JP2011525361A - 向上した基質特異性を有するpqq−依存的グルコースデヒドロゲナーゼの新規変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明による変異体を生産するために、sPQQGDHについての遺伝子は発現プラスミドにおいて利用可能にしなければならず、該発現プラスミドは微生物において増殖させることができるものであって、sPQQGDHの発現を誘導し、所望の突然変異の実施に用いることができるものである。この目的のために利用可能な多様なプラスミドおよび微生物が当業者に公知である。本実施例およびすべてのさらなる実施例において、市販のベクター pASK-IBA3 (IBA GmbH、Goettingen)に基づくコンストラクトを用いた。株、アシネトバクター種(sp.)KOZ65からのsPQQGDH 遺伝子をpASK-IBA3へと以下のようにしてクローニングした。1.46 kb長のDNA断片をアシネトバクター種(sp.) KOZ65のゲノム DNAから2つのオリゴヌクレオチド、GDH-U3 (5’-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGC TAAAATTAC-3’; 配列番号19) および GDH-L5 (5’-TTCAGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATC-3’; 配列番号20)を用いて、製造業者の指示にしたがってPCR反応 (Phusion DNA Polymerase、Finnzymes Oy)によって作成した。断片をクリーンアップし(cleaned up)、次いで制限酵素 BsaIとともにインキュベートした。ベクター pASK-IBA3を制限酵素 HindIIIにより開裂した。制限酵素を熱処理によって変性させ、結果として得られたDNA オーバーハングをdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの存在下でT4 DNA ポリメラーゼを用いて埋めて平滑化した(filled)。DNAを次いでクリーンアップし、制限酵素 BsaIとともにインキュベートした。こうして遊離した 114 bp長断片を棄てた; KOZ65からの sPQQGDH 遺伝子を有するPCR アンプリコンを3.1 kb長ベクター断片へとライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌株 DH5αのコンピテントセルへと形質転換した。このようにして生成したベクター pAI3B-KOZ65は、型KOZ65のsPQQGDHの誘導性発現に好適である。ベクター pAI3B-KOZ65のヌクレオチド配列を配列番号21に報告し;それによってコードされるsPQQGDHのアミノ酸配列を配列番号22に報告する。
位置Q168とL169との間に4つの追加のアミノ酸を有する挿入突然変異体を生産するために、4つの合成オリゴヌクレオチドを用いた: EarV2-Random (5’-CGACGTAACCAGNNKNNKNNKNNKCTGGCTTACCTG-3’; 配列番号29)、EarV2-Lower (5’-GTGTGCTGTGCCTGGTTCGGCAGGAACAGGTAAGCCAG-3’; 配列番号 30)、EarV2-UpAmp (5’-CCTACCTACGACTCTTCCGACGTAACCAG-3’; 配列番号 31)、およびEarV2-LoAmp (5’-CCATGCTCTTCAGTCGGAGTGTGCTGTGCC-3’; 配列番号 32)。図2において、これらオリゴヌクレオチドから二本鎖挿入断片を生産する戦略を模式的に図示する。4つの挿入すべきアミノ酸の配列はこの場合、ランダム化されている: NNK NNK NNK NNK。Nは、それぞれの位置のオリゴヌクレオチドの合成における4つのすべてのヌクレオチド(dATP (A)、dCTP (C)、dGTP (G)、dTTP (T)) の混合物であり、一方、Kは、GまたはTである。配列 NNKはすべての20のアミノ酸についてのコドンを有することを可能にするが、3つの終止コドンの1つのみのコドンを有することを可能にするものであるため、不完全な遺伝子産物の可能性を低下させる。個々の位置におけるヌクレオチドの別の組合せは自由に選択可能であり、例えばその目的としては、あるコドン位置において可能なアミノ酸を制限することが挙げられる。オリゴヌクレオチド EarV2-Randomは、R166から L172をコードする配列を含み;オリゴヌクレオチド EarV2-Lowerは、L169 からL172の領域においてオーバーラップし、T181まで達する相補鎖を表す。オリゴヌクレオチド EarV2-UpAmpは3’末端にてオリゴヌクレオチド EarV2-Randomの5’末端と12 bpオーバーラップし、オリゴヌクレオチド EarV2-LoAmpは同様に3’末端にてオリゴヌクレオチド EarV2-Lowerの5’末端と12 bpオーバーラップする。最後に言及した2つのオリゴヌクレオチドはそれぞれEarI 制限部位 (CTCTTCN’NNN)を含む。
実施例 2に記載の方法に従って生産したライブラリーから好適な変異体を選択するために、2200のコロニーを全部で約4000のコロニーを有する2枚の寒天プレートから自動コロニーピッカー QPix (Genetix)によりピックアップし、各場合において、ウェルあたりアンピシリンを100 μg/mL含む200μLの LB 培地を有するマイクロタイタープレート (MTP)に移した。4つのMTP上の全部で8つのウェルにさらに元の株である大腸菌-DH5α::pAI3B-KOZ65の培養物を接種した。MTPをガス透過性フィルム (Airpore Sheets、Qiagen)で密封し、5 時間37℃で振盪した。次いで、50 μLの各個々の培養液を150 μL のアンピシリンを含むLB 培地が存在するMTP中の新しいウェルに移した。この目的のために、96のピペッティング操作を並行して実行するピペッティングロボットを利用した。この培地にはさらに200 ng/mL のアンヒドロテトラサイクリンを加えてsPQQGDH 遺伝子の発現を誘導した。これらの MTPは28℃で一晩振盪した。
実施例 3に記載のスクリーニングを用いて188のコロニーが選択され、これらはグルコースに対する活性およびグルコースまたはマルトースに対する活性の比の両方が特に有望であるようであり、これらコロニーを2つの新しいMTP上に元の株 大腸菌-DH5α::pAI3B-KOZ65の培養液とともに編成し、まず37℃で培養し、次いで実施例 3に記載のように28℃で一晩誘導をかけた。誘導のために、2つのプレートを各MTPから設定してスクリーニング実験のために十分な培養溶液を得た。誘導の後、並行して培養された、それぞれ約200 μLの培養液を一緒にして混合した。これらの誘導をかけた培養液のそれぞれから、40 μLを各場合において測定プレートに移し、測定プレートには実施例 3に記載のように60 μL の試験溶液が各場合において存在したが、以下の糖を有するものであった: G - 50 mM グルコース、M - 50 mM マルトース、GM - 50 mM グルコースおよび50 mM マルトース、GGal -50 mM グルコースおよび50 mM ガラクトース、またはGXyl - 50 mM グルコースおよび50 mM キシロース。これらのプレートを培養液と測定溶液の混合の直後に30 分かけて30秒の間隔で測定し、各個々の培養液の反応速度論を得た。このようにして得たデータから、グルコースおよびマルトース単独に対する変換速度、グルコースおよびマルトースに対する活性の比、そして特に、グルコースの変換に対するマルトース、ガラクトース、およびキシロースの影響 (干渉)を各培養液について評価することができる。図 4において、実施例 3に記載のスクリーニングについて選択されたコロニーの追跡調査(二次スクリーニング) の結果を示す。
まず、前培養液(preculture)を、各場合において3つの追加のアミノ酸を位置Q168とL169との間に有するライブラリーの4つの選択されたコロニーのそれぞれから以下のようにして産生した: 2 mLのTB 培地 (100μg/mL アンピシリンを含む)に確認すべきコロニーを接種し、一晩37℃で225 rpmにて振盪した。主培養液(main culture)について、50 mLのTB 培地 (100 μg/mL アンピシリン)に完全に成育した前培養液を接種した。培養液を37℃で225 rpmにて605 nmでの光学密度(OD605)が約1に達するまで振盪した。次いで、酵素の発現をアンヒドロテトラサイクリン (AHT) ストック溶液の添加により誘導した。この目的のために、誘導物質をDMFに溶解した。培養液中のAHTの終濃度は0.2 μg/mLであり;誘導は24時間27℃で225 rpmにて行った。
実施例 5からの上清をカラムバッファー (10 mM MOPS、pH 7.6 + 2.5 mM CaCl2) で1:5から10または50 mLに希釈し、陽イオン交換体 (Toyopearl CM-650M、TOSOH BIOSEP GmbH)でのクロマトグラフィーにより分離した。この目的のために、約16 mLの カラム床を有する10 x 1.42 cmのカラムを用いる;流速は4 mL/分とした。カラムを10 カラム容積のバッファーにより平衡化した; その後、サンプルをアプライした。カラムを4 カラム容積のバッファーにより洗浄した;次いで、sPQQGDHをカラムバッファー中0から0.4 M NaClの線形塩グラジエントによって溶出させ、溶出液を1または3 mLのフラクションに回収した。sPQQGDHは実質的に均一なタンパク質としてこれら条件で溶出したので、さらなるクリーンアップは不要であった。タンパク質を測定するために、溶液のOD280 を測定した。KOZ65からのクリーンアップしたsPQQGDH タンパク質により、1 mg/mL sPQQGDH 溶液のOD280 (PQQ-不含有アポ酵素)は1.27であることが重量分析により以前に確立されていた。
酵素活性を正確に測定するために、以下の試験を用いた。調査すべき酵素溶液について各場合において以下のバッファー中の希釈系列を作った: 50 mM 1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸 (PIPES)、pH 6.5、0.1% Triton X-100、1 mM CaCl2、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA)、および3 μM PQQ。基質として作用する糖、電子媒介物質である N-メチルフェナゾニウムメタスルフェート(PMS)、および検出試薬であるニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)を別々に調製した:二回蒸留水中の50 mM PIPES、pH 6.5、および 2% Triton X-100の11.7 mL の溶液を450 μLの0.9 M D-グルコース、450 μLの6 mM PMS、および450 μL の6.6 mM NBT (すべての物質は二回蒸留水に溶解されている)と混合し、暗所で25℃で維持し、1時間以内に使用した。グルコース以外の糖に対する酵素活性を測定する場合は、グルコースのかわりにそれらの糖を濃度0.9 Mにて用いる。測定溶液中の個々の反応物の終濃度は以下の通りであった: 30 mM 糖基質、200 μM PMS、および220 μM NBT。あらかじめ温めておいた試験溶液 (725 μL)をキュベット中で25 μLの希釈酵素溶液と混合し、ホルマザンの発色(development)を570 nmにて25℃で3 分間追跡した。1 μmolのグルコースの変換の結果、0.5 μmolのホルマザンが生じ、そのモル吸光係数ε = 40,200 M-1cm-1である。したがって、サンプル中の酵素濃度は以下の関係によって確認することができる: 1 U/mLのsPQQGDH はOD570の1.493 min-1の変化に対応する。0.05 U/mLを下回るかまたは0.7 U/mLを上回る測定値は棄却しなければならないことが判明したため、個々のサンプルの希釈系列は必要である。というのは、測定の十分な線形性はこの範囲を超えると確証されないからである。次いで元のサンプルの濃度を用いた希釈レベルを考慮して算出した。結果を以下の表2に示す。
表2:
目的の変異体における位置Q168とL169との間に挿入された実際のアミノ酸を確認するために、プラスミド DNAを目的の株から QiaPrep プラスミド単離キット(Qiagen、Hilden)を用いて製造業者の指示に従って調製し、挿入部位のDNA 配列をオリゴヌクレオチド、4472-US1 (5’-CACCGTTAAAGCTTGGATTATC-3’; 配列番号 34)および4831-DS1 (5’-CCTTCATCGAAAGACCATCAG-3’; 配列番号 35)をプライマーとして用いて両方向から確認した。4472-US1の配列の3’末端は挿入部位の58 bp上流に位置しており; 4831-DS1の配列の3’末端は挿入部位の82 bp下流に位置している。配列分析の結果を以下の表3に列挙する。
出発試験溶液における30 mM の基質濃度が通常、sPQQGDHの比活性の判定のために用いられるが、問題の糖のより低い濃度は干渉の確認のために適している;約1桁が以下の適用において起こりうる(as occurs in potential)。血中のグルコースの生理濃度は約100 mg/dLであり、約5.6 mMに相当する。この理由のため、以下に示す実験は100 mg/dLのグルコース 濃度および50から250 mg/dLの干渉性の糖を用いて行った。しかし場合によっては、両方の糖のその他の濃度および互いの比も調査した。
KOZ65から挿入突然変異を有さないsPQQGDHとの直接比較を可能にするために、クローン 5152-20-A7からのクリーンアップした 変異体 sPQQGDHおよびKOZ65からのクリーンアップした酵素をグルコースおよび、糖、マルトース、ガラクトース、キシロース、ラクトース、セロビオース、またはマンノースの混合物に対して調査した。各測定点について、4連を記録した。図6は、KOZ65 からの元の酵素でのマルトース、セロビオース、およびラクトースによる強い干渉が変異体 5152-20-A7によって発現された酵素においては抑制されていることを示す。より具体的には、約等モル量のマルトースによる(100 mg/dL グルコース の200 mg/dL マルトースによる) 干渉がKOZ65での63%から 5152-20-A7での6%へと低下しており;ラクトースについては、干渉はもはや有意ではない。
向上した基質特異性を有するsPQQGDH 変異体の生産のための本発明による手順の一般妥当性を示すために、3、4および5つの追加のアミノ酸をKOZ65からの野生型 sPQQGDHの位置Q168とL169との間に有するライブラリーを設計し、以前の実施例に記載のようにして調査した。比較のために、位置Q168とL169との間に2つのみの追加のアミノ酸を有するライブラリーも設定し、調査した。しかし、基質特異性にわずかな向上を有する10のみのクローンがみられた(マルトースおよびグルコースに対する活性の比が25から75%)。1つのみのクローン (5156-13-G12;表4参照)が向上した基質特異性を有していたが、グルコースに対する比活性は低かった。しかし、以下の表4から明らかなように、3から5の追加のアミノ酸を有するすべてのライブラリーが、野生型よりも顕著に高い基質特異性を示すクローンを含んでいた。
Claims (13)
- アシネトバクター属の種からの野生型株の1つ、例えば、アシネトバクター・カルコアセチカス LMD 79.41、の可溶性ピロロキノリン-キノン-依存的グルコースデヒドロゲナーゼ (sPQQGDH)と比較して、基質結合領域の領域において3から5のアミノ酸の挿入を有することを特徴とするsPQQGDH。
- 挿入部位が、基質結合領域から多くとも5 オングストロームの距離だけ離れている請求項1のsPQQGDH。
- 挿入部位が野生型 アシネトバクター・カルコアセチカス LMD 79.41の配列に基づいて位置Q168とL169との間にある請求項1または2のいずれかのsPQQGDH。
- 以下のシリーズの株から突然変異誘発によって生じたものである請求項1から 3のいずれかのsPQQGDH:PT16、KOZ62、KOZ65、PTN69、KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGN100。
- 3 アミノ酸の挿入を有する請求項1から 4のいずれかのsPQQGDHであって、挿入されたアミノ酸が位置 1にAまたはGを有し、位置 2にY、F、またはWを有し、かつ位置 3にQ、L、V、またはIを有するsPQQGDH。
- 4 アミノ酸の挿入を有する請求項1から 4のいずれかのsPQQGDHであって、挿入されたアミノ酸が位置 1に AまたはGを有し、位置 2に G、D、またはLを有し、位置 3に RまたはAを有し、かつ、位置 4にMまたはVを有するsPQQGDH。
- 5 アミノ酸の挿入を有する請求項1から 4のいずれかのsPQQGDHであって、挿入されたアミノ酸が位置 1に A、M、S、またはVを有し、位置 2に E、G、またはSを有し、位置 3に H、K、R、S、またはTを有し、位置 4にF、H、I、L、N、V、またはYを有し、かつ、位置 5にF、H、L、N、Q、T、またはYを有するsPQQGDH。
- 配列番号1から配列番号18からの挿入配列を有する請求項1から 4のいずれかのsPQQGDH。
- 請求項1から8のいずれかのタンパク質の1つをコードする遺伝子。
- 挿入部位の領域において、ユニークな制限酵素切断部位を有することにより、この部位に請求項1から 6のいずれかのsPQQGDHをコードするオリゴヌクレオチド配列が挿入可能となることを特徴とするベクター。
- 配列番号27の配列を有する請求項10のベクター。
- 請求項1から 8のいずれかのsPQQGDHを生産および同定する方法であって、第1工程において、挿入部位の領域においてユニークな制限酵素切断部位を有するベクターが作られ、第2工程において、多様な異なるオリゴヌクレオチド配列が該ベクターに挿入され、第3工程において、こうして得られた組換えベクターが宿主細菌へと形質転換され、そして細菌が増殖させられ、第4工程において細菌によって産生されたsPQQGDHが、少なくとも2つの異なる糖に対するsPQQGDH の個々の活性および少なくとも1つの糖の少なくとも1つの別の糖による干渉の両方が測定されるスクリーニングに供され、そして第5工程において、野生株の非修飾 sPQQGDHと比較して向上した基質特異性を有するsPQQGDHが選択されることを特徴とする、方法。
- 請求項1から 8のいずれかのsPQQGDHを含むグルコースセンサー。
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