JP7196607B2 - グルコース測定方法およびグルコースセンサ - Google Patents
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Description
そのため、SMBGセンサ上でのD-キシロース作用性に関する評価は、スパイク試験を用いて行われることが多い。また、D-キシロースの影響がないことを確実に担保するために、スパイク試験で採用するD-キシロース濃度は非特許文献1に記載の濃度よりも高く設定し性能評価を行う場合がある。
項1.下記の特性(1)及び(2)を備えるグルコース脱水素酵素を用いるグルコース測定方法。
(1)D-グルコースに対するKmが0.1mM以上、100mM以下
(2)D-キシロースに対するKmが600mM以上、3000mM以下
項2.グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するKmが619mM以上、3000mM以下である項1に記載のグルコース測定方法。
項3.グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するKmが736mM以上、3000mM以下である項1に記載のグルコース測定方法。
項4.グルコース脱水素酵素を備えた酵素電極を用いる項1から3のいずれかに記載のグルコース測定方法。
項5.グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのD-キシロース作用性(10mMのグルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%))が95%以上、105%以下である項1から4のいずれかに記載のD-グルコースを測定する方法。
項6.下記の特性(1)及び(2)を備えるグルコース脱水素酵素が、カーボン電極または金属電極上に備わるグルコースセンサ。
(1)D-グルコースに対するKmが0.1mM以上、100mM以下
(2)D-キシロースに対するKmが600mM以上、3000mM以下
項7.グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのD-キシロース作用性(10mMのグルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%))が95%以上、105%以下である項6に記載のグルコースセンサ。
項8.カーボン電極または金属電極上に、さらに、メディエーターを備えた項6または7に記載のグルコースセンサ。
項9.グルコース脱水素酵素のキシロースに対するミカエリス定数(Km)を測定する工程を含むグルコースセンサの製造方法。
項10.グルコース脱水素酵素のキシロースに対するKmを測定し、かつ、Kmが600mM以上であるグルコース脱水素酵素を選択する工程を含む項9に記載のセンサの製造方法。
本発明のグルコース測定方法は、以下の反応を触媒するグルコース脱水素酵素を利用することを特徴とする。
D-グルコース + 電子受容体(酸化型) → D-グルコノ-δ-ラクトン + 電子受容体(還元型)
温度安定性は、50℃、15分処理後の残存活性が70%以上であることが好ましく、75%以上がより好ましく、80%以上がさらに好ましい。
至適pHは、5.0から8.5であることが好ましく、5.5から8.0がより好ましく、6.0から7.5がさらに好ましい。
pH安定性は、25℃、16時間処理条件下で、2.5から10.0であることが好ましく、3.5から9.0がより好ましく、4.5から8.0がさらに好ましい。
糖含有量は、5%から50%であることが好ましく、10%から40%がより好ましく、20%から30%がさらに好ましい。
至適温度 50~55℃
温度安定性 50℃、15分処理後の残存活性が80%以上
至適pH 7.0付近
pH安定性 4.0~8.0(25℃、16時間)
糖含有量 20~50%
D-グルコースに対するKm 50~70mM
至適温度 50~70℃
温度安定性 50℃、15分処理後の残存活性が80%以上
至適pH 6.5~7.5
pH安定性 2.5~10.0(25℃、16時間)
糖含有量 10~40%
D-グルコースに対するKm 10~90mM
至適温度 45~50℃
温度安定性 45℃、15分処理後の残存活性が80%以上
至適pH 6.0~6.5
pH安定性 3.5~6.5(25℃、16時間)
糖含有量 20~50%
D-グルコースに対するKm 5~20mM
(I)D-キシロースに対するミカエリス定数(Km)が619mM以上であるグルコース脱水素酵素を用いて、酵素電極法により、D-グルコースを測定する。
(II)酵素電極法でのD-キシロース作用性(10mMのD-グルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%))が80%以上120%以下であり、好ましくは85%以上115%以下であり、さらに好ましくは90%以上110%以下であり、さらに好ましくは95%以上105%以下であり、さらに好ましくは97%以上103%以下である。
本発明において、グルコース脱水素酵素の活性は、以下の組成からなる試薬を用いた方法に従い、基質存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量を1単位(U)として定義する。
<試薬>
50mM PIPES緩衝液(pH6.5;0.1%TritonX-100を含む)
24mM PMS溶液
2mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
1M D-グルコース溶液
上記溶液を混合して200mM D‐グルコース、0.068mM DCPIP、1.63mM PMS、0.1% TritonX‐100、35mM PIPES緩衝液(pH6.5)となるように反応試薬を調製する。
まず、反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。これにGDH溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から、次の式に従ってGDH活性を求める。GDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD-グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義する。
グルコース脱水素酵素のD-グルコースに対するミカエリス定数(Km)は、本発明においてはラインウィーバー・バークプロットから算出する。具体的には、上記1記載のD-グルコース脱水素酵素活性測定法において30mM、50mM、100mMおよび200mMの4点のD-グルコース濃度における反応速度を測定することで算出できる。
グルコース脱水素酵素の水系でのD-キシロース作用性は、上記1に記載のグルコース脱水素酵素活性測定法において、基質濃度を50mM及び200mMの2水準に設定した2種類の方法で、それぞれグルコース及びD-キシロースに対する反応性を取得し、グルコースへの反応性に対するキシロースへの反応性の割合を算出することで評価する。キシロースに対する反応性は、以下の測定条件で取得する
50mM PIPES緩衝液(pH6.5;0.1%TritonX-100を含む)
24mM PMS溶液
2mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
1M D-キシロース溶液
上記溶液を混合して50mMまたは200mM D‐キシロース、0.068mM DCPIP、1.63mM PMS、0.1% TritonX‐100、35mM PIPES緩衝液(pH6.5)となるように反応試薬を調製する。
まず、反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。これにGDH溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から、上記1に記載の方法によりキシロースに対する反応性を求める。
グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するミカエリス定数(Km)は、本発明においてはラインウィーバー・バークプロットから算出する。具体的には、上記1記載のグルコース脱水素酵素活性測定法において基質をD-グルコースからD-キシロースに変更し、各種D-キシロース濃度における反応速度を測定することで算出できる。算出のために用いるD-キシロース濃度は、その酵素のミカエリス定数に応じて適切な濃度を設定できるが、本発明では、Kmが0mM~100mMの間であれば、30mM、50mM、100mM及び200mMの4点、Kmが100mM~500mMの間であれば、50mM、200mM、600mMおよび1000mMの4点、Kmが500mM~1500mMの間であれば、50mM、200mM、600mMおよび1400mMの4点をプロットするものとする。
本発明に用いる酵素電極法は特に限定されない。図5に酵素電極を用いてD-グルコースを測定する方法の原理の一例を示す。グルコース脱水素酵素は、メディエーター(電子受容体)の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。FADGDHがD-グルコースに作用する際に、補酵素FADはFADH2(還元型)となるが、メディエーターとしてフェリシアン化物(例えば「Fe(CN)6」3-)を存在させると、FADH2(還元型)はこれをフェロシアン化物(この場合「Fe(CN)6」4-)へと変換し、自らはFAD(酸化型)へと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質をメディエーターとすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。
酵素電極法におけるキシロースに対する反応性は、下記の方法で作製したセンサチップを用い、10mMのグルコース溶液に対し、20mM(300mg/dLに相当)のD-キシロースをスパイクした溶液で評価する。なお、この条件は、非特許文献1に記載の条件を参考に、非特許文献1の推奨条件より厳しく設定したものである。
絶縁性基板に作用電極、対向電極および参照電極を配した電極センサを、有限会社バイオデバイステクノロジー(石川県能美市)より、委託製造により入手した。本電極センサは、4.0mm×17mmの基板上に電極が印刷されている。このセンサの作用電極(面積約1.3mm2)上に試薬層となる水溶液を3μLマウントした。試薬層となる水溶液には、下記の組成からなる。
1000U/ml FAD-GDH
200mM フェリシアン化カリウム
50mM リン酸カリウムバッファー (pH7.0)
これを50℃で10分加温することにより乾燥させ、FADGDHが1枚当たり3U固定化されたグルコースセンサチップを得る。
10mMのグルコース溶液及び10mMのグルコース溶液に対し、20mMのD-キシロースをスパイクした溶液を調製する。ポテンショスタットに接続した上記チップに、これら試料溶液5μLをマイクロピペットで滴下し、滴下から5秒後に+300mVの電圧を印加、電流値を測定する。10mMのグルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのグルコース溶液に対し、20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%)を酵素電極法におけるキシロースに対する作用性と定義する。この値が100%であれば、D-キシロースからの影響を全く受けないことを示す。この値が100%から離れるほど、D-キシロースから正または負の影響を受けていることになる。
4種類のFADGDH(後述のGDH1~4)についてその特性を比較した。比較した項目および各項目の測定方法は、次の通りである。
(a)基質濃度50mMでの水系でのD-キシロース作用性
測定法:「3.グルコース脱水素酵素の水系でのD-キシロース作用性の評価方法」に記載の方法
(b)水系でのD-キシロースに対するミカエリス定数(Km)
測定法:「4.グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するミカエリス定数」に記載の方法
(c)水系でのD-グルコースに対するミカエリス定数(Km)
測定法:「2.グルコース脱水素酵素のD-グルコースに対するミカエリス定数」に記載の方法
(d)酵素電極法でのD-キシロース作用性
測定法:「6.酵素電極法におけるD-キシロース作用性の評価方法」に記載の方法
GDH1~4における各種酵素特性を比較した結果を表1に示す。
実施例1の結果から導かれた前記の仮説を検証するために、D-キシロースに対するKm(b)が619mM以上となるGDHを探索した。特開2015-84676の実施例1には、サッカロマイセス属酵母を宿主とした、FADGDHランダム変異ライブラリーの構築について記載がある。配列番号5のアミノ酸配列記載のGDHをコードするDNAから、特開2015-84676の実施例1記載の方法に基づく方法で、1000株からなるサッカロミセス属酵母を宿主とした、FADGDHランダム変異ライブラリーを構築した。
溶液中での酵素の反応速度が分単位の観察によって計算されるのに対し、酵素電極法に代表されるセンサ系では、秒単位あるいはミリ秒単位の変化を電流応答値として観察している。実施例1の結果より、D-キシロースに対する親和性が低い、すなわちKmが十分に大きい酵素を使用した酵素電極法においては、瞬間的に測り込まれるD-キシロース分解に由来の電流応答値が少なく抑えられるため、D-キシローススパイク条件下での電流応答値の変動が小さくなるであろうと推測された。
Claims (8)
- グルコース脱水素酵素のD-グルコースおよびD-キシロースに対するミカエリス定数(Km)を測定する工程、並びに10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値を測定する工程を含み、かつ、下記の特性(1)及び(2)を備えるグルコース脱水素酵素を用いる、グルコースセンサの製造方法。
(1)D-グルコースに対するKmが0.1mM以上、100mM以下
(2)D-キシロースに対するKmが600mM以上、3000mM以下 - グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するKmが619mM以上、3000mM以下である、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
- グルコース脱水素酵素のD-キシロースに対するKmが736mM以上、3000mM以下である、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
- グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのD-キシロース作用性(10mMのグルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%))が95%以上、105%以下である、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
- グルコース脱水素酵素が、さらに、酵素電極法でのD-キシロース作用性(10mMのグルコース溶液に対する応答値に対して、10mMのD-グルコース溶液に対し20mMのD-キシロースをスパイクした溶液に対する応答値の割合(%))が97%以上、103%以下である、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
- グルコース脱水素酵素が、以下の(a)から(f)に示す理化学的特性を有する、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
(a)至適温度50~55℃
(b)温度安定性50℃、15分処理後の残存活性が80%以上
(c)至適pH 7.0付近
(d)pH安定性4.0~8.0(25℃、16時間)
(e)糖含有量20~50%
(f)D-グルコースに対するKm 50~70mM - グルコース脱水素酵素が、以下の(a)から(f)に示す理化学的特性を有する、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
(a)至適温度50~70℃
(b)温度安定性50℃、15分処理後の残存活性が80%以上
(c)至適pH 6.5~7.5
(d)pH安定性2.5~10.0(25℃、16時間)
(e)糖含有量10~40%
(f)D-グルコースに対するKm 10~90mM - グルコース脱水素酵素が、以下の(a)から(f)に示す理化学的特性を有する、請求項1に記載のグルコースセンサの製造方法。
(a)至適温度45~50℃
(b)温度安定性45℃、15分処理後の残存活性が80%以上
(c)至適pH 6.0~6.5
(d)pH安定性3.5~6.5(25℃、16時間)
(e)糖含有量20~50%
(f)D-グルコースに対するKm 5~20mM
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