CN101107353A - 突变葡糖脱氢酶 - Google Patents
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Abstract
对葡萄糖的底物特异性提高的突变葡糖脱氢酶，其是包含下述氨基酸序列并且具有葡糖脱氢酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列是SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列或者是在SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第365位以外具有1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，对应于所述第365位氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基。
Description
技术领域
本发明涉及底物特异性提高的突变葡糖脱氢酶。本发明的突变葡糖脱氢酶可适用于葡萄糖传感器、葡萄糖测定试剂盒等，且在生物化学领域、临床医学领域等是有用的。
背景技术
近年来，许多酶被用作生物传感器元件。葡糖氧化酶(GOD)已经在实践上被用作测量血液中葡萄糖水平的传感器元件，用于诊断糖尿病。但是GOD具有受到样品中溶解的氧影响的问题。因此，用不受样品中溶解的氧的影响的葡糖脱氢酶(GDH)作为GOD的备选方案，受到瞩目。
已报道，GDH中，有的需要NAD(P)+作为辅酶(E.C.1.1.1.47)，也有的需要吡咯并喹啉醌(PQQ)作为辅酶(PQQGDH；E.C.1.1.99.17)等。需要NAD(P)+作为辅酶的GDH，由于需要在测定体系中添加NAD(P)+，因而，作为传感器元件是有问题的。另一方面，诸如PQQGDH的辅酶结合型GDH，不需要在测定体系中添加辅酶。
此外，需要显示稳定性的传感器元件，其即使连续使用或者是放置于室温也不会丧失作为传感器的功能。
由于高温下生长的嗜热细菌来源的酶，一般具有高热稳定性，且即使长期保存、连续使用等，也显示高稳定性，因而，其作为传感器元件的应用，为人们所期待。然而，尽管已报道嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)和硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)来源的GDH为嗜热细菌来源的热稳定GDH，但它们都需要以NAD(P)+作为辅酶。
另一方面，中度嗜热细菌洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)产生的热稳定GDH，是FAD结合型GDH，且其诸如最适反应温度、热稳定性和底物特异性的酶学性质业已阐明(专利文献1)。该GDH，通常以异源寡聚体(heterooligomer)的形式存在，该寡聚体由显示高耐热性的催化亚基(α亚基)、电子传递亚基(β亚基，即，细胞色素C)和功能尚不清楚的γ亚基组成，且其最适反应温度为45℃。通过在大于50℃的温度进行热处理，可使这些亚基解离，以释放最适反应温度为75℃的α亚基单体。α亚基单体对热稳定，且即使60℃热处理30分钟后，仍显示80％或以上的残余活性。编码这些亚基的基因也已经被分离(专利文献1、专利文献2)。
但是，辅酶结合型GDH，一般来说，底物特异性广，且除葡萄糖外，还可和麦芽糖、半乳糖等反应。在用作监控糖尿病患者血糖水平的葡萄糖传感器时，且在糖尿病患者具有必须进行腹膜透析的严重症状时，由于透析液含有大量麦芽糖，因而，有得到比真实血糖水平高的值的危险。同样地，源自洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH，除葡萄糖外，也和麦芽糖与半乳糖反应。
通过导入氨基酸取代突变，改变GDH底物特异性的技术已为人们所知。这样的突变型GDH，例如已知，大肠杆菌(E.coli)(专利文献3和4)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(Gluconobactercalcoaceticus)(专利文献5)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(专利文献6～8)来源的需要吡咯并喹啉醌为辅酶的PQQGDHs。
专利文献1：美国专利申请第2004/0023330号
专利文献2：国际专利公开WO03/091430号
专利文献3：日本特开平10-243786号公报
专利文献4：日本特开2001-197888号公报
专利文献5：日本特开2004-173538号公报
专利文献6：日本特开2004-313172号公报
专利文献7：日本特开2004-313180号公报
专利文献8：日本特开2004-344145号公报
发明内容
本发明的目的在于提供对葡萄糖的底物特异性提高的FAD结合型GDH。
本发明人为达到上述目的进行了各种研究。结果是发现，通过对源自洋葱伯克霍尔德氏菌的FAD结合型GDH的特定位点的氨基酸序列进行修饰，可在维持对葡萄糖的反应性的同时，降低对不同于葡萄糖的糖的反应性，从而完成本发明。
即，本发明提供：
(1)具有如下氨基酸序列并具有葡糖脱氢酶活性的突变葡糖脱氢酶，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包括除了第365位氨基酸残基之外的1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，其中对应于所述氨基酸序列的第365位上的氨基酸残基被替换成另一个氨基酸残基，且所述突变葡糖脱氢酶对葡萄糖的底物特异性提高。
(2)根据(1)所述突变葡糖脱氢酶，其在对应于第365位的位置之外，具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。
(3)根据(1)或(2)所述突变葡糖脱氢酶，较之于在对应于第365位的位置上的氨基酸残基是野生型的葡糖脱氢酶，其对二糖的反应性降低。
(4)根据(3)所述突变葡糖脱氢酶，其中，所述二糖是麦芽糖。
(5)根据(4)所述突变葡糖脱氢酶，其对麦芽糖的反应性是对葡萄糖的反应性的20％或以下。
(6)根据(1)～(5)任一项所述突变葡糖脱氢酶，其中所述其他氨基酸残基是选自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸残基的氨基酸残基。
(7)根据(1)～(6)任一项所述突变葡糖脱氢酶，其中在对应于选自SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的第324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525和529位之中的至少一个位置上的一个或多个氨基酸残基，被替换成另一个或其他氨基酸残基。
(8)根据(7)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置由选自第326、472、475和529位之中的至少一个位置组成。
(9)根据(8)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第472位。
(10)根据(8)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第475位。
(11)根据(8)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置由第472和475位组成。
(12)根据(8)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第326位。
(13)根据(8)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第529位。
(14)根据(9)所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第472位的氨基酸残基被替换成选自天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺和组氨酸残基的氨基酸残基。
(15)根据(10)所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第475位的氨基酸残基被替换成组氨酸或丝氨酸残基。
(16)根据(12)所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第326位丝氨酸的氨基酸残基被替换成谷氨酰胺或缬氨酸残基。
(17)根据(13)所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第529位亮氨酸的氨基酸残基被替换成酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基。
(18)具有如下氨基酸序列并具有葡糖脱氢酶活性的突变葡糖脱氢酶，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包括1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，其包含(i)将对应于选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525和529位之中的至少一个位置的一个或多个位置上的一个或多个残基用一个或多个其他氨基酸残基取代，(ii)将对应于第472位的位置上的氨基酸残基用天冬氨酸残基取代，和(iii)将对应于第475位的位置上的氨基酸残基用组氨酸残基取代，且对葡萄糖的底物特异性提高。
(19)根据(18)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述一个或多个其他氨基酸残基选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基。
(20)根据(18)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第326位，且对应于该位置上的氨基酸残基被替换成谷氨酰胺或缬氨酸残基。
(21)根据(18)所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第529位，且对应于该位置上的氨基酸残基被替换成酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基。
(22)包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的FAD结合型突变葡糖脱氢酶。
(23)至少包含(1)～(22)任一项所述突变葡糖脱氢酶和电子传递亚基的突变葡糖脱氢酶复合体。
(24)根据(23)所述葡糖脱氢酶复合体，其中，所述电子传递亚基是细胞色素C。
(25)编码(1)～(22)任一项所述突变葡糖脱氢酶的DNA。
(26)携带(25)所述DNA，并产生(1)～(22)任一项所述突变葡糖脱氢酶或(23)所述突变葡糖脱氢酶复合体的微生物。
(27)包含(1)～(22)所述突变葡糖脱氢酶、(23)所述突变葡糖脱氢酶复合体或(26)所述微生物的葡萄糖测定试剂盒。
(28)包含(1)～(22)所述突变葡糖脱氢酶、(23)所述突变葡糖脱氢酶复合体或(26)所述微生物的葡萄糖传感器。
附图简述
图1是显示葡萄糖传感器的结构的图。
图2是显示葡萄糖传感器的试剂部分的图。
图3是显示采用了突变GDH的葡萄糖传感器对葡萄糖的反应性的图。
图4是显示采用了突变GDH的葡萄糖传感器在葡萄糖存在时对麦芽糖的反应性的图。
图5是显示使用采用了野生型GDH或突变GDH的葡萄糖传感器，测得的表观血糖水平(apparent blood sugar level)的图。
实施本发明的具体方式
以下，对本发明进行详细解释。
通过将特定突变导入野生型GDH，可制造本发明的突变GDH。野生型GDH的实例包括洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDH。洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDH的实例包括洋葱伯克霍尔德氏菌KSl株、JCM2800株和JCM2801株产生的GDH。KSl株，于2000年9月25日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地l中央第6)，且保藏号为FERM BP-7306。JCM2800和JCM280l株保藏于独立行政法人理化学研究所微生物系统保存设施(Japan Collection of Microorganisms)。
KSl株的包含GDH的α亚基基因和部分p亚基基因的染色体DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1(美国专利申请第2004/0023330号)。该核苷酸序列中有3个可读框(ORF)，自5’末端侧第2和第3个ORF，分别编码α亚基(SEQ ID NO：3)和β亚基(SEQ ID NO：4)。此外推测，第一个ORF编码γ亚基(SEQ ID NO：2)。此外，SEQ ID NO：5显示的是包含全长β亚基基因的片段的核苷酸序列。此外，β亚基的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6(EP1498484A)。据推测，SEQ ID NO：6中第1～22位氨基酸对应于信号肽。此外，尽管SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6中第1位氨基酸残基是Val，但其很有可能是Met，且有可能在翻译后消除。
本发明的突变GDH，可以仅由α亚基组成，可以由α亚基和β亚基的复合体组成，或可以由α亚基、β亚基和γ亚基的复合体组成。本发明的突变GDH，可在任何情况下通过向α亚基中导入特定突变得到，且除上述特定突变外，还可以含有保守突变。此外，其他亚基可以是野生型或具有保守突变。“保守突变”是指，对GDH活性没有相当大影响的突变。
本发明的突变α亚基，优选除了包括后述特定突变外，具有SEQ IDNO：13所示氨基酸序列。此外，突变α亚基，只要具有GDH活性，就可以具有前述保守突变。即，其可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是除上述特定突变外，包括取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO：13所示氨基酸序列。SEQ IDNO：13显示的是可以由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列。然而N末端的甲硫氨酸残基可能会在翻译后消除。上述术语“一个或几个”优选是指，1～10个，更优选1～5个，尤其优选1～3个。
此外，β亚基一般具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列。但是，只要是能够作为GDH的β亚基发挥功能，β亚基就可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：16的第23～425位氨基酸的氨基酸序列，其中包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。上述术语“一个或几个”优选是指，1～20个，更优选1～10个，尤其优选1～5个。此外，表述“作为GDH的β亚基发挥功能”是指，在不降低GDH酶促活性的情况下，发挥细胞色素C的功能。
野生型α亚基基因的具体实例包括含有对应于SEQ ID NO：11的第764～2380位核苷酸的核苷酸序列的DNA。此外，α亚基基因可以是具有对应于SEQ ID NO：11核苷酸序列的第764～2380位核苷酸的核苷酸序列的DNA，或者是与由上述序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有GDH活性的蛋白质的DNA。
此外，β亚基基因的具体实例包括具有对应于SEQ ID NO：9的第187～1398位核苷酸的核苷酸序列的DNA。此外，β亚基基因可以是具有对应于SEQ ID NO：9的第187～1398位核苷酸的核苷酸序列的DNA，或者是与由上述序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码能够作为β亚基发挥功能的蛋白质的DNA。
例如，上述“严格条件”的实例包括，具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，尤其优选95％或更高同源性的DNA相互杂交的条件，且具体而言，例如，1×SSC、0.1％SDS、60℃的条件。
例如，α亚基基因和β亚基基因可以以洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株的染色体DNA为模板，通过PCR获得。PCR用引物，通过基于上述核苷酸序列的化学合成来制备。此外，还可通过以基于上述序列制备的寡核苷酸为探针，通过杂交，从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株的染色体DNA获得。此外，从洋葱伯克霍尔德氏菌的其他菌株，也可类似地获得其变体。其他菌株的实例包括上述JCM2800株和JCM2801株。这些菌株产生的GDH的α亚基，和KS1株的α亚基分别具有95.4％和93.7％的同源性。
此外，其他微生物产生的GDH也可以用于制造本发明的突变GDH，只要选择和洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH具有类似的结构和酶学性质的GDH。这样的GDH的实例包括，(i)类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)，(ii)鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)，和(iii)茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)来源的GDH【(i)、(ii)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(39)，14240～14245(2004)，(iii)Nature 415(6871)，497～502(2002)】。
本发明的突变GDH对葡萄糖的底物特异性提高的原因在于，其是通过在如上述那样的野生型GDH或具有保守突变的GDH中添加特定突变获得的。“对葡萄糖的底物特异性提高”是指，在对葡萄糖的反应性基本上不变的情况下，降低对其他单糖、二糖和寡糖，例如，麦芽糖、半乳糖和木糖的反应性，以及对葡萄糖的反应性比对其他糖的反应性提高。例如，即使是对葡萄糖的反应性降低，只要是对其他糖的反应性降低的更多，则对葡萄糖的底物特异性提高。此外，即使是对其他糖的反应性提高，只要对葡萄糖的底物特异性提高的更多，则对葡萄糖的底物特异性提高。具体而言，例如，如果突变酶的底物特异性相对于野生型酶的底物特异性提高【底物特异性是指对葡萄糖以外的糖(例如麦芽糖)的比活性与对葡萄糖的比活性的比率，且提高以下式表示】为10％或更高，优选20％或更高，更优选40％或更高，则底物特异性是提高的。例如，如果野生型酶的底物特异性为60％，且突变GDH的底物特异性为40％，对葡萄糖以外的糖的反应性降低了33％。底物特异性＝(对葡萄糖以外的糖的比活性/对葡萄糖的比活性)×100底物特异性提高＝(A-B)×100/A
A：野生型酶的底物特异性
B：突变酶的底物特异性
此外，突变GDH对麦芽糖的反应性(比活性)优选是对葡萄糖的反应性(比活性)的30％或以下，更优选是20％或以下。
特定突变的具体实例包括如下所述。
(1)将对应于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第365位的位置上的氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代
(2)将对应于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第365位的位置上的氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代，并且将对应于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525和529位中的一个或多个位置上的至少1个或任意2个或更多个氨基酸残基用另一个或其他氨基酸残基取代
(3)(i)将对应于选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525和529位中的至少1个或任意2个或更多个位置的一个或多个位置上的一个或多个氨基酸残基用另一个或其他氨基酸残基取代，(ii)将对应于第472位的位置上的氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代，和(iii)将对应于第475位的位置上的氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代。
上述特定突变的实例进一步包括这样的突变，从而在GDH的氨基酸序列中应该含有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列。SEQ ID NO：7所示氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3所示GDH中的第360～366位的序列。人们认为，即使GDH是洋葱伯克霍尔德氏菌以外的FAD结合型GDH，如果对应的野生型GDH不含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，那么包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的突变GDH的底物特异性应该提高。
在上述突变(1)中提及的其他氨基酸残基的实例包括丝氨酸以外的氨基酸，具体而言为，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸。这些之中，优选苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸残基。
上述突变(2)中提及的其他氨基酸残基的实例包括野生型GDH的那些位置上的氨基酸残基以外的氨基酸残基。上述氨基酸取代的位置之中，优选第326位、472位、475位和529位，更优选第472位和475位。尽管对应于第472位和475位的氨基酸残基的取代，可以独立进行，更优选两个都被取代。
在第472位上，取代后的氨基酸残基，优选天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或组氨酸残基，更优选天冬氨酸残基。
在第475位上，取代后的氨基酸残基，优选组氨酸或丝氨酸残基，更优选组氨酸残基。
在第326位上，取代后的氨基酸残基，优选谷氨酰胺或缬氨酸残基。
在第529位上，取代后的氨基酸残基，优选酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基。
上述突变(3)的优选的实施方案，和上述类似。
上述氨基酸取代突变的位置为位于SEQ ID NO：3，即洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株野生型GDH的α亚基的氨基酸序列中的位置；在具有如下氨基酸序列的GDH的α亚基的同源物或变体中，其中所述氨基酸序列是指在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中，除上述特定突变以外，还包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，所述位置为对应于通过和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列比对所确定的上述氨基酸取代位置的位置。例如，在第1～364位区域中有一个氨基酸残基缺失的保守的GDH的α亚基变体中，第365位是指所述变体的第364位。
本发明的突变GDH中突变的优选实施方案，如下所示(数字表示在氨基酸序列中的位置，氨基酸残基表示所述位置发生取代后的氨基酸残基，且“+”表示同时包括2个氨基酸残基取代)。
(A)365Arg，365Asn，365Asp，365Cys，365Glu，365Gly，365His，365Ile，365Leu，365Met，365Phe，365Pro，365Trp，365Tyr，365Val，365Lys，365Gln，365Thr，365Ala
(B)326Gln，326Val，326Arg
(C)529His，529Tyr，529Trp
(D)365Tyr+326Gln，365Tyr+326Val，365Tyr+326Arg，365Tyr+472Phe，365Tyr+472Ile，365Tyr+472Ash，365Tyr+472Asp，365Tyr+472His，365Tyr+472Leu，365Tyr+472Ser，365Tyr+475Ser，365Tyr+475His，365Phe+472Phe
(E)472Asp+475His+365Phe，472Asp+475His+326Gln，472Asp+475His+326Thr，472Asp+475His+326Val，472Asp+475His+529Trp，472Asp+475His+529His，472Asp+475His+529Tyr，472Tyr+475His+365Phe，472Tyr+475His+365His，472Tyr+475His+326Val，472Ile+475His+326Gln
(F)472Asp+475His+529His+326Gln，472Asp+475His+529Trp+326Gln
本发明人比较了GMC氧化还原酶家族中以FAD为辅酶的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨糖醇脱氢酶(GenBank accessionAB039821)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的2-酮戊二酸脱氢酶(GenBank accession AF068066)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的纤维二糖脱氢酶(CDH)【J.Mol.Biol.，315(3)，421～34(2002)】、链霉菌属物种(Streptomyces species)的胆固醇氧化酶(COD)【J.Struct.Biol.，116(2)，317～9(1996)】和Penicilliumamagasakiens的葡糖氧化酶(Eur.J.Biochem.，252，90～99(1998)的氨基酸序列，并发现了FAD结合结构域和FAD-罩盖保守的区域，和参与蛋白质折叠的氨基酸残基脯氨酸保守的区域。于是，他们通过修饰这些区域和其他区域之间的边界附近的序列，检查了提高底物特异性的可能性。具体而言，检查了R53～H73、E88～A108、N308～G336、K362～A377、A391～R497和S509～V539。其结果是，在上述区域中，他们发现了一些使得可提高底物特异性的位置。
通过定点诱变，在编码GDH的α亚基的DNA(α亚基基因)中，导入对应于所需的氨基酸突变的核苷酸突变，并用适当的表达体系表达所述得到的突变DNA，可得到具有所需突变的GDH的α亚基。此外，通过将编码突变GDH的α亚基的DNA，和编码β亚基的DNA(β亚基基因)，或者是和β亚基基因和编码γ亚基的DNA(γ亚基基因)一起表达，可获得突变GDH复合体。针对向编码GDH的α亚基的DNA中导入突变，也可以使用以GDHα亚基、γ亚基和β亚基的顺序进行编码的多顺反子DNA片段。
导入有突变的GDH的α亚基或GDH复合体对糖的底物特异性，可通过采用实施例所述方法检查对各种糖的反应性，再将其和野生型GDH的α亚基或野生型GDH复合体的反应性进行比较，予以确定。
例如，以γ亚基、α亚基和β亚基的顺序进行编码的多顺反子DNA片段，可通过以洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株的染色体DNA为模板，且以具有SEQ ID NO：8和9所示核苷酸序列的寡核苷酸为引物，通过PCR来获得(参考后述实施例)。
GDH的亚基的基因的获得、突变的导入、基因表达等中使用的载体的实例包括在埃希菌属(Escherichia)细菌内发挥功能的载体，且其具体实例包括pTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等。基因表达用启动子的实例包括lac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等。此外，通过在包含启动子的表达载体的适当位点，插入α亚基基因或其他亚基基因，这些基因向载体的插入和启动子的连接可在一步中进行。这样的表达载体的实例包括pTrc99A、pBluescript、pKK223-3等。
此外，可以将α亚基基因或其他亚基基因以可表达的形式整合入宿主微生物的染色体DNA中。
用重组载体转化微生物的方法的实例包括，例如，通过钙处理的感受态细胞方法、原生质体法、电穿孔法等。
宿主微生物的实例包括诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、诸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母和诸如黑色曲霉(Aspergillus niger)的丝状真菌。然而，宿主微生物并不局限于这些实例，且可以使用适于外来蛋白质产生的宿主微生物。
本发明的突变α亚基、突变GDH复合体和表达它们的微生物，可用作葡萄糖传感器的酶电极或葡萄糖测定试剂盒的组分。使用洋葱伯克霍尔德氏菌的野生型GDH的葡萄糖传感器和葡萄糖测定试剂盒，在美国专利第2004/0023330A1中有记载。本发明的突变GDH，也可以以类似方式使用。
实施例
以下，参考实施例对本发明进行更为具体的解释。但本发明并不局限于这些实施例。
【实施例1】表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒
制备表达GDH的α亚基和γ亚基的质粒，以及表达α亚基、β亚基和γ亚基的质粒，作为表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒。<1>表达GDH的α亚基和γ亚基的质粒
使用WO02/036779(对应于EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703A)中记载的质粒pTrc99A/γ+α，作为表达α亚基和γ亚基的质粒。该质粒是通过将连续含有从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株(FERM BP-7306)染色体DNA分离得到的GDH的γ亚基结构基因和α亚基结构基因的DNA片段，插入到载体pTrc99A(Pharmacia)的克隆位点NcoI/HindIII得到的。该质粒中的GDHγα基因通过trc启动子调节。pTrc99A/γ+α具有氨苄青霉素抗性基因。
<2>表达GDH的α亚基、β亚基和γ亚基的质粒
表达GDH的α亚基、β亚基和γ亚基的质粒，如下制备。
(1)从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株制备染色体DNA
从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1株，按照常规方式制备染色体基因。即，使用TL液体培养基(1L中含有10g聚胨、1g酵母提取物、5g氯化钠、2g KH2PO4、5g葡萄糖；pH7.2)，并将该菌株的细胞于34℃在培养基中振荡过夜。通过离心，收集生长的细胞。将该细胞悬浮于含有10mM氯化钠、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS和100μg/mL蛋白酶K的溶液中，并于50℃处理6小时。向混合物中加入等体积的苯酚-氯仿，并于室温搅拌混合物10分钟。然后，通过离心收集上清液。向上清液中加入终浓度为0.3M的乙酸钠，然后覆盖2倍体积的乙醇，以使染色体DNA在中间层沉淀。用玻璃棒收集DNA，用70％乙醇洗涤，然后溶解于适量体积的TE缓冲液，以获得染色体DNA溶液。
(2)编码GDH的γ亚基、α亚基和β亚基的DNA片段的制备
以上述染色体DNA为模板，并以具有下述序列的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增编码GDH的γ亚基、α亚基和β亚基的DNA片段。正向引物：
5′-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3′(SEQ I D NO：8)
反向引物：
5′-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3′(SEQ I D NO：9)
将扩增的片段的C末端侧平端化后，用NcoI消化N末端侧，并将片段连接到类似处理的pTrc99A(Pharmacia)。用得到的重组载体转化大肠杆菌DH5α，并收集在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落。将得到的转化体用液体LB培养基培养后，提取质粒，并分析插入质粒中的DNA片段。结果，证实了大约3.8kb的插入片段。将该质粒命名为pTrc99Aγαβ。该质粒中的GDH的结构基因，通过trc启动子调节。pTrc99Aγαβ具有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。
【实施例2】通过在GDH的α亚基中的诱变，搜索GDH的α亚基的底物相互作用位点
(1)在第472位和第475位的诱变
将实施例1得到的pTrc99Aγαβ中所含的GDH的α亚基基因进行诱变，从而分别用组氨酸残基和天冬酰胺残基取代该基因编码的α亚基的第472位上的丙氨酸残基和第475位上的天冬氨酸残基。将该突变体称为472D+475H突变体。本发明人已经证实，通过这些突变，底物特性得到改善。
具体而言，使用市售定点诱变试剂盒(Stratagene，QuikChangeIISite-Directed Mutagenesis Kit)，用天冬氨酸(GAT)或谷氨酸(GAA)的密码子取代实施例1所述质粒pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ中所含的GDH的α亚基基因的第475位上的天冬酰胺的密码子(AAT)。使用下述寡核苷酸作为引物。
<A472D突变导入用引物>
正向引物：SEQ ID NO：224
5′-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3′
反向引物：SEQ ID NO：225
5′-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3′
<N475H突变导入用引物>
正向引物：SEQ ID NO：226
5′-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3′
反向引物：SEO ID NO：227
5′-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3′
(2)在第472位和第475位以外的位置的诱变
使用上述得到的编码472D+475H突变体的突变基因，以获得用苯丙氨酸残基对如下所示区域的氨基酸残基的取代。但当野生型氨基酸残基为苯丙氨酸残基时，在该位置不进行氨基酸取代。下述数字表示的是氨基酸序列中的位置，且数字前的字母表示的是氨基酸的种类。例如，R53表示的是第53位上的精氨酸。
(i)R53～H73
(ii)E88～A108
(iii)N308～G336
(iv)K362～A377
(v)A391～R497
(vi)S509～V539
作为诱变靶的α亚基基因，可使用底物特性改善作用已得到确认的472D+475H突变体，通过突变组合，以获得协同作用。
上述氨基酸残基取代使用的正向引物的序列如下所示。反向引物的序列是和正向引物完全互补的链。
在突变的记号中，数字表示是在氨基酸序列中的位置，数字前的字母表示的是氨基酸取代前的氨基酸种类，且数字后的字母表示的是氨基酸取代后的氨基酸残基。例如，R53F表示的是用苯丙氨酸取代第53位上的精氨酸。
使用下述反应组成进行RCR。95℃反应30秒后，重复进行15次下述反应循环：95℃、30秒，55℃、1分钟和68℃、8分钟。然后，并于68℃反应30分钟后，将反应混合物保持在4℃。
【反应混合物组成】
模板DNA(5ng/μL) 2μL
(导入有472D+475H的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ)
10×反应缓冲液 5μL
正向引物(100ng/μL) 1.25μL
反向引物(100ng/μL) 1.25μL
dNTP 1μL
蒸馏水 38.5μL
DNA聚合酶 1μL
合计 50μL
PCR后，在反应混合物中添加0.5μL DNA聚合酶I，并于37℃温育混合物1小时，以使模板质粒分解。
用得到的反应混合物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(supE44，Δ1acU169(φ80lacZΔM15)、hsdR17、recAi、endA1、gyrA96、thi-1、relA1)。从在含有氨苄青霉素(50μg/mL)和卡那霉素(30μg/mL)的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、1.5％琼脂)上生长的几个菌落，制备质粒DNA，并进行序列分析，以确认目的突变已导入到GDH的α亚基基因中。
表1：R53～H73区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| R53F | 10 | P64F | 20 |
| N54F | 11 | Y65F | 21 |
| Q55F | 12 | P66F | 22 |
| P56F | 13 | S67F | 23 |
| D57F | 14 | S68F | 24 |
| K58F | 15 | P69F | 25 |
| M59F | 16 | W70F | 26 |
| D60F | 17 | A71F | 27 |
| M62F | 18 | P72F | 28 |
| A63F | 19 | H73F | 29 |
表2：E88～A108区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| E88F | 30 | V99F | 40 |
| H89F | 31 | G100F | 41 |
| K90F | 32 | G101F | 42 |
| N92F | 33 | T102F | 43 |
| S93F | 34 | T103F | 44 |
| Q94F | 35 | W104F | 45 |
| Y95F | 36 | H105F | 46 |
| I96F | 37 | W106F | 47 |
| R97F | 38 | A107F | 48 |
| A98F | 39 | A108F | 49 |
表3：N308～G336区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| N308F | 50 | G322F | 64 |
| S309F | 51 | T323F | 65 |
| S310F | 52 | G324F | 66 |
| D311F | 53 | V325F | 67 |
| M312F | 54 | S326F | 68 |
| V313F | 55 | Y328F | 69 |
| G314F | 56 | A329F | 70 |
| R315F | 57 | S330F | 71 |
| N316F | 58 | E331F | 72 |
| L317F | 59 | K332F | 73 |
| M318F | 60 | L333F | 74 |
| D319F | 61 | W334F | 75 |
| H320F | 62 | P335F | 76 |
| P321F | 63 | G336F | 77 |
表4：K362～I377区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| I362F | 78 | I370F | 86 |
| H363F | 79 | D371F | 87 |
| L364F | 80 | Q372F | 88 |
| S365F | 81 | E373F | 89 |
| N366F | 82 | T374F | 90 |
| L367F | 83 | Q375F | 91 |
| S368F | 84 | K376F | 92 |
| R369F | 85 | I377F | 93 |
表5：A391～Y453区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| A391F | 94 | D425F | 124 |
| Q392F | 95 | A426F | 125 |
| I393F | 96 | I427F | 126 |
| R394F | 97 | G428F | 127 |
| D395F | 98 | I429F | 128 |
| R396F | 99 | P430F | 129 |
| S397F | 100 | R431F | 130 |
| A398F | 101 | P432F | 131 |
| R399F | 102 | E433F | 132 |
| Y400F | 103 | I434F | 133 |
| V401F | 104 | T435F | 134 |
| Q402F | 105 | Y436F | 135 |
| D404F | 106 | A437F | 136 |
| C405F | 107 | I438F | 137 |
| H407F | 108 | D439F | 138 |
| E408F | 109 | D440F | 139 |
| I409F | 110 | Y441F | 140 |
| L410F | 111 | V442F | 141 |
| P413F | 112 | K443F | 142 |
| E414F | 113 | R444F | 143 |
| N415F | 114 | G445F | 144 |
| R416F | 115 | A446F | 145 |
| I417F | 116 | A447F | 146 |
| V418F | 117 | H448F | 147 |
| P419F | 118 | T449F | 148 |
| S420F | 119 | R450F | 149 |
| K421F | 120 | E451F | 150 |
| T422F | 121 | V452F | 151 |
| A423F | 122 | Y453F | 152 |
| T424F | 123 |
表6：I477～R497区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| I477F | 153 | R488F | 164 |
| T478F | 154 | D489F | 165 |
| G479F | 155 | S490F | 166 |
| S480F | 156 | V491F | 167 |
| T481F | 157 | V492F | 168 |
| I482F | 158 | D493F | 169 |
| M483F | 159 | K494F | 170 |
| G484F | 160 | D495F | 171 |
| A485F | 161 | C496F | 172 |
| D486F | 162 | R497F | 173 |
| A487F | 163 |
表7：S509～V539区域取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| S509F | 174 | A525F | 190 |
| A510F | 175 | A526F | 191 |
| T511F | 176 | L527F | 192 |
| M512F | 177 | A528F | 193 |
| P513F | 178 | L529F | 194 |
| T514F | 179 | R530F | 195 |
| V515F | 180 | M531F | 196 |
| G516F | 181 | S532F | 197 |
| T517F | 182 | DS33F | 198 |
| V518F | 183 | T534F | 299 |
| N519F | 184 | L535F | 200 |
| V520F | 185 | K536F | 201 |
| T521F | 186 | KS37F | 202 |
| L522F | 187 | E538F | 203 |
| T523F | 188 | V539F | 204 |
| I524F | 189 |
【实施例3】突变GDH的底物特异性分析
用实施例2得到的表达突变GDH的质粒，制造突变GDH，并检查其底物特异性。
(1)培养
在L型管中，将导入有各突变的大肠杆菌DH5α各菌株，在2mL的LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL卡那霉素)中于37℃振荡培养过夜。将这些培养液各自接种于包含于500mL坂口瓶中的150mL的LB培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL卡那霉素)中，并于37℃振荡培养细胞。在培养开始3小时后，添加终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)，并将细胞再培养2小时。
(2)粗酶样品的制备
从上述获得的各培养液收集细胞，洗涤，以每0.3mg湿细胞1ml含有0.2％Triton×100的10mM磷酸钾缓冲液(PPB)(pH7.0)的比例悬浮细胞，并通过超声破坏。将该悬浮液离心(10000r.p.m，10分钟，4℃)，以除去残渣，然后将上清液超速离心(50,000r.p.m，60分钟，4℃)，并将得到的上清液(水溶性级分)用作粗酶样品。此外，通过常规疏水层析(柱：辛基琼脂糖凝胶，Amersham Biosciences)和离子交换层析(柱：Q-琼脂糖凝胶，Amersham Biosciences)，对上述样品进行纯化，以得到纯化的酶样品。以GDH活性为指标，确定目标酶级分。
(3)GDH活性的测量
向8μL上述纯化的酶样品中，添加8μL活性测量用试剂【通过向12μL的600mM甲基吩嗪硫酸二甲酯(PMS)和120μL的6mM 2，6-二氯酚靛酚(DCIP)中添加含有0.2％(w/v)Triton X-100的10mM PPB，直至终体积为480μL的溶液】。将该混合物用铝块恒温室(aluminumblock thermostatic chamber)在各反应温度预温育1分钟，然后，迅速添加8μL各浓度的底物(葡萄糖或麦芽糖)或蒸馏水到混合物中，并搅拌混合物，用分光光度计测量600nm(DCIP来源的吸收波长)处的吸光度。试剂DCIP和PMS的终浓度分别为0.06mM和0.6mM。底物终浓度为5mM。
结果示于表8～14。野生型GDH的反应比为48％。
表8
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| A472D+N475H | 2.02 | 0.28 | 13.8％ |
| R53F | 3.34 | 0.42 | 12.6％ |
| N54F | 2.19 | 0.32 | 14.4％ |
| Q55F | 1.95 | 0.24 | 12.4％ |
| P56F | 2.28 | 0.37 | 16.4％ |
| D57F | 2.85 | 0.42 | 14.9％ |
| K58F | 1.57 | 0.20 | 12.8％ |
| M59F | 1.94 | 0.29 | 14.8％ |
| D60F | 2.62 | 0.36 | 13.9％ |
| M62F | 0.85 | 0.16 | 19.2％ |
| A63F | 0.66 | 0.12 | 18.6％ |
| P64F | 1.79 | 0.30 | 16.9％ |
| Y65F | 0.29 | 0.16 | 54.0％ |
| P66F | 0.12 | 0.12 | 100.0％ |
| S67F | 0.70 | 0.20 | 28.0％ |
| S68F | 2.23 | 0.26 | 11.6％ |
| P69F | 0.60 | 0.09 | 15.1％ |
| W70F | 2.64 | 0.32 | 12.2％ |
| A71F | 2.90 | 0.31 | 10.7％ |
| P72F | 0.05 | 0.06 | 112.7％ |
| H73F | 3.25 | 0.39 | 12.1％ |
表9
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| E88F | 1.14 | 0.16 | 16.6％ |
| H89F | 1.83 | 0.28 | 17.1％ |
| K90F | 1.19 | 0.14 | 14.6％ |
| N92F | 1.11 | 0.17 | 18.4％ |
| S93F | 2.47 | 0.38 | 16.7％ |
| Q94F | 1.16 | 0.14 | 15.0％ |
| Y95F | 1.89 | 0.20 | 12.5％ |
| I96F | 0.53 | 0.06 | 17.7％ |
| R97F | 0.73 | 0.10 | 17.6％ |
| A98F | 2.47 | 0.24 | 11.0％ |
| V99F | 0.40 | 0.04 | 17.4％ |
| G100F | 0.07 | 0.02 | 50.5％ |
| G101F | -0.02 | -0.01 | 108.3％ |
| T102F | -0.02 | -0.02 | 126.7％ |
| T103F | -0.03 | -0.01 | 203.0％ |
| W104F | 0.52 | 0.04 | 14.4％ |
| H105F | 0.01 | 0.01 | 112.7％ |
| W106F | 0.29 | 0.03 | 20.4％ |
| A107F | 0.52 | 0.03 | 12.4％ |
| A108F | 0.00 | 0.00 | 104.1％ |
表10
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| N308F | 0.03 | 0.04 | 104.7％ |
| S309F | 0.03 | 0.03 | 94.4％ |
| S310F | 0.04 | 0.06 | 144.8％ |
| D311F | 0.76 | 0.08 | 10.3％ |
| M312F | 0.19 | 0.07 | 35.4％ |
| V313F | 0.04 | 0.04 | 103.8％ |
| G314F | 0.15 | 0.08 | 50.6％ |
| R315F | 0.01 | 0.01 | 89.5％ |
| N316F | 0.16 | 0.07 | 44.4％ |
| L317F | 0.10 | 0.07 | 70.4％ |
| M318F | 0.04 | 0.01 | 26.6％ |
| D319F | 0.03 | 0.02 | 53.8％ |
| H320F | 1.30 | 0.23 | 17.9％ |
| P321F | 2.43 | 0.40 | 16.6％ |
| G322F | 0.04 | 0.04 | 98.9％ |
| T323F | 0.62 | 0.10 | 16.5％ |
| G324F | 3.34 | 0.20 | 6.0％ |
| V325F | 0.08 | 0.09 | 114.1％ |
| S326F | 2.45 | 0.17 | 6.7％ |
| Y328F | 0.03 | 0.03 | 97.2％ |
| A329F | 0.69 | 0.09 | 12.4％ |
| S330F | 0.39 | 0.07 | 17.3％ |
| E331F | 1.86 | 0.17 | 9.4％ |
| K332F | 0.81 | 0.10 | 12.8％ |
| L333F | 3.05 | 0.26 | 8.4％ |
| W334F | 4.18 | 0.29 | 7.0％ |
| P335F | 0.10 | 0.02 | 22.4％ |
| G336F | 0.02 | 0.00 | 0.5％ |
表11
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| I362F | 0.11 | 0.10 | 88.2％ |
| H363F | 0.47 | 0.10 | 20.4％ |
| L364F | 3.30 | 0.33 | 10.1％ |
| S365F | 2.89 | 0.04 | 1.2％ |
| N366F | 0.04 | 0.03 | 75.8％ |
| L367F | 4.30 | 0.44 | 10.2％ |
| S368F | 3.88 | 0.25 | 6.4％ |
| R369F | 3.58 | 0.25 | 7.1％ |
| I370F | 1.30 | 0.12 | 8.9％ |
| D371F | 2.73 | 0.35 | 12.9％ |
| Q372F | 3.98 | 0.36 | 8.9％ |
| E373F | 1.60 | 0.21 | 12.9％ |
| T374F | 1.91 | 0.18 | 9.4％ |
| Q375F | 3.59 | 0.39 | 10.8％ |
| K376F | 2.83 | 0.20 | 6.9％ |
| I377F | 3.05 | 0.23 | 7.6％ |
表12
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | ||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | ||
| A391F | 2.07 | 0.22 | 10.9％ | D425F | 0.02 | 0.02 | 124.5％ |
| Q392F | 2.21 | 0.22 | 10.2％ | A426F | 1.75 | 0.19 | 10.8％ |
| I393F | 1.76 | 0.19 | 11.1％ | I427F | 1.95 | 0.25 | 12.8％ |
| R394F | 0.73 | 0.13 | 17.4％ | G428F | 0.25 | 0.14 | 56.1％ |
| D395F | 1.39 | 0.17 | 12.0％ | I429F | 0.46 | 0.06 | 12.0％ |
| R396F | 1.20 | 0.14 | 11.9％ | P430F | 0.41 | 0.05 | 11.2％ |
| S397F | 0.75 | 0.08 | 10.8％ | R431F | 1.80 | 0.16 | 8.7％ |
| A398F | 2.11 | 0.22 | 10.3％ | P432F | 0.19 | 0.11 | 56.4％ |
| R399F | 1.98 | 0.20 | 10.1％ | E433F | 1.31 | 0.14 | 10.4％ |
| Y400F | 2.35 | 0.24 | 10.0％ | I434F | 0.13 | 0.05 | 41.2％ |
| V401F | 0.57 | 0.11 | 19.2％ | T435F | 1.16 | 0.13 | 11.0％ |
| Q402F | 0.58 | 0.07 | 12.3％ | Y436F | 4.35 | 0.26 | 6.1％ |
| D404F | 0.28 | 0.08 | 29.2％ | A437F | 2.44 | 0.22 | 9.0％ |
| C405F | 0.06 | 0.06 | 104.9％ | I438F | 0.07 | 0.03 | 39.8％ |
| H407F | 0.08 | 0.06 | 67.3％ | D439F | 0.01 | 0.01 | 73.0％ |
| E408F | 0.08 | 0.08 | 97.0％ | D440F | 0.03 | 0.04 | 155.6％ |
| I409F | 0.16 | 0.04 | 25.0％ | Y441F | 0.03 | 0.04 | 119.5％ |
| L410F | 0.08 | 0.07 | 85.7％ | V442F | 0.01 | 0.01 | 175.0％ |
| P413F | 0.05 | 0.04 | 72.9％ | K443F | 4.64 | 0.27 | 5.9％ |
| E414F | 1.22 | 0.15 | 12.6％ | R444F | 2.41 | 0.26 | 10.8％ |
| N415F | 0.03 | 0.04 | 119.5％ | H448F | 0.87 | 0.07 | 8.3％ |
| R416F | 0.18 | 0.03 | 17.1％ | T449F | 2.47 | 0.30 | 12.0％ |
| I417F | 0.05 | 0.05 | 86.6％ | R450F | 0.04 | 0.05 | 112.7％ |
| V418F | 2.66 | 0.19 | 7.3％ | E451F | 2.15 | 0.22 | 10.0％ |
| P419F | 1.74 | 0.10 | 5.7％ | V452F | 1.17 | 0.18 | 15.3％ |
| S420F | 0.45 | 0.04 | 8.5％ | Y453F | 0.17 | 0.18 | 106.1％ |
| K421F | 0.42 | 0.06 | 15.0％ | ||||
| T422F | 1.98 | 0.18 | 9.1％ | ||||
| T424F | 2.27 | 0.26 | 11.6％ | ||||
表13
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| I477F | 0.83 | 0.20 | 24％ |
| T478F | 0.03 | 0.03 | 104％ |
| G479F | 0.05 | 0.05 | 96％ |
| S480F | 0.08 | 0.11 | 144％ |
| T481F | 0.01 | 0.00 | -20％ |
| I482F | 0.01 | -0.01 | -200％ |
| M483F | 2.54 | 0.22 | 9％ |
| G484F | 0.01 | 0.01 | 116％ |
| A485F | 0.05 | 0.06 | 116％ |
| D486F | 0.77 | 0.10 | 14％ |
| A487F | 0.10 | 0.07 | 67％ |
| R488F | 0.08 | 0.07 | 88％ |
| D489F | 1.57 | 0.18 | 11％ |
| S490F | 0.03 | 0.04 | 149％ |
| V491F | 0.05 | 0.04 | 81％ |
| V492F | 0.08 | 0.08 | 109％ |
| D493F | 0.05 | 0.03 | 77％ |
| K494F | 1.32 | 0.26 | 20％ |
| D495F | 0.10 | 0.07 | 74％ |
| C496F | 0.04 | 0.07 | 150％ |
| R497F | 0.19 | 0.13 | 68％ |
表14
| 酶 | U/ml(培养基) | 反应比 | |
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| S509F | 0.16 | 0.04 | 24％ |
| A510F | 0.20 | 0.05 | 25％ |
| T511F | 0.18 | 0.04 | 20％ |
| M512F | 2.18 | 0.25 | 11％ |
| P513F | 3.50 | 0.35 | 10％ |
| T514F | 0.01 | 0.00 | 41％ |
| V515F | 0.04 | 0.03 | 78％ |
| G516F | 0.02 | 0.01 | 76％ |
| T517F | 0.03 | 0.02 | 83％ |
| V518F | 0.02 | 0.01 | 73％ |
| N519F | 0.04 | 0.03 | 78％ |
| V520F | 0.02 | 0.01 | 58％ |
| T521F | -0.01 | -0.01 | 168％ |
| L522F | 0.01 | 0.00 | -29％ |
| T523F | 0.01 | 0.00 | 24％ |
| I524F | 0.01 | -0.01 | -110％ |
| A525F | 3.20 | 0.24 | 7％ |
| A526F | 0.02 | 0.00 | 23％ |
| L527F | 0.29 | 0.10 | 34％ |
| A528F | 0.00 | -0.01 | 350％ |
| L529F | 3.32 | 0.30 | 9％ |
| R530F | 0.40 | 0.10 | 26％ |
| M531F | 0.10 | 0.04 | 42％ |
| S532F | 0.00 | 0.00 | 23％ |
| D533F | 0.03 | 0.01 | 27％ |
| L537F | 0.45 | 0.10 | 22％ |
| E538F | 3.08 | 0.52 | 17％ |
| V539F | 1.52 | 0.29 | 19％ |
其结果是，发现472D+475H+365F是极其有效的突变，在维持了对葡萄糖的反应性的同时，其将对麦芽糖的反应性降低到1％水平。
在365位突变以外的突变中，用苯丙氨酸取代G324、S326、L333、W334、S368、R369、K376、I377、V418、P419、Y436、K433、H448、A525和L529的突变，均使得对麦芽糖的反应性降低到诱变前的60％或以下，因而，这些突变是有效的。
【实施例4】检查第365位上的诱变
从实施例3得到的结果估计，第365位是降低对麦芽糖的反应性的非常有效的位置。因此，决定对该位置进行详细检查。
具体而言，检查在α亚基基因的第365位上的单个诱变所引起的底物特性改善作用。
在pTrc99Aγαβ所含的野生型GDH的α亚基基因的第365位，进行诱变，并评价突变的酶的底物特异性。采用和实施例2相同的方式进行诱变。
诱变用正向引物如下所示。反向引物是正向引物的完全互补链。
表15：S365位取代用引物
| 氨基酸取代 | SEQ ID NO | 氨基酸取代 | SEQ ID NO |
| S365G | 205 | S365N | 215 |
| S365A | 206 | S365Q | 216 |
| S365V | 207 | S365Y | 217 |
| S365L | 208 | S365C | 218 |
| S365I | 209 | S365K | 219 |
| S365M | 210 | S365R | 220 |
| S365P | 211 | S365H | 221 |
| S365F | 212 | S365D | 222 |
| S365W | 213 | S365E | 223 |
| S365T | 214 |
【实施例5】突变GDH的底物特异性分析
用实施例4得到的表达突变GDH的质粒，以与实施例3相同的方式，制备突变GDH，并检查其底物特异性。用粗酶样品检查酶活性。各突变GDH对葡萄糖的比活性、对麦芽糖的比活性和反应比(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性，单位：U/mL)示于表16。评价时底物浓度为5mM和10mM。
表16：单个诱变U/mL(培养基)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| 野生型 | 2.87 | 0.77 | 26.9％ | 2.52 | 1.22 | 48.2％ |
| S365F | 3.02 | 0.46 | 15.4％ | 4.59 | 1.00 | 21.7％ |
| S365D | 2.77 | 0.41 | 14.8％ | 4.73 | 0.87 | 18.4％ |
| S365H | 0.90 | 0.04 | 4.3％ | 1.49 | 0.12 | 8.1％ |
| S365R | 1.09 | 0.08 | 6.9％ | 1.96 | 0.28 | 14.1％ |
| S365W | 0.47 | 0.01 | 2.3％ | 1.17 | 0.02 | 2.0％ |
| S365Y | 1.42 | 0.02 | 1.6％ | 2.46 | 0.05 | 2.0％ |
| S365G | 2.51 | 0.42 | 16.9％ | 3.80 | 0.81 | 21.3％ |
| S365E | 0.55 | 0.04 | 7.6％ | 0.98 | 0.19 | 19.2％ |
| S365I | 1.00 | 0.08 | 7.6％ | 1.56 | 0.16 | 10.5％ |
| S365P | 0.62 | 0.06 | 9.7％ | 1.29 | 0.17 | 13.3％ |
| S365L | 0.97 | 0.07 | 7.4％ | 1.59 | 0.19 | 11.7％ |
| S365N | 1.90 | 0.23 | 12.3％ | 2.92 | 0.43 | 14.8％ |
| S365K | 1.61 | 0.13 | 7.9％ | 2.35 | 0.26 | 10.9％ |
| S365Q | 1.68 | 0.19 | 11.4％ | 3.53 | 0.44 | 12.6％ |
| S365M | 2.10 | 0.29 | 13.7％ | 3.99 | 0.56 | 14.1％ |
| S365T | 1.76 | 0.23 | 13.1％ | 3.19 | 0.56 | 17.4％ |
| S365A | 3.14 | 0.49 | 15.7％ | 4.80 | 0.29 | 6.0％ |
| S365C | 1.79 | 0.19 | 10.4％ | 2.74 | 0.20 | 7.4％ |
| S365V | 2.20 | 0.26 | 12.0％ | 3.03 | 0.62 | 20.4％ |
其结果是，将野生型第365位上的丝氨酸残基替换成除丝氨酸以外的所有19种氨基酸残基类型，观察到底物特性改善作用。具体而言，所有的这些氨基酸取代，均使得对麦芽糖的反应性比野生型降低50％或以上。尤其是在取代成酪氨酸和色氨酸后，底物浓度为5mM和10mM时，对麦芽糖的反应性为2％或更低，而野生型反应比则为40％左右。由此可见，所述取代将对麦芽糖的反应性降低了90％或以上，并因而观察到极其显著的底物特性改善作用。
【实施例6】检查第365位和其他位置的组合作用
如实施例2和实施例5的结果所示，至少确认了在第365位的突变365F和472D+475H突变的组合，以及仅在第365位由所有氨基酸取代进行的单个诱变的作用。由此知道，第365位是底物特性改善的极其高效的位置。由此，为获得更进一步的底物特性改善，其通过将第365位的氨基酸取代和其他位置的氨基酸取代组合来实现，又进行了进一步的研究。具体而言，检查了将第365位和第326位、529位和472位之中的任一位的双重诱变；以及第365位、第472位和第475位的三重诱变。
表17：双重诱变 U/mL(培养基)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| S365Y(单突变) | 1.42 | 0.02 | 1.6％ | 2.46 | 0.05 | 2.0％ |
| S365F(单突变) | 3.02 | 0.46 | 15.4％ | 4.59 | 1.00 | 21.7％ |
| 365Y+326C | 2.56 | 0.02 | 1.0％ | 3.71 | 0.06 | 1.5％ |
| 365Y+326Q | 2.28 | 0.01 | 0.6％ | 3.32 | 0.03 | 1.0％ |
| 365Y+326T | 1.76 | 0.02 | 1.2％ | 2.64 | 0.06 | 2.3％ |
| 365Y+326V | 1.55 | 0.01 | 0.5％ | 2.47 | 0.01 | 0.5％ |
| 365Y+326G | 2.36 | 0.03 | 1.4％ | 3.32 | 0.09 | 2.6％ |
| 365Y+326E | 1.90 | 0.02 | 1.1％ | 2.82 | 0.05 | 1.7％ |
| 365Y+326K | 2.98 | 0.06 | 2.0％ | 4.22 | 0.17 | 4.0％ |
| 365Y+326Y | 1.60 | 0.02 | 1.3％ | 2.33 | 0.04 | 1.8％ |
| 365Y+326H | 1.27 | 0.02 | 1.5％ | 1.84 | 0.04 | 2.2％ |
| 365Y+326R | 1.84 | 0.01 | 0.8％ | 2.63 | 0.03 | 1.0％ |
| 365Y+472F | 1.35 | 0.01 | 0.8％ | 2.04 | 0.02 | 1.1％ |
| 365F+326T | 0.54 | 0.10 | 18.4％ | 6.84 | 1.38 | 20.1％ |
| 365F+326G | 0.46 | 0.08 | 17.8％ | 5.51 | 1.37 | 24.9％ |
| 365F+326E | 2.44 | 0.33 | 13.6％ | 3.06 | 0.61 | 19.8％ |
| 365F+326R | 3.14 | 0.49 | 15.5％ | 3.83 | 0.81 | 21.1％ |
| 365F+472F | 1.51 | 0.01 | 0.6％ | 2.28 | 0.02 | 1.0％ |
| 365Y+475H | 2.07 | 0.027 | 1.0％ | 3.62 | 0.044 | 1.5％ |
| 365Y+475S | 3.41 | 0.066 | 1.9％ | 4.54 | 0.116 | 2.6％ |
| 365Y+472G | 2.60 | 0.064 | 2.5％ | 4.76 | 0.078 | 1.6％ |
| 365Y+472I | 1.31 | 0.008 | 0.6％ | 2.04 | 0.020 | 1.0％ |
| 365Y+472N | 2.19 | 0.018 | 0.8％ | 3.42 | 0.052 | 1.5％ |
| 365Y+472D | 1.33 | 0.009 | 0.6％ | 2.08 | 0.004 | 0.2％ |
| 365Y+472E | 2.99 | 0.068 | 2.3％ | 5.27 | 0.089 | 1.7％ |
| 365Y+472R | 1.77 | 0.030 | 1.7％ | 2.87 | 0.025 | 0.9％ |
| 365Y+472V | 3.19 | 0.073 | 2.3％ | 5.10 | 0.095 | 1.9％ |
| 365Y+472C | 0.74 | 0.023 | 3.1％ | 1.07 | 0.018 | 1.7％ |
| 365Y+472H | 1.04 | 0.002 | 0.2％ | 1.63 | 0.005 | 0.3％ |
| 365Y+472L | 3.21 | 0.053 | 1.6％ | 4.85 | 0.062 | 1.3％ |
| 365Y+472M | 1.17 | 0.019 | 1.6％ | 1.87 | 0.029 | 1.5％ |
| 365Y+472F | 1.67 | 0.029 | 1.7％ | 2.99 | 0.043 | 1.4％ |
| 365Y+472p | 0.44 | 0.080 | 18.1％ | 0.72 | 0.048 | 6.7％ |
| 365Y+472S | 3.70 | 0.079 | 2.1％ | 4.74 | 0.087 | 1.8％ |
| 365Y+472W | 0.84 | 0.046 | 5.5％ | 1.63 | 0.044 | 2.7％ |
| 365Y+472Y | 0.98 | 0.051 | 5.2％ | 1.85 | 0.042 | 2.3％ |
表18：三重诱变 U/mL(培养液)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| 472D+475H | 1.54 | 0.19 | 13％ | 2.33 | 0.34 | 14％ |
| +S365F | 1.33 | 0.01 | 0.7％ | 2.44 | 0.02 | 0.9％ |
| +S365D | 0.25 | 0.01 | 2.1％ | 0.64 | 0.01 | 1.9％ |
| +S365H | 0.48 | 0.01 | 1.9％ | 0.85 | 0.02 | 2.5％ |
| +S365R | 0.15 | 0.01 | 9.6％ | 0.54 | 0.04 | 7.5％ |
| +S365W | 0.30 | 0.01 | 3.0％ | 0.54 | 0.03 | 4.8％ |
| +S365Y | 0.97 | 0.03 | 2.9％ | 1.66 | 0.08 | 5.1％ |
| +S365V | 0.07 | 0.01 | 8.3％ | 0.16 | 0.01 | 6.8％ |
| 472Y+475H | 1.30 | 0.06 | 4.5％ | 2.06 | 0.15 | 7.3％ |
| +S365F | 1.15 | 0.01 | 0.7％ | 1.83 | 0.01 | 0.6％ |
| +S365D | 0.27 | 0.01 | 4.9％ | 0.55 | 0.05 | 9.5％ |
| +S365H | 0.49 | 0.01 | 1.1％ | 0.95 | 0.01 | 1.5％ |
| +S365R | 0.33 | 0.02 | 5.0％ | 0.83 | 0.06 | 6.9％ |
| +S365W | 0.22 | 0.01 | 2.3％ | 0.37 | 0.01 | 3.0％ |
| +S365Y | 1.09 | 0.04 | 4.0％ | 1.88 | 0.13 | 6.8％ |
| +S365V | 0.79 | 0.02 | 2.0％ | |||
| 472F+475S | 0.67 | 0.05 | 7.6％ | 1.35 | 0.11 | 8.0％ |
| +S365F | 0.88 | 0.06 | 6.7％ | 1.19 | 0.08 | 7.1％ |
| +S365D | 0.35 | 0.01 | 4.2％ | 0.97 | 0.03 | 3.5％ |
| +S365H | 0.04 | 0.00 | 9.7％ | 0.13 | 0.00 | 3.4％ |
| +S365R | 0.39 | 0.02 | 4.9％ | 0.92 | 0.04 | 4.5％ |
| +S365W | 0.10 | 0.00 | 2.9％ | 0.24 | 0.00 | 1.3％ |
| +S365Y | 0.36 | 0.01 | 4.1％ | 0.56 | 0.02 | 3.0％ |
| 472F+475H+S365Y | 2.75 | 0.35 | 12.8％ | 3.90 | 0.63 | 16.1％ |
结果发现，通过和检查的所有位置的组合，使得底物特性得到协同改善，且由此可知，通过将第365位的突变和改善底物特性的其他位置的氨基酸取代进行组合，可进一步改善底物特性。
【实施例7】检查第472位和第475位与其他位置的组合作用
实施例6的结果提示，通过将具有底物特性改善作用的氨基酸取代相互组合，可使得底物特性协同改善。
由此，检测已经被发明人确认具有底物特性改善作用的第472位或第475位的突变与第365位以外的位置的突变组合的作用。
具体而言，检查了在第472位和第475位的突变组合中底物特性改善作用最高的472D+475H突变，和第326位或第529位的突变的组合。此外，也检查了第472位和第475位的其他突变。
表19：三重诱变 U/mL(培养液)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| 472D+475H | 1.54 | 0.19 | 13％ | 2.33 | 0.34 | 14％ |
| +326C | 1.27 | 0.03 | 2.4％ | 2.08 | 0.11 | 5.2％ |
| +326Q | 1.22 | 0.02 | 1.8％ | 2.04 | 0.09 | 4.2％ |
| +326T | 1.29 | 0.02 | 1.8％ | 2.13 | 0.10 | 4.7％ |
| +326V | 0.69 | 0.01 | 2.0％ | 1.10 | 0.03 | 3.0％ |
| +326G | 1.98 | 0.07 | 3.6％ | 2.99 | 0.22 | 7.3％ |
| +326L | 0.09 | 0.00 | 3.1％ | 0.24 | 0.01 | 3.4％ |
| +326E | 0.34 | 0.00 | 0.8％ | 0.69 | 0.02 | 2.9％ |
| +326I | 0.35 | 0.01 | 1.7％ | 0.77 | 0.06 | 7.5％ |
| +326K | 1.55 | 0.05 | 3.1％ | 1.87 | 0.14 | 7.2％ |
| 472D+475H+326Q | 1.20 | 0.02 | 1.7％ | 1.87 | 0.07 | 3.9％ |
| 472E+475H+326Q | 1.55 | 0.08 | 5.5％ | 2.69 | 0.26 | 9.7％ |
| 472H+475H+326Q | 0.10 | 0.02 | 23.6％ | 0.17 | 0.06 | 32.0％ |
| 472I+475H+326Q | 1.05 | 0.03 | 2.6％ | 1.81 | 0.08 | 4.5％ |
| 472L+475H+326Q | 2.17 | 0.15 | 6.7％ | 3.41 | 0.32 | 9.3％ |
| 472M+475H+326Q | 3.07 | 0.28 | 9.0％ | 4.99 | 0.53 | 10.7％ |
| 472N+475H+326Q | 2.45 | 0.24 | 9.7％ | 4.01 | 0.57 | 14.3％ |
| 472W+475H+326Q | 2.82 | 0.44 | 15.8％ | 4.37 | 0.89 | 20.4％ |
| 472Y+475H+326Q | 1.73 | 0.07 | 4.3％ | 3.03 | 0.19 | 6.1％ |
| 472D+475H+326V | 0.69 | 0.01 | 2.0％ | 1.10 | 0.03 | 3.0％ |
| 472E+475H+326V | 1.90 | 0.12 | 6.2％ | 2.88 | 0.25 | 8.8％ |
| 472H+475H+326V | 1.07 | 0.08 | 7.4％ | 1.91 | 0.19 | 9.7％ |
| 472I+475H+326V | 2.90 | 0.26 | 9.0％ | 4.35 | 0.69 | 15.9％ |
| 472L+475H+326V | 1.32 | 0.05 | 4.1％ | 2.00 | 0.12 | 6.1％ |
| 472M+475H+326V | 3.52 | 0.32 | 9.0％ | 5.64 | 0.41 | 7.4％ |
| 472N+475H+326V | 2.85 | 0.25 | 8.7％ | 4.48 | 0.49 | 10.9％ |
| 472W+475H+326V | 2.71 | 0.38 | 14.0％ | 4.56 | 0.74 | 16.2％ |
| 472Y+475H+326V | 0.99 | 0.01 | 1.2％ | 1.79 | 0.05 | 2.5％ |
表20：三重诱变 U/mL(培养液)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| 472D+475H | 1.54 | 0.19 | 12.5％ | 2.33 | 0.34 | 14.5％ |
| +529F | 2.13 | 0.29 | 13.7％ | 3.11 | 0.41 | 13.3％ |
| +529Y | 0.21 | 0.02 | 8.3％ | 0.42 | 0.03 | 7.9％ |
| +529H | 1.36 | 0.11 | 7.8％ | 2.24 | 0.21 | 9.4％ |
| +529W | 0.49 | 0.03 | 5.1％ | 0.78 | 0.04 | 5.7％ |
表21：四重诱变 U/mL(培养液)
| 5mM | 10mM | |||||
| 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | 葡萄糖 | 麦芽糖 | 麦芽糖/葡萄糖 | |
| 472D+475H+529H+326Q | 0.49 | 0.01 | 1.9％ | 0.93 | 0.03 | 2.8％ |
| 472D+475H+529W+326Q | 0.45 | 0.02 | 4.7％ | 0.72 | 0.07 | 10.1％ |
也确认了第472位和第475位的突变与其他位置的突变组合的协同作用。具体地，第472位、475位、326位和529位的四重诱变具有很明显地降低对麦芽糖的反应性的作用，该结果也证实，通过将具有底物特性改善作用的氨基酸取代进行组合，可协同改善底物特性。
【实施例7】纯化酶的制备
对实施例5和6中观察到具有底物特异性改善的一些突变GDH，进行纯化。采用与实施例3所述相同的方法。各纯化酶对葡萄糖的比活性(U/mg)示于表8。
其结果是发现，包含S365Y的突变，可将对葡萄糖的比活性维持在约90％，且因此从葡萄糖测量的观点看，是优选的突变。此外还发现，S326Q突变具有提高对葡萄糖的比活性的作用。
表22
| 酶 | 比活性 |
| 野生型 | 1490U/mg-p |
| 472Y+475H+326V | 1547U/mg-p |
| 365Y | 1234U/mg-p |
| 326Q+365Y | 1316U/mg-p |
| 472D+475H+365F | 477U/mg-p |
| 472D+475H+529W | 963U/mg-p |
| 472D+475H+529H | 961U/mg-p |
| 472D+475H+326Q | 1316U/mg-p |
| 472D+475H+326V | 1157U/mg-p |
【实施例8】使用突变GDH测量血糖水平的比色传感器的制备
用实施例7得到的突变GDH，制备用于测量血糖水平的比色传感器。
制备具有图1所示基本结构的葡萄糖传感器。即，上述葡萄糖传感器具有如下构型，即，在透明基板2A上经由隔板3层压透明盖4A(材料：PET)，且毛细管5A由元件2A～4A来限定。毛细管5A的尺寸为，1.3mm×9mm×50μm(图1)。透明基板2A和透明盖4A是由厚250μm的PET形成的，隔板3A是由黑色双面胶带形成的。
葡萄糖传感器具有图2所示第1试剂部分、第2试剂部分和第3试剂部分，各部分的成分和涂覆量示于表23。表中，“Ru”表示六氨钌复合物(ruthenium hexaammine complex，Ru(NH3)6Cl3)，CHAPS表示(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸)，ACES表示N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，且MTT表示3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑。
表23
第1试剂部分
含有电子传递物质的试剂部分用材料溶液(溶剂是水)
| Ru | 涂覆量 |
| 200mM | 0.2μL |
第2试剂部分
含有酶的试剂部分用材料溶液(溶剂是水)
| 酶浓度 | CHAPS | 蔗糖单月桂酸酯 | ACES(pH7.5) | 涂覆量 |
| 15KU/mL | 0.20％ | 0.05％ | 75mM | 0.1μL |
第3试剂部分
含有显色剂的试剂部分用材料溶液(溶剂是水)
| MTT | 丙烯酰胺 | 甲醇 | 涂覆量 |
| 60mM | 0.40％ | 50％ | 0.2μL |
将测定样品供给上述葡萄糖传感器的毛细管，且其后，每隔0.1秒，重复测量吸光度，以制作吸光度的时程。每次测量吸光度时，沿毛细管的高度方向，对第3试剂部分进行光照射，且照射后，接收透过传感器的光。用发光二极管以630nm的光照射获得光照射。透射的光被电二极管接受。
测定样品使用的是添加有葡萄糖的血液。在血细胞比容被调整到42％的血液样品中，添加浓度为0、100、200、400、600和800mg/dL的葡萄糖，并用于评估葡萄糖传感器的线性。线性评价方法如下：在将测定样品导入传感器后5秒，绘制终点的吸光度图。结果示于图3。
此外，在血细胞比容被调整到45％、且葡萄糖浓度被调整到45mg/dL的血液样品中，还添加浓度为0、100、200和300mg/dL的麦芽糖，并用于评价麦芽糖的影响。结果示于图4。同样在所述试验中，线性通过绘制导入测定样品后5秒终点的吸光度图来进行。
在以葡萄糖为底物进行线性评价时，对于所有酶，吸光度均呈现浓度依赖性增加，且由此知道，可对葡萄糖进行测量。尤其是包括突变365Y或包括第365位突变的突变326Q365Y的突变GDH的线性比野生型的更为改善，并从而提示，其使得可进行更高浓度范围(600mg/dL附近)的测定。
至于麦芽糖的影响，在将麦芽糖添加到含有45mg/dL葡萄糖的样品时，野生型的吸光度以麦芽糖浓度依赖性的方式增加，由此提示和麦芽糖发生了强烈反应。另一方面，对于使用了突变酶的传感器，麦芽糖浓度依赖性的吸光度的增加被阻抑，从而麦芽糖产生的影响较小。通过将这些数据换算成表观血糖增加值所得的结果，示于图5和表24。在使用了野生型酶的传感器中，由于麦芽糖的污染，低血糖水平(45mg/dL葡萄糖)被表观表示成正常值(138mg/dL葡萄糖)。另一方面，在使用了修饰的GDH的传感器中，即使当样品被最高300mg/dL的麦芽糖污染时，表观血糖水平最高也只增加到60mg/dL，从而可以说影响被大幅度阻抑。结论是：这提示包含第365位突变的突变，从对葡萄糖的反应性(线性)和麦芽糖影响的观点看，是最适合的。
表24
| 添加麦芽糖 | 野生型 | 365Y | 326Q+365Y | 472D+475H+365F |
| 0 | 45 | 45 | 45 | 45 |
| 100 | 75 | 45 | 47 | 46 |
| 200 | 113 | 48 | 47 | 48 |
| 300 | 138 | 50 | 58 | 54 |
| 添加麦芽糖 | 472Y+475H+326V | 472D+475H+529W | 472D+475H+529H | 472D+475H+326Q | 472D+475H+326V |
| 0 | 45 | 45 | 45 | 45 | 45 |
| 100 | 53 | 45 | 46 | 45 | 45 |
| 200 | 60 | 46 | 47 | 49 | 47 |
| 300 | 60 | 47 | 49 | 50 | 53 |
由以上结果可清楚知道，在使用了突变GDH的葡萄糖传感器中，即使是线性和野生型的维持在相当或更高程度，对麦芽糖的反应性也大大降低。如果采用该使用了突变GDH的葡萄糖传感器，则可以说，在医院等施用时的血液麦芽糖水平的上限浓度200mg/dL的情况下，不会观察到错误值，且即便是在超过上限值的300mg/dL，低血糖值(50mg/dL或更低)也不会被判断成正常值或高血糖水平，且因而可进行安全治疗。此外，由于上述那样的GDH不和溶解的氧反应，因而，通过提供使用该突变GDH的传感器，可对糖尿病患者进行正确的诊断和治疗。
【实施例9】基于SV图对纯化酶的评价
使用实施例5和6中观察到显著的底物特异性改善作用的365Y和326Q+365Y突变GDH作为纯化酶，获得SV图。
其结果是确认，在检查的所有底物浓度下，纯化酶的反应比(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性)均比野生型大幅降低，并因此得到改善。此外，由于结果和使用粗酶溶液获得的测量结果基本一致，因而可确认，用粗酶对修饰酶进行评价，是充分可行的。进而，由于血液麦芽糖水平最高也只上升到200mg/dL，因而，尤其关注了底物浓度为10mM(360mg/dL)和5mM(180mg/dL)时的反应比。其结果是，在该浓度范围，S365Y突变的GDH的麦芽糖/葡萄糖的反应比为0.1％，且因而这提示其几乎不和麦芽糖反应。
此外还知道，除突变365Y之外使用突变326Q，可提高对葡萄糖的比活性，并相对降低对麦芽糖的反应性。
表25
酶特性的评价
对葡萄糖的比活性
| 40 | 20 | 10 | 5 | 25 | 1.25 | 0.625 | mM | |
| 野生型 | 1543.7 | 1490.0 | 1388.1 | 1223.4 | 925.1 | 604.6 | 346.2 | U/mg-p |
| 365Y | 1464.4 | 1234.0 | 970.8 | 661.1 | 397.2 | 218.2 | 101.8 | U/mg-p |
| 326Q365Y | 1525.8 | 1316.0 | 1022.4 | 686.4 | 436.8 | 238.8 | 114.7 | U/mg-p |
对麦芽糖的比活性
| 40 | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | mM | |
| 野生型 | 658.1 | 501.9 | 335.3 | 194.3 | 85.9 | 27.9 | 5.4 | U/mg-p |
| 365Y | 31.1 | 8.1 | 1.4 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.0 | U/mg-p |
| 326Q365Y | 31.2 | 7.2 | 1.4 | 0.3 | 0.4 | 0.0 | 0.0 | U/mg-p |
麦芽糖/葡萄糖(反应比)
| 40 | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | mM | |
| 野生型 | 42.6％ | 33.7％ | 24.2％ | 15.9％ | 9.3％ | 4.6％ | 1.6％ | ％ |
| 365Y | 2.1％ | 0.7％ | 0.1％ | 0.1％ | 0.0％ | 0.1％ | 0.0％ | ％ |
| 3260365Y | 20％ | 0.5％ | 0.1％ | 0.0％ | 0.1％ | 0.0％ | 0.0％ | ％ |
工业适用性
本发明的突变GDH，对葡萄糖的底物特异性提高，且可适用于使用了葡萄糖传感器等的葡萄糖的测量。
序 列 表
<110>Arkray.Inc.
<120>突变葡糖脱氢酶
<130>G1017-C6142
<150>JP2005-179231
<151>2005-06-20
<160>227
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2467
<212>DNA
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)
<220>
<221>CDS
<222>(258)..(761)
<220>
<221>CDS
<222>(764)..(2380)
<220>
<221>CDS
<222>(2386)..(2466)
<400>1
aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60
gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120
tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180
tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240
gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg
1 5 10
cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338
His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln
15 20 25
ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu
30 35 40
cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434
Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met
45 50 55
acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482
Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile
60 65 70 75
ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530
Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala
80 85 90
gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578
Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr
95 100 105
cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626
Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu
110 115 120
ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc 674
Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe
125 130 135
ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722
Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys
140 145 150 155
ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769
Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala
160 165 170
gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc 817
Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val
175 180 185
gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg 865
Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val
190 195 200
atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913
Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu
205 210 215
cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg 961
Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro
220 225 230
tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac 1009
Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr
235 240 245 250
ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg 1057
Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala
255 260 265
gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105
Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile
270 275 280
ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg 1153
Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp
285 290 295
ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa 1201
Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu
300 305 310
gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg 1249
Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro
315 320 325 330
cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag 1297
Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu
335 340 345
cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc 1345
Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val
350 355 360
gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg 1393
Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro
365 370 375
act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg 1441
Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala
380 385 390
atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg 1489
Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala
395 400 405 410
aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac 1537
Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp
415 420 425
aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat 1585
Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His
430 435 440
cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg 1633
Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr
445 450 455
ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc 1681
Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val
460 465 470
gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc 1729
Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly
475 480 485 490
acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc 1777
Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
495 500 505
ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc 1825
Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg
510 515 520
gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc 1873
Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile
525 530 535
gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921
Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro
540 545 550
gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969
Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln
555 560 565 570
ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017
Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val
575 580 585
ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc 2065
Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile
590 595 600
acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113
Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg
605 610 615
gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161
Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val
620 625 630
ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc 2209
Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile
635 640 645 650
atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257
Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr
655 660 665
ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc 2305
Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr
670 675 680
gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg 2353
Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg
685 690 695
atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403
Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu
700 705 710
act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg 2451
Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala
715 720 725
gcc gat gcg gcc gat c 2467
Ala Asp Ala Ala Asp
730
<210>2
<211>168
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)
<400>2
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp
35 40 45
Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser
50 55 60
Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln
85 90 95
Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser
100 105 110
Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn
115 120 125
Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp
130 135 140
Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala
145 150 155 160
Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala
165
<210>3
<211>539
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)
<400>3
Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser
1 5 10 15
Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys
20 25 30
Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile
35 40 45
Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
50 55 60
Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile
85 90 95
Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg
100 105 110
Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg
115 120 125
Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala
130 135 140
Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe
165 170 175
Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
180 185 190
His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly
195 200 205
Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile
210 215 220
Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala
225 230 235 240
Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly
245 250 255
Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala
260 265 270
Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile
275 280 285
Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn
290 295 300
Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His
305 310 315 320
Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly
325 330 335
Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro
340 345 350
Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser
355 360 365
Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met
370 375 380
Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr
385 390 395 400
Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
405 410 415
Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro
420 425 430
Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His
435 440 445
Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp
450 455 460
Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser
465 470 475 480
Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys
485 490 495
Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met
500 505 510
Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala
515 520 525
Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val
530 535
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhorderia cepacia)
<400>4
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp
20 25
<210>5
<211>1441
<212>DNA
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)
<220>
<221>CDS
<222>(121)..(1398)
<400>5
tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60
gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120
gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg 168
Val Arg Lys Set Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1 5 10 15
ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag 216
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
20 25 30
cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag 264
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
35 40 45
atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
50 55 60
gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
65 70 75 80
ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
85 90 95
ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg 456
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
100 105 110
tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac 504
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
115 120 125
ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag 552
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
130 135 140
atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg 600
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145 150 155 160
ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc 648
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
165 170 175
gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc 696
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
180 185 190
acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac 744
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
195 200 205
gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac 792
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210 215 220
ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg 840
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225 230 235 240
cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc 888
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
245 250 255
gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg 936
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
260 265 270
aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg 984
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
275 280 285
gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg 1032
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
290 295 300
ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg 1080
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305 310 315 320
tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg 1128
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325 330 335
tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg 1176
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
340 345 350
ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg 1224
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
355 360 365
cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 1272
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
370 375 380
ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg 1320
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385 390 395 400
ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg 1368
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
405 410 415
acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
420 425
cggcgcaacc gataggacag gag 1441
<210>6
<211>425
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)
<400>6
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
20 25 30
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
35 40 45
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
50 55 60
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
65 70 75 80
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
85 90 95
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
100 105 110
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
115 120 125
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
130 135 140
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145 150 155 160
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
165 170 175
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
180 185 190
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
195 200 205
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
210 215 220
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225 230 235 240
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
245 250 255
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
260 265 270
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
275 280 285
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
290 295 300
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325 330 335
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
340 345 350
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
355 360 365
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
370 375 380
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385 390 395 400
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
405 410 415
Thr Gln Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
420 425
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以为除丝氨酸之外的任何天然存在的氨基酸
<400>7
Lys Lys Ile His Leu Xaa Asn
1 5
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>8
catgccatgg cacacaacga caacac 26
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac 30
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
ggaaatcgtc gagcgcttct ttaatcagcc cgacaagatg g 41
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>11
cgagcgcttc cgctttcagc ccgacaagat g 31
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>12
gtcgagcgct tccgcaattt tcccgacaag atggacttc 39
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>13
gagcgcttcc gcaatcagtt tgacaagatg gacttcatgg c 41
<210>14
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>14
gcttccgcaa tcagcccttt aagatggact tcatggcgc 39
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>15
ccgcaatcag cccgacttta tggacttcat ggcgccg 37
<210>16
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>16
gcaatcagcc cgacaagttt gacttcatgg cgccg 35
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>17
caatcagccc gacaagatgt ttttcatggc gccgtaccc 39
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>18
cgacaagatg gacttctttg cgccgtaccc gtc 33
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>19
cgacaagatg gacttcatgt ttccgtaccc gtcgagccc 39
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>20
caagatggac ttcatggcgt tttacccgtc gagcccctg 39
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>21
acttcatggc gccgtttccg tcgagcccc 29
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>22
cttcatggcg ccgtactttt cgagcccctg ggc 33
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>23
gcgccgtacc cgtttagccc ctgggcg 27
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>24
cgccgtaccc gtcgtttccc tgggcgccg 29
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>25
ccgtacccgt cgagcttttg ggcgccgcatccc 33
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>26
ccgtcgagcc cctttgcgcc gcatccc 27
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>27
cgtcgagccc ctggtttccg catcccgagt acg 33
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>28
cgagcccctg ggcgtttcat cccgagtacg gcc 33
<210>29
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>29
ccctgggcgc cgtttcccga gtacggc 27
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>30
ctacctgatc ctgaagggct ttcacaagtt caactcgcag tac 43
<210>31
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>31
cctgatcctg aagggcgagt ttaagttcaa ctcgcagtac atc 43
<210>32
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>32
atcctgaagg gcgagcactt tttcaactcg cagtacatcc g 41
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>33
agggcgagca caagttcttt tcgcagtaca tccgcgc 37
<210>34
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>34
gcgagcacaa gttcaacttt cagtacatcc gcgcg 35
<210>35
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>35
cgagcacaag ttcaactcgt tttacatccg cgcggtggg 39
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>36
caagttcaac tcgcagttta tccgcgcggt ggg 33
<210>37
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>37
gttcaactcg cagtactttc gcgcggtggg c 31
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>38
gttcaactcg cagtacatct ttgcggtggg cggcacg 37
<210>39
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>39
ctcgcagtac atccgctttg tgggcggcac gac 33
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>40
agtacatccg cgcgtttggc ggcacgacg 29
<210>41
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>41
tacatccgcg cggtgtttgg cacgacgtgg cac 33
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>42
ccgcgcggtg ggctttacga cgtggcactg g 31
<210>43
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>43
cgcggtgggc ggctttacgt ggcactgggc c 31
<210>44
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>44
cggtgggcgg cacgttttgg cactgggccg c 31
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>45
ggcggcacga cgtttcactg ggccgcg 27
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>46
gcggcacgac gtggttttgg gccgcgtcgg c 31
<210>47
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>47
gcacgacgtg gcactttgcc gcgtcggcg 29
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>48
cgacgtggca ctggtttgcg tcggcgtggc g 31
<210>49
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>49
acgtggcact gggccttttc ggcgtggcgc ttc 33
<210>50
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>50
cccgaacggt gtcgcgttta gctcggacat ggtcg 35
<210>51
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>51
gaacggtgtc gcgaactttt cggacatggt cggcc 35
<210>52
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>52
gtgtcgcgaa cagctttgac atggtcggcc g 31
<210>53
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>53
tgtcgcgaac agctcgttta tggtcggccg caacc 35
<210>54
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>54
cgaacagctc ggactttgtc ggccgcaacc t 31
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>55
cgaacagctc ggacatgttt ggccgcaacc tgatg 35
<210>56
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>56
gaacagctcg gacatggtct ttcgcaacct gatggaccat c 41
<210>57
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>57
ctcggacatg gtcggcttta acctgatgga ccatccg 37
<210>58
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>58
ggacatggtc ggccgctttc tgatggacca tccgg 35
<210>59
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>59
ggtcggccgc aactttatgg accatccggg c 31
<210>60
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>60
cggccgcaac ctgtttgacc atccgggca 29
<210>61
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>61
cggccgcaac ctgatgtttc atccgggcac cgg 33
<210>62
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>62
gcaacctgat ggactttccg ggcaccggc 29
<210>63
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>63
gcaacctgat ggaccatttt ggcaccggcg tgtcg 35
<210>64
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>64
caacctgatg gaccatccgt ttaccggcgt gtcgttctat g 41
<210>65
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>65
tgatggacca tccgggcttt ggcgtgtcgt tctatgc 37
<210>66
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>66
ggaccatccg ggcacctttg tgtcgttcta tgcgagc 37
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>67
tccgggcacc ggcttttcgt tctatgcgag c 31
<210>68
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>68
gggcaccggc gtgtttttct atgcgagcga g 31
<210>69
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>69
cggcgtgtcg ttctttgcga gcgagaagc 29
<210>70
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>70
ccggcgtgtc gttctatttt agcgagaagc tgtggcc 37
<210>71
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>71
ggcgtgtcgt tctatgcgtt tgagaagctg tggccgg 37
<210>72
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>72
gtgtcgttct atgcgagctt taagctgtgg ccgggcc 37
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>73
gttctatgcg agcgagtttc tgtggccggg ccg 33
<210>74
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>74
atgcgagcga gaagttttgg ccgggccgc 29
<210>75
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>75
cgagcgagaa gctgtttccg ggccgcggc 29
<210>76
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>76
agcgagaagc tgtggtttgg ccgcggcccg c 31
<210>77
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>77
gagaagctgt ggccgtttcg cggcccgcag g 31
<210>78
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>78
cgaagcggcg aagaagtttc acctgtcgaa cctgt 35
<210>79
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>79
cgaagcggcg aagaagatct ttctgtcgaa cctgtcgcg 39
<210>80
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>80
ggcgaagaag atccactttt cgaacctgtc gcgca 35
<210>81
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>81
gcgaagaaga tccacctgtt taacctgtcg cgcatcg 37
<210>82
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>82
gaagaagatc cacctgtcgt ttctgtcgcg catcgacca 39
<210>83
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>83
agatccacct gtcgaacttt tcgcgcatcg accag 35
<210>84
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>84
cacctgtcga acctgtttcg catcgaccag gag 33
<210>85
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>85
cacctgtcga acctgtcgtt tatcgaccag gagacgcag 39
<210>86
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>86
cgaacctgtc gcgctttgac caggagacgc a 31
<210>87
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>87
cgaacctgtc gcgcatcttt caggagacgc agaagatct 39
<210>88
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>88
gaacctgtcg cgcatcgact ttgagacgca gaagatcttc aag 43
<210>89
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>89
ctgtcgcgca tcgaccagtt tacgcagaag atcttcaagg c 41
<210>90
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>90
cgcgcatcga ccaggagttt cagaagatct tcaaggccg 39
<210>91
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>91
gcatcgacca ggagacgttt aagatcttca aggccggca 39
<210>92
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>92
cgaccaggag acgcagttta tcttcaaggc cggcaag 37
<210>93
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>93
ccaggagacg cagaagtttt tcaaggccgg caagc 35
<210>94
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>94
cccgacgagc tcgactttca gatccgcgac cgt 33
<210>95
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>95
gacgagctcg acgcgtttat ccgcgaccgt tcc 33
<210>96
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>96
gctcgacgcg cagtttcgcg accgttccg 29
<210>97
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>97
ctcgacgcgc agatctttga ccgttccgca cgc 33
<210>98
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>98
gacgcgcaga tccgctttcg ttccgcacgc tac 33
<210>99
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>99
cgcagatccg cgacttttcc gcacgctacg t 31
<210>100
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>100
cagatccgcg accgttttgc acgctacgtg cag 33
<210>101
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>101
gatccgcgac cgttcctttc gctacgtgca gttcg 35
<210>102
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>102
ccgcgaccgt tccgcatttt acgtgcagtt cgactgc 37
<210>103
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>103
ccgttccgca cgctttgtgc agttcgactg c 31
<210>104
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>104
ccgttccgca cgctactttc agttcgactg cttcc 35
<210>105
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>105
cgttccgcac gctacgtgtt tttcgactgc ttccacgaaat 41
<210>106
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>106
cgcacgctac gtgcagttct tttgcttcca cgaaatcctgc 41
<210>107
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>107
gctacgtgca gttcgacttt ttccacgaaa tcctgcc 37
<210>108
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>108
gtgcagttcg actgcttctt tgaaatcctg ccgcaaccc 39
<210>109
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>109
cagttcgact gcttccactt tatcctgccg caacccg 37
<210>110
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>110
cgactgcttc cacgaatttc tgccgcaacc cga 33
<210>111
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>111
gactgcttcc acgaaatctt tccgcaaccc gagaacc 37
<210>112
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>112
ccacgaaatc ctgccgcaat ttgagaaccg catcgtgcc 39
<210>113
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>113
aaatcctgcc gcaacccttt aaccgcatcg tgccgag 37
<210>114
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>114
ctgccgcaac ccgagtttcg catcgtgccg agc 33
<210>115
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>115
gccgcaaccc gagaacttta tcgtgccgag caagacg 37
<210>116
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>116
caacccgaga accgctttgt gccgagcaag acg 33
<210>117
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>117
ccgagaaccg catctttccg agcaagacgg c 31
<210>118
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>118
cgagaaccgc atcgtgttta gcaagacggc gaccg 35
<210>119
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>119
gaaccgcatc gtgccgttta agacggcgac cgatg 35
<210>120
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>120
cgcatcgtgc cgagctttac ggcgaccgat gcg 33
<210>121
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>121
catcgtgccg agcaagtttg cgaccgatgc gatcg 35
<210>122
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>122
cgtgccgagc aagacgttta ccgatgcgat cggca 35
<210>123
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>123
ccgagcaaga cggcgtttga tgcgatcggc attcc 35
<210>124
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>124
gcaagacggc gacctttgcg atcggcattc c 31
<210>125
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>125
caagacggcg accgatttta tcggcattcc gcgcc 35
<210>126
<210>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>126
ggcgaccgat gcgtttggca ttccgcgcc 29
<210>127
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>127
gcgaccgatg cgatctttat tccgcgcccc gag 33
<210>128
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>128
tgcgatcggc tttccgcgcc ccg 23
<210>129
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>129
ccgatgcgat cggcattttt cgccccgaga tcacg 35
<210>130
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>130
gatgcgatcg gcattccgtt tcccgagatc acgtatgcg 39
<210>131
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>131
cgatcggcat tccgcgcttt gagatcacgt atgcgatcg 39
<210>132
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>132
ggcattccgc gcccctttat cacgtatgcg atcgacg 37
<210>133
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>133
ccgcgccccg agtttacgta tgcgatcgac g 31
<210>134
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>134
ccgcgccccg agatctttta tgcgatcgac gactacg 37
<210>135
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>135
ccccgagatc acgtttgcga tcgacgact 29
<210>136
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>136
gcgccccgag atcacgtatt ttatcgacga ctacgtgaag c 41
<210>137
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>137
ccgagatcac gtatgcgttt gacgactacg tgaagcg 37
<210>138
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>138
cgagatcacg tatgcgatct ttgactacgt gaagcgcgg 39
<210>139
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>139
gatcacgtat gcgatcgact tttacgtgaa gcgcggcgc 39
<210>140
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>140
gtatgcgatc gacgactttg tgaagcgcgg cgc 33
<210>141
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>141
gcgatcgacg actactttaa gcgcggcgcc g 31
<210>142
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>142
cgatcgacga ctacgtgttt cgcggcgccg cgc 33
<210>143
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>143
tcgacgacta cgtgaagttt ggcgccgcgc atacg 35
<210>144
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>144
cgactacgtg aagcgctttg ccgcgcatac gcg 33
<210>145
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>145
tacgtgaagc gcggctttgc gcatacgcgc gag 33
<210>146
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>146
tgaagcgcgg cgcctttcat acgcgcgagg tct 33
<210>147
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>147
gcggcgccgc gtttacgcgc gaggtct 27
<210>148
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>148
cggcgccgcg cattttcgcg aggtctacgc g 31
<210>149
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>149
ggcgccgcgc atacgtttga ggtctacgcg acc 33
<210>150
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>150
gccgcgcata cgcgctttgt ctacgcgacc gcc 33
<210>151
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>151
gcatacgcgc gagttttacg cgaccgccg 29
<210>152
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>152
acgcgcgagg tctttgcgac cgccgcg 27
<210>153
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>153
cgatccgaac catcacttta cgggctcgac gatca 35
<210>154
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>154
cgatccgaac catcacatct ttggctcgac gatcatggg 39
<210>155
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>155
tccgaaccat cacatcacgt tttcgacgat catgggcgc 39
<210>156
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>156
catcacatca cgggctttac gatcatgggc gcc 33
<210>157
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>157
atcacatcac gggctcgttt atcatgggcg ccgatgc 37
<210>158
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>158
cacgggctcg acgtttatgg gcgccgatg 29
<210>159
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>159
cgggctcgac gatctttggc gccgatgcg 29
<210>160
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>160
gggctcgacg atcatgtttg ccgatgcgcg cga 33
<210>161
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>161
gctcgacgat catgggcttt gatgcgcgcg actcc 35
<210>162
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>162
cgatcatggg cgcctttgcg cgcgactcc 29
<210>163
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>163
cgatcatggg cgccgatttt cgcgactccg tcgtc 35
<210>164
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>164
tgggcgccga tgcgtttgac tccgtcgtcg aca 33
<210>165
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>165
gcgccgatgc gcgcttttcc gtcgtcgaca agg 33
<210>166
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>166
cgatgcgcgc gactttgtcg tcgacaagga c 31
<210>167
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>167
tgcgcgcgac tcctttgtcg acaaggactg c 31
<210>168
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>168
cgcgcgactc cgtctttgac aaggactgcc g 31
<210>169
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>169
cgcgactccg tcgtctttaa ggactgccgc acg 33
<210>170
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>170
cgactccgtc gtcgactttg actgccgcac gttcg 35
<210>171
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>171
ctccgtcgtc gacaagtttt gccgcacgtt cgacc 35
<210>172
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>172
cgtcgtcgac aaggactttc gcacgttcga ccatc 35
<210>173
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>173
gtcgtcgaca aggactgctt tacgttcgac catccgaac 39
<210>174
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>174
cgaacctgtt catttcgagc tttgcgacga tgccgaccg 39
<210>175
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>175
cctgttcatt tcgagcagct ttacgatgcc gaccgtcgg 39
<210>176
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>176
tcatttcgag cagcgcgttt atgccgaccg tcggtac 37
<210>177
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>177
gagcagcgcg acgtttccga ccgtcggta 29
<210>178
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>178
gagcagcgcg acgatgttta ccgtcggtac cgtaaac 37
<210>179
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>179
cagcgcgacg atgccgtttg tcggtaccgt aaacgtg 37
<210>180
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>180
gcgacgatgc cgacctttgg taccgtaaac gtgac 35
<210>181
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>181
cgatgccgac cgtctttacc gtaaacgtga cgc 33
<210>182
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>182
gatgccgacc gtcggttttg taaacgtgac gctgacg 37
<210>183
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>183
cgaccgtcgg tacctttaac gtgacgctga cga 33
<210>184
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>184
cgaccgtcgg taccgtattt gtgacgctga cgatcgc 37
<210>185
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>185
cgtcggtacc gtaaacttta cgctgacgat cgccg 35
<210>186
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>186
gtcggtaccg taaacgtgtt tctgacgatc gccgcgc 37
<210>187
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>187
gtaccgtaaa cgtgacgttt acgatcgccg cgctc 35
<210>188
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>188
ccgtaaacgt gacgctgttt atcgccgcgc tcgcg 35
<210>189
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>189
acgtgacgct gacgtttgcc gcgctcgcg 29
<210>190
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>190
cgtgacgctg acgatctttg cgctcgcgct gcg 33
<210>191
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>191
acgctgacga tcgcctttct cgcgctgcgg atg 33
<210>192
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>192
gacgatcgcc gcgtttgcgc tgcggatgt 29
<210>193
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>193
cgatcgccgc gctctttctg cggatgtcgg aca 33
<210>194
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>194
gccgcgctcg cgtttcggat gtcggacac 29
<210>195
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>195
ccgcgctcgc gctgtttatg tcggacacgc tga 33
<210>196
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>196
gctcgcgctg cggttttcgg acacgctgaa g 31
<210>197
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>197
tcgcgctgcg gatgtttgac acgctgaaga agg 33
<210>198
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>198
cgcgctgcgg atgtcgttta cgctgaagaa ggaagtc 37
<210>199
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>199
cgcgctgcgg atgtcgatgt ttctgaagaa ggaagtc 37
<210>200
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>200
cgcgctgcgg atgtcgatga cgtttaagaa ggaagtc 37
<210>201
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>201
cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgtttaa ggaagtc 37
<210>202
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>202
cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagtt tgaagtc 37
<210>203
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>203
cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagaa gtttgtc 37
<210>204
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>204
cgcgctgcgg atgtcgatga cgctgaagaa ggaattt 37
<210>205
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>205
gaagaagatc cacctgggca acctgtcgcg catcg 35
<210>206
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>206
aagatccacc tggcgaacct gtcgcgc 27
<210>207
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>207
gaagaagatc cacctggtga acctgtcgcg catcg 35
<210>208
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>208
gaagaagatc cacctgctga acctgtcgcg cat 33
<210>209
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>209
gcgaagaaga tccacctgat taacctgtcg cgcatcgac 39
<210>210
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>210
gaagaagatc cacctgatga acctgtcgcg catcg 35
<210>211
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>211
aagatccacc tgccgaacct gtcgcgc 27
<210>212
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>212
gcgaagaaga tccacctgtt taacctgtcg cgcatcg 37
<210>213
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>213
agaagatcca cctgtggaac ctgtcgcgc 29
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gagcccgtga tgtggtggtt cggcgcgaat t 31
Claims (28)
1.具有如下氨基酸序列并具有葡糖脱氢酶活性的突变葡糖脱氢酶，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包括除了第365位氨基酸残基之外的1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，其中对应于所述氨基酸序列的第365位上的氨基酸残基被替换成另一个氨基酸残基，且所述突变葡糖脱氢酶对葡萄糖的底物特异性提高。
2.根据权利要求1所述突变葡糖脱氢酶，其除对应于第365位的位置之外，具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述突变葡糖脱氢酶，较之于在对应于第365位的位置上的氨基酸残基是野生型的葡糖脱氢酶，其对二糖的反应性降低。
4.根据权利要求3所述突变葡糖脱氢酶，其中，所述二糖是麦芽糖。
5.根据权利要求4所述突变葡糖脱氢酶，其对麦芽糖的反应性是对葡萄糖的反应性的20％或以下。
6.根据权利要求1～5任一项所述突变葡糖脱氢酶，其中所述其他氨基酸残基是选自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸残基的氨基酸残基。
7.根据权利要求1～6任一项所述突变葡糖脱氢酶，其中在对应于选自SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的第324、326、333、334、368、369、376、377、418、419、436、433、448、472、475、525和529位之中的至少一个位置上的一个或多个氨基酸残基，被替换成另一个或其他氨基酸残基。
8.根据权利要求7所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置由选自第326、472、475和529位之中的至少一个位置组成。
9.根据权利要求8所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第472位。
10.根据权利要求8所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第475位。
11.根据权利要求8所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置由第472和475位组成。
12.根据权利要求8所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第326位。
13.根据权利要求8所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第529位。
14.根据权利要求9所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第472位上的氨基酸残基被替换成选自天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺和组氨酸残基的氨基酸残基。
15.根据权利要求10所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第475位上的氨基酸残基被替换成组氨酸或丝氨酸残基。
16.根据权利要求12所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第326位丝氨酸的氨基酸残基被替换成谷氨酰胺或缬氨酸残基。
17.根据权利要求13所述突变葡糖脱氢酶，其中对应于第529位亮氨酸的氨基酸残基被替换成酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基。
18.具有如下氨基酸序列并具有葡糖脱氢酶活性的突变葡糖脱氢酶，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包括1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：3所示氨基酸序列，其包含(i)将对应于选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第324、326、333、334、365、368、369、376、377、418、419、436、433、448、525和529位之中的至少一个位置的一个或多个位置上的一个或多个残基用一个或多个其他氨基酸残基取代，(ii)将对应于第472位的位置上的氨基酸残基用天冬氨酸残基取代，和(iii)将对应于第475位的位置上的氨基酸残基用组氨酸残基取代，且对葡萄糖的底物特异性提高。
19.根据权利要求18所述突变葡糖脱氢酶，其中所述一个或多个其他氨基酸残基选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基。
20.根据权利要求18所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第326位，且对应于该位置上的氨基酸残基被替换成谷氨酰胺或缬氨酸残基。
21.根据权利要求18所述突变葡糖脱氢酶，其中所述位置是第529位，且对应于该位置上的氨基酸残基被替换成酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基。
22.包含SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的FAD结合型突变葡糖脱氢酶。
23.至少包含权利要求1～22任一项所述突变葡糖脱氢酶和电子传递亚基的突变葡糖脱氢酶复合体。
24.根据权利要求23所述葡糖脱氢酶复合体，其中，所述电子传递亚基是细胞色素C。
25.编码权利要求1～22任一项所述突变葡糖脱氢酶的DNA。
26.携带权利要求25所述DNA，并产生权利要求1～22任一项所述突变葡糖脱氢酶或权利要求23所述突变葡糖脱氢酶复合体的微生物。
27.包含权利要求1～22所述突变葡糖脱氢酶、权利要求23所述突变葡糖脱氢酶复合体或权利要求26所述微生物的葡萄糖测定试剂盒。
28.包含权利要求1～22所述突变葡糖脱氢酶、权利要求23所述突变葡糖脱氢酶复合体或权利要求26所述微生物的葡萄糖传感器。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453702A (zh) * | 2010-10-27 | 2012-05-16 | 爱科来株式会社 | 变异葡萄糖脱氢酶 |
| CN102559624A (zh) * | 2012-03-05 | 2012-07-11 | 浙江德清汇宁生物科技有限公司 | 一种吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法 |
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Families Citing this family (17)
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|---|---|---|---|---|
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| US10689626B2 (en) | 2014-12-04 | 2020-06-23 | SmartZyme Innovations Ltd. | Compositions and methods for measuring blood glucose levels |
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Family Cites Families (16)
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453702A (zh) * | 2010-10-27 | 2012-05-16 | 爱科来株式会社 | 变异葡萄糖脱氢酶 |
| CN102453702B (zh) * | 2010-10-27 | 2016-02-17 | 爱科来株式会社 | 变异葡萄糖脱氢酶 |
| CN102559624A (zh) * | 2012-03-05 | 2012-07-11 | 浙江德清汇宁生物科技有限公司 | 一种吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法 |
| CN106349392A (zh) * | 2015-07-14 | 2017-01-25 | 达尔生技股份有限公司 | 一种融合多肽 |
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