WO2006137283A1

WO2006137283A1 - 変異グルコース脱水素酵素

Info

Publication number: WO2006137283A1
Application number: PCT/JP2006/311774
Authority: WO
Inventors: Hideaki Yamaoka; Masashi Tsukada
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-12
Publication date: 2006-12-28
Also published as: EP2077321A2; KR101387240B1; DE602006011858D1; EP1860183A1; EP2077321B1; US20080206833A1; KR20080028834A; US20100086989A1; US7776575B2; JP5341312B2; EP2077321A3; CN101107353A; TW201307562A; CN101107353B; EP1860183B1; US7604969B2; KR20130018336A; TW200726842A; ATE455848T1; JPWO2006137283A1

Abstract

配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において３６５位以外の１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の３６５位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。

Description

明細書

変異グルコース脱水素酵素

技術分野

[0001] 本発明は、基質特異性の向上した変異グルコース脱水素酵素に関する。本発明の変異グルコース脱水素酵素は、グルコースセンサ、及びグルコースアツセィキット等に好適に使用することができ、生化学分野、臨床分野等で有用である。

背景技術

[0002] 近年バイオセンサ素子として様々な酵素が用いられて、る。糖尿病の診断を目的とした血液中のグルコース濃度を測定するセンサ素子として、グルコースォキシダーゼ ( GOD)がすでに実用化されている力 GODはサンプル中の溶存酸素に影響を受けることが問題となって、る。そこでサンプル中の溶存酸素に影響を受けな、グルコース脱水素酵素（GDH)が GODに代わるものとして注目されて、る。

[0003] GDHには、 NAD(P)+を補酵素とするもの（E.C. 1.1.1.47)やピロ口キノリンキノン（PQ Q)を補酵素とするもの（PQQGDH; E.C. 1.1.99.17)などが報告されている。 NAD(P)+ を補酵素とする GDHは、測定系に NAD(P)+を添加する必要があると、う点でセンサ素子として問題がある。一方、 PQQGDHなどの補酵素結合型 GDHは測定系に補酵素を添加する必要がない。

[0004] また、センサ素子には、連続使用や室温に放置して!/ヽてもセンサとしての機能を失わなヽと、うような安定性が望まれる。

高温下で生育する好熱性細菌由来の酵素は、一般に高い熱安定性を有し、長期保存や連続使用などにおいても高い安定性を示すことから、センサ素子としての応用が期待されている。しかし、好熱菌由来の耐熱性 GDHについては、サーモゲネス' ァシドフィラム（Thermoplasma acidophilm)、スルファロバス'ソルフアタリカス（Sulfolob us solfataricus)由来の GDHが報告されている力いずれも NAD(P)+を補酵素とするものである。

[0005] 一方、中度好熱性細菌であるブルクホリデリア ·セパシァ（Burkholderia cepacia)が産生する耐熱性 GDHは FAD結合型であり、すでに至適反応温度、熱安定性、基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている (特許文献 1)。この GDHは、通常は、高い耐熱性を持つ触媒サブユニット（αサブユニット）、チトクローム Cである電子伝達サブユニット ( βサブユニット）、機能不明の γサブユニットから構成されるへテロオリゴマーとして存在し、 45°Cに至適反応温度を持つが、 50°C以上の熱処理を行うことによりサブユニットの解離が起こり、 75°Cに至適反応温度をもつ αサブユニット単量体になる。 αサブユニット単量体は熱に安定であり、 60°C30分の熱処理後にも 80% 以上の残存活性を示す。これらのサブユニットをコードする遺伝子も単離されている（特許文献 1、特許文献 2)。

[0006] しかし、補酵素結合型 GDHは一般的に基質特性が広ぐグルコース以外にマルト一スゃガラタトースなどとも反応するため、糖尿病患者向け血糖測定向けのダルコ一スセンサとして応用した場合で、糖尿病患者が腹膜透析を実施しなければならないような重篤な症状の場合は、透析液にマルトースが大量に含まれているため、本来の血糖値より高く測定値が出てしまう危険性がある。ブルクホリデリア'セパシァの GDH も同様に、グルコース以外にマルトースゃガラタトースとも反応性を有している。

[0007] アミノ酸置換変異を導入することによって、 GDHの基質特異性を変化させる技術が知られている。このような変異 GDHとしては、例えば、 E. coli (特許文献 3、 4)、ァシネトバクタ^ ~ ·カルコァセティカス（Gluconobacter calcoaceticus) (特許文献 5)、又はァシネトパクター 'バウマン- (特許文献 6〜8)由来の、ピロ口キノリンキノンを補酵素とする PQQGDHが知られて!/ヽる。

特許文献 1：米国特許出願公開第 2004Z0023330号

特許文献 2 :国際公開第 03Z091430号パンフレット

特許文献 3：特開平 10— 243786号公報

特許文献 4:特開 2001— 197888号公報

特許文献 5 :特開 2004— 173538号公報

特許文献 6：特開 2004 - 313172号公報

特許文献 7：特開 2004— 313180号公報

特許文献 8：特開 2004— 344145号公報

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、グルコースに対する基質特異性の向上した FAD結合型 GDHを提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブルクホリデリア

'セパシァの FAD結合型 GDHの特定の部位のアミノ酸配列を改変することにより、グルコースに対する反応性を維持しながら、他の糖に対する反応性が低下させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0010] すなわち、本発明は以下のとおりである。

(1)配列番号 3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において 365位以外の 1 又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の 365位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。

(2) 365位に相当する位置以外は配列番号 3に示すアミノ酸配列を有する、 (1)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(3) 365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、（1)または（2)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(4) 2糖類がマルトースであることを特徴とする（3)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(5)マルトースに対する反応性がグルコースに対する反応性の 20%以下であることを特徴とする (4)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(6)前記他のアミノ酸残基が、フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジン力選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする（1)〜（5)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素。

(7)さらに、酉己歹 IJ番号 3のアミノ酸酉己歹 IJにおける 324、 326、 333、 334、 368、 369、 3 76、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 472、 475、 525、及び 529力も選ばれる少なくとも 1つの位置に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、 ( 1 ) 〜（6)のいずれかに記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(8)前記位置が、 326、 472、 475、及び 529から選ばれる少なくとも 1つである（7) に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(9)前記位置が、 472位である（8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(10)前記位置が、 475位である（8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(11)前記位置が、 472位及び 475位の両方である（8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(12)前記位置が、 326位である（8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(13)前記位置が、 529位である（8)に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

(14) 472位に相当するアミノ酸残基がァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ-ルァラ- ン、チロシン、イソロイシン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする（9)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(15) 475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする（10)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(16) 326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はパリンに置換されたことを特徴とする（12)に記載の変異グルコース脱水素酵素

(17) 529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする（13)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(18)配列番号 3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ダルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、（i)前記アミノ酸配列における 32 4、 326、 333、 334、 365、 368、 369、 376、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 5 25、及び 529から選ばれる少なくとも 1つの位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、（ii) 472位に相当する位置のアミノ酸残基のァスパラギン酸への置換、及び (iii) 475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む、ダルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。

(19)前記他アミノ酸残基がフエ-ルァラニン、チロシン又はトリプトファンであることを特徴とする（18)に記載の変異グルコース脱水素酵素

(20)前記位置が 326位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする（18)に記載の変異グルコース脱水素酵素

(21)前記位置が 529位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリブトファンに置換されたことを特徴とする（18)に記載の変異グルコース脱水素酵素。

(22)配列番号 7のアミノ酸配列を含む、 FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。

(23) (1)〜（22)のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。

(24)電子伝達サブユニットがシトクロム Cであることを特徴とする（23)に記載のダルコース脱水素酵素複合体。

(25) (1)〜（22)の、ずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素をコードする DNA

(26) (25)に記載の DNAを保持し、（1)〜（22)のいずれかに記載の変異ダルコ一ス脱水素酵素又は（23)に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。

(27) (1)〜（22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、（23)に記載の変異ダルコ一ス脱水素酵素複合体、又は（26)に記載の微生物を含む、グルコースアツセィキット。

(28) (1)〜（22)に記載の変異グルコース脱水素酵素、（23)に記載の変異ダルコ一ス脱水素酵素複合体、又は（26)に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。

図面の簡単な説明

[図 1]グルコースセンサの構造を示す図。

[図 2]グルコースセンサの各試薬部を示す図。

[図 3]変異型 GDHを用いたグルコースセンサのグルコースに対する反応性を示す図。

[図 4]変異型 GDHを用いたグルコースセンサの、グルコース存在下におけるマルトースに対する反応性を示す図。

[図 5]野生型 GDH及び変異 GDHを用いたグルコースセンサを用いて測定された見かけ上の血糖値を示す図。発明を実施するための最良の形態

[0012] 以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の変異 GDHは、野生型 GDHに特定の変異を導入することにより、製造される。野生型 GDHとしては、ブルクホリデリア 'セパシァが産生する GDHが挙げられる。ブルクホリデリア ·セパシァの GDHとしては、ブルクホリデリア ·セパシァ KS 1株、 JCM 2800株又 ίお CM2801株が産生する GDHが挙げられる。 KS 1株は、平成 12年 9月 2 5日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (干 305-8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に、受託番号第 FERM BP— 7306として寄託されている。 JCM2800株又 ίお CM2801株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM)に保存されている。

[0013] KS 1株の GDH aサブユニット遺伝子、及び βサブユニット遺伝子の一部を含む染色体 DNA断片の塩基配列を配列番号 1に示す (米国特許出願公開第 2004Ζ002 3330号)。この塩基配列には 3つのオープンリーディングフレーム（ORF)が存在し、 5 '末端側から 2番目及び 3番目の ORFは、それぞれ aサブユニット（配列番号 3)、及び βサブユニット（配列番号 4)をコードして!/、る。また、 1番目の ORFは yサブュニット (配列番号 2)をコードしていると推定される。また、配列番号 5に、サブュ-ット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さら〖こ、 |8サブユニットのアミノ酸配列を配列番号 6に示す (欧州特許出願公開第 1498484号)。配列番号 6において、ァミノ酸番号 1〜22はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号 5及び 6において、第 1番目のアミノ酸残基は Valと記載されている力 Metである可能性が高ぐまた、翻訳後に脱落している可能性がある。

[0014] 本発明の変異 GDHは、 αサブユニットのみであってもよいし、 αサブユニットと j8サブユニットとの複合体、又は _aサブユニット、 βサブユニット及び _Ύサブユニットからなる複合体であってもよい。本発明の変異 GDHは、いずれの場合も αサブユニットに特定の変異が導入されたものであるが、この特定の変異の他に、保存的な変異を有していてもよい。また、他のサブユニットは野生型であっても、保存的な変異を有するものであってもよい。尚、「保存的変異」とは、 GDH活性に実質的に影響しない変異をいう。

[0015] 本発明の変異型 exサブユニットは、好ましくは、後述する特定の変異以外は、配列番号 13に示すアミノ酸配列を有する。また、変異型 αサブユニットは、 GDH活性を有する限り、前述したような保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号 13 のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号 13には、配列番号 11の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、 Ν末端のメチォニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「 1又は複数」とは、好ましくは 1〜： LO個、より好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜3 個である。

[0016] また、 βサブユニットは、典型的には配列番号 16のアミノ酸配列を有する。しかし、 GDHの 13サブユニットとして機能し得る限り、配列番号 16のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付カロされたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「1又は複数」とは、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、特に好ましくは 1〜5個である。尚、 GDH の βサブユニットとして機能するとは、 aサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体の GDH活性を損なわずにチトクローム Cとして機能することをいう。

[0017] 野生型 (Xサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号 11の塩基番号 764〜2

380からなる塩基配列を含む DNAが挙げられる。また、 αサブユニット遺伝子は、配列番号 11の塩基配列の塩基番号 764〜2380からなる塩基配列を有する DNA、又はこの配列力も調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、 GDH活性を有するタンパク質をコードする DNAであってもよ!/、。

[0018] また、 j8サブユニット遺伝子として具体的には、配列番号 15の塩基番号 187〜13

98からなる塩基配列を含む DNAが挙げられる。また /3サブユニット遺伝子は、配列番号 15の塩基番号 187〜1398からなる塩基配列を有する DNA、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ、 j8サブユニットとして機能し得るタンパク質をコードする DNAであってもよい。

[0019] 前記ストリンジェントな条件としては、 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズする条件、具体的には、 1 X SSC、 0. 1 %SDS、 60°C力 S挙げられる。

[0020] aサブユニット遺伝子及び βサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株の染色体 DNAを铸型とする PCRによって、取得することができる。 PCR 用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダィゼーシヨンによって、ブルクホルデリア'セパシァ KS1株の染色体 DNAから取得することもできる。また、ブルクホルデリア'セパシァの他の菌株からも、同様にしてノリアントを取得することができる。他の菌株としては、前記の JCM2800株及び JC M2801株が挙げられる。これらの菌株が産生する GDHの αサブユニットは、 KS 1株の αサブユニットと各々 95. 4%及び 93. 7%の相同性を有している。

[0021] また、他の微生物が産生する GDHであっても、ブルクホルデリア 'セパシァの GDHと類似の構造及び酵素学的性質を有するものであれば、本発明の変異 GDHの製造に用いることができる。このような GDHとしては、例えば (i)Burkholderia pseudomallei, (ii) Burkholaena mallei, (ni)Ralstonia solanacearum由来の GDH力挙げりれ o ((i)、 (uノ Pro c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14240-14245 (2004), (iii)Nature 415 (6871), 49 7-502 (2002)) o

[0022] 本発明の変異 GDHは、上記のような野生型 GDH又は保存的変異を有する GDHが特定の変異を有することによって、グルコースに対する基質特異性が向上したものである。「グルコースに対する基質特異性が向上した」とは、グルコースに対する反応性を実質的に維持したまま、他の単糖類、二糖類又はオリゴ糖等の糖類、例えばマルトース、ガラクトース、キシロース等に対する反応性が低下したこと、あるいは、ダルコ一スに対する反応性が他の糖類に対する反応性に比べて向上したことを含む。例えば、グルコースに対する反応性が低下しても、他の糖類に対する反応性がそれ以上に低下すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。また、他の糖類に対する反応性が上昇しても、グルコースに対する基質特異性がそれ以上に上昇すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。具体的には例えば、野生型酵素に対する変異型酵素の基質特異性 (グルコースに対する比活性と、他の糖類、例えばマルトース、に対する比活性との比）の向上（下記式で表される）が、 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 40%以上であれば、グルコースに対する基質特異性は向上している。例えば、基質特異性が、野生型酵素では 60%、変異型 GDHでは 40% の場合、グルコース以外の糖類に対する反応性は、 33%低下している。基質特異性 = (グルコース以外の糖類に対する比活性 Zグルコースに対する比活性 ) X 100) 基質特異性の向上 = (A-B) X 100/ A

A：野生型酵素の基質特異性

B :変異型酵素の基質特異性また、変異型 GDHは、マルトースに対する反応性 (比活性）がグルコースに対する反応性 (比活性)の 30%以下、好ましくは 20%以下であることが好ま、。

[0023] 前記特定の変異とは、具体的には以下のとおりである。

(1)配列番号 3に示すアミノ酸配列の 365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。

(2)配列番号 3に示すアミノ酸配列の 365位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び、 324、 326、 333、 334、 368、 369、 376、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 472、 475、 525、及び 529の少なくとも 1つ、又は任意の 2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。

(3) (i)配列番号 3に示すアミノ酸配列の 324、 326、 333、 334、 365、 368、 369、 3 76、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 525、及び 529力ら選ば、れる少なくとも 1つ、又は任意の 2以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、（ii ) 472位に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び (iii) 475 位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。

[0024] また、前記特定の変異としては、 GDHのアミノ酸配列中に、配列番号 7に示すアミノ酸配列を含む変異が挙げられる。配列番号 7に示すアミノ酸配列は、配列番号 3に示す GDHにおいては、 360位〜 366位に相当する。ブルクホリデリア'セパシァ以外の FAD結合型 GDHであっても、野生型 GDHが配列番号 7に示すアミノ酸配列を含まない場合、配列番号 7のアミノ酸配列を含む変異型 GDHは、基質特異性が向上していると考免られる。

[0025] 前記（1)の変異において、他のアミノ酸残基としては、セリン以外のアミノ酸、具体的にはフエ二ルァラニン、チロシン、ァスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、リシン、ァスノラギン、ロイシン、システィン、トレオニン、イソロイシン、グリシン、ノリン、メチォニン、グルタミン、グルタミン酸、ァラニン、プロリンが挙げられる。これらの中では、フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンが好ましい。

[0026] 前記（2)の変異にぉ、て、他のアミノ酸残基としては、野生型 GDHの各々の位置におけるアミノ酸残基以外のアミノ酸が挙げられる。前記のアミノ酸置換の位置の中でも、 326位、 472位、 475位、及び 529位力 S好ましく、 472位及び 475位力 Sさらに好ましい。 472位及び 475位に相当するアミノ酸残基の置換は、それぞれ単独でもよいが、両方置換されて、ることがより好ま U、。

[0027] 472位にぉ、ては、置換後のアミノ酸残基は、ァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ二ルァラニン、チロシン、イソロイシン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、又はヒスチジンが好ましぐァスバラギン酸が特に好ましい。

475位においては、置換後のアミノ酸残基はヒスチジン又はセリンが好ましぐヒスチジンが特に好ましい。

326位においては、置換後のアミノ酸残基は、グルタミン又はパリンが好ましい。 529位においては、置換後のアミノ酸残基は、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンが好ましい。

[0028] 上記の好ましいアミノ酸置換の態様は、前記（3)の変異においても同様である。

[0029] 上記アミノ酸置換変異の位置は、配列番号 3、すなわちブルクホリデリア 'セパシァ KS1株の野生型 GDH αサブユニットのアミノ酸配列における位置である力配列番号 3のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有する GDH αサブユニットのホモログ又はバリアントにおいては、配列番号 3のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、前記アミノ酸置換の位置に相当する位置を示す。例えば、 1〜364位の領域において 1個のアミノ酸残基の欠失を有する GDH αサブユニットの保存的ノリアントにおいては、 365位とは、前記バリアントの 364位を示す。

[0030] 本発明の変異型 GDHの好まし、変異の態様を以下に示す。

(数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のァミノ酸残基を示し、「 +」は同時に 2つのアミノ酸置換を有することを示す。 )

(A) 365Arg、 365Asn、 365Asp、 365Cys、 365Glu、 365Gly、 365His、 365Ile 、 365Leu、 365Met、 365Phe、 365Pro、 365Trp、 365Tyr、 365Val、 365Lys、 365Gln、 365Thr、 365Ala

(B) 326Gln、 326Val、 326Arg

(C) 529His、 529Tyr、 529Trp

(D) 365Tyr+ 326Gln, 365Tyr+ 326Val、 365Tyr+ 326Arg、 365Tyr+472 Phe、 365Tyr+472Ile、 365Tyr+472Asn、 365Tyr+472Asp、 365Tyr+47 2His、 365Tyr+472Leu, 365Tyr+472Ser, 365Tyr+475Ser, 365Tyr+4 75His、 365Phe+472Phe

(E) 472Asp +475His + 365Phe, 472Asp+475His + 326Gln、 472Asp+47 5His + 326Thr、 472Asp+475His + 326Val, 472Asp +475His + 529Trp, 4 72Asp+475His + 529His, 472Asp+475His + 529Tyr, 472Tyr+475His + 365Phe、 472Tyr+475His + 365His、 472Tyr+475His + 326Val, 472Ile +475His + 326Gln

(F) 472Asp+475His + 529His + 326Gln、 472Asp+475His + 529Trp + 32 6Gln

[0031] 本発明者は、 FADを補酵素として有する GMCォキシドレダクターゼファミリーであるダルコノバクタ^ ~ ·ォキシダンスのソルビトール脱水素酵素（GenBank accession AB 039821)、ェルビ-ァ'ヘルビコーラの 2—ケトグルタル酸脱水素酵素（GenBank acce ssion AF068066)、ファネロケート 'タリソスポリウムのセロビオース脱水素酵素（CDH) (J. Mol. Biol, 315(3), 421-34 (2002))、ストレプトマイセス 'スビシーズのコレステロ一ルォキシターゼ（COD) (J. Struct. Biol. 116(2), 317- 9(1996))、ぺ-シリウム'ァマガサキエンスのグルコースォキシダーゼ（Eur. J. Biochem. 252, 90-99(1998))のァミノ酸配列を比較し、 FAD結合ドメイン及び FAD- covering lid等の保存された領域、およびタンパク質の折りたたみに関与するアミノ酸残基であるプロリンが保存されている領域を見い出した。そして、これらの領域と他の領域との境界付近の配列を改変することにより、基質特異性を向上できる可能性について検討を行った。具体的には R53〜 H73、 E88〜A108、 N308〜G336、 K362〜A377、 A391〜R497、 S509〜V539を検討した。その結果、上記領域の中において基質特異性を向上することができる場所をいくつか発見した。

[0032] 所望の変異を有する GDH αサブユニットは、 GDH αサブユニットをコードする DN Α ( _αサブユニット遺伝子）に、部位特異的変異法によって、所望のアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異を導入し、得られる変異 DNAを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。また、変異 GDH _αサブユニットをコードする DNAを、 13サブユニットをコードする DNA ( βサブユニット遺伝子）、又は j8サブユニット遺伝子と γサブユニットをコードする DNA ( γサブユニット遺伝子）とともに発現させることによって、変異 GDH複合体を取得することができる。尚、 GDH αサブュニットをコードする DNAへの変異の導入は、 _Ύサブユニット、 αサブユニット及び j8 サブユニットをこの順にコードするポリシスト口ニックな DNA断片を用いてもよい。

[0033] 変異が導入された GDH αサブユニット又は GDH複合体の糖類に対する基質特異性は、実施例に記載された方法によって各種糖類に対する反応性を調べ、野生型 G DH αサブユニット又は野生型 GDH複合体の反応性と比較することよって、決定することができる。

[0034] γサブユニット、 _αサブユニット及び βサブユニットをこの順にコードするポリシスト口ニックな DNA断片は、例えば、ブルクホルデリア 'セパシァ KS1株の染色体 DNAを铸型とし、配列番号 8、 9の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとする Ρ CRによって取得することができる（後記実施例参照)。

[0035] GDHの各サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクタ一としては、例えばェシエリヒア属細菌で機能するベクター、具体的には pTrc99A 、 pBR322、 pUC18、 pUC118、 pUC19、 pUC119、 pACYC184、 pBBR122等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、例えば lac、 trp、 tac、 trc、 P、 tet、 P

L

hoA等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、 αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子を挿入することによって、これらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、 pTrc99A、 pBluescript、 pKK223-3等が挙げられる。

[0036] また、 αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子は、発現可能な形態で宿主微生物の染色体 DNA中に組み込まれてもよ、。

[0037] 組換えベクターで微生物を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンビテントセル法、プロトプラスト法又はエレクト口ポレーシヨン法等が挙げられる。

[0038] 宿主微生物としては、バチルス ·サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス · セレピシェ等の酵母、ァスペルギルス ·-ガー等の糸状菌が挙げられる力これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。

[0039] 本発明の変異 exサブユニットもしくは変異 GDH複合体又はこれらを発現する微生物は、グルコースセンサの酵素電極、又はグルコースのアツセィキットの構成要素として用いることができる。ブルクホルデリア ·セパシァの野生型 GDHを用いたグルコースセンサ及びグルコースアツセィキットは、米国特許公開第 2004/0023330A1に記載されている。本発明の変異 GDHも、同様にして使用することかできる。

実施例

[0040] 次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな、。

[0041] 〔実施例 1〕ブルクホルデリア'セパシァの GDHを発現するプラスミド

ブルクホルデリア.セパシァの GDHを発現するプラスミドとして、 GDHの αサブュ- ット及び 0サブユニットを発現するプラスミド、並びに、 αサブユニット、 j8サブュニット及び Ίサブユニットを発現するプラスミドを用意した。

[0042] < 1 > GDHの aサブユニット及び γサブユニットを発現するプラスミド

aサブユニット及び γサブユニットを発現するプラスミドとしては、 WO02/036779 (Ε

P1331272A1 , US2004023330A1 , CN1484703Aに対応）に記載のプラスミド pTrc99A/ γ + αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア'セパシァ KS1株（FERM BP- 730 6)染色体 DNAから単離された、 GDH γサブユニット構造遺伝子と aサブユニット構造遺伝子を連続して含む DNA断片が、ベクター pTrc99A (Pharmacia社）のクロー- ング部位である Ncol/Hindlllに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中の GDH γ a遺伝子は、 trcプロモーターによって制御される。 _PTrc99A/ γ + αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持してヽる。

[0043] < 2 >GDHの aサブユニット、 βサブユニット及び _Ίサブユニットを発現するプラスミド、

GDHの αサブユニット、 βサブユニット及び _Ίサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようして調製した。

[0044] (1)ブルクホルデリア.セパシァ KS1株からの染色体 DNAの調製

ブルクホルデリア 'セパシァ KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株を TL液体倍地 (ポリペプトン 10g、酵母抽出液 lg、 NaCl 5g、 KH PO

2

2g、グルコース 5g; lL、 pH 7.2)を用いて、 34°Cで一晩振盪した。増殖した菌体を

4

遠心分離により回収した。この菌体を 10mM NaCl、 20mM Tris- HCl(pH8.0)、 ImM ED TA、 0.5% SDS、 100 μ g/mlのプロティナーゼ Kを含む溶液に懸濁し、 50°Cで 6時間処理した。ここに等量のフエノールークロロホルムを加えて室温で 10分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度 0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、 2倍量のエタノールを重層して中間層に染色体 DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、 70%エタノールで洗浄した後、適当量の TEバッファーに溶解させ、染色体 DNA溶液とした。

[0045] (2) GDHの γサブユニット、 αサブユニット及び j8サブユニットをコードする DNA断片の調製

前記染色体 DNAを铸型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとする PCRにより、 GDHの γサブユニット、 _αサブユニット及び j8サブユニットをコードする DNA断片を増幅した。

[0046] 〔フォワードプライマー〕

5'- CATGCCATGGCACACAACGACAACAC- 3' (配列番号 8)

〔リバースプライマー〕 5し GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC- 3' (配列番号 9)

[0047] 増幅した断片の C末端側を平滑末端化した後、 N末端側を Ncolで消化し、同様に処理した pTrc99A (Pharmacia社）にライゲーシヨンした。得られた組換えベクターで E. coli DH5 aを形質転換し、アンピシリン 50 μ g/mLを含む LB寒天培地で生じるコ口- 一を採取した。得られた形質転換体を液体の LB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入 DNA断片を解析したところ、約 3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドを pTrc99A y α βと命名した。本プラスミド中の GDHの各構造遺伝子は、 trcプロモーターによって制御される。 pTrc99A y α βは、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を保持して!/、る。

[0048] 〔実施例 2〕GDH αサブユニット遺伝子への変異導入による基質相互作用部位の探索

( 1) 472位及び 475位への変異導入

実施例 1で得られた pTrc99A y α βに含まれる GDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードする _αサブユニットの 472位のァラニン残基をァスパラギン酸残基に、および 475位のァスパラギン残基をヒスチジン残基に置換されるような変異を導入した。この変異体を 472D +475H変異体と称する。これらの変異により基質特性が改善されることは、本発明者らはすでに確認している。

具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Stratagene社、 QuikChangell Site -Directed Mutagenesis Kit)を用いて、実施例 1に記載のプラスミド pTrc99A/ γ + α及び pTrc99A y a j8に含まれる GDH αサブユニット遺伝子の 475位のァスパラギンのコドン (ΑΑΤ)をァスパラギン酸 (GAT)又はグルタミン酸 (GAA)のコドンに置換した。プライマーには、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。

[0049] 〔A472D変異導入用プライマー〕

フォワードプライマー：配列番号 224 リバースプライマー：配列番号 225

[0050] 〔N475H変異導入用プライマー〕フォワードプライマー：配列番号 226

5 -AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3'

リバースプライマー：配列番号 227

5し GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT- 3'

[0051] (2) 472位及び 475位以外の位置への変異導入

[0052] 前記で得られた 472D+475H変異体をコードする変異遺伝子を用いて、さらに以下に示す領域のアミノ酸残基のフエ-ルァラニンへの置換を実施した。ただし、野生型のアミノ酸残基がフエ-ルァラニンである位置にっ、ては、アミノ酸置換は行わな力つた。尚、下記の数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸の種類を示す。例えば、 R53は、 53位のアルギニンを示す。

[0053] (i)R53〜H73

(ii)E88〜A108

(m)N308〜G336

(iv) K362〜A377

(v) A391〜R497

(vi) S509〜V539

[0054] なお変異を導入するターゲットの exサブユニット遺伝子に関しては、変異の組み合わせによる相乗効果を狙って、既に基質特性改善効果を確認済みである 472D+4 75H変異体を用いた。

[0055] 前記アミノ酸残基置換に用いたフォワードプライマーの配列を以下に示す。リバ一スプ

ライマーの配列は、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。

尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のァルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、 R53Fは、 53位のアルギニンからフエ-ルァラニンへの置換を示す。

[0056] PCR反応は、以下の反応組成で、 95°C、 30秒の後、 95°C 30秒、 55°C 1分、 68°C 8 分を 15サイクル繰り返し、 68°C 30分の反応を行った後、 4°Cで保持した。 [0057] 〔反応液組成〕

铸型 ϋΝΑ(5η_§//ζ1) 2μ\

(472D+475H導入 p frc99A/ γ + 及び pTrc99Ay β)

10 X反応緩衝液 5μ1

フォワードプライマー（lOOng/ μΐ) 1. 25 μ 1

リバースプライマー（lOOng/μΙ ) 1. 25^1

dNTP 1 μ 1

蒸留水 38. 5 1

DNAポリメラーゼ 1 μ 1

合計 50 μΐ

[0058] PCR反応の後、反応液に DNAポリメラーゼ Iを 0. 5 μ 1添加し、 37°Cで 1時間インキュペートし、铸型プラスミドを分解させた。

[0059] 得られた反応液で、ェシエリヒア 'コリ DH5 a (supE44, AlacU169( φ 801acZAM15), hsdR17, recAi, endAl, gyrA96, thi-1, relAl)のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（50 μ g/ml)およびカナマイシン（30 μ g/ml)を含む LB寒天培地 (パクトリプトン 1%、酵母エキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 1%、寒天 1. 5%)上に生育してきたコ口-一数個からプラスミド DNAを調製し、配列解析を行って、 GDH _αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。

[0060] [表 1]

表 1 R53〜H73領域置換用プライマー

[0061] [表 2] 表 2 E88〜A108領域置換用プライマ一

[0062] [表 3]

N308〜G336領域置換用プライマ

[0063] [表 4]

表 4 K362〜I377領:域置換用プライマ一

アミノ酸置換配列番号アミノ酸置換配列番号

I362F 78 I370F 86

H363F 79 D371F 87

L364F 80 Q372F 88

S365F 81 E373F 89

N366F 82 T374F 90

L367F 83 Q375F 91

S368F 84 K376F 92

R369F 85 I377F 93 [0064] [表 5]

表 5 A391 ~Y453領域置換用プライマー

[0065] [表 6」表 6 I477~R497領域置換用プライマ一

[0066] [表 7] 表 7 S509〜V539領域置換用プライマ

[0067] 〔実施例 3〕変異 GDHの基質特異性の解析

実施例 2で得られた変異 GDH発現プラスミドを用いて、変異 GDHを製造し、基質特異性を検討した。

[0068] (1)培養

変異導入したェシエリヒア'コリ DH5 α株を、各々 2mlの LB培地（アンピシリン 50 μ g/ ml及びカナマイシン 30 g/ml含有)で、 L字管を用いて 37°Cで一晩振とう培養した。それらの培養液を、 150mlの LB培地（アンピシリン 50 μ g/mlおよびカナマイシン 30 μ g /ml含有)を含む 500mlの坂口フラスコに植菌し、 37°Cで振とう培養した。培養開始から 3時間後に IPTG (イソプロピル一 β— D—チォガラクトピラノシド)を終濃度 O.lmMになるように添加し、さらに 2時間培養した。

[0069] (2)粗酵素サンプルの調製

前記で培養した培養液力ゝら菌体を集め、洗浄後、湿菌体 0.3mgあたり lmlの 0.2% Tri ton X100を含む 10mMリン酸カリウムバッファー（PPB) (pH7.0)で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（10000r.p.m、 10分、 4°C)して残渣を除去した後、上清を超遠心分離 (50,000r.p.m.、 60分、 4°C)し、得られた上清 (水溶性画分)を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー（カラム名：ォクチルセファロース (アマシャム'バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー（Q-セファロース (アマシャム'バイオサイエンス製）により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、 GDH活性を指標として行った。

[0070] (3) GDH活性の測定

前記酵素サンプル 8 μ 1に、活性測定用試薬（12 μ 1の 600mMメチルフエナジンメトサルフェート (PMS)、 120 1の 6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフエノール (DCIP)に、 0.2(w/v)% Triton X- 100 10mM PPBを加え、全量 480 μ 1とした溶液）を 8 μ 1添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で 1分間プレインキュペートした後、素早く各濃度の基質 (グルコース又はマルトース）、または蒸留水を 8 ^ 1加えて攪拌し、分光光度計を用いて DCIP由来の吸収波長である 600應の吸光度を測定した。各試薬の終濃度は DCIP:0.06mM、 PMS、 0.6mM。基質の終濃度は 5mMである。結果を、表 8〜14に示す。尚、野生型 GDHの反応比は 48%であった。

[0071] [表 8] 表 8

9] 表 9

表 1 0

表 1 1

表 1 2

13] 表 1 3

表 1 4

果、 472D+475H + 365Fが、グルコース対する反応性を維持しつつ、マルトースとの反応性が 1%台まで低下する大変効果の高い変異であった。

365位以外の変異では、 G324、 S326、 L333、 W334、 S368、 R369、 K376、 I 377、 V418、 P419、 Y436、 K433、 H448、 A525、 L529のフエ-ルァラエンへの変異がマルトースとの反応性において変異導入前の⁶0°/。以下となり効果が見られた

〔実施例 4〕 365位への変異導入の検証

実施例 3で得られた結果から、 365位はマルトースとの反応性低下において大変効果的な部位であることが推察された。よってこの部位の詳細な検討を行なう事とした。具体的には aサブユニット遺伝子に対する、 365位への単変異導入による基質特性改善効果を検証した。

PTrc99A y ひに含まれる野生型 GDH ひサブュ-ット遺伝子の 365位に変異導入を実施し、変異酵素の基質特異性を評価した。変異導入に関しては実施例 2と同様に行なった。

変異導入用フォワードプライマーは以下の通りである。リバースプライマーは、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。

[表 15]

〔実施例 5〕変異 GDHの基質特異性の解析

実施例 4で得られた変異 GDH発現プラスミドを用いて、実施例 3と同様にして、変異 GDHを製造し、基質特異性を検討した。酵素活性は、粗酵素サンプルを用いて行つた。それぞれの変異 GDHのグルコースに対する比活性、マルトースに対する比活性、反応比（マルトースに対する比活性 Zグルコースに対する比活性。単位は U/ml)を、表 16に示す。基質濃度に関しては 5mMおよび 10mMにて評価した。

[表 16] 表 1 6 単変異導入 U/ml (培養液）

[0082] その結果、 365位に関しては、野生型でのセリン残基以外の 19種類全てのアミノ酸置換で基質特性改善効果が認められた。具体的には全てのアミノ酸置換で、野生型と比較し、マルトースに対する反応性が 50%以上低下していた。特にチロシン、トリプトフアンへの置換では、基質濃度 5mM, 10mMのいずれにおいても、野生型が反応比 40%程度であるのに対し、 2%以下と、マルトースに対する反応性が野生型の 90% 以上低下し、極めて大きな基質特性改善効果が認められた。

[0083] 〔実施例 6〕 365位と他の部位との組み合わせ効果の検証実施例 2および実施例 5の結果により、 365位は少なくとも 365Fと 472D+475H の組み合わせにおいて効果が確認され、さらに 365位のみの単変異導入において全てのアミノ酸置換にて効果が見られた事から、基質特性改善効果の大変高!、部位であることが明らかになった。よって、 365位のアミノ酸置換と他の部位とのアミノ酸置換との組み合わせによる、更なる基質特性改善を目指し、さらに鋭意検討を行なった。具体的には 365位と 326位、 529位、 472位の何れかとの組み合わせに 2変異導入、並びに 472及び 475位の変異との組み合わせによる 3変異導入を検討した。

[表 17]

[8ΐ峯] [S800]

tLLll£/900Zd£/13d 3S C8JZ.£l/900Z: OAV 表 1 8 3変異導入 U/ml (培養液)

[0086] 検討した全ての部位との組み合わせにおいて相乗効果的に基質特性が改香されることが見出され、 365位は基質特性を改善する別の部位におけるアミノ酸置換との組み合わせにより更に基質特性を改善できることが明らかとなった。

[0087] 〔実施例 7〕 472位及び 475位と、他の部位との組み合わせ効果の検証

実施例 6の結果により、基質特性改善効果のあるアミノ酸置換は、それらの部位同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性が改善される可能性が示唆された。よって、すでに発明者らによって基質特性改善効果が確認されている部位である 4 72、 475位と 365以外の部位との組み合わせ効果を検証した。

具体的には 472位と 475位の組み合わせにおいて最も基質特性改善効果の高かつた 472D+475Hと、 326位又は 529位との組み合わせを検証した。また、 472位及び 475位の他の変異についても、同様に検証した。

[表 19]

表 1 9 3変異導入 U/ml (培養液)

[表 20]

表 2 0 3変異導入 U/ml (培養液)

5mM 10mM

ゲルコースマルトース Mal/Glc ゲルコースマルトース Mal/Glc

F472D+475H 1.54 0.19 12.5% 2.33 0.34 14.5%

+529F 2.13 0.29 13.7% 3.11 0.41 13.3%

+529Y 0.21 0.02 8.3% 0.42 0.03 7.9%

+529H 1.36 0.11 7.8% 2.24 0.21 9.4%

+529W 0.49 0.03 5.1% 0.78 0.04 5.7% [0090] [表 21]

4変異導入 U/ml (培養液)

[0091] 472及び 475位と、他の部位との組み合わせにおいても相乗効果が確認された。

特に 472、 475、 326、 529位の 4変異導入はマルトースに対する反応性低下効果が高く、この結果力も基質特性改善効果のあるアミノ酸置換同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性を改善できることが示された。

[0092] 〔実施例 7〕精製酵素の調製

実施例 5および 6で基質特異性の改善が認められたいくつかの変異 GDHについて精製を実施した。方法は実施例 3に記載の通りに行なった。各精製酵素のダルコ一スに対する比活性 (U/mg)を表 8に示す。

その結果、 S365Yを含む変異は、グルコースに対する比活性を 90%近く維持し、グルコース測定の観点からは好適な変異であることが明ら力となった。また S326Q変異はグルコースに対する比活性を上げる効果があることも判明した。

[0093] [表 22]

表 2 2

[0094] 〔実施例 8〕変異 GDHを用いた血糖測定用比色式センサの作製

実施例 7で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。

[0095] 図 1に示す基本構成を有するグルコースセンサを作製した。すなわち、前記ダルコースセンサは、透明基板 2Aに対してスぺーサー 3を介して透明カバー 4A (材質 PE

T)を積層した形態を有し、各要素 2A〜4Aによってキヤビラリ 5Aが規定されている。キヤビラリ 5Aの寸法は、 1.3mm X 9mm X 50 ^ mである（図 1)。透明基板 2Aおよび透明カバー 4Aは、厚みが 250 μ mである PETにより形成し、スぺーサー 3Aは黒色の両面テープにより構成した。

[0096] グルコースセンサは、図 2に示す第 1試薬部〜第 3試薬部を有し、それぞれ成分及び塗布量を表 23に示す。表中、「Ru」は、へキサルテニウムアンミン錯体 (Ru(NH ) C

3

1 )を、 CHAPSは 3— [(3— cholamidopropyDdimethylammonio] propanesulfonic acid 、

3

ACESは N— (2— acetamido)— 2— aminoethanesulfonic acidを、 MTTは 3— (4,5— Dimethyl— 2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideを、各々示す。

[0097] [表 23] 表 2 3

第 1試薬部

電子伝達物質含有試薬部用材料液 (溶媒は水)

[0098] 上記グルコースセンサのキヤビラリに測定試料を供給し、その時点力 0. 1秒毎に吸光度を繰り返し測定して、吸光度のタイムコースを作成した。各回の吸光度の測定においては、第 3試薬部に対して、キヤビラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサを透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて 630nmの光を照射することにより行なった。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。

[0099] 測定試料としては、グルコースを添カ卩した血液を用いた。へマトクリットを 42%に調整した血液【こ、 0, 100， 200, 400,600又 ίま 800mg/dlの濃度【こなるよう【こグノレースを添カ卩したものを用いて、グルコースセンサの直線性を評価した。なお直線性評価は測定試料のセンサへの導入 5秒後のエンドポイントの吸光度をプロットする事により行なった。結果を、図 3に示す。

[0100] また、へマトクリット値 45%、グノレコース濃度 45mgZdlに調整した血液に、さらにマノレ卜ースを 0, 100, 200又は 300mg/dlになるように添カロしたものを用いて、マノレ卜ースの影響を評価した。結果を、図 4に示す。この試験も同様に測定試料導入 5秒後の吸光度をプロットする事により行なった。 [0101] グルコースを基質として用いた直線性評価では、全ての酵素に関して濃度依存的に吸光度が増加し、グルコースを測定可能であることが分かる。特に 365を含む変異である 365Yおよび 326Q365Yは野生型より直線性が伸びており、より高濃度域 (6 OOmg/dl付近)まで測定可能であることが示唆される。

[0102] 次にマルトース影響に関してである力グルコース 45mg/dlにマルトースを添カ卩した場合、野生型ではマルトース濃度に依存して吸光度が大きく増加し、マルトースと強く反応していることが示唆される。一方変異酵素を用いたセンサでは、マルトース濃度に応じた吸光度の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなつていることがわかる。これらのデータを見かけの血糖上昇値に換算した結果を図 5及び表 24 に示す。野生型酵素を用いたセンサでは、低血糖 (45mgZdlグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の（138mgZdlグルコース）に見かけ上表示されてしまう。一方、改変 GDHを用いたセンサでは、マルトースが最大 300mgZdl混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも 60mg/dほでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える。結論としては 365を含む変異力グルコースに対する反応性 (直線性）とマルトース影響の観点力最適であることが示唆される。

[0103] [表 24]

表 2 4

*単位は mg/dl

添加

添加

以上の結果から明らかなように、変異 GDHを用いたグルコースセンサは、直線性も野生型と同程度以上確保されているにも関わらず、マルトースとの反応性が大きく低下している。この変異 GDHを用いたグルコースセンサを用いれば、病院等で投与される血中マルトース濃度の上限値である 200mgZdlにおいては正誤差は無いと言え、上限値以上の 300mg/dlにおいても低血糖（50mgZdl以下）が正常値や高血糖と判定されること無ぐ安全な治療が行なえる。また前述の通り GDHは溶存酸素とも反応しないことから、この変異 GDHを用いたセンサを提供することで、糖尿病患者の正確な診断治療が行なえる。

[0105] 〔実施例 9〕精製酵素の SVプロット評価

実施例 5および 6で特に基質特異性改善効果が認められた 365Yおよび 326Q + 3

65Y変異 GDHについて、精製酵素を用いた SVプロットを取得した。

その結果、精製した酵素においても、試験した全ての基質濃度に関して、反応比（マルトースに対する比活性 Zグルコースに対する比活性）が野生型と比べて大幅に低くなり改善されてレ、ることが確認できた。また結果に関しても粗酵素溶液による測定結果とほぼ一致したことから、粗酵素による改変酵素の評価は十分可能であることが確認できた。さらに付けカ卩えると、マルトース輸液による、血中のマルトース濃度の上昇は最大でも 200mg/dほでしか上昇しな、ことから、特に基質濃度 10mM(360mg/dl) と 5mM(180mg/dl)における反応比に注目した。その結果、この濃度域における S365 Y変異のマルトース /グルコース反応比は 0. 1%と、殆どマルトースとは反応しないことが示唆された。

また 326Qを 365Yに付加することで、グルコースに対する比活性を上げ、相対的にマルトースとの反応性を下げることが出来ることも明らかとなつた。

[0106] [表 25]

表 2 5

酵素特性評価

グルコースに対する比活性

40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 m 野生型 1543.7 1490.0 1388.1 1223.4 925.1 604.6 346.2 U/mg-p

365Y 1464.4 1234.0 970.8 661.1 397.2 218.2 101.8 U/mg-p

326Q365Y 1525.8 1316.0 1022.4 686.4 436.8 238.8 114.7 U/mg-p

7ルトースに対する比活

40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 mM 野生型 658.1 501.9 335.3 194.3 85.9 27.9 5.4 U/mg-p

365Y 31.1 8.1 1.4 0.5 0.2 0.1 0.0 U/mg-p

326Q365Y 31.2 7.2 1.4 0.3 0.4 0.0 0.0 U/mg-p マルトース /グルコース（反応比）

40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 m 野生型 42.6% 33.7% 24.2% 15.9% 9.3% 4.6% 1.6% %

365Y 2.1% 0.7% 0.1% 0.1% 0.0% 0.1% 0.0% %

326Q365Y 2.0% 0.5% 0.1% 0.0% 0.1 % 0.0¾ 0.0% % 産業上の利用可能性

本発明の変異 GDHは、グルコースに対する基質特異性が向上しており、ダルコスセンサ等を用いたグルコースの測定に好適に使用することができる。

Claims

請求の範囲

[I] 配列番号 3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において 365位以外の 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、力つ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の 36 5位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。

[2] 365位に相当する位置以外は配列番号 3に示すアミノ酸配列を有する、請求項 1に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[3] 365位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、請求項 1または 2に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[4] 2糖類がマルトースであることを特徴とする請求項 3に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[5] マルトースに対する反応性がダルコースに対する反応性の 20%以下であることを特徴とする請求項 4に記載の変異ダルコース脱水素酵素。

[6] 前記他のアミノ酸残基が、フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジン力選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする請求項 1〜5のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[7] さらに、酉己歹 IJ番号 3のアミノ酸酉己歹 IJにおける 324、 326、 333、 334、 368、 369、 37

6、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 472、 475、 525、及び 529力も選ばれる少なくとも 1つの位置に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項

1〜6のいずれか一項に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[8] 前記位置が、 326、 472、 475、及び 529から選ばれる少なくとも 1つである請求項

7に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[9] 前記位置が、 472位である請求項 8に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[10] 前記位置が、 475位である請求項 8に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[II] 前記位置が、 472位及び 475位の両方である請求項 8に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[12] 前記位置が、 326位である請求項 8に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[13] 前記位置が、 529位である請求項 8に記載の変異型グルコース脱水素酵素。

[14] 472位に相当するアミノ酸残基がァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ-ルァラニン、チロシン、イソロイシン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、及びヒスチジン力も選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項 9に記載の変異グルコース脱水素酵素

[15] 475位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする請求項 10に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[16] 326位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はパリンに置換されたことを特徴とする請求項 12に記載の変異ダルコース脱水素酵素

[17] 529位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする請求項 13に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[18] 配列番号 3に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、（i)前記アミノ酸配列における 324、 3 26、 333、 334、 365、 368、 369、 376、 377、 418、 419、 436、 433、 448、 525、及び 529から選ばれる少なくとも 1つの位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、（ii) 472位に相当する位置のアミノ酸残基のァスパラギン酸への置換、及び (iii) 475位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。

[19] 前記他アミノ酸残基力 Sフエ-ルァラニン、チロシン又はトリブトファンであることを特徴とする請求項 18に記載の変異ダルコース脱水素酵素

[20] 前記位置が 326位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がグルタミン又はノリンに置換されたことを特徴とする請求項 18に記載の変異グルコース脱水素酵素

[21] 前記位置が 529位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリブトファンに置換されたことを特徴とする請求項 18に記載の変異グルコース脱水素酵素。

[22] 配列番号 7のアミノ酸配列を含む FAD結合型変異グルコース脱水素酵素。

[23] 請求項 1〜22のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。

[24] 電子伝達サブユニットがシトクロム Cであることを特徴とする請求項 23に記載のダルコース脱水素酵素複合体。

[25] 請求項 1〜22のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードする D

[26] 請求項 25に記載の DNAを保持し、請求項 1〜22のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素又は請求項 23に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。

[27] 請求項 1〜22に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項 23に記載の変異ダルコース脱水素酵素複合体、又は請求項 26に記載の微生物を含む、グルコースアツセィ³ rット。

[28] 請求項 1〜22に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項 23に記載の変異ダルコース脱水素酵素複合体、又は請求項 26に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。