JP6652757B2 - フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質、該変異型タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。

血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。

グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）は、血糖センサ用の酵素として古くから利用されており、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有している。しかし、グルコースオキシダーゼを用いた測定では、血液中の溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。

一方、溶存酸素の影響を受けない酵素として、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用の酵素として知られている。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは、安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であるといった欠点があり、また、ＰＱＱＧＤＨは、基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するという欠点がある。

このため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、基質特異性にも優れた酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨは、ある程度の熱安定性を有している。しかし、グルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合や、保管時の環境温度が高温になる場合が考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は高い熱安定性を有していることが望ましい。

このため、特許文献１では、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させることにより、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性を有する変異型ＦＡＤＧＤＨが得られることが開示されている。また、特許文献２では、さらに熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨとして、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓなどの好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが開示されている。

国際公開第２００９／１１９７２８号 国際公開第２０１４／０４５９１２号

特許文献２に開示される好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨのうち、特にＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは、耐熱性（熱安定性）に優れている。しかし、本発明者らの分析により、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは、基質親和性が低い（Ｋｍ値が高い）ため、血液中のグルコース濃度付近における酵素活性が低いという問題があることがわかった。

本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。

〔１〕
フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のアミノ酸配列と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓの各々に由来するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する３種の野生型タンパク質のアミノ酸配列とを対比したときに、前記３種の野生型タンパク質の全てに共通するアミノ酸残基に対して相違する前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、他のアミノ酸残基で置換されているか、または、隣の位置に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されていることを特徴とする、変異型タンパク質。
〔２〕
前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔１〕に記載の変異型タンパク質。
〔３〕
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２２２番目、４２３番目、４２５番目および４３４番目のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、他のアミノ酸残基で置換されているか、または、３５６番目と３５７番目の間に１つのアミノ酸残基が挿入されている、〔２〕に記載の変異型タンパク質。
〔４〕
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも２２２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、
前記他のアミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）の残基である、〔３〕に記載の変異型タンパク質。
〔５〕
前記他のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）残基である、〔４〕に記載の変異型タンパク質。
〔６〕
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも４３４番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、
前記他のアミノ酸残基が、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン酸（Ｅ）の残基である、〔３〕に記載の変異型タンパク質。
〔７〕
前記他のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）残基である、〔６〕に記載の変異型タンパク質。
〔８〕
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質をコードする遺伝子。
〔９〕
（Ａ） 塩基配列の６６４〜６６６番目、１２６７〜１２６９番目、１２７３〜１２７５番目、および、１３００〜１３０２番目の塩基の少なくともいずれかが他の塩基に置換されているか、または、１０６６〜１０７７番目の塩基配列のいずれかの位置に塩基が挿入された、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
〔１０〕
〔８〕または〔９〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔１１〕
〔８〕または〔９〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。
〔１２〕
〔８〕または〔９〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１３〕
〔１１〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１４〕
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
〔１５〕
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ。
〔１６〕
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
〔１７〕
〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の変異型タンパク質を用いたバイオ燃料電池。

本発明によれば、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高い、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することができる。

Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。 Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨとＫｍ値の低いＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列を対比して示す図である。 評価試験における実施例１および比較例１のＦＡＤＧＤＨについての酵素活性の測定結果を示すグラフである。 評価試験における実施例２および比較例１のＦＡＤＧＤＨについての酵素活性の測定結果を示すグラフである。 評価試験における実施例３および比較例１のＦＡＤＧＤＨについての酵素活性の測定結果を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。実施形態２以降では実施形態１と共通の事柄についての記述を省略し、異なる点についてのみ説明する。特に、同様の構成による同様の作用効果については実施形態毎には逐次言及しない。

（実施形態１）
本実施形態の発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のアミノ酸配列と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓの各々に由来するフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する３種の野生型タンパク質のアミノ酸配列とを対比したときに、３種の野生型タンパク質の全てに共通するアミノ酸残基に対して相違するＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、他のアミノ酸残基で置換されているか、または、隣の位置に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されていることを特徴とする、変異型タンパク質である。

なお、上記野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなることが好ましい。なお、配列番号１は、「野生型のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。

シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えた後、その少なくとも一部が切除される（成熟タンパク質）。

図２に、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨと、本発明者らによりＫｍ値が特に低いことが分かった糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ、すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒｕｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ（ＮＢＲＣ６９９３）由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ（ＮＢＲＣ５８６１）由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍａｌｉｇｎｕｓ（ＮＢＲＣ８１３２）由来ＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列を対比して示す。なお、図２において黒色の背景に白色の文字で示している部分は、全てのＦＡＤＧＤＨに共通のアミノ酸配列である。

なお、これらの糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、本発明者らによってその存在やアミノ酸配列等が確認されたものであり、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ以外は本願の出願時において公知のものではない。また、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値(基質親和性）、および、上記３種のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ属糸状菌に由来するＦＡＤＧＤＨについてのＫｍ値、酵素活性などの特性も本発明者らの実験により見出された知見であり、本願出願時には公知ではない。

図２（黒色の背景以外の部分）に示される対比から、上記３種のＫｍ値が低い糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨの全てに共通するアミノ酸残基に対して、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のみアミノ酸残基が異なる位置がいくつか存在することが分かる。

したがって、これらの位置のアミノ酸残基の種類が、基質親和性に与える影響が大きいと考えられ、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉに由来する野生型ＦＡＤＧＤＨに対して、これらの位置の少なくともいずれかにおいて変異を導入することで、ＦＡＤＧＤＨ特有の利点と高い耐熱性とを有し、かつ、Ｋｍ値が低い（基質親和性が高い）変異型ＦＡＤＧＤＨを得られることが示唆される。

本発明者らは、後述のように、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉに由来する野生型ＦＡＤＧＤＨに対して、これらの位置のいくつかにおいて変異を導入した変異型ＦＡＤＧＤＨを生産し、基質親和性への影響を確認した。その結果、本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２２２番目、４２３番目、４２５番目および４３４番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する変異、または、３５６番目と３５７番目の間に１つのアミノ酸残基を挿入する変異を導入することで、Ｋｍ値が大幅に低下することを確認した。

したがって、本実施形態の変異型タンパク質（変異型ＦＡＤＧＤＨ）においては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２２２番目、４２３番目、４２５番目および４３４番目のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、他のアミノ酸残基で置換されているか、または、３５６番目と３５７番目の間に１つのアミノ酸残基が挿入されていることが好ましい。この場合、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの中でも特に耐熱性（熱安定性）に優れたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨについて、糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの中でも特にＫｍ値が小さいＦＡＤＧＤＨと対比することで特定された上記４つのアミノ酸残基の少なくともいずれかに変異を導入することで、極めて高い耐熱性と低いＫｍ値（高い基質親和性）とを有する変異型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる。

ただし、上記３種のＫｍ値が低い糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨの全てに共通するアミノ酸残基に対して、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質のみアミノ酸残基が異なる位置の全てについて検討したわけではないため、２２２番目、３５６番目、３５７番目、４２３番目、４２５番目および４３４番目のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基に変異を導入した場合でも、極めて高い耐熱性と低いＫｍ値（高い基質親和性）とを有する変異型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる可能性はある。

また、本発明者らは、後述のように、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、２２２番目のアミノ酸残基の飽和変異体の各々の酵素活性を調べた。その結果、２２２番目のアミノ酸残基をアルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）の残基で置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が野生型ＦＡＤＧＤＨより高くなることが確認された。なお、これらの中でもアルギニン（Ｒ）残基に置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が最も高くなることが確認された。

したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも２２２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている場合、他のアミノ酸残基（置換後の２２２番目のアミノ酸残基）は、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）の残基であり、最も好ましくはアルギニン（Ｒ）残基である。

また、本発明者らは、後述のように、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４３４番目のアミノ酸残基の飽和変異体の各々の酵素活性を調べた。その結果、４３４番目のアミノ酸残基をセリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン酸（Ｅ）の残基で置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が野生型ＦＡＤＧＤＨより高くなることが確認された。なお、これらの中でもセリン（Ｓ）残基に置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が最も高くなることが確認された。

したがって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくとも４３４番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている場合、他のアミノ酸残基（置換後の４３４番目のアミノ酸残基）は、好ましくは、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン酸（Ｅ）の残基であり、最も好ましくはセリン（Ｓ）残基である。

以上説明したとおり、本実施形態の変異型タンパク質（変異型ＦＡＤＧＤＨ）は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性が高く、かつ、基質親和性が高く、酵素活性が高いという優れた特徴を有している。したがって、本実施形態の変異型タンパク質は、グルコース測定を短時間で実施できる点などにおいて有利である。

（実施形態２）
本実施形態の発明は、上記実施形態１の変異型タンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、（Ａ） 塩基配列の６６４〜６６６番目、１２６７〜１２６９番目、１２７３〜１２７５番目、および、１３００〜１３０２番目の塩基の少なくともいずれかが他の塩基に置換されているか、または、１０６６〜１０７７番目の塩基配列のいずれかの位置に塩基が挿入された、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。

配列番号２は、「野生型のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。

「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエクソンとし、そのエクソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。

本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１のタンパク質（アミノ酸配列）をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。

ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換または挿入すること等により、改変（変異型）タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ），ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー）、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する方法、あるいはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する方法が挙げられる。

（実施形態３）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態２の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして、宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。

宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えば、ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１（タカラバイオ）を用いても良い。

（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができる。糖鎖が付加されたタンパク質を生産する場合には、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが使用できる。

本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態３の組換えベクターで形質転換された大腸菌が挙げられる。

（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。

所望のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態２の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして宿主に導入される。宿主については、上記実施形態４で説明した宿主と同様である。

こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培地温度は、微生物が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、宿主が酵母の場合、好ましくは２０℃以上３５℃以下であり、宿主が大腸菌の場合、好ましくは２０℃以上４２℃以下である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常、培養時間は６時間以上７２時間以下である。培地ｐＨは、菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、好ましくはｐＨ５．０以上９．０以下である。

ＦＡＤＧＤＨを生産する微生物を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合、濾過、遠心分離などにより、タンパク質を含有する溶液と微生物とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが微生物の体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により微生物を採取し、次いで、この微生物を機械的方法、または、リゾチームなどを用いた酵素的方法で破壊する。また必要に応じて、微生物を含む液中にＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤などを添加して、ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、溶液としてＦＡＤＧＤＨを分離採取する。

このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。

なお、ＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態２の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によってＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。

（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。

グルコース濃度測定試薬は、実施形態５の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。

グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。

固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。

（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。

恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（比較例１）
本比較例は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、ＮＢＲＣ３１２３２）由来の野生型ＦＡＤＧＤＨであり、特許文献２の実施例２と同様にして大腸菌を用いて製造したＦＡＤＧＤＨの精製標品である。

組換え酵素の大腸菌による発現と精製は次に示す方法により行った。シグナル配列（シグナルペプチドをコードする塩基配列）を切除したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）のマルチクローニングサイトであるＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのサイトで連結することにより、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２）を作製した。

ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２を大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入した。発現型プラスミドを保有 するＢＬＲ（ＤＥ３）をＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した（前培養）。本培養用ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有） に前培養液を１％植菌し、４時間ほど３７℃で好気的に培養した。その後、培地中に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、２５℃で約２０時間培養を続けた。

培養後の大腸菌を集菌し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をＰＢＳに懸濁した。ＰＢＳ緩衝液に懸濁 した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間、４℃）することにより上清（全菌体画分）と沈殿（未破砕菌体） を分離した。全菌体画分をさらに遠心分離（１２０００ｇ、２０分間、４℃）し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ―Ｈｉｓ−ｔａｇ―（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＦＡＤＧＤＨを精製した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ ＭＷＣＯ１０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

なお、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエクソン（エクソン１；３４６ｂｐ、エクソン２；５９８ｂｐ、エクソン３；６１４ｂｐ、エクソン４；２２１ｂｐ）から構成される１７７９ｂｐのＯＲＦ（５９３アミノ酸をコード）を含んでいる。図１に、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７８２ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。これらは、そのクローニング方法や解析方法とともに特許文献２に詳細に開示されている。

なお、本比較例のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析により電気泳動的に純度の高い精製標品であることが確認されている。また、吸収スペクトル分析により、補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されていることが確認されている。

［実施例１］
本実施例では、図１に示されるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの２２２番目のアミノ酸（図１において枠で囲んだＳ）をコードする６６４〜６６６番目の塩基（図１において枠で囲んだＴＣＧ）がＣＧＣに置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ発現型プラスミドの作製を行った。それ以外は、比較例１と同様にして、２２２番目のアミノ酸であるグリシン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）に置換されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

なお、このようなアミノ酸変異を「Ｓ２２２Ｒ」と表記する場合があり、他の変異についても同様に表記する場合がある。

具体的には、シグナル配列を切除したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）のマルチクローニングサイトであるＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのサイトで連結したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２）を鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）および変異導入用プライマーを用いてＰＣＲを行なうことで、Ｓ２２２Ｒの変異型ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むプラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｓ２２２Ｒ）を作製した。変異導入用プライマーとしては、３１２３２Ｓ２２２ＲＳ（５’−ＴＴＣＣＣＧＣＧＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴ−３’）、および３１２３２Ｓ２２２ＲＡ（５’−ＧＡＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＡＴ−３’）を使用した。変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例１に記載した大腸菌における発現と組換え酵素の精製方法により作製した。

なお、作製した当該変異型ＦＡＤＧＤＨは、シグナルペプチドが切除された成熟タンパク質であり、アミノ酸配列における変異アミノ酸残基の番号（２２２番目）は、シグナルペプチドを含めたアミノ酸配列のＮ末端（アミノ末端）のメチオニン（Ｍ）から数えたアミノ酸の番号である。また、変異導入用プライマーは上記変異導入キットのプロトコールに従って設計しており、以下に記載の実施例においても当該プロトコールに従って変異導入プライマーを設計することができる。

なお、本実施例および以下の実施例は、図２を参照して説明した基質親和性に与える影響が大きいと考えられる位置の少なくとも１つに変異を導入した変異型ＦＡＤＧＤＨ（フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する変異型タンパク質）である。

［実施例２］
本実施例では、図１に示されるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、実施例１と同様にして、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの３５６〜３５９番目のアミノ酸（図１において枠で囲んだＳと、その次のＶ、ＡおよびＹ）をコードする１０６６〜１０７７番目の塩基（図１において枠で囲んだＴＣＴがＡＣＣに置換され、かつその次にＴＡＴが挿入され、さらにＧＴＣＧＣＣＴＡＴがＣＴＧＧＧＣＣＡＴに置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ発現型プラスミドの作製を行った。変異導入用プライマーとしては、３１２３２Ｓ３５６ＴＹ／Ｖ３５７Ｌ／Ａ３５８Ｇ／Ｙ３５９ＨＳ（５’−ＡＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＣＣＴＣ−３’）、および３１２３２Ｓ３５６ＴＹ／Ｖ３５７Ｌ／Ａ３５８Ｇ／Ｙ３５９ＨＡ（５’−ＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣ−３’）を使用した。それ以外は、比較例１と同様にして、３５６番目のアミノ酸であるセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）に置換され、かつその次にチロシン（Ｙ）が挿入され、さらに３５７番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）に、３５８番目のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に、３５９番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）に置換された（Ｓ３５６ＴＹ／Ｖ３５７Ｌ／Ａ３５８Ｇ／Ｙ３５９Ｈ）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

なお、本実施例および次の実施例３では、基質親和性に与える影響が大きいと考えられる複数の位置が隣接していたため、連続する複数のアミノ酸残基に同時に変異を導入した。このように、まずは複数の変異を導入した変異型タンパク質を分析し、目的とする効果（活性の上昇）が確認された場合においてのみ、その複数の変異を個々に分析することで、有用な変異体を効率的にスクリーニングすることができる。

［実施例３］
本実施例では、図１に示されるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、実施例１と同様にして、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの４２３〜４２５番目のアミノ酸（図１において枠で囲んだＹと、その前のＩおよびＴ）をコードする１２６７〜１２７５番目の塩基（図１において枠で囲んだＴＡＴと、その前のＡＴＣＡＣＴ）がＣＴＧＧＴＧＡＣＣに置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ発現型プラスミドの作製を行った。変異導入用プライマーには、３１２３２Ｉ４２３Ｌ／Ｔ４２４Ｖ／Ｙ４２５ＴＳ（５’−ＡＴＣ ＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧ−３’）、および３１２３２Ｉ４２３Ｌ／Ｔ４２４Ｖ／Ｙ４２５ＴＡ（５’−ＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＴＣ−３’）を使用した。それ以外は、比較例１と同様にして、４２３番目のアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換され、４２４番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がバリン（Ｖ）に置換され、４２５番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）がトレオニン（Ｔ）に置換された（Ｉ４２３Ｌ／Ｔ４２４Ｖ／Ｙ４２５Ｔ）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

［実施例４］
本実施例では、図１に示されるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の代わりに、実施例１と同様にして、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの４３４番目のアミノ酸（図１において枠で囲んだＧ）をコードする１３００〜１３０２番目の塩基（図１において枠で囲んだＧＧＧ）のうち、１３０１番目と１３０２番目の塩基であるＧがともにＡに置換されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を持つＦＡＤＧＤＨ発現型プラスミドの作製を行った。変異導入用プライマーには、３１２３２Ｇ４３４ＥＳ（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴ−３’）、および３１２３２Ｇ４３４ＥＡ（５’−ＣＣＡＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧ−３’）を使用した。それ以外は、比較例１と同様にして、４３４番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された（Ｇ４３４Ｅ）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

［参考例］
本参考例では、上記実施例と同様にして、表１に示す比較例１および実施例１〜４以外の変異を有するＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の変異型ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。

［評価試験］
実施例１〜実施例４および比較例１（野生型）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（Ｋｍ値、酵素活性、基質特異性、温度安定性）に関する評価試験を行った。なお、本評価試験における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。

（酵素活性測定原理）
Ｄ−グルコース ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＦＡＤＧＤＨ
→ Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋ ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＰＩＰ
→ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。

（酵素活性の定義）
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。

具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤ_TEST、ΔＯＤ_BLANK）から以下の式により求められる。

ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤ_TEST−ΔＯＤ_BLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）

なお、式中の各定数は、
３．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３ ： ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ^−１・ｃｍ^−１）
０．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。

（活性測定方法）
（１）キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０） １．５ｍＬ
１Ｍ グルコース溶液 ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ 2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ） ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate（1-mPMS） ０．０２１ｍＬ
１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０６ｍＬ
Ｈ_２Ｏ ０．３９９ｍＬ
（２） ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３） ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_TEST）を算出する。
（４） 対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_BLANK）を算出する。

＜酵素活性、Ｋｍ＞
ここでは、酵素活性（反応速度）について検討した。具体的には、上記活性測定方法と同様にして、グルコース溶液の濃度を０〜２Ｍの範囲で変化させて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の酵素活性を測定した。

さらに、上記測定結果に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の各々について、ミカエリスメンテンの式に基づいたイーディー−ホフステープロット（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ ｐｌｏｔ）を作成した。イーディー−ホフステープロットにおいて、直線の傾きが−Ｋｍとなるため、グラフからＫｍを求めることができる。なお、Ｋｍはラインウィーバーバークプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ ｐｌｏｔ）により求めることもできる。ラインウィーバーバークプロットにおいて、直線のＸ切片が−１／Ｋｍとなるため、グラフからＫｍを求めることができる。本評価試験では上記２つのプロットを行なった結果、イーディー−ホフステープロットの方が比較的精度の良いＫｍ値が得られたため、イーディー−ホフステープロットにより求めたＫｍ値を記載した。

イーディー−ホフステープロットから求めた実施例１〜４、比較例１および参考例のＦＡＤＧＤＨ精製標品のＫｍ値を表１に示す。また、グルコース溶液の濃度（基質濃度）が３００ｍＭであるときの酵素活性を併せて表１に示す。なお、表１において、活性（Ｕ／ｍｇ）は酵素１ｍｇあたりの活性であり、活性（Ｕ／μｍｏｌ−ＦＡＤ）は、酵素に結合しているＦＡＤ（ホロ化酵素）１μｍｏｌあたりの活性である。

＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、実施例で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０^−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。

このＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜７０℃の範囲内の所定の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。実施例１〜４、比較例１および参考例のＦＡＤＧＤＨ精製標品において変性の中点の温度の（Ｔｍ）を算出した結果を表１に併せて示す。

表１のＫｍの測定結果から、実施例１〜４の変異型タンパク質（変異型ＦＡＤＧＤＨ）のＫｍ値は、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも著しく低下していることが分かる。なお、酵素のＫｍ値が小さいほど、酵素の基質親和性が高いことを意味する。

さらに、グルコース溶液の濃度（基質濃度）が３０ｍＭであるときの相対活性（ＦＡＤ１μｍｏｌあたりの酵素活性について、野生型ＦＡＤＧＤＨを１００％としたときの比率）を図３に示す。

図３に示す結果から、実施例１〜４の変異型ＦＡＤＧＤＨの相対活性は、実際に測定される血中のグルコース濃度に近い３０ｍＭの基質濃度において、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも優位に上昇していることが分かる。さらに、Ｔｍの測定結果から、実施例１〜４の変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨと同程度の耐熱性を維持していることが分かる。

次に、実施例２および実施例３は、上記のとおり複数の位置に同時に変異を導入したものであるため、個々の位置について上記と同様の評価試験を行った。すなわち、表２に示される個々のアミノ酸変異を導入した変異型ＦＡＤＧＤＨを上記実施例と同様にして生産し、その各々の変異型ＦＡＤＧＤＨについてＫｍ、Ｔｍ等の測定を行った。測定結果を表２に示す。

表２に示される結果から、実施例２で導入した複数の変異のうち、「Ｓ３５６ＳＹ」変異３５６番目のセリン（Ｓ）残基と３５７番目のロイシン（Ｌ）残基との間にチロシン（Ｙ）残基を挿入する変異がＫｍ値の低下（基質親和性の向上）に最も寄与することが分かる。また、この場合でも比較例１の野生型と同程度の高い耐熱性を維持していることが分かる。したがって、３５６番目のセリン（Ｓ）残基と３５７番目のロイシン（Ｌ）残基との間にチロシン（Ｙ）残基を挿入する変異を導入することで、耐熱性が高く、かつＫｍ値が低い変異型ＦＡＤＧＤＨを得ることができると考えられる。

また、表２に示される結果から、実施例３で導入した複数の変異のうち、「Ｙ４２５Ｔ」変異（４２５番目のチロシン（Ｙ）残基をトレオニン（Ｔ）に置換する変異）がＫｍ値の低下（基質親和性の向上）に最も寄与することが分かる。また、この場合でも比較例１の野生型と同程度の高い耐熱性を維持していることが分かる。また、「Ｉ４２３Ｌ」変異（４２３番目のイソロイシン（Ｉ）残基をロイシン（Ｌ）残基に置換する変異）においては、Ｋｍ値が改善しただけでなく、酵素１ｍｇあたりの活性とＦＡＤ１μｍｏｌあたりの活性が大幅に上昇した。したがって、４２３番目のロイシン（Ｌ）残基、または４２５番目のチロシン（Ｙ）残基に変異を導入することで、耐熱性が高く、かつＫｍ値が低い変異型ＦＡＤＧＤＨを得ることができると考えられる。

次に、セリン（Ｓ）残基をアルギニン（Ｒ）残基に置換した変異においてＫｍ値が低下した２２２番目のアミノ酸残基において、セリン（Ｓ）残基とアルギニン（Ｒ）残基以外のアミノ酸残基に置換した変異体の中からＫｍ値や活性などがより優れている変異体の探索を行なうために、２２２番目のセリン（Ｓ）残基をランダムに他のアミノ酸残基に置換する部位特異的飽和変異導入を行なった。この方法は、エラープローンＰＣＲによるタンパク質全体へのランダムな変異導入と比較して、タンパク質の機能に関わる重要な特定のアミノ酸残基へランダムに変異を導入できるという利点がある。

具体的には、実施例１と同様の方法を用いており、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミド（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２）を鋳型にして、飽和変異導入用プライマーを用いてＰＣＲを行なうことで、２２２番目のセリン（Ｓ）残基を他のアミノ酸残基にランダムに変異が導入されたプラスミドのライブラリー（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｓ２２２Ｘ）を作製した。飽和変異導入用プライマーには、３１２３２Ｓ２２２ＸＳ（５’−ＴＴＣＣＣＧＮＮＫＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴ−３’）、および３１２３２Ｓ２２２ＸＡ（５’−ＧＡＣＣＧＴＭＮＮＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＡＴ−３’）を使用した。なお、当該プライマーの配列中にあるＮはアデニン（Ａ）塩基、グアニン（Ｇ）塩基、シトシン（Ｃ）塩基、チミン（Ｔ）塩基のいずれかで構成される。また、Ｋはグアニン（Ｇ）塩基またはチミン(Ｔ)塩基で構成され、Ｍはシトシン（Ｃ）塩基またはアデニン（Ａ）塩基で構成される。

また、グリシン（Ｇ）残基をグルタミン酸（Ｅ）残基に置換した変異においてＫｍ値が低下した４３４番目のアミノ酸残基において、グリシン（Ｇ）残基とグルタミン酸（Ｅ）残基以外のアミノ酸残基に置換した変異体の中からＫｍ値や活性などがより優れている変異体の探索を行なうために、４３４番目のグリシン（Ｇ）残基をランダムに他のアミノ酸残基に置換する部位特異的飽和変異導入を行なった。

具体的には、上記と同様の方法で４３４番目のグリシン（Ｇ）残基を他のアミノ酸残基にランダムに変異が導入されたプラスミドのライブラリー（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｇ４３４Ｘ）を作製した。飽和変異導入用プライマーには、３１２３２Ｇ４３４ＸＳ（５’−ＧＣＧＧＣＣＮＮＫＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴ−３’）、および３１２３２Ｇ４３４ＸＡ（５’−ＣＣＡＧＴＡＭＮＮＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧ−３’）を使用した。

当該方法で作製したプラスミドのライブラリー（ｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｓ２２２ＸまたはｐＥＴ−２１ｂ（＋）＿３１２３２Ｇ４３４Ｘ）を大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入し、ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した。形成された無数のコロニーの中から、無作為にコロニーを選択し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注したＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に植菌し、振とう撹拌しながら一晩培養した。また、９６ウェルプレートの各ウェルに植菌した同コロニーは、ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に再度植菌し、この大腸菌（大腸菌クローン）からプラスミドを単離精製するためのマスタープレートとした。９６ウェルプレートによる培養後、９６ウェルプレート中の培養液を遠心分離（２５００ｇ、１０分間、室温）により上清画分と沈殿画分（大腸菌）に分け、上清画分を取り除いた。９６ウェルプレートの各ウェル中の沈殿画分を、リコンビナントリゾチーム（ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｒｅ）を終濃度１ＫＵ／ｍＬで添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｒｅ）５０μＬに懸濁し、２５℃で２０分間振とう撹拌を行なうことで大腸菌を溶菌した。振とう後、遠心分離（２５００ｇ、１０分間、室温）により上清画分（粗抽出液）を回収し、粗抽出液のグルコース脱水素酵素活性を５０ｍＭグルコース存在下で測定した。活性を測定した粗抽出液のうち、上記と同条件で調製したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨが含まれる粗抽出液の１５０％程度以上の活性が得られたものにおいて、マスタープレートに形成された該当する大腸菌クローンのコロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に植菌し、振とう撹拌による培養を一晩行なった。培養後、菌体からＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドのＦＡＤＧＤＨ遺伝子に対してＤＮＡシークエンス解析を行ない、２２２番目または４３４番目に変異が導入されたアミノ酸残基をコードする塩基配列を確認した。

上記により作製したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉＦＡＤＧＤＨの変異体が含まれる粗抽出液のグルコース脱水素酵素活性の測定結果を、野生型（Ｓ２２２、Ｇ４３４）の活性を１００％としたときの相対活性として図４および図５にそれぞれ示す。なお、図４中のＳ２２２Ｘは、実施した大腸菌クローンの各粗抽出液の活性の平均値（３１０クローン）を示す。図５中のＧ４３４Ｘは、実施した大腸菌クローンの各粗抽出液の活性の平均値（３２０クローン）を示す。

その結果、２２２番目のアミノ酸残基をアルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）の残基で置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が野生型ＦＡＤＧＤＨより高くなることが示唆された。

また、４３４番目のアミノ酸残基をセリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）またはグルタミン酸（Ｅ）の残基で置換した場合に、変異型ＦＡＤＧＤＨの酵素活性が野生型ＦＡＤＧＤＨより高くなることが示唆された。

次に、上記により得られた２２２番目および４３４番目に変異が導入されたＦＡＤＧＤＨを比較例１に記載した方法で大腸菌発現および精製を行ない、Ｋｍ、Ｔｍ等の測定を行ない、その結果を表３および表４にそれぞれ示す。

表３に示されるＫｍ値の結果は、１０種類の変異体すべてでＫｍ値が低下したことを示している。なお、表３に示されるＴｍの結果から、実施例１の置換後のアミノ酸残基を変更した場合でも、比較例１の野生型と同程度の高い耐熱性を維持していることが分かる。

表４に示されるＫｍ値の結果は、８種類の変異体のうち７種類でＫｍ値が低下したことを示している。また、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｈ、Ｇ４３４Ａ、Ｇ４３４Ｃなどにおいては、３００ｍＭグルコース存在下における活性が大きく上昇した。なお、表４に示されるＴｍの結果から、実施例２の置換後のアミノ酸残基を変更した場合でも、比較例１の野生型と同程度の高い耐熱性を維持していることが分かる。

＜基質特異性＞
ここでは、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨ、実施例１〜４の変異型ＦＡＤＧＤＨ、および、上記表２〜表４に示されるアミノ酸変異が導入された変異型ＦＡＤＧＤＨについて、基質特異性（グルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうか）を確認した。

具体的には、まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように調製し、酵素活性を測定した。測定は、表５に示す４種類の糖類について行った。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、表５〜表８にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、「Ｎ．Ｄ．」（Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。また、各表ごとに野生型の評価実験を行なったため、比較例１の結果は各表の間で必ずしも一致していない。

表５〜表９に示される結果から、一部でＤ−キシロースに対する反応性が高いものがあるものの、それ以外の変異型ＦＡＤＧＤＨは、比較例１の野生型ＦＡＤＧＤＨと同様に、グルコースに対する基質特異性が最も高く、ガラクトースやマンノースと反応しないことが分かる。

今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

Claims (17)

1. フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有し、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
   前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
   前記配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
   （ａ）２２２番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）で置換された変異、
   （ｂ）４２３番目のアミノ酸残基が、ロイシン（Ｌ）で置換された変異、
   （ｃ）４２５番目のアミノ酸残基が、トレオニン（Ｔ）で置換された変異、
   （ｄ）４３４番目のアミノ酸残基が、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）またはメチオニン（Ｍ）で置換された変異、および、
   （ｅ）３５６番目と３５７番目のアミノ酸残基の間にチロシン（Ｙ）が挿入された変異、
   の少なくとも１つを含む変異型タンパク質。
2. フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有し、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質に変異を導入してなる変異型タンパク質であって、
   前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来野生型タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
   前記配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４３４番目のアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）で置換され、かつ、
   （ａ）２２２番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）で置換された変異、
   （ｂ）４２３番目のアミノ酸残基が、ロイシン（Ｌ）で置換された変異、
   （ｃ）４２５番目のアミノ酸残基が、トレオニン（Ｔ）で置換された変異、および、
   （ｄ）３５６番目と３５７番目のアミノ酸残基の間にチロシン（Ｙ）が挿入された変異、
   の少なくとも１つを含む変異型タンパク質。
3. 前記２２２番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）残基である、請求項１または２に記載の変異型タンパク質。
4. 前記４３４番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）残基である、請求項１に記載の変異型タンパク質。
5. 前記４２３番目のアミノ酸残基が、ロイシン（Ｌ）である、請求項１または２に記載の変異型タンパク質。
6. 前記４２５番目のアミノ酸残基が、トレオニン（Ｔ）である、請求項１または２に記載の変異型タンパク質。
7. 前記３５６番目と前記３５７番目の間にチロシン（Ｙ）が挿入されている、請求項１または２に記載の変異型タンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型タンパク質をコードする遺伝子。
9. （Ａ） 塩基配列の６６４〜６６６番目のＴＣＧがＣＧＣに、１２６７〜１２６９番目のＡＴＣがＣＴＧに、および、１２７３〜１２７５番目のＴＡＴがＡＣＣに置換された変異のうち少なくともいずれかを有するか、または、１０６８番目の塩基の後ろにＴＡＴが挿入された、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （Ｂ） 塩基配列の１３００〜１３０２番目のＧＧＧがＧＡＡに置換された変異を有し、かつ、
   塩基配列の６６４〜６６６番目のＴＣＧがＣＧＣに置換された変異、１２６７〜１２６９番目のＡＴＣがＣＴＧに置換された変異、１２７３〜１２７５番目のＴＡＴがＡＣＣに置換された変異、および、１０６８番目の塩基の後ろにＴＡＴが挿入された変異のうち少なくともいずれかを有する、
   配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
   （Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ
   からなり、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
10. 請求項８または９に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
11. 請求項８または９に記載の遺伝子を含む形質転換体。
12. 請求項８または９に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
13. 請求項１１に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
14. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
15. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたグルコースセンサ。
16. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
17. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を用いたバイオ燃料電池。