JP2008154572A - 糸状菌由来グルコース脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
基質特異性の優れた糸状菌由来グルコース脱水素酵素を遺伝子組み換えにて工業的に大量生産する方法を提供する。
【解決手段】
糸状菌由来のグルコース脱水素酵素の遺伝子を挿入した発現ベクターにて形質転換した宿主を培養する際、培養時のｐＨを７．３以下に制御するか、および／または単位体積あたりの酸素移動速度を１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以下に制御する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素（以下ＧＤＨと略すこともある）を遺伝子組み換えで生産する方法に関するものである．特に前記酵素を高発現させるための培養方法に関するものである。

血中グルコース量は糖尿病の重要なマーカーであり，特に血糖自己測定は，糖尿病患者が通常の自己の血糖値を把握し治療に生かすために重要である．血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている．そのような酵素の例としては，例えばグルコース酸化酵素（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる．グルコース酸化酵素はグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されてきたが、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされ、その反応で生じたプロトンが酸素にとられるため反応液中の溶存酸素の影響を受け易いという問題があった。

このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコース脱水素酵素（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられるようになった。これらの酵素は溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコース脱水素酵素は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性があり、後者のピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素も、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性に欠けるという欠点を有していた。

こうしたグルコース脱水素酵素に対して、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤと略す）を補酵素とするグルコース脱水素酵素が知られている（非特許文献１〜６および特許文献１）。
Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （１９６７）２４２：３６６５−３６７２ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９６）５６：３０１−３１０ ＷＯ ２００４／０５８９５８

これらのＦＡＤを補酵素とするＧＤＨは古くから知られており、なかでも糸状菌に由来するＧＤＨ（非特許文献１〜４および特許文献１）は、グルコースに対する基質特異性に優れ、溶存酸素の影響を受けず、しかもマルトースに対する作用性が低いといった優れた特性を有している。

しかしながら、これらの糸状菌に由来するＧＤＨは野生型微生物の培養物から単離、抽出されたものであり、その生産量には限りがあり、到底工業的に利用し得るものではなかった。

そこで当然ながら遺伝子組み換えでの大量生産を目指して、常法によりこれら糸状菌由来ＧＤＨの遺伝子がクローニングされ、大腸菌、酵母などの宿主・ベクター系を用いての製造が検討された（特許文献２）。
ＷＯ ２００６／１０１２３９

遺伝子組み換えでタンパク質を生産する場合、通常は取扱いが容易であることから、前記のような大腸菌、酵母が宿主として用いられることが多い。こういった好気的微生物の培養において、目的とするタンパク質を高い収量で取得するためには、培養に影響を与える種々の因子を最適化する必要がある。それらの因子としては一般的に、培地成分、培養温度、通気攪拌速度、ｐＨなどの因子が挙げられる。これらの因子の内、通気攪拌速度については好気的微生物であることから通常培養液中の溶存酸素が十分な条件で培養するのが一般的である。

そのような例として、特許文献３には、大腸菌を宿主とする遺伝子組み換え菌の培養において、溶存酸素を３ｐｐｍ以上の条件で培養することが記載されている。また特許文献４には、リパーゼ遺伝子で形質転換させたピキア属酵母を溶存酸素２０％飽和以下で培養することが記載されている。さらに特許文献５には、Ｎ末端にメチオニンの付加していない組み換えタンパク質の製造において、培養液中の溶存酸素濃度を１ｐｐｍ以下に制御する培養方法が記載されている。特許文献６は好気的微生物であっても培養液中の溶存酸素を制限して培養する方法の一例である。しかしながら、本発明の糸状菌由来のＧＤＨのように（配列番号１１）、Ｎ末端にメチオニンが付加している場合については報告されていなかった。
特開昭６３−１５７９７４ 特開平０８−２２８７７９ 特開２００２−２５３２７０

本発明の目的は、より工業的な実用レベルの生産性を有する糸状菌由来ＧＤＨの製造方法を提供することである。さらにより具体的には、糸状菌由来のＧＤＨ遺伝子により形質転換された宿主微生物の培養を制御することにより、極めて高い収量で糸状菌由来ＧＤＨを取得することである。

本発明者らは、上記目的を達成するために、糸状菌由来ＧＤＨ遺伝子により形質転換させた宿主微生物の培養条件を様々な角度から検討したところ、本酵素の場合、培養時のｐＨを７．３以下に制御することにより高い生産性を達成できることを見出した。また、通気攪拌速度について詳細に検討を進めたところ、好気的な宿主微生物であっても、培養液への酸素供給を制限する制御を行うことにより、目的酵素が著量生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、糸状菌由来のＧＤＨを製造する方法であって、当該酵素のＤＮＡを挿入した発現ベクターで形質転換した宿主微生物を培養する際、培養時のｐＨを７．３以下に制御するか、および／または培養液の酸素移動速度を単位体積あたり１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以下に制御する培養方法を提供する。また、さらに好ましくは前記酸素移動速度を０．１から０．８μｍｏｌ／ｍｌ・分の間に制御する培養方法を提供し、より好ましくは０．１から０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分の間に制御する培養方法を提供するものである。

本発明により、糸状菌由来のＧＤＨを工業的なレベルで高収量に生産することが可能になり、血糖自己測定用として市場に流通しているグルコースセンサであって、グルコースに対して極めて高い特異性を有するグルコースセンサの製造が可能になった。

本発明に用いる糸状菌とは一般的に「カビ」と俗称される微生物であって、菌糸が分岐して菌糸体を形成し、葉緑素を有しない一群の微生物を示しており、生物分類学上では菌類の中の真菌類を構成する生物群から、出芽によって無性生殖を行う酵母類を除外した一群の生物を指している。その一例を挙げると、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ムコール属などが挙げられ、本発明に使用する糸状菌として特に好ましいのは、アスペルギルス属の糸状菌である。

これらの糸状菌からＧＤＨの遺伝子を取得するには、公知の遺伝子クローニングの手法を組み合わせることによって容易に可能である。例えばＧＤＨを生産するペニシリウム属の培養液から酵素を高純度に精製した後、タンパク質の部分アミノ酸配列を決定し、決定した部分アミノ酸配列から作製したプローブを用いて元のペニシリウム属菌のｃＤＮＡライブラリからＧＤＨ遺伝子を取得することができる。こうして得られたＧＤＨ遺伝子を利用すれば例えば他の糸状菌、例えばアスペルギルス属の糸状菌から同様にしてＧＤＨ遺伝子も取得することができる。また、アウペルギルス属の１種であるアスペルギルス・オリゼ株ではゲノム配列が公開されているため、ホモロジー検索によってＧＤＨ遺伝子を検索することが可能であり、検索された配列を利用してアスペルギルス・オリゼ株のｃＤＮＡライブラリから同様にしてＧＤＨ遺伝子を取得できる。本発明においては、特にアスペルギルス属由来のＧＤＨ遺伝子を用いるのが好ましい。

このようにして得られたＧＤＨ遺伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させてＧＤＨを生産する形質転換体とする。ここで宿主としては特に限定するものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの内でもその宿主・ベクター系が良く検討されており、取扱いが容易である、大腸菌、酵母が特に好ましい。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどが用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリスなどが例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。

ＧＤＨ遺伝子にて形質転換させた宿主を培養する方法としては、回分培養、連続培養、流加培養などの方法であればいずれでも良いが、特に好ましいのは回分培養である。回分培養では初発培地で栄養条件が制限される閉鎖系の培養となるため、培養温度、培養時ｐＨ、通気撹拌条件などの生物工学的な条件が培養を成功させるための重要な因子となる。

このような培養の培地としては、一般微生物の通常の培養に使用される炭素源、窒素源、有機ないしは無機塩等を適宜含む培地を使用することができる。炭素源としては、グルコース、グリセリン、マルトース、デンプン、デキストリン、シュークロース、動植物油、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、およびアンモニア、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等の有機または無機の窒素源等が挙げられる。なお、天然有機窒素源は窒素源であるとともに炭素源にもなりうる。有機ないし無機塩としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩類、酢酸塩類、リン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素１カリウム、リン酸水素２カリウム、リン酸水素１ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム等を挙げることができる。培地のｐＨを調節する目的で有機または無機の酸、アルカリ等を加えてもよく、消泡の目的で油脂類、表面活性剤等を適量加えてもよい。

ＧＤＨを工業的に生産するには、上記のようにして調整した培地を数十リットル以上の規模の培養槽に投入し、加熱殺菌を行い、前記の形質転換体を接種して通気撹拌培養を行う。ここで培養温度は、形質転換体である宿主が生育可能な範囲から選択することができるが、例えば約２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃の範囲が挙げられる。

本発明においては、培養時のｐＨを７．３以下に制御する。培養時のｐＨを制御するには、通常、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウムなどの酸、アルカリ溶液を必要により希釈、加熱殺菌して培養槽に適宜添加して行われる。糸状菌由来ＧＤＨの生産においては、培養の経過とともにｐＨの上昇が起こるため、酸の添加によりｐＨを７．３以下になるように制御する。

本発明において、より好適に実施するには、ｐＨを７．３以下に制御することに加えて、培養液の酸素移動速度を単位体積あたり１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以下、好ましくは０．１から０．８μｍｏｌ／ｍｌ・分以下、さらに好ましくは０．１から０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分以下に制御する。本発明ではｐＨを７．３以下に制御するか、酸素移動速度を単位体積あたり１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以下に制御するかのいずれによっても良いが、この両者をともに実施することがより好ましい。

本発明を、糸状菌由来ＧＤＨを組換え生産する方法においてより好適に実施するには、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることができる。変異の形態としては、たとえば、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換する変異を行えばよい。
シグナルペプチドは、成熟型タンパク質のＮ末端に残基数１５〜３０個に及ぶ延長ペプチドとして存在する。該ペプチド配列中には、疎水性アミノ酸領域を持ち、新生ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過に先導役を務め、膜通過後は切断されるものである。

さらに具体的には、配列番号２、４、１０、１２のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させればよい。また、配列番号２、４、１０、１２のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列に、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うよう変異させてもよい。
発現の際には、遺伝子ＤＮＡはＧＤＨの発現をさらに向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものであってもよい。

本発明における糸状菌由来のＧＤＨ組換え体は特に限定されるものではないが、アスペルギルス属やペニシリウム属などをＧＤＨ遺伝子の給源としたＧＤＨ組換え体が例示できる。好ましくはアスペルギルス属のＧＤＨであり、さらに好ましくはアスペルギルス・オリゼである。最も好ましくは配列番号４、１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨが例示できる。

これらＧＤＨ組換え体は、該ＧＤＨをコードする遺伝子をＰＣＲ法にて入手し、この遺伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化してＧＤＨを含む水溶性画分として得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。

本発明においては、ＧＤＨのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することによりシグナルペプチドの機能を低下できる。
例えば、配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨでは、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除することによりシグナルペプチドの機能を低下することができる。あるいは、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことによっても可能である。
具体的な置換位置は例えばシグナルペプチド切断部が例示できる。好ましくはシグナルペプチドのＣ末端に相当するアラニンを他のアミノ酸に置換することにより、機能低下が可能である。

該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液１ｍｌあたりの総活性値を比較して確認することが出来る。また、シグナルペプチド配列の改変は、エドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸シーケンスにより確かめることができる。

本発明において培養槽の酸素移動速度とは、培養液の温度、培養槽内の圧力、通気撹拌条件によって定まり、次のようにして測定する（「発酵工学の基礎」：Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ著、学会出版センター）。
＜亜硫酸酸化法による酸素移動速度の測定＞
亜硫酸ソーダを銅またはコバルト触媒の存在下で硫酸ソーダに酸化する速度を測定して酸素移動速度を求める方法であり、この系では亜硫酸の酸化速度と酸素移動速度は等しいとする。まず、培養槽に１ｍＭの銅イオンを加えた０．５Ｍの亜硫酸ソーダ液を張り込み、一定の速度で通気撹拌する。一定時間毎に液のサンプリングを行い、直ちに過剰のヨウ素液を加え、未反応の亜硫酸をヨウ素と反応させ、チオ硫酸ソーダで逆滴定して、その滴定量を時間に対してプロットすれば、その勾配から酸素移動速度が求められる。実際には、使用する培養槽に対して、種々の通気撹拌条件における酸素移動速度を求めておき、該当する通気撹拌条件を設定することにより、その条件による培養槽の酸素移動速度が決定される。

本発明において、糸状菌由来のＧＤＨの酵素量はその酵素活性をもって表すことができる。具体的にはＧＤＨ活性の測定は次のようにして行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ−グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。

＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義される。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．０×希釈倍率｝／（１６．３×０．１×１．０）

なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．８は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

なお、本発明者らは、大収量のＧＤＨタンパク質を取得するために鋭意努力した結果、上記目的を達成するために、まずその改変の元になる遺伝子ＤＮＡとして、先の発明でアスペルギルス・オリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出している。

本発明者らは、ＮＣＢＩのデータベースを利用し、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出した。

本発明者らは、非特許文献１〜４、ＮＣＢＩのデータベースなどから、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の同定は容易になしうると予想していた。そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献１〜４に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、ＧＤＨをコードする遺伝子を単離することを試みた。

本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼ培養上清から、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の１つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。

また、本発明者らは他起源のＧＤＨ遺伝子の取得についても種々検討し、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）由来のＧＤＨをコードする遺伝子、およびアスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細も実施例に後述する。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＮＣＢＩのデータベースから予測される、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列からイントロンを除去したものである。配列番号２はその対応アミノ酸配列である。

配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、ＮＣＩＢのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。

配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルス・オリゼ ＴＩ株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。配列番号４はその対応アミノ酸配列である。また、
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。

配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。また、
配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。

後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。

アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実験例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。

そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実験例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実験例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実験例１［５］）、取得した。

＜実験例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなっているのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。

［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。

［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。

［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号１５）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号１６）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。

［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。

＜実施例１＞
アスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素（以下ＡＴＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入
ＡＴＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・テレウスの菌体（寄託番号ＮＢＲＣ ３３０２６として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。）よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号１３，１４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてＡＴＧＤＨ遺伝子（予想シグナルペプチド配列を除去した遺伝子配列）を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＴＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１１）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５６８アミノ酸（配列番号１２）であった。

＜実施例２＞
実施例１で得た形質転換体を、培養温度２８℃にて、単位体積あたりの酸素移動速度を０．１から１．５（μｍｏｌ／ｍｌ・分）の範囲で１０Ｌ容ジャーファーメンターにてＴＢ培地で１〜４日間液体培養した。なお、この実施例では培養時のｐＨを７．３以下に制御することは特に行わなかった。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を測定した。それぞれの酸素移動速度における菌体量，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を図１〜６に示す。この図に示すように、ＧＤＨの生成量は酸素移動速度を０．１〜０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分の間に制御した場合に最大に達することが判明した。また、ＧＤＨの生成が良好に維持される限界の酸素移動速度は１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分付近に存在すること、１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分を超えると急激に低下することも明らかになった。

＜実施例３＞
アスペルギルス・オリゼ由来のグルコース脱水素酵素（以下ＡＯＧＤＨと略する）の遺伝子を取得するために、まず同じ糸状菌であるペニシリウム属の１菌種を培養して、その培養液からＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製酵素を得た。次にこの精製酵素をＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼにて部分分解した後電気泳動でペプチド断片を単離した。ついで単離したペプチドのアミノ酸配列をペプチドシーケンサーにて決定した。一方、前記のペニシリウム属菌から常法により取得したｃＤＮＡをテンプレートとして、前記ペプチドの部分アミノ酸配列を元に作製したデイジェネレートプライマーを用いてＰＣＲを実施したところ約１．４Ｋｂの増幅産物が得られた。この増幅産物を精製して、精製ＤＮＡ断片をＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡績製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡績製）を用いてプラスミドを精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号１３、１４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンぺレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１１）。（ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号１２）

＜実施例４＞
実施例３で得られた形質転換体を実施例２と同様に、単位体積あたりの酸素移動速度を０．５から１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分の範囲で、１０Ｌ容ジャーファーメンターにてＴＢ培地で３日間培養した。なお、この場合も特に培養時のｐＨの制御は行わなかった。その培養経過を図７〜９に示す。この図に示すように、アスペルギルス・オリゼでは、ＧＤＨの生成量は単位体積あたりの酸素移動速度は０．５から０．７５μｍｏｌ／ｍｌ・分の範囲で最大になることが示され、１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以上では急激に低下することが判明した。

＜比較例１＞
アスペルギルス・テレウス野生株を液体培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ_４ ・７水和物、２％グルコース、０．０５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）にて、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて３０℃、１日間培養し、菌体内のＧＤＨ活性を測定したところ、約０．１Ｕ／ｍｌであった。

本発明は、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素を遺伝子組み換えにより工業的なレベルで大量に取得することを可能にする。また、血糖測定のためのグルコースセンサにおいて基質特異性に優れたセンサの開発に適したグルコース脱水素酵素を提供することが可能になる。

アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．１μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．３μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．７５μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、１．５μｍｏｌ／ｍｌ・分の条件にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、０．７５μｍｏｌ／ｍｌ・分にて培養した時の培養経過を示している。 アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子にて形質転換した大腸菌を、単位体積あたりの酸素移動速度をそれぞれ、１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分にて培養した時の培養経過を示している。

Claims (5)

1. 糸状菌由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の製造において，前記酵素の遺伝子を挿入した発現ベクターにより形質転換された宿主を培養する際に，培養時のｐＨを７．３以下に制御するか，および／または培養液の酸素移動速度を単位体積あたり１．０μｍｏｌ／ｍｌ・分以下に制御することを特徴とする糸状菌由来ＧＤＨの製造方法。
2. 酸素移動速度を単位体積あたり０．１から０．８μｍｏｌ／ｍｌ・分の間に制御することを特徴とする請求項１記載の糸状菌由来ＧＤＨの製造方法。
3. 酸素移動速度を単位体積あたり０．１から０．５μｍｏｌ／ｍｌ・分の間に制御することを特徴とする請求項１記載の糸状菌由来ＧＤＨの製造方法。
4. 糸状菌がアスペルギルス属である請求項１から請求項３に記載の糸状菌由来ＧＤＨの製造方法。
5. 糸状菌由来のＧＤＨの遺伝子が配列番号１１に記載の遺伝子である請求項１から請求項３に記載の糸状菌由来ＧＤＨの製造方法。

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