JP2000312588A - グルコース脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、改良されたグルコースに対する親
和性を有する改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供すること
を目的とする。 【解決手段】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨの第２６８残基から２８９残基に相当する領
域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミ
ノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グル
コース脱水素酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型ＰＱＱＧＤＨに関する。本発明の改変
型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコース
の定量に有用である。

【０００２】

【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。

【０００３】ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性
酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨ
は、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株に
おいてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９
（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクロ
ーニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３
０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのホモダイマ
ーである。他のＰＱＱ酵素とは蛋白質一次構造上でのホ
モロジーがほとんどなく、その機能と構造の相関に関す
る研究はすすんでいないため、酵素安定化の指針となり
うる知見はこれまでに得られていない。

【０００４】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマ
ーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しか
し、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にとも
ない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼある
いはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要があ
った。またＧＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進め
られてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存す
ることから高濃度のグルコース試料には適さないこと、
あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可
能性があった。一方、Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に基づ
くグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補酵素
であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないという煩
雑性があった。そこで、これまでのグルコース酵素定量
方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素としてＰ
ＱＱＧＤＨの応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨはグ
ルコースに対して高い酸化活性を有していること、およ
びＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受
容体として酸素を必要としないことから、グルコースセ
ンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応
用が期待されている。しかしながら、ＰＱＱＧＤＨはグ
ルコースに対する親和性が低いこという問題点があっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、改良されたグルコースに対する親和性を有する改変
型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は従来の水溶性
ＰＱＱＧＤＨを改良してそのグルコースに対する親和性
を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶
性ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸変異を導
入することにより、グルコースに対する親和性がきわめ
て高い酵素を得ることに成功した。

【０００７】すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノ
ンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におい
て、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の１またはそれ
以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されてお
り、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較
してグルコースに対して親和性が向上していることを特
徴とする改変型グルコース脱水素酵素を提供する。好ま
しくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対
するＫｍ値は１０ｍＭ未満であり、天然型のＰＱＱＧＤ
ＨのＫｍ値の２０ｍＭより低い。

【０００８】本発明はまた、ピロロキノリンキノンを補
酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
由来水溶性ＰＱＱＧＤＨ（本明細書においては、野生型
ＰＱＱＧＤＨとも称される）の第２６８残基から２８９
残基に相当する領域において１またはそれ以上のアミノ
酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グル
コース脱水素酵素を提供する。なお、本明細書において
は、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号
付けする。

【０００９】本発明の特に好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨ
は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２６８残基
から２８９残基の領域において、１またはそれ以上のア
ミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。さら
に好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番
号１で表されるアミノ酸配列の２７７番目のグルタミン
酸残基が、アラニン、アスパラギン、リジン、アスパラ
ギン酸、ヒスチジン、グルタミン、バリンおよびグリシ
ンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されて
いるか、または２７８番目のイソロイシン残基がフェニ
ルアラニン残基で置換されている。

【００１０】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列：Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser
Asp Asp Xaa1 Xaa2 Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn
Tyr Gly Trp［式中、Ｘａａ１およびはＸａａ２は任意
の天然アミノ酸残基であるが、ただし、Ｘａａ１がＧｌ
ｕであるときＸａａ２はＩｌｅではない］を含む。

【００１１】本発明はまた、上述の改変型グルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター
および該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ットおよびグルコースセンサーを提供する。

【００１２】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素蛋白質
はグルコースに対して高い親和性を示し、かつグルコー
スに対して高い酸化活性を有していることから、グルコ
ースの高感度かつ高選択的な測定に応用できる。

【００１３】

【発明の実施の形態】改変型ＰＱＱＧＤＨの構造 本発明者は、水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の
コーディング領域中にエラープローンＰＣＲ法によりラ
ンダムに変異を導入し、アミノ酸残基の変異が導入され
た水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを構築した。これ
を大腸菌に形質転換し、グルコースに対するＰＱＱＧＤ
Ｈの活性についてスクリーニングして、２０ｍＭ濃度の
グルコースに対する活性が１００ｍＭのグルコースに対
する活性と同等であり、低濃度のグルコースに対して野
生型酵素より反応性が向上したＰＱＱＧＤＨを発現する
多数のクローンを得た。

【００１４】これらのクローンの一つについて遺伝子配
列を解析したところ、第２７７番目のＧｌｕがＧｌｙに
置換されていることが判明した。さらにこの残基を種々
の別のアミノ酸残基に置換したところ、いずれの残基に
置換しても野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨよりもグルコース
に対する親和性が向上した優れた変異酵素が得られた。
次に、これらの結果に基づいて、他のアミノ酸残基の変
異によるグルコースに対する親和性の向上の可能性につ
いて検討した。

【００１５】これまでに水溶性ＰＱＱＧＤＨと一次構造
上類似する蛋白質がほとんど知られていないことから、
その構造と機能の相関に関する研究はほとんど進められ
ていなかった。そこで本発明者は、現在一般に知られて
いる最も信頼できる蛋白質二次構造予測のひとつであ
り、ニューラルネットワークを基本としたアルゴリズム
により蛋白質二次構造を予測するプログラム、ＰＨＤ法
（Rost, B., PHD: Predicting one-dimensional protei
n structure by profile based neural networks, Meth
ods Enzymol., 266, 525-539(1996))により水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨの一次構造をもとに、水溶性ＰＱＱＧＤＨの二
次構造を予測した。その結果本酵素は３０本のβストラ
ンドから構成されるβ蛋白質であることが示された。さ
らに、組み換えＤＮＡ技術を用いてA.calcoaceticus 由
来の野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨを大腸菌を用いて生産
し、精製し、これを円二色性偏向分光光度計により解析
した。得られたスペクトルより常法に従って、本酵素の
二次構造含有量を測定したところ、βストランドが約４
５％であり、他の特徴的な二次構造を含有していないこ
とを見いだした。さらに得られた二次構造含有量は先に
示したＰＨＤ法による二次構造予測から得られた水溶性
ＰＱＱＧＤＨの二次構造とほぼ一致した。このことは、
上述の水溶性ＰＱＱＧＤＨの二次構造予測の妥当性を実
験的に支持するものである。さらに、この二次構造のパ
ターンに関してThreading method ( Rost,B., Schneide
r, R. and Sander, C. Protein fold recognition by p
rediction-based threading. J. Mol. Biol., 270, 471
-480(1997))によって同様な二次構造パターンを示す蛋
白質を検索したところ、シアリダーゼとガラクトースオ
キシダーゼと共通な二次構造パターンをもっていること
が予測された。シアリダーゼとガラクトースオキシダー
ゼは２つともβ蛋白質であり、その中でもβストランド
４本から構成されるＷ―モチーフと呼ばれる特徴的な構
造が環状のプロペラ構造を形成するβプロペラ蛋白質で
ある。シアリダーゼは６つのＷ−モチーフから、ガラク
トースオキシダーゼは７つのＷ−モチーフから構成され
ているβプロペラ蛋白質である。一方、これまでにＰＱ
Ｑを補酵素とする酵素の中で唯一高次構造が明らかにさ
れているＰＱＱメタノール脱水素酵素もＷ−モチーフ８
つから構成されるβプロペラ蛋白質であることが明らか
となっている。これらのことから、水溶性ＰＱＱＧＤＨ
も同様にβプロペラ蛋白質であると予測される。

【００１６】これまでにβプロペラ蛋白質の基質認識に
関する研究に関してはSodeらの膜結合性ＰＱＱＧＤＨに
関する一連の研究(Biotechnol. Lett., 19, 1073-1077
(1997) Improved substrate specificity and dynamic
range for glucose measurement of Escherichia coli
PQQ glucose dehydrogenase by site directed mutagen
esis, K.Sode and K.Kojima, Protein Engineering, 1
2, 63-70 (1999) Engineering a chimeric pyrroloquin
oline quinone glucose dehydrogenase: improvement o
f EDTA tolerance, thermal stability and substrate
specificity, byH.Yoshida et al.)およびCozierらによ
る構造予測モデルでの総説(Biochem.,J.,312, 679-685
(1995) Structure of the quinoprotein glucose dehyd
rogenaseof Escherichia coli modeled on that of met
hanol dehydrogenase from Methylobacterium extorque
ns)がある。これらの研究によれば、基質認識に関与す
る領域はループにあることが示唆されており、Sodeらの
研究により、膜結合性ＰＱＱＧＤＨのループに存在する
７７５番目の残基であるＨｉｓを他のアミノ酸残基に置
換することにより、グルコースに対する親和性、ならび
に基質特異性を改変できることが報告されている。

【００１７】本発明においては、ループ領域の１つであ
る第２６８残基から２８９残基の領域中の第２７７番目
のGluを他のアミノ酸に置換することにより、グルコー
スに対する親和性が向上することが見いだされた。すな
わち、本ループ領域中に適切な変異を導入することによ
り、水溶性ＰＱＱＧＤＨにおいてもグルコースに対する
親和性が向上したＰＱＱＧＤＨを構築しうることが立証
された。

【００１８】そこで、本ループ内の他の残基に関して部
位特異的に変異を導入し、グルコースに対する親和性の
向上を試みた。第２６８残基から２８９残基のループ領
域中の、２７８番目のＩｌｅをＰｈｅに置換した改変型
酵素、および２７９番目のＡｓｎをＨｉｓに置換した改
変型酵素を作成し、その活性を測定したところ、予測さ
れたように、これらの改変型酵素のグルコースに対する
親和性が向上した。このことは、水溶性ＰＱＱＧＤＨに
おいては、このループ領域がその基質認識に重要な役割
を担っており、この特定のループ領域には、変異を導入
することによりグルコースに対する親和性を向上させう
るアミノ酸残基が存在することを意味する。上記に示し
たＧｌｕ２７７、Ｉｌｅ２７８およびＡｓｎ２７９残基
は単なる例であり、本発明を限定するものではない。

【００１９】すなわち、本発明は、ループ領域の構造遺
伝子の特定の部位に変異を導入することによりＰＱＱＧ
ＤＨのグルコースに対する親和性を改良できることを当
該技術分野において初めて明らかにしたものであり、Ｐ
ＱＱＧＤＨの基質特異性を改良する方法論がここで提供
される。

【００２０】本発明の好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨは、
配列番号１で表されるアミノ酸配列の第２６８残基から
２８９残基の領域において、１またはそれ以上のアミノ
酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。さらに、
本発明の特に好ましい改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号
１で表されるアミノ酸配列の２７７番目のグルタミン酸
残基が、アラニン、アスパラギン、リジン、アスパラギ
ン酸、ヒスチジン、グルタミン、バリンおよびグリシン
からなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されてい
るか、または２７８番目のイソロイシン残基がフェニル
アラニン残基で置換されている。

【００２１】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列：Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser
Asp Asp Xaa1 Xaa2 Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn
Tyr Gly Trp［式中、Ｘａａ１およびはＸａａ２は任意
の天然アミノ酸残基であるが、ただし、Ｘａａ１がＧｌ
ｕであるときＸａａ２はＩｌｅではない］を含む。

【００２２】本発明の改変型グルコース脱水素酵素にお
いては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限
り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換さ
れていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されてい
てもよい。

【００２３】さらに、当業者は、他の細菌に由来する水
溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがっ
てループ構造を有する領域を予測し、この領域内でアミ
ノ酸残基を置換することにより、グルコースに対する親
和性が向上した改変型グルコース脱水素酵素を得ること
ができる。特に、蛋白質の一次構造を並列して比較する
こと、あるいは当該酵素の一次構造をもとに予測された
二次構造を比較することにより、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨの第２６８残基から２８９残基のループ領域お
よびその領域における２７７番目のグルタミン酸残基お
よび２７８番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基
を容易に認識することができ、本発明にしたがって、か
かるループ領域中において１またはそれ以上のアミノ酸
残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、基質に
対する親和性が改良された改変型グルコース脱水素酵素
を得ることができる。これらの改変型グルコース脱水素
酵素も本発明の範囲内である。改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は配列番号２で規定される。

【００２４】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子において、上述のループ領域中に存在するアミノ酸残
基をコードする塩基配列を、変異すべきアミノ酸残基を
コードする塩基配列に置換することにより構築すること
ができる。このような部位特異的塩基配列置換のための
種々の方法が、当該技術分野において知られている。こ
のようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター
（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例
えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させ
るための多くのベクター・宿主系が当該技術分野におい
て知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培
養細胞などの種々のものを用いることができる。

【００２５】ランダム変異を導入する場合には、標的と
するループ領域においてエラープローンＰＣＲ法により
ランダムに変異を導入し、ループ領域に変異が導入され
た変異水溶性ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを構築す
る。これを大腸菌に形質転換し、ＰＱＱＧＤＨのグルコ
ースに対する親和性について各クローンをスクリーニン
グする。水溶性ＰＱＱＧＤＨは大腸菌において発現させ
たときにペリプラズム空間に分泌されるため、菌体その
ものを用いて容易に酵素活性の検定を行うことができ
る。このライブラリーを２０ｍＭグルコース存在下で色
素としてＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、ＰＱＱＧＤＨの活性
を目視により判定して、グルコース１００ｍＭに対する
活性と同等な活性を示すクローンを選択し、遺伝子配列
を解析してその変異を確認する。

【００２６】上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させるこ
ともできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、Ｈ
ＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨを調製する。酵素活性の測定方法 本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。

【００２７】酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグ
ルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸
化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈
色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ンなどを用いることができる。グルコースに対する親和性 本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対する親和
性が野生型の親和性より大幅に向上している。すなわ
ち、改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対するＫｍ値は
全て１０ｍＭ未満であり、野生型ＰＱＱＧＤＨのグルコ
ースに対するＫｍ値２０ｍＭより大幅に低い。改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨの中でもＥ２７７Ｋのグルコースに対するＫ
ｍ値は３．８ｍＭであり、また最大活性も野生型酵素と
遜色ないことから、低い濃度のグルコースに対する反応
性が向上している。

【００２８】したがって、本改変型酵素を用いて作成さ
れたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース
測定に関して感度が高く、低い濃度のグルコースが検出
できるなどの優れた利点を有する。グルコースアッセイキット 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧ
ＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。グルコースセンサー 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドをブロッキングする。

【００２９】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱ
およびＣａＣｌ₂、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電
極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。

【００３０】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリの構築およびスクリ
ーニング プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファ
ルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Acinetob
acter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構
造遺伝子を挿入したものである（図１）。このプラスミ
ドをテンプレートとして、エラープローンＰＣＲ法によ
りコーディング領域中にランダムに変異を導入した。Ｐ
ＣＲ反応は、表１に示す組成の溶液中で、９４℃３分
間、次に、９４℃３分間、５０℃２分間、および７２℃
２分間を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間の条件
で行った。

【００３１】

【表１】

【００３２】得られた変異水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブ
ラリーを大腸菌に形質転換し、形成された各コロニーを
マイクロタイタープレートに移した。コロニーを別のプ
レートにレプリカし、片方のプレートにはグルコース濃
度１０ｍＭおよびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、他方のプレ
ートには１００ｍＭグルコースおよびＰＭＳ−ＤＣＩＰ
を加え、双方のＰＱＱＧＤＨの活性を目視で判定した。
２枚のプレートで同等のＰＱＱＧＤＨの活性を示すクロ
ーンが多数得られた。

【００３３】このうち１つのクローンを任意に選び、遺
伝子配列を解析したところ、第２７７番目のグルタミン
酸がグリシンに変異していたことがわかった。 実施例２ 改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築 配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、常法に従って部
位特異的変異法により２７７番目のグルタミン酸残基ま
たは２７８番目のイソロイシン残基をコードする塩基配
列を所定のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換し
た。部位特異的変異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図
２に示す方法により行った。変異に用いた合成オリゴヌ
クレオチドターゲットプライマーの配列を表２に示す。
表２においては、例えば「Ｅ２７７Ａ」は、２７７番目
のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されていること
を表す。

【００３４】

【表２】 E277A 5'- GAG GTT AAT TGC ATC GTC AGA G -3' E277N 5'- C AAT GAG GTT AAT GTT ATC GTC AGA GTT TG -3' E277K 5'- GAG GTT AAT ATC ATC GTC AGA G -3' E277D 5'- GAG GTT AAT TTT ATC GTC AGA G -3' E277H 5'- C AAT GAG GTT AAT GTG ATC GTC AGA GTT TG -3' E277Q 5'- GAG GTT AAT TTG ATC GTC AGA G -3' E277V 5'- C AAT GAG GTT AAT TAC ATC GTC AGA GTT TG -3' E277G 5'- GAG GTT AAT TCC ATC GTC AGA G -3' I278F 5'- C AAT GAG GTT GAA TTC ATC GTC AGA G -3' N279H 5'- GAC AAT GAG GTG AAT TTC ATC GTC AGA GTT -3' ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にAc
inetobacter calcoaceticus 由来ＰＱＱＧＤＨをコード
する遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断片を組み込
み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０
ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキットに付属のセレクションプライ
マー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプライマー５
０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量の同キット
のアニーリングバッファーとともに混合し、１００℃、
３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１本鎖にし
た。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイ
シン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を復帰させ
るためのものである。これを５分間氷上に置き、プライ
マーをアニーリングさせた。これに３μｌの同キットエ
クステンションバッファー、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌ
の滅菌水を加えて相補鎖を合成した。

【００３５】これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株で
あるE.coli ＢＭＨ７１−１８mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。次に、こ
こから抽出したプラスミドをE.coli ＭＶ１１８４に形
質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そ
してこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、
目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラス
ミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子のKpn I-Hind III断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈの遺伝子を構築した。 実施例３ 改変型酵素の調製 野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドをE.coli ＤＨ５α株に形
質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ
含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養
し、１ｍＭＣａＣｌ₂、５００μＭＰＱＱを含む７１の
Ｌ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピル
チオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加
し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離
（5000×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体
を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌
体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（10000×ｇ、
１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠
心分離（160500×ｇ（40000r.p.m.)、９０分、４℃）
し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以
下の実施例において用いた。

【００３６】さらに、こうして得た水溶性画分を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で一晩透析した。透析したサ
ンプルを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇ
ｅｌ ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株
式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２
Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を
用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行っ
た。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。
このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ
蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例
において用いた。 実施例４ 酵素活性の測定 酵素活性の測定は１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光
度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少
速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μ
ｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットと
した。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係
数は１６．３ｍＭ^-1とした。 実施例５ 粗精製酵素標品グルコースに対する親和性の評価 実施例３で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨ
の粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂存在下で１時間以上ホロ化した。これを１８７
μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４
８μｌ，６００ｍＭＰＭＳ ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０ １６μｌ）および各濃度のＤ−グルコ
ース溶液１０μｌを加え、実施例４に示す方法により室
温で酵素活性を測定した。基質濃度対酵素活性のプロッ
トから、Ｋｍを求めた。結果を表３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】これまで報告されている野生型ＰＱＱＧＤ
Ｈのグルコースに対するＫｍ値は約２０ｍＭである。こ
れに対して、今回構築した２７７番目のグルタミン酸残
基に変異を導入した酵素および２７８番目のイソロイシ
ンをフェニルアラニンに置換した酵素では、いずれもグ
ルコースに対するＫｍ値は１０ｍＭ未満であった。この
結果から、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはグルコースに
対して高い親和性を有する酵素であることがわかる。 実施例６ 精製酵素標品のグルコースに対する親和性の評価 実施例３で得られた野生型酵素およびＥ２７７Ｋ改変型
酵素の精製酵素標品を用いて、実施例５と同様にそれぞ
れ１μＭＰＱＱ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂存在下で１時間以
上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３μｌの
活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６００ｍＭＰＭＳ
８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０ １６μ
ｌ）および各濃度のＤ−グルコース溶液１０μｌを加
え、実施例４に示す方法により室温で酵素活性を測定し
た。基質濃度対酵素活性のプロットから、ＫｍおよびＶ
ｍａｘを求めた。Ｅ２７７Ｋのグルコースに対するＫｍ
値は約３．８ｍＭであり、Ｖｍａｘ値は２７７１Ｕ／ｍ
ｇであった。これまで報告されている野生型ＰＱＱＧＤ
Ｈのグルコースに対するＫｍ値は約２０ｍＭであり、Ｖ
ｍａｘ値は測定上件により２５００−７０００Ｕ／ｍｇ
である。この結果から、Ｅ２７７Ｋ改変型ＰＱＱＧＤＨ
はグルコースに対する親和性が大幅に向上し、かつ、野
生型ＰＱＱＧＤＨに匹敵する高い活性を有する酵素であ
ることがわかる。 実施例７ グルコースのアッセイ 改変型ＰＱＱＧＤＨを用いてグルコースをアッセイし
た。Ｅ２７７Ｋ改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ₂存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグ
ルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂存
在下で酵素活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵
素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度
の変化を指標とした。図３に示されるように、Ｅ２７７
Ｋ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、０．１−２０ｍＭの範
囲でグルコースの定量を行うことができた。 実施例８ 酵素センサーの作製および評価 ５ＵのＥ２７７Ｋ改変型酵素にカーボンペースト２０ｍ
ｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既
にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペ
ースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。こ
の電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理し
た後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルア
ルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡
化させた。電極は４℃で保存した。

【００３９】作製した酵素センサーを用いてグルコース
濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固
定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの
範囲でグルコースの定量を行うことができる。

【００４０】

【発明の効果】改変型ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対す
る親和性が高いことから、本酵素を用いてアッセイキッ
トあるいは酵素センサーを作成すると従来の天然型のＰ
ＱＱＧＤＨを用いた場合に比べ、より低濃度のグルコー
ス測定が可能であり、また大幅な感度の向上といった利
点が期待される。

【００４１】

【配列表】 Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> 990387 <160> 13 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 10 <223> Xaa is any amino acid residue except for Glu <220> <222> 11 <223> Xaa is any amino acid residue except for Ile <400> 3 Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Xaa Xaa Asn Leu Ile Val Lys 1 5 10 15 Gly Gly Asn Tyr Gly Trp 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 4 gaggttaatt gcatcgtcag ag 22 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 5 caatgaggtt aatgttatcg tcagagtttg 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 6 gaggttaata tcatcgtcag ag 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 7 gaggttaatt ttatcgtcag ag 22 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 8 caatgaggtt aatgtgatcg tcagagtttg 30 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 9 gaggttaatt tgatcgtcag ag 22 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 10 caatgaggtt aattacatcg tcagagtttg 30 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 11 gaggttaatt ccatcgtcag ag 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 12 caatgaggtt gaattcatcg tcagag 26 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 13 gacaatgagg tgaatttcat cgtcagagtt 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の改変型酵素をコードする突
然変異遺伝子を作成する方法を示す。

【図２】 図２は、本発明において用いたプラスミドｐ
ＧＢ２の構造を示す。

【図３】 図３は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースのアッセイを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/00 1/32 1/32 1/54 1/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｓ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
   溶性グルコース脱水素酵素において、天然の水溶性グル
   コース脱水素酵素の１またはそれ以上のアミノ酸残基が
   他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然の水
   溶性グルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対し
   て親和性が向上していることを特徴とする改変型グルコ
   ース脱水素酵素。
2. 【請求項２】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
   溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
   ａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
   ＱＱＧＤＨの第２６８残基から２８９残基に相当する領
   域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミ
   ノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グル
   コース脱水素酵素。
3. 【請求項３】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
   溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
   ａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
   ＱＱＧＤＨの２７７番目のグルタミン酸残基に相当する
   アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変
   型グルコース脱水素酵素。
4. 【請求項４】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
   溶性グルコース脱水素酵素において、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
   ａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性Ｐ
   ＱＱＧＤＨの２７８番目のイソロイシン残基に相当する
   アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変
   型グルコース脱水素酵素。
5. 【請求項５】 ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
   溶性グルコース脱水素酵素において、配列番号１で表さ
   れるアミノ酸配列の、第２６８残基から２８９残基の領
   域において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のア
   ミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グ
   ルコース脱水素酵素。
6. 【請求項６】 配列番号１で表されるアミノ酸配列の２
   ７７番目のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基で置換
   されている、請求項５記載の改変型グルコース脱水素酵
   素。
7. 【請求項７】 配列番号１で表されるアミノ酸配列の２
   ７８番目のイソロイシン残基が他のアミノ酸残基で置換
   されている、請求項５記載の改変型グルコース脱水素酵
   素。
8. 【請求項８】 配列：Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser As
   p Asp Xaa1 Xaa2 Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Ty
   r Gly Trp［式中、Ｘａａ１およびはＸａａ２は任意の
   天然アミノ酸残基であるが、ただし、Ｘａａ１がＧｌｕ
   であるときＸａａ２はＩｌｅではない］を含む、ピロロ
   キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素
   酵素。
9. 【請求項９】 請求項１−８のいずれかに記載の改変型
   グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の遺伝子を含むベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の遺伝子を含む形質転
    換体。
12. 【請求項１２】 請求項９に記載の遺伝子が主染色体に
    組み込まれた生物。
13. 【請求項１３】 請求項１−８のいずれかに記載の改変
    型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキッ
    ト。
14. 【請求項１４】 請求項１−８のいずれかに記載の改変
    型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。