WO2010140431A1 - フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ Download PDF

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WO2010140431A1
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WO
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flavin
glucose dehydrogenase
binding
gdh
glucose
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PCT/JP2010/056899
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遼子 田嶋
敦 一柳
惠一 市川
吉村　太郎
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キッコーマン株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to a novel flavin-binding glucose dehydrogenase having a flavin compound as a coenzyme, and a method for producing the same.
  • Blood glucose level is an important marker of diabetes.
  • SMBG self-monitoring blood glucose
  • enzymes using glucose as a substrate such as glucose oxidase (GOD)
  • GOD glucose oxidase
  • GOD glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD nicotinamide dinucleotide
  • NADP nicotinamide dinucleotide phosphate
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD (P) -GDH has the problem that the stability of the enzyme is poor and the addition of a coenzyme is necessary, and PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • PQQ-GDH has a low substrate specificity, and other than glucose to be measured.
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose
  • sugar compounds other than glucose in the measurement sample affect the measurement value, and an accurate measurement value cannot be obtained. There is a point.
  • Non-Patent Documents 2 to 5 do not have a detailed description on substrate specificity, but there are reports on GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose glucose dehydrogenase (FAD-GDH) using flavin adenine dinucleotide (FAD) derived from the genus Aspergillus as a coenzyme, and Patent Document 4 reduces the activity on D-xylose.
  • FAD-GDH derived from the genus Aspergillus has been disclosed.
  • Patent Documents 1 to 4 describe FAD-GDH that has low reactivity with one or several sugar compounds that are not D-glucose, but any one of maltose, D-galactose, and D-xylose.
  • no flavin-binding GDH has been known that has sufficiently low reactivity.
  • a flavin-binding GDH capable of accurately measuring the glucose concentration under the conditions in which D-glucose, maltose, D-galactose and D-xylose are present without being affected by the sugar compounds.
  • An object of the present invention is to provide a novel GDH that has high specificity for D-glucose and can accurately measure the amount of D-glucose even under the coexistence conditions of sugar compounds other than D-glucose.
  • the present inventors have conducted intensive studies and conducted screening of microorganisms that produce novel GDH that enables accurate measurement of glucose levels.
  • the present inventors have found a novel GDH having a GDH activity that has high specificity to glucose and can accurately measure glucose even when measurement is performed under the coexistence conditions of sugar compounds other than glucose.
  • These new GDHs were purified to determine their properties, confirmed to be novel flavin-binding GDH, and actually measured for D-glucose in the presence of maltose, D-galactose, and D-xylose.
  • the present invention was completed by acquiring the amino acid sequence of the novel GDH and the gene sequence information encoding it.
  • the present invention is as follows. (1) The following properties (i) to (iii): (I) Action: exhibits GDH activity in the presence of an electron acceptor, (Ii) molecular weight: the molecular weight of the polypeptide chain portion of the protein is about 80 kDa, (Iii) Substrate specificity: low reactivity to maltose, D-galactose, and D-xylose versus reactivity to D-glucose, A flavin-binding GDH.
  • Action exhibits GDH activity in the presence of an electron acceptor
  • molecular weight the molecular weight of the polypeptide chain portion of the protein is about 80 kDa
  • Substrate specificity low reactivity to maltose, D-galactose, and D-xylose versus reactivity to D-glucose, A flavin-binding GDH.
  • the optimum pH is 6.5 to 7.0, the optimum temperature is 37 to 40 ° C., the stable pH range is pH 3.5 to 7.0, and after heat treatment at 40 ° C. for 15 minutes.
  • the flavin-binding GDH according to any one of the above (1) to (3), which has a residual activity of 80% or more.
  • the subspecies preferably, from the order of the fungus, more preferably from the order of the fungus, and still more preferably from the microorganisms classified into the family Aceraceae Flavin-binding GDH.
  • the flavin-binding GDH according to (5) which is derived from a microorganism classified into the genus Mucor.
  • a flavin-binding GDH gene comprising any DNA selected from the group consisting of the following (A) to (E): (A) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; (C) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4; (E) DNA encoding a protein having a base sequence 80% or more homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having a flavin-binding GDH enzyme activity.
  • the flavin-binding GDH of the present invention makes it possible to accurately measure the amount of D-glucose without being affected by sugar compounds such as maltose, D-galactose and D-xylose contained in the measurement sample. This makes it possible to accurately measure the blood glucose level of a patient who is receiving an infusion containing maltose or a sample of a patient who is performing a galactose tolerance test and a xylose absorption test.
  • the flavin-binding GDH of the present invention is characterized by excellent substrate specificity and extremely high selectivity for D-glucose. Specifically, the flavin-binding GDH of the present invention has extremely low reactivity with maltose, D-galactose, and D-xylose. Specifically, when the reactivity to D-glucose is 100%, the reactivity to maltose, D-galactose and D-xylose is all 2% or less.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has such a high substrate specificity, samples of patients who are receiving infusions containing maltose and patients undergoing galactose tolerance tests and xylose absorption tests are also available. It is possible to accurately measure the amount of D-glucose without being affected by sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose contained in the measurement sample.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has a very low measurement value when measured using a sugar compound such as maltose, D-galactose, D-xylose instead of D-glucose as a substrate. It is characterized in that a glucose measurement value can be accurately measured even under conditions in which sugar compounds such as maltose, D-galactose and D-xylose are contaminated. Specifically, when the reactivity with respect to D-glucose in the absence of the contaminating sugar compound is 100%, at least one selected from maltose, D-galactose, and D-xylose is selected as the contaminating sugar compound.
  • the measured value when present is 96% to 103%, and even when three kinds of maltose, D-galactose and D-xylose are present simultaneously as the contaminating sugar compound, the measured value is 96% to 104%.
  • flavin-binding GDH having such characteristics is used, it is possible to accurately measure the amount of glucose even when maltose, D-galactose, and D-xylose are present in the measurement sample. ,preferable.
  • Examples of preferable enzymes as the flavin-binding GDH of the present invention include those having the following enzymatic chemical characteristics.
  • Optimal temperature 37-40 ° C
  • Km value for D-glucose is 26-33 mM
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose contained in the measurement sample. It becomes possible.
  • GDH having the enzyme chemical characteristics as described above, the amount of D-glucose is accurately measured without being affected by sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose contained in the measurement sample. It becomes possible.
  • the above various property parameters are typical examples, but the above parameters are acceptable as long as the effects of the present invention can be achieved when measuring D-glucose under predetermined measurement conditions.
  • parameters such as a stable pH range, an optimum pH range, and an optimum temperature range may be a little wider than the above typical range within a range including predetermined measurement conditions, and conversely, Even if it is slightly narrower than this range, it is sufficient that sufficient activity and / or stability are ensured under the measurement conditions.
  • the enzyme of the present invention has a value within a range in which a substantially sufficient substrate can be selected under a predetermined measurement condition. Just do it.
  • a purified enzyme refers to an enzyme that has been separated to a state that does not substantially contain components other than the enzyme, particularly proteins other than the enzyme (contaminating protein). Specifically, for example, the content of contaminating protein is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, and even more preferably less than about 1%, based on weight.
  • MpGDH “MjGDH”, and “McGDH” described later in this specification refer to purified enzymes unless otherwise specified.
  • the electron acceptor used by the flavin-binding GDH of the present invention is not particularly limited, and for example, any known electron acceptor can be used as a suitable reagent component for use in blood glucose level measurement.
  • the coenzyme used by the flavin-binding GDH of the present invention is a flavin compound.
  • the flavin compound include flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin mononucleotide (FMN) and the like.
  • Examples of a preferable enzyme as the flavin-binding GDH of the present invention include flavin-binding GDH in which the molecular weight of the polypeptide chain portion of the protein is about 80 kDa as measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis. It should be noted that the flavin-binding GDH of the present invention is considered to have a sugar chain bound thereto, and when the operation for removing the sugar chain is not performed, the molecular weight as measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis is larger than this. Have a tendency to be measured. Examples of a preferable enzyme as the flavin-binding GDH of the present invention include flavin-binding GDH having a Km value of 26 to 33 mM for D-glucose.
  • the flavin-binding GDH of the present invention catalyzes a reaction in which a hydroxyl group of glucose is oxidized to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor. Therefore, using this principle, for example, the activity of the flavin-binding GDH of the present invention is measured by the following measurement system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. Can be measured.
  • PMS phenazine methosulfate
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • reaction 1 PMS (reduced form) is generated as glucose is oxidized. Since DCIP is reduced along with the oxidation of PMS by proceeding (Reaction 2), the disappearance of oxidized DCIP can be measured from the change in absorbance at a wavelength of 600 nm.
  • the activity of flavin-binding GDH is measured according to the following procedure. 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) 1.79 mL, 1.25 M D-glucose solution 0.08 mL and 20 mM DCIP solution 0.01 mL are mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the flavin-binding GDH activity is calculated according to the following formula.
  • the flavin-binding GDH activity is defined as 1 U for the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of 50 mM D-glucose at 37 ° C.
  • 2.0 is the reaction reagent + enzyme reagent liquid volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution liquid volume.
  • ML 1.0 is the optical path length (cm) of the cell
  • ⁇ A600 blank is the decrease per minute in absorbance at 600 nm when the reaction is started by adding 10 mM acetate buffer instead of the enzyme sample solution
  • the flavin-binding GDH of the present invention having the above-mentioned characteristics can be obtained from microorganisms classified into the genus Pleurotus, preferably the genus Pleurotus, more preferably the order Pleuroforma, and more preferably the genus Pleurosumaceae.
  • microorganisms classified into the subspecies, preferably the genus Pleurotus, more preferably the genus Pleurosum, and more preferably the genus Aceraceae include the genus Mucor, the genus Absidia, the genus Actinomucor, and the like.
  • microorganisms classified into the genus Mucor and producing the flavin-binding GDH of the present invention include Mucor prainii, Mucor javanicus or Mucor circinelloides f. Circinelloides. More specifically, Mucor prainii NISL0103, Mucor javanicus NISL0111 or Mucor circinelloides f. Circinelloides NISL0117 may be mentioned.
  • Specific examples of microorganisms classified into the genus Absidia and producing the flavin-binding GDH of the present invention include Absidia cylindrospora and Absidia hyalospora.
  • Absidia cylindrospora NISL0211 and Absidia hyalospora NISL0218 can be mentioned.
  • Actinomucor elegans can be mentioned as an example of a specific preferable microorganism that is classified into the genus Actinomucor and produces the flavin-binding GDH of the present invention. More specifically, Actinomucor elegans NISL9082 can be mentioned.
  • said strain is a stock strain of NISL (Noda Institute of Industrial Science and Technology), and can be sold through a predetermined procedure.
  • the flavin-binding GDH of the present invention is derived from microorganisms classified into the subfamily Pleurotus, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably, the family Phyperaceae.
  • a flavin-binding GDH ".
  • a gene encoding flavin-binding GDH obtained from these flavin-binding GDH-producing microorganisms by a known genetic engineering technique is used, and if necessary, it is partially modified to make various known host microorganisms.
  • Recombinant flavin-binding GDH produced by the method of the present invention is also a microorganism classified into the subfamily, Pseudomonas, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably, Pleurotusaceae of the present invention. And is included in the “flavin-binding GDH having the various properties described above”.
  • the “microorganisms classified into the genus Mucor” or the flavin-binding GDH in which the name of a specific production microorganism strain is described have the above-mentioned various properties obtained based on the gene information derived from each. Such flavin-binding GDH is also included in the present invention.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence that is 80% or more homologous to the amino acid sequence, or one or several amino acids in the amino acid sequence deleted. It has a substituted or added amino acid sequence.
  • the flavin-binding GDH having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 has the various properties described above.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence having 80% or more homology, preferably 85%, more preferably 90%, most preferably 95% or more homology, GDH having various properties similar to the flavin-binding GDH having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is also included in the flavin-binding GDH of the present invention.
  • the gene encoding the flavin-binding GDH of the present invention is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence that is 80% or more homologous to the amino acid sequence, or one or several amino acids in the amino acid sequence.
  • the gene encoding the flavin-binding GDH of the present invention refers to a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the gene encoding the flavin-binding GDH of the present invention has a homology of 80% or more, preferably 85%, more preferably 90%, most preferably, with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the gene encoding the flavin-binding GDH of the present invention can be inserted into various appropriate known vectors. Furthermore, this vector can be introduced into an appropriate known host to produce a transformant into which a recombinant DNA containing a flavin-binding GDH gene has been introduced. Methods for obtaining these genes, methods for obtaining gene sequences and amino acid sequence information, methods for producing various vectors, and methods for producing transformants are known to those skilled in the art, and an example will be described later.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells having flavin-binding GDH production ability and various cells by a conventional method, for example, the method described in Current Protocols Molecular Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989).
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • an appropriate probe DNA is synthesized and used to screen from a chromosomal DNA or cDNA library, or an appropriate primer DNA is prepared based on the amino acid sequence.
  • the DNA containing the gene fragment of interest is amplified by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5′RACE method or 3′RACE method, and these are ligated to produce DNA containing the full length gene of interest. Obtainable.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • a preferred example of the gene encoding the flavin-binding GDH thus obtained is a flavin-binding GDH gene derived from the genus Mucor. It is preferable for handling that these genes are linked to various vectors as usual.
  • a recombinant plasmid containing a gene encoding an isolated flavin-binding GDH derived from the genus Mucor is prepared, From, for example, QIAGEN (manufactured by Qiagen) can be used for extraction and purification.
  • vector DNA that can be used in the present invention include plasmid vector DNA and bacteriophage vector DNA. Specifically, for example, pBluescript II SK + (manufactured by STRATAGENE) is preferable.
  • Determination and confirmation of the base sequence of the flavin-binding GDH gene obtained by the above method can be performed by using, for example, a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter).
  • the flavin-binding GDH gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and a host corresponding to each vector Can be transformed or transduced by conventional methods.
  • the host include microorganisms belonging to the genus Escherichia, for example, E. coli K-12, preferably E. coli JM109, DH5 ⁇ (both manufactured by Takara Bio Inc.), etc.
  • Each strain is obtained by introduction. By culturing the transformant thus obtained, a large amount of flavin-binding GDH can be produced.
  • the flavin-binding GDH of the present invention can be produced using various known enzyme production methods.
  • the aforementioned flavin-binding GDH-producing microorganism can be cultured in a medium to produce the desired flavin-binding GDH, and the enzyme can be collected from the culture or inside the cultured cells.
  • the present invention includes a flavin-binding GDH gene or a recombinant DNA containing the GDH gene, culturing a microorganism capable of producing flavin-binding GDH, and collecting flavin-binding glucose dehydrogenase from the culture. be able to.
  • Microorganisms may be cultured by a normal solid culture method, but it is preferable to employ a liquid culture method as much as possible.
  • the medium used for the culture only needs to contain a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and other nutrients as appropriate, and may be any of a synthetic medium and a natural medium, and can efficiently produce the target enzyme. Any medium may be used as long as it is a medium.
  • the carbon source used in the medium may be any assimilable carbon compound, and examples thereof include glucose, starch hydrolysate, glycerin, fructose, and molasses.
  • the nitrogen source may be any available nitrogen compound, and examples thereof include yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soy flour, malt extract, amino acid, ammonium sulfate, and ammonium nitrate.
  • various salts such as salt, potassium chloride, magnesium sulfate, manganese chloride, ferrous sulfate, 1st potassium phosphate, 2nd potassium phosphate, sodium carbonate, calcium chloride, are mentioned, for example.
  • vitamins and antifoaming agents may be added as necessary.
  • nutrient sources and components that can be added to improve the production amount of the flavin-binding GDH of the present invention they may be used alone or in combination.
  • Culture conditions vary depending on the microorganism to be cultured.
  • the initial pH of the medium is adjusted to pH 5 to 10
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C.
  • the culture time is 10 to 50 hours, 15 to 25 hours, or 1 to 2 days. It can be carried out by aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture, etc.
  • a culture medium and culture conditions when cultivating the microorganism of A. niger shaking for 2 days at 30 ° C. and 130 rpm using a medium of yeast extract 2.0%, glucose 4%, pH 6.0 Can be mentioned.
  • a culture medium and culture conditions for culturing microorganisms such as Escherichia coli, yeast extract 0.1%, malt extract 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, magnesium sulfate 0.05%, pH 7.3 And shaking culture at 25 ° C. and 120 rpm for 4 days.
  • a normal enzyme collecting means can be used.
  • the enzyme is present in the microbial cell, it is preferable to separate the microbial cell from the culture by, for example, filtration, centrifugation, or the like, and collect the enzyme from the microbial cell.
  • a method of destroying bacterial cells using normal disruption means such as an ultrasonic crusher, French press, dynomill, a method of lysing bacterial cell walls using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, Triton X-100, etc.
  • the method of extracting an enzyme from a microbial cell using these surfactants can be used alone or in combination.
  • the insoluble matter is removed by filtration or centrifugation to obtain an enzyme extract.
  • an enzyme extract In order to isolate and purify flavin-binding GDH from the resulting extract as necessary, after removing nucleic acid as necessary, ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added to the fraction, and then precipitated. Collect a thing.
  • a highly purified enzyme preparation for example, gel filtration method using Sephadex, ultragel or biogel, adsorption elution method using ion exchanger, hydroxyapatite, affinity chromatography method, molecular sieve membrane or A fractionation method using a hollow fiber membrane or the like is appropriately selected, and a combination thereof is performed.
  • the flavin-binding GDH used for the measurement of the present invention may be mass-produced using a known gene recombination technique.
  • gene sequences and amino acid sequences of various flavin-binding GDHs described above are analyzed by known methods, and flavin-binding GDHs having similar structures and characteristics are mass-produced in various host microorganisms based on the information. be able to.
  • flavin-binding GDH is produced by modifying the gene sequence and part of amino acid sequence of flavin-binding GDH by deletion, substitution, addition and / or insertion and imparting desired characteristics using various known techniques. It is also possible to do.
  • the flavin-binding GDH of the present invention produced by the method as described above can accurately measure the amount of glucose even in the presence of a contaminating sugar compound, it should be suitably used for application and practical application to glucose sensors and the like. Can do.
  • GDH-producing bacteria were screened from about 500 strains of strains isolated from nature and from about 500 strains of the preserved bacteria distributed by the microorganism preservation organization (Noda Institute of Industrial Science). Each 3 ml of malt extract medium (malz extract 2.0%, D-glucose 2.0%, polypeptone 0.1%, pH 6.0) was inoculated with the test strain, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 to 5 days. This culture solution was centrifuged at 800 ⁇ g for 10 minutes to obtain bacterial cells as a precipitate.
  • malt extract medium malz extract 2.0%, D-glucose 2.0%, polypeptone 0.1%, pH 6.0
  • the cells are suspended in 10 mM acetate buffer (pH 5.0), and the cells are crushed (2,000 rpm, 60 seconds, 16 times) using a bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.). The supernatant recovered by centrifugation at 20,000 ⁇ g for 10 minutes was used as a crude enzyme solution.
  • 2.0 is the reaction reagent + enzyme reagent liquid volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution liquid volume.
  • ML 1.0 is the optical path length (cm) of the cell
  • ⁇ A600 blank is the decrease per minute in absorbance at 600 nm when the reaction is started by adding 10 mM acetate buffer instead of the enzyme sample solution
  • Table 1 shows the results of examining the presence or absence of GDH activity in the crude enzyme solution of each strain based on the above activity measurement method.
  • Pre-culture medium yeast extract 2.0%, glucose 4%, pH 6.0
  • Pre-culture medium yeast extract 2.0%, glucose 4%, pH 6.0
  • a seed culture 0.2 L each of 20 L of the medium contained in a 30 L jar fermenter was inoculated (2 jar fermenters) and cultured at 30 ° C., 200 rpm, 0.5 vvm for 3 days. After completion of the culture, 40 L of the culture solution was filtered with a filter cloth, and the cells were collected. Subsequently, the obtained microbial cells were suspended in 10 mM acetate buffer (pH 5.0).
  • the above cell suspension was fed to a dynomill (150 ml / min) and crushed, and centrifuged at 6,000 ⁇ g for 30 minutes to recover the supernatant.
  • the supernatant is concentrated using a hollow fiber membrane AIP2013 (manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.) having a molecular weight cut off of 6,000, and ammonium sulfate is gradually added to the concentrated enzyme solution so as to be 70% saturated to remove excess protein. Precipitated. After standing overnight at 4 ° C., the supernatant was collected by centrifugation (200,000 ⁇ g, 60 minutes).
  • GDH derived from Mucor prainii NISL0103 is referred to as MpGDH
  • GDH derived from Mucor javanicus NISL0111 is referred to as MjGDH
  • GDH derived from Mucor circinelloides f. Circinelloides NISL0117 is referred to as McGDH.
  • Example 2 (Examination of enzyme chemical properties of flavin-binding GDH derived from Mucor genus) Various properties of each purified GDH obtained in Example 2 were examined.
  • A Measurement of absorption spectrum MpGDH, MjGDH and McGDH were dialyzed with 10 mM acetate buffer (pH 5.0), and the absorption spectrum at 250-800 nm was measured with a spectrophotometer U-3010 (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). The measurement results are shown in FIG. 1 (FIG. 1A shows the absorption spectrum of MpGDH, FIG. 1B shows the absorption spectrum of MjGDH, and FIG. 1C shows the absorption spectrum of McGDH).
  • GDH activity and GOD activity were measured using MpGDH, MjGDH and McGDH obtained in Example 2 and commercially available glucose oxidase derived from Aspergillus niger (GOD, biozyme laboratories). The results are shown in Table 2.
  • the GDH activity is the same as in Example 1, and the GOD activity is 4-aminoantipyrine (4-AA) and N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS). It measured by the following methods used.
  • 3.1 is the volume of the reaction reagent + enzyme reagent (mL)
  • 32.8 is the molar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions, and 0.5 is 1 molecule of H 2.
  • the number of quinoneimine dye molecules generated when O 2 is reduced 0.1 is the amount of the enzyme solution (mL)
  • 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • ⁇ A555 blank is the 10 mM acetate buffer enzyme sample
  • GOD mainly exhibits GOD activity but also has GDH activity. That is, it was shown that the GDH of the present invention does not use oxygen as an electron acceptor, and therefore is hardly affected by dissolved oxygen in the reaction system when quantifying D-glucose.
  • FIG. 2 Optimum pH
  • FIG. 2A shows MpGDH
  • B shows MjGDH
  • C shows McGDH results
  • the relative activity of MpGDH and McGDH was highest at pH 7.0, and its peripheral region showed 80% or more of the maximum relative activity value in the range of pH 6.5-7.5. Therefore, it was considered that it can be suitably used within this range.
  • the relative activity of MjGDH was highest at pH 6.5, and its peripheral region showed 80% or more of the maximum relative activity value in the range of pH 6.0-7.0. It was thought that it can be used suitably.
  • (D) Optimum temperature range According to the activity measurement method described in Example 2, the activity of the enzyme was measured at various temperatures. Specifically, 30.0 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 6.0 mL of 833 mM D-glucose solution, 0.3 mL of 25 mM 4-AA solution, 0.3 mL of 40 mM TOOS solution, and 500 U / mL POD solution 0 After mixing 3 mL, transfer 3.0 mL to a test tube and incubate at each temperature for 5 minutes instead of maintaining at 37 ° C., then add 0.02 mL of 20 mM PMS solution and 0.1 mL of enzyme sample solution, The reaction was started at temperature.
  • FIG. 3 shows MpGDH
  • B shows MjGDH
  • C shows McGDH results. All showed the maximum activity around 37 ° C., and the temperature range showing 80% or more of the maximum activity was 30 to 40 ° C. From the above, it was considered that the optimum temperature range of the flavin-binding GDH of the present invention was 30 to 40 ° C., and the most preferable temperature was 37 ° C.
  • FIG. 4 shows the results of thermal stability when the flavin-binding GDH of the present invention was treated for 15 minutes at each temperature using a 100 mM potassium acetate buffer (pH 5.0) (FIG. 4).
  • A shows MpGDH
  • B shows MjGDH
  • C shows McGDH results). It was found that the flavin-binding GDH of the present invention has a residual activity of 80% or more after heat treatment at 40 ° C. for 15 minutes and is stable up to about 40 ° C.
  • FIG. 5 (G) Range of stable pH
  • FIG. 5A shows MpGDH
  • B shows MjGDH
  • C shows McGDH results
  • 100 mM glycine-HCl buffer (pH 2.5-3.5, plotted with square marks in the figure), 100 mM potassium acetate buffer (pH 3.5-5.5, plotted with ⁇ marks in the figure), 100 mM MES-NaOH buffer (pH 5.5-6.5, plotted with diagonal squares in the figure), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0-8.0, plotted with circles in the figure), 100 mM Tris-HCl A buffer solution (pH 7.5-9.0, plotted with crosses in the figure) was used and treated at 25 ° C. for 16 hours at each pH, and then the residual activity of the flavin-binding GDH of the present invention was measured.
  • the pH range showing 80% or more of the activity in the vicinity of pH 5.0 showing the maximum residual activity was pH 3.5 to 7.0. From the above, it was found that the stable pH range of the flavin-binding GDH of the present invention is pH 3.5-7.0.
  • Lane 1 Molecular weight marker (manufactured by New England Biolabs, Protein Ladder (10-250 kDa), 250 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 15 kDa, 15 kDa)
  • Lane 2 MpGDH Lane 3: MpGDH after deglycosylation treatment
  • Lane 4 MjGDH
  • Lane 5 MjGDH after deglycosylation treatment
  • Lane 6 McGDH
  • Lane 7 McGDH after deglycosylation treatment
  • Lane 8 Enzyme used for deglycosylation reaction
  • the molecular weight of the flavin-binding GDH of the present invention is about 90-130 kDa for MpGDH, about 100-150 kDa for MjGDH, and about 130-200 kDa for McGDH, and is a deglycosylation kit (manufactured by EnzymaticzDeglycylation Kit, PZM).
  • the molecular weight after removal of the sugar chain by MpGDH, MjGDH and McGDH was about 80 kDa.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has a very low reactivity with respect to various sugar compounds when the activity against D-glucose is 100%.
  • the activities against maltose, D-galactose, and D-xylose were all 2% or less.
  • the inhibitory effect of 1,10-phenanthroline on the flavin-binding GDH of the present invention is low, and the addition of 1 mM 1,10-phenanthroline only shows an inhibitory effect of about 2 to 4%. It was about 10%.
  • Glucose was measured using the flavin-binding GDH of the present invention. Specifically, 1.79 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), D-glucose solution (250, 750, 1,250, 1,750, 2,500, 3,250, 4,000, 5, 000mg / dL) Mix 0.08mL and 0.01mL of 20mM DCIP solution and incubate at 37 ° C for 5 minutes, then add 0.02mL of 20mM PMS solution and 0.1mL of 0.8U / mL GDH solution to start the reaction did.
  • FIG. 7 shows the relationship between the decrease in absorbance per minute at 600 nm ( ⁇ A600) and the final glucose concentration as the enzyme reaction proceeds (FIG. 7A shows the measurement results using MpGDH, and FIG. 7B shows MjGDH). (C) shows the measurement result using McGDH).
  • the glucose concentration in the measurement sample can be measured with high accuracy if the final glucose concentration is 200 mg / dL or less.
  • GDH of the present invention is a sample glucose containing maltose having a final concentration of 600 mg / dL or less, D-galactose having a final concentration of 300 mg / dL or less, or D-xylose having a final concentration of 200 mg / dL or less. It was shown that the concentration can be accurately quantified.
  • MpGDH or MjGDH indicates the concentration of glucose in a sample containing maltose having a final concentration of 600 mg / dL or less, D-galactose having a final concentration of 300 mg / dL or less, and D-xylose having a final concentration of 200 mg / dL or less. It was shown that quantification can be performed with extremely high accuracy.
  • RT-PCR was performed according to the protocol of this kit using Prime Script RT-PCR Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) using Mucor prainii NISL0103 mRNA prepared in (1) above as a template.
  • the oligo dT primer attached to this kit was used for the reverse transcription reaction, and the degenerate primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 were used for cDNA amplification by PCR.
  • SEQ ID NOs: 7 and 8 were used for cDNA amplification by PCR.
  • the amplified DNA fragment contained in this band was purified, and the amplified plasmid was ligated to pT7Blue (Novagen) using Ligation Convenient Kit (Nippon Gene) to construct a recombinant plasmid pTMGD-1. .
  • E. coli JM109 competent cells (manufactured by Nippon Gene) were transformed by a known heat shock method.
  • a plasmid was extracted and purified from the obtained transformant using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma), and the base sequence of the amplified DNA fragment contained in the plasmid was determined (767 bp).
  • 3′-Full RACE Core Set (manufactured by Takara Bio Inc.) is used to identify the 3′-side GDH gene unknown region, and 5′-Full RACE Core Set ( 5'-side GDH gene unknown region was determined using Takara Bio.
  • 3′-Full RACE Core Set uses the 3 site adapter primer attached to this kit and the primer shown in SEQ ID NO: 9, and 5′-Full RACE Core Set uses SEQ ID NO: 10, 11, Primers shown in 12, 13, and 14 were used, respectively.
  • N-terminal region primer (SEQ ID NO: 15) and C-terminal region primer (SEQ ID NO: 16) were prepared, and these primers and Mucor prepared in (1) above.
  • RT-PCR was performed using mRNA of prainii NISL0103.
  • a single band corresponding to a length of about 2 kbp was confirmed.
  • the amplified DNA fragment contained in this band was purified and ligated with plasmid pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with restriction enzyme SmaI to construct a recombinant plasmid puc-MGD.
  • E. coli JM109 competent cells manufactured by Nippon Gene
  • TY medium 1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0 containing 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured with shaking at 30 ° C. for 6 hours.
  • the culture broth was crushed by cooling 4 times for 20 seconds using an ultrasonic crusher (Ultrasonic generator, manufactured by Nissei) under cooling on ice.
  • the crushed liquid was put into an Eppendorf tube, centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes using a microcentrifuge, and then the supernatant fraction was transferred to another Eppendorf tube to obtain a crude enzyme solution.
  • the GDH activity in this crude enzyme solution was measured by the aforementioned enzyme activity measurement method, the flavin-binding GDH activity of the present invention was confirmed.
  • Double-joint PCR (Fungal Genetics and Biology, 2004, Vol. 41, p973-981), 5 ′ arm region to PyrG gene (uracil auxotrophic marker)
  • a cassette consisting of a TEF1 promoter gene, a flavin-binding GDH gene, and a 3 ′ arm region was constructed, and the Aspergillus sojae KK1-2 strain was transformed into the host by the protoplast-PEG method.
  • the target transformant was selected from the obtained strains after confirmation by PCR.
  • the GDH activity in this crude enzyme solution was measured by the enzyme activity measurement method described above, the GDH activity in the crude enzyme solution obtained using the control strain was 0.3 U / mL, whereas The GDH activity in the crude enzyme solution obtained using the transformant was 14.0 U / mL, and it was confirmed that the flavin-binding GDH of the present invention was expressed in the transformant.
  • GDH activity against each substrate was measured using the above-described transformant in which the flavin-binding GDH gene of the present invention was inserted.
  • the enzyme activity measurement method of Example 1 D-glucose, maltose, D-galactose, D-xylose, mannose, sucrose, and trehalose were used as substrates.
  • the substrate concentration was 50 mM. The results are shown in Table 10.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has a very low reactivity with respect to various sugar compounds when the activity against D-glucose is 100%.
  • the activities against maltose, D-galactose, and D-xylose were all 2% or less.
  • the flavin-binding GDH of the present invention has a very high substrate specificity for D-glucose and a sufficiently low reactivity to sugar compounds other than D-glucose (maltose, D-galactose, D-xylose).
  • D-glucose sugar compounds other than D-glucose
  • -Even when measuring a sample containing a sugar compound other than glucose, the D-glucose concentration can be accurately quantified, which is useful in fields such as blood glucose level measurement and glucose concentration determination in foods.

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Abstract

　Ｄ-グルコースに対する基質特異性が高いフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供する。　Mucor属に属する微生物由来の、新規なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。Ｄ-グルコースに対する反応性に比較して、マルトース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-キシロースに対する反応性が低く、それらの糖化合物の影響を受けにくいことを特徴とする。　溶存酸素の影響を受けにくく、試料中にグルコース以外の糖化合物が存在する場合でも、グルコース量を正確に測定することができる。

Description

フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、フラビン化合物を補酵素とする新規なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、およびその製造法に関する。
　血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Self Monitoring of Blood Glucose：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
　一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ－ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
　近年、ＰＱＱ－ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ－ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ－ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ－キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ－ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５～３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
　上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、非特許文献２～５には、基質特異性に関する詳細な記載はないが、Aspergillus oryzae由来のＧＤＨについての報告がある。特許文献１～３にはAspergillus属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開示されており、特許文献４にはＤ－キシロースに対する作用性を低減させたAspergillus属由来のＦＡＤ－ＧＤＨが開示されている。
　特許文献１～４には、Ｄ－グルコースではない１種または数種の糖化合物に対し反応性が低いＦＡＤ－ＧＤＨが記載されてはいるが、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有するフラビン結合型ＧＤＨは知られていない。また、Ｄ－グルコース、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在する条件下において、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能なフラビン結合型ＧＤＨも知られていない。
特開２００７－２８９１４８号公報 国際公開第０４／０５８９５８号パンフレット 国際公開第０７／１３９０１３パンフレット 特開２００８－２３７２１０号公報
医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No.206）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).
　本発明では、Ｄ－グルコースに特異性が高く、Ｄ－グルコース以外の糖化合物の共存条件下においてもＤ－グルコース量を正確に測定できる新規なＧＤＨを提供することを課題とする。
　上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ね、グルコース量の正確な測定を可能とする新規なＧＤＨを生産する微生物のスクリーニングを実施した結果、ケカビ亜門に属する菌株から、グルコースに特異性が高く、グルコース以外の糖化合物の共存条件下で測定を行った場合でもグルコースを正確に測定できるＧＤＨ活性を有する新規なＧＤＨを見出した。そして、それらの新規なＧＤＨを精製してその諸性質を決定し、新規なフラビン結合型ＧＤＨであることを確認し、実際にマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース存在下でのＤ－グルコース測定を実施するとともに、その新規なＧＤＨのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列情報を取得して、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す、
（ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
（ｉｉｉ）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びＤ－ガラクトース、及びＤ－キシロースに対する反応性が低い、
を備えるフラビン結合型ＧＤＨ。
（２）Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトース、およびＤ－キシロースに対する反応性がいずれも２％以下である上記（１）記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（３）以下の（ａ）から（ｃ）の糖化合物：
（ａ）マルトース
（ｂ）Ｄ－ガラクトース
（ｃ）Ｄ－キシロース
の１以上が存在する場合のＤ－グルコースに対する反応性が、前記（ａ）～（ｃ）が存在しない場合のＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合の９６％～１０４％である、上記（１）～（２）に記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（４）至適ｐＨがｐＨ６．５～７．０であり、至適温度が３７～４０℃であり、安定ｐＨ範囲がｐＨ３．５～７．０であり、４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、上記（１）～（３）のいずれか一項に記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（５）ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来する上記（１）～（４）のいずれか一項に記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（６）Mucor属に分類される微生物に由来する上記（５）記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（７）Mucor属に分類される微生物を培地に培養し、該微生物菌体からフラビン結合型ＧＤＨを採取することを特徴とする上記（１）～（６）のいずれか一項に記載のフラビン結合型ＧＤＨの製造方法。
（８）微生物がMucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f.circinelloidesから選択される１以上である上記（７）記載のフラビン結合型ＧＤＨの製造方法。
（９）配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上相同なアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記（１）～（６）のいずれか一項に記載のフラビン結合型ＧＤＨ。
（１０）以下の（Ａ）～（Ｅ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８０％以上相同な塩基配列を有し、且つフラビン結合型ＧＤＨ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１１）上記（１０）記載のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（１２）上記（１１）記載の組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体。
（１３）上記（１０）記載のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子または上記（１１）記載の組換え体ＤＮＡを含み、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物を培養し、該培養物よりフラビン結合型ＧＤＨを採取することを特徴とする、Ｄ－グルコースに対する反応性に対して、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が低いフラビン結合型ＧＤＨの製造方法。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨにより、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ－グルコース量を測定することが可能となる。これにより、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、正確に血糖値を測定することが可能となる。
本発明のフラビン結合型ＧＤＨの吸収スペクトルを示す図である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨの至適ｐＨを示す図である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨの至適温度を示す図である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨの熱安定性を示す図である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨのｐＨ安定性を示す図である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨのＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動結果である。 本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いて測定した、Ｄ－グルコース量の測定結果を示す図である。
　（フラビン結合型ＧＤＨの基質特異性）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、基質特異性に優れ、Ｄ－グルコースに対する選択性が極めて高いことを特徴とする。具体的には、本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が極めて低い。具体的には、Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ－グルコース量を測定することが可能となる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、上述のようにＤ－グルコースの代わりにマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にグルコース測定値を測定できることを特徴とする。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％～１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％～１０４％であることを特徴とする。このような特性を有するフラビン結合型ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在している状況でも、グルコース量を正確に測定することが可能であり、好ましい。
　（本発明のフラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的特徴）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、以下の酵素化学的特徴を有するものが挙げられる。
（１）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す
（２）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである
（３）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が低い
（４）至適ｐＨ：ｐＨ６．５～７．０
（５）至適温度：３７～４０℃
（６）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．５～７．０
（７）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する
（８）フラビン化合物を補酵素とする
（９）Ｋｍ値：Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が２６～３３ｍＭである
　上記のような酵素化学的特徴を有するＧＤＨであれば、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ－グルコース量を測定することが可能となる。また、血糖値の測定等の臨床診断に応用するために好適なｐＨ範囲、温度範囲で良好に作用するので、診断用測定試薬等の用途に好適に使用することができる。
　なお、上記の諸性質パラメータは典型的な例であるが、所定の測定条件においてＤ－グルコースの測定を行う際に本発明の効果を達成可能である範囲で、上記パラメータのうちには、許容可能な変動の幅を有するものがある。例えば、安定ｐＨ範囲や至適ｐＨ範囲、至適温度範囲等のパラメータは、所定の測定条件を含む範囲で、上記の典型的な範囲よりやや広くてもよいし、逆に、上記の典型的な範囲よりやや狭い場合でも、測定条件において十分な活性および／または安定性が確保されていればよい。Ｋｍ値は一般的には小さくなるほど基質特異性が良いとされるが、本発明の酵素としては、所定の測定条件において実質的に十分な基質の選択が実現される範囲の値を有していればよい。
　上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
　精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素をいう。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。なお、本明細書中に後述する「ＭｐＧＤＨ」、「ＭｊＧＤＨ」および「ＭｃＧＤＨ」は、特に断りの無い限り、精製酵素をいう。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨが利用する電子受容体は、特に限定されず、例えば、血糖値測定に用いるために好適な試薬成分として公知の任意の電子受容体を用いることができる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨが利用する補酵素は、フラビン化合物であることを特徴とする。フラビン化合物には、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）等が挙げられる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときに、タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。なお、本発明のフラビン結合型ＧＤＨには糖鎖が結合していると考えられ、糖鎖を除去する操作を行わない場合、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動で測定した際の分子量はこれより大きめに測定される傾向を有する。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が２６～３３ｍＭであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。
　（フラビン結合型ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。
　したがって、この原理を利用して、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系により、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定することができる。
（反応１）　Ｄ－グルコ－ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
　　　　　　　　→ Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　　　　　→ ＰＭＳ ＋ ＤＣＩＰ（還元型）
　まず、（反応１）において、グルコースの酸化に伴いＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳの酸化と共にＤＣＩＰが還元されるため、酸化型ＤＣＩＰの消失を６００ｎｍの波長の吸光度変化量から測定することができる。
　具体的には、本発明において、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
　（フラビン結合型ＧＤＨの由来）
　上記の特徴を有する本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物から得ることができる。ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物としては、例えば、Mucor属、Absidia属、Actinomucor属等が挙げられる。Mucor属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Mucor prainii、Mucor javanicusもしくはMucor circinelloides f. circinelloidesが挙げられる。より具体的には、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111もしくはMucor circinelloides f. circinelloides NISL0117が挙げられる。Absidia属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。より具体的には、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218を挙げることができる。Actinomucor属に分類される微生物であって、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor elegansを挙げることができる。より具体的には、Actinomucor elegans NISL9082を挙げることができる。なお、上記の菌株はＮＩＳＬ（財団法人　野田産業科学研究所）の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、上述の通り、「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」である。さらにまた、それらのフラビン結合型ＧＤＨ生産微生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用し、必要によりそれを一部改変して、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えフラビン結合型ＧＤＨもまた、本発明の「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」に含まれる。同様に、「Mucor属に分類される微生物」、あるいは、特定の生産微生物菌株名を記載したフラビン結合型ＧＤＨについても、各々に由来する遺伝子情報を元に取得される、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨをも本発明に包含する。
　（フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする。配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨは、上述の各種の性質を有する。また、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨと同様な諸性質を有するＧＤＨも、本発明のフラビン結合型ＧＤＨに含まれる。
　（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨをコードするＤＮＡをいう。または、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡをいう。あるいは、本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８０％以上の相同性、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、且つフラビン結合型ＧＤＨ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡをいう。
　（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列を含むベクター、形質転換体）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体を作製することができる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。
　フラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物からフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
　このようにして得られたフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子の好ましい一例として、Mucor属由来のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したMucor属由来のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを作製し、そこから例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得ることができる。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
　上記方法により得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行い得る。
　上述のように得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により形質転換または形質導入することができる。宿主としては、例えば、Escherichia属に属する微生物、例えば、大腸菌Ｋ－１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（ともにタカラバイオ社製）等が挙げられ、これらの宿主を形質転換して、またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。こうして得られた上記形質転換体を培養することによって、フラビン結合型ＧＤＨを大量に生産することができる。
　（フラビン結合型ＧＤＨの製造）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、各種公知の酵素生産方法を用いて製造することができる。例えば、前述のフラビン結合型ＧＤＨ生産微生物を培地中で培養して目的とするフラビン結合型ＧＤＨを産生させ、培養物あるいは培養菌体内部より酵素を採取することができる。また、本発明発明のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子または該ＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを包含し、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することができる。
　微生物の培養は、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能なかぎり液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有するものであればよく、また、合成培地、天然培地の何れでもよく、目的の酵素を効率よく製造することのできる培地であれば、如何なる培地でもよい。
　培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。
　その他にも、添加することにより本発明のフラビン結合型ＧＤＨ製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。
　培養条件は、培養する微生物により異なる。例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５～１０に調整し、培養温度は、２０～４０℃、培養時間は、１０～５０時間、１５～２５時間、あるいは１～２日間等、適宜設定することができ、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などにより実施する。例えば、ケカビ亜門の微生物を培養する場合の培地および培養条件の一例として、イーストエキス２．０％、グルコース４％、ｐＨ６．０の培地を用いた、３０℃、１３０ｒｐｍで２日間の振盪が挙げられる。また、大腸菌等の微生物を培養する培地および培養条件の一例として、イーストエキス０．１％、マルツエキス０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７．３の培地を用いた、２５℃、１２０ｒｐｍで４日間の振盪培養が挙げられる。
　酵素生産微生物の培養終了後、該培養物あるいは培養菌体内部から本発明の方法に使用するフラビン結合型ＧＤＨを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。上記酵素が菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から酵素を採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどの、通常の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用することができる。
　次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、酵素抽出液を得る。得られた抽出液から、フラビン結合型ＧＤＨを、必要に応じて単離、精製するには、必要により核酸を除去したのち、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトンなどを添加して分画し、沈殿物を採取する。さらに精製度の高い酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲル濾過法、イオン交換体、ヒドロキシアパタイトなどを用いる吸着溶出法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜などを用いる分画法などを適宜選択し、またこれらを組み合わせて実施する。
　本発明の測定に使用するフラビン結合型ＧＤＨは、公知の遺伝子組換え手法を用いて大量生産してもよい。例えば、前述の各種フラビン結合型ＧＤＨの遺伝子配列およびアミノ酸配列を公知の方法により解析し、その情報に基づいて同様の構造・特性を有するフラビン結合型ＧＤＨを、各種の宿主微生物中で大量生産させることができる。また、公知の各種技術を用いてフラビン結合型ＧＤＨの遺伝子配列およびアミノ酸配列の一部を欠失、置換、付加および／または挿入により改変して所望の特性を付与させたフラビン結合型ＧＤＨを製造することも可能である。
　上記のような方法で製造された、本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、夾雑糖化合物の存在下においても正確にグルコース量を測定できることから、グルコースセンサなどへの応用・実用化に好適に用いることができる。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
　（本発明のフラビン結合型ＧＤＨの取得）
１．ＧＤＨ生産菌のスクリーニング
　自然界から分離した菌株および微生物保存機関（（財）野田産業科学研究所）から分与された保存菌約５００株から、ＧＤＨ生産菌のスクリーニングを行った。マルツエキス培地（マルツエキス２．０％、Ｄ－グルコース２．０％、ポリペプトン０．１％、ｐＨ６．０）３ｍｌに供試菌株をそれぞれ接種し、３～５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を８００×ｇ、１０分間遠心分離して菌体を沈殿として得た。その後、この菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に懸濁し、ビーズショッカー（安井器械（株）製）により菌体を破砕（２，０００ｒｐｍ、６０秒、１６回）し、４℃、２０,０００×ｇ、１０分間の遠心によって回収された上清を粗酵素液とした。
２．ＧＤＨ活性の確認
　以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定して、粗酵素液中のＧＤＨ活性を調べた。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、次式に従いＧＤＨ活性を算出した。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ－グルコ－ス存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
　各菌株の粗酵素液について、上記活性測定法に基づいてＧＤＨ活性の有無を調べた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0107、Mucor javanicus NISL0108、Mucor javanicus NISL0111、Mucor javanicus NISL0112、Mucor javanicus NISL0115、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0116、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117、Mucor hiemalis f. silvaticus NISL0118、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218、Actinomucor elegans NISL9082由来の粗酵素液中にＧＤＨ活性が検出された。
　（Mucor属由来フラビン結合型ＧＤＨの精製）
　前培養用培地（イーストエキス ２．０ ％、グルコース ４％、ｐＨ６．０）０．１Ｌを０．５Ｌ容坂口フラスコに入れ、予めプレート培地上で培養したMucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117を、約１ｃｍ２分それぞれ接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで２日間回転振とう培養した。これを種培養として、３０Ｌ容ジャーファメンターに入れた上記培地２０Ｌに０．２Ｌずつ接種し（ジャーファメンター２基）、３０℃、２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで３日間培養した。培養終了後、培養液４０Ｌをろ布でろ過し、菌体を回収した。次いで、得られた菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁した。
　上記の菌体懸濁液を、ダイノミルに送液（１５０ｍｌ／分）して破砕し、６,０００×ｇで３０分遠心して上清を回収した。この上清を分画分子量６，０００の中空糸膜ＡＩＰ２０１３（旭化成ケミカルズ社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを７０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心分離（２００,０００×ｇ、６０分）により上清を回収した。
　この上清を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス－７０（ミリポア社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２００ｍＭ 塩化カリウム、ｐＨ４．５）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
　以降、各精製酵素について、Mucor prainii NISL0103由来のＧＤＨをＭｐＧＤＨ、Mucor javanicus NISL0111由来のＧＤＨをＭｊＧＤＨ、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117由来のＧＤＨをＭｃＧＤＨと表記する。
　（Mucor属由来フラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的性質の検討）
　実施例２により得られた各精製ＧＤＨの諸性質を調べた。
（ａ）吸収スペクトルの測定
　ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨを１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、２５０－８００ｎｍにおける吸収スペクトルを分光光度計Ｕ－３０１０（日立ハイテクノロジーズ社製）により測定した。測定結果を図１に示す（図１（Ａ）はＭｐＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｂ）はＭｊＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｃ）はＭｃＧＤＨの吸収スペクトルを示す）。いずれのＧＤＨについても、波長３４０～３５０ｎｍ付近および波長４２０～４３０ｎｍ付近に極大を示す２つのピークが確認され、このような吸収スペクトルの形状がフラビン酵素に特有の形状であることから、本発明のＧＤＨがフラビン結合型タンパク質であることが強く示唆された。
（ｂ）ＧＯＤ活性の測定
　実施例２により得られたＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨと、Aspergillus niger由来の市販のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、ｂｉｏｚｙｍｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、ＧＤＨ活性およびＧＯＤ活性を測定した。結果を表２に示す。
　ＧＤＨ活性は、実施例１の方法に準じ、ＧＯＤ活性は、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、およびＮ－エチルーＮ－（２－ヒドロキシー３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）を使用した以下の方法で測定した。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ３０．０ｍＬ、８３３ｍＭ Ｄ－グルコース溶液 ６．０ｍＬ、２５ｍＭ ４－ＡＡ溶液 ０．３ｍＬ、４０ｍＭ ＴＯＯＳ溶液 ０．３ｍＬおよび５００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ溶液 ０．３ｍＬを混合後、３．０ｍＬを試験管に移し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加して反応を開始した。酵素反応の進行に伴う５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５５５）を測定し、次式に従ってＧＯＤ活性を算出した。この際、ＧＯＤ活性は、３７℃において濃度１３１ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、３２．８は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．５は１分子のＨ２Ｏ２が還元されるときに生じるキノンイミン染料の分子数、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ５５５ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表２に示す通り、ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨはいずれも全くＧＯＤ活性を示さず、専らＧＤＨ活性を示した。一方、ＧＯＤは主としてＧＯＤ活性を示すが、ＧＤＨ活性も併せ持つことが判明した。すなわち、本発明のＧＤＨは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ－グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を極めて受けにくいことが示された。
（ｃ）至適ｐＨ
　上記の本発明のフラビン結合型ＧＤＨにおける至適ｐＨを調べた。結果を図２に示す（図２（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０－５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５－６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５－９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。
　その結果、上記のフラビン結合型ＧＤＨはいずれも、ｐＨ６．５もしくはｐＨ７．０において最も高い活性を示し、ｐＨ７．０付近に至適ｐＨを有していた。個別にみると、ＭｐＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ７．０においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．５－７．５の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。また、ＭｊＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ６．５においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．０－７．０の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。
（ｄ）至適温度範囲
　実施例２記載の活性測定法に準じ、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ３０．０ｍＬ、８３３ｍＭ Ｄ－グルコース溶液 ６．０ｍＬ、２５ｍＭ ４－ＡＡ溶液 ０．３ｍＬ、４０ｍＭ ＴＯＯＳ溶液 ０．３ｍＬおよび５００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ溶液 ０．３ｍＬを混合後、３．０ｍＬを試験管に移し、３７℃で保温する代わりに各温度で５分間保温し、次いで、２０ｍＭ　ＰＭＳ溶液０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時、および、２分後の吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を求めた。結果を図３に示す（図３（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。いずれも３７℃付近で最大の活性を示し、最大活性に対して８０％以上の活性を示す温度範囲は３０～４０℃であった。以上より、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの至適温度範囲は、３０～４０℃、最も好ましい温度は３７℃であると考えられた。
（ｅ）Ｄ－グルコースに対するＫｍ値
　前記活性測定法において、基質であるＤ－グルコース濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、Ｄ－グルコースに対するＫｍ値は、ＭｐＧＤＨで３１．１ｍＭ、ＭｊＧＤＨで２６．４ｍＭ、ＭｃＧＤＨで３３．２ｍＭであった。
（ｆ）熱安定性
　１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを各温度で１５分間処理した時の熱安定性の結果を図４に示す（図４（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約４０℃まで安定であることがわかった。
（ｇ）安定ｐＨの範囲
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨにおける安定ｐＨを調べた。結果を図５に示す（図５（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ グリシン－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５－３．５、図中四角印でプロット）、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５－５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５－６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５－９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて２５℃で１６時間処理した後、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの残存活性をそれぞれ測定した。その結果、いずれも、最大の残存活性を示したｐＨ５．０付近での活性に対し８０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ３．５－７．０であった。以上から、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの安定ｐＨ範囲はｐＨ３．５－７．０であることが判った。
（ｈ）分子量
　スーパーセップエース １０－２０％（和光純薬工業社製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動によりＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの分子量を求めた。また、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）を用いて、本発明の各フラビン結合型ＧＤＨを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動に供した。結果を図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
　レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ（１０－２５０ｋＤａ），上から２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ）
　レーン２：ＭｐＧＤＨ
　レーン３：脱糖鎖処理後のＭｐＧＤＨ
　レーン４：ＭｊＧＤＨ
　レーン５：脱糖鎖処理後のＭｊＧＤＨ
　レーン６：ＭｃＧＤＨ
　レーン７：脱糖鎖処理後のＭｃＧＤＨ
　レーン８：脱糖鎖反応に使用した酵素
　図６より、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、ＭｐＧＤＨで約９０～１３０ｋＤａ、ＭｊＧＤＨで約１００～１５０ｋＤａ、ＭｃＧＤＨで約１３０～２００ｋＤａであり、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）により糖鎖を除去した後の分子量はＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨいずれも約８０ｋＤａであった。
（ｉ）基質特異性
　実施例１の酵素活性測定方法に準じ、基質としてはＤ－グルコース、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオースをそれぞれ用いて、各基質に対する本発明のフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　その結果、本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、Ｄ－グルコースに対する活性を１００％とした場合に、各種の糖化合物に対し、いずれも反応性が非常に低いことが判明した。そして、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する活性は、いずれも、２％以下であった。
（ｊ）１，１０－フェナントロリンによる阻害効果
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨの活性に対する１，１０－フェナントロリンの阻害効果を、以下の方法で調べた。実施例１の酵素活性の測定方法に準じ、ただし、終濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭとなるように１，１０－フェナントロリンを添加した場合の酵素活性を求め、１，１０－フェナントロリン無添加の阻害率を０％として、その阻害率を計算した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨに対する１，１０－フェナントロリンの阻害効果は低く、１ｍＭの１，１０－フェナントロリン添加では２～４％程度の阻害効果が認められるに過ぎず、５ｍＭの添加でも阻害率は１０％程度であった。
　（本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証１）
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いて、グルコースの測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、Ｄ－グルコース溶液（２５０、７５０、１，２５０、１，７５０、２，５００、３，２５０、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび０．８Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を図７に示す（図７（Ａ）はＭｐＧＤＨを用いた測定結果、（Ｂ）はＭｊＧＤＨを用いた測定結果、（Ｃ）はＭｃＧＤＨを用いた測定結果を示す）。
　図７に示す通り、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いることにより、終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のグルコース濃度であれば、測定試料中のグルコース濃度を精度良く測定できることが確認された。
　（本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証２）
　１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７７ｍＬ、Ｄ－グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ－ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ－キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬを添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）、およびグルコースの終濃度の関係を表５～７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表５～７より、本発明ＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、または、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ－ガラクトース、あるいは終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ－キシロースを含有するサンプルのグルコース濃度を精度良く定量できることが示された。
　（本発明のフラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証３）
　１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．６１ｍＬ、Ｄ－グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）、Ｄ－ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）およびＤ－キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） をそれぞれ０．０８ｍＬ添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ の本発明のフラビン結合型ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を表８～９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表８～９より、ＭｐＧＤＨまたはＭｊＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ－ガラクトースおよび終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ－キシロースを含有する試料中のグルコース濃度を、極めて精度良く定量できることが示された。
（Mucor属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと形質転換体による発現）
（１）ｍＲＮＡの調製
　Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地（マルツエキス　２．０％、グルコース　４．０％、ポリペプトン　０．１％、ｐＨ６．０）３ｍＬに接種し、２日、３０℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
　実施例２より得られたＭｐＧＤＨをスーパーセップエース　１０－２０％（和光純薬工業社製）に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＱｕｉｃｋ－ＣＢＢ（和光純薬工業社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＬＶＥＮＦＴＰＰＴＰＡＱＩＥ（配列番号５）およびＩＲＮＳＴＤＥＷＡＮＹＹ（配列番号６）であった。
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
　上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号７（フォワードプライマー）、配列番号８（リバースプライマー）に示す）を作製した。なお、配列番号７および８に記載の１文字表記において、混合塩基はそれぞれ、ｈ＝ａ＋ｃ＋ｔ、ｒ＝ａ＋ｇ、ｙ＝ｃ＋ｔ、ｄ＝ａ＋ｇ＋ｔを表す。上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡをテンプレートとし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ－ＰＣＲを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴｄＴプライマーを、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号７、８に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、８００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドｐＴＭＧＤ－１を構築した。
　次いで、得られたｐＴＭＧＤ－１を用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（７６７ｂｐ）。
　得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、３’－Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて３’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を、また、５’－Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて５’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、３’－Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔでは本キット付属の３サイトアダプタープライマーおよび配列番号９に示すプライマーを用い、また、５’－Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔでは配列番号１０、１１、１２、１３、１４に示すプライマーをそれぞれ用いた。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２および配列番号４に示す全鎖長１９２６ｂｐのMucor prainii NISL0103由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。
（４）大腸菌の形質転換とＧＤＨ活性の確認
　Ｎ末領域のプライマー（配列番号１５）およびＣ末領域のプライマー(配列番号１６)を作製し、これらのプライマーおよび上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。
　反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２ｋｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、制限酵素ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）とライゲーションを行って、組換えプラスミドｐｕｃ－ＭＧＤを構築した。
　得られた組換えプラスミドｐｕｃ－ＭＧＤを用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。次いで、形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ－ＭＧＤ）菌体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％　バクトトリプトン、０．５％　バクトイースト・エクストラクト、０．５％　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍＬ中で３７℃、２時間振とう培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに３０℃、６時間振とう培養を行った。
　この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｎｉｓｓｅｉ社製）を用いて２０秒間、４回処理し、破砕した。破砕液をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清画分を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法によりこの粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定したところ、本発明のフラビン結合型ＧＤＨ活性が確認された。
（５）麹菌の形質転換とＧＤＨ活性の確認
　Ｄｏｕｂｌｅ－ｊｏｉｎｔ　ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３－９８１）を行い、５’アーム領域～ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）～ＴＥＦ１プロモーター遺伝子～フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子～３’アーム領域から成るカセットを構築し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ　ＫＫ１－２株を宿主に、プロトプラスト－ＰＥＧ法により形質転換を行った。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、ＰＣＲで確認して選抜した。
　０．８％散水した小麦ふすまを１５０ｍＬ三角フラスコに５ｇ取り、綿栓をして１２１℃、５０分オートクレーブ滅菌した。これに対し、本発明のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挿入された上記の形質転換体、もしくはコントロール株の分生子懸濁液を、１×１０５／ｇ麹となるように植菌し、３０℃、６４時間培養した。コントロール株としては、形質転換をしていない宿主を用いた。
　培養後のふすま麹２ｇに対し、５倍量の１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、ポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（キネマチカ社製）で３０秒×８回破砕を行った。破砕後、１４，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、得られた上清画分を粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、この粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定したところ、コントロール株を用いて得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性は０．３Ｕ／ｍＬであったのに対し、形質転換体を用いて得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性は１４．０Ｕ／ｍＬであり、形質転換体において本発明のフラビン結合型ＧＤＨが発現されていることが確認された。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挿入された上記の形質転換体を用いて、各基質に対するＧＤＨ活性を測定した。実施例１の酵素活性測定方法に準じ、基質としてはＤ－グルコース、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース、マンノース、スクロース、トレハロースをそれぞれ用いて測定した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　その結果、本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、Ｄ－グルコースに対する活性を１００％とした場合に、各種の糖化合物に対し、いずれも反応性が非常に低いことが判明した。そして、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する活性は、いずれも、２％以下であった。
　本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、Ｄ－グルコースに対する基質特異性が非常に高く、Ｄ－グルコース以外の糖化合物（マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース）への反応性が十分に低いため、Ｄ－グルコース以外の糖化合物を含有する試料を測定する場合でもＤ－グルコース濃度を精度良く定量することができるので、血糖値の測定や食品中のグルコース濃度の定量等の分野において有用である。

Claims (13)

  1. 　以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の性質：
    （ｉ）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
    （ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
    （ｉｉｉ）基質特異性：Ｄ－グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びＤ－ガラクトース、及びＤ－キシロースに対する反応性が低い、
    を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  2. 　Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトース、およびＤ－キシロースに対する反応性がいずれも２％以下である請求項１記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  3. 　以下の（ａ）から（ｃ）の糖化合物：
    （ａ）マルトース
    （ｂ）Ｄ－ガラクトース
    （ｃ）Ｄ－キシロース
    の１以上が存在する場合のＤ－グルコースに対する反応性が、前記（ａ）～（ｃ）が存在しない場合のＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合の９６％～１０４％である、請求項１～２に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  4. 　至適ｐＨがｐＨ６．５～７．０であり、至適温度が３７～４０℃であり、安定ｐＨ範囲がｐＨ３．５～７．０であり、４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  5. 　ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来する請求項１～４のいずれか一項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  6. 　Mucor属に分類される微生物に由来する請求項５記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  7. 　Mucor属に分類される微生物を培地に培養し、該微生物菌体からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
  8. 　微生物がMucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f.circinelloidesから選択される１以上である請求項７記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
  9. 　配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるを有することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  10. 以下の（Ａ）～（Ｅ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （Ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （Ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （Ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （Ｅ）配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８０％以上相同な塩基配列を有し、且つフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ。
  11. 　請求項１０記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
  12. 　請求１１記載の組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体。
  13. 　請求項１０記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子または請求１１記載の組換え体ＤＮＡを含み、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、Ｄ－グルコースに対する反応性に対して、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が低いフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
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