ
のｐＨ条件における酵素活性を測定した。最も活性が高かったｐＨ条件における酵素活性を１００（％）とし、他の各ｐＨ条件における酵素活性の比率を相対活性として求めた。結果を図１１（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。

図１１において、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの至適ｐＨはｐＨ５．０〜８．０であることが示された。

Claims (13)

1. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
   （ａ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｂ） 配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
   （ｃ） 上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、および、
   （ｄ） 上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
2. アスペルギルス ビスポラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）由来である、請求項１に記載のタンパク質。
3. 糖鎖が付加された、請求項１または２に記載のタンパク質。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
5. 以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
   （Ａ） 配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （Ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
   （Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、および、
   （Ｄ） 上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと９０％以上の同一性を有し、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 請求項４または５に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
7. 請求項４または５に記載の遺伝子を含む形質転換体。
8. 請求項４または５に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
9. 請求項７に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
10. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
11. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
12. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
13. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。