JP2001197888A - 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素 - Google Patents
基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グルコースに対する改良された選択性を有す
る改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供する。 【解決手段】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基か
ら第４６８残基に相当する領域において１またはそれ以
上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている
ことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。
る改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供する。 【解決手段】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基か
ら第４６８残基に相当する領域において１またはそれ以
上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている
ことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型ＰＱＱＧＤＨに関する。本発明の改変
型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコース
の定量に有用である。
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型ＰＱＱＧＤＨに関する。本発明の改変
型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコース
の定量に有用である。
【０００２】
【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。
【０００３】ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性
酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨ
は、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。例えば、ＡＭ． Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９９
０） １７２， ６３０８−６３１５を参照されたい。
一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株におい
てその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），
１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニング
されアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３
６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのホモダイマーであ
る。他のＰＱＱ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロ
ジーがほとんどない。
酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨ
は、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。例えば、ＡＭ． Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９９
０） １７２， ６３０８−６３１５を参照されたい。
一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株におい
てその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），
１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニング
されアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３
６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのホモダイマーであ
る。他のＰＱＱ酵素とは蛋白質の一次構造上でのホモロ
ジーがほとんどない。
【０００４】最近、本酵素のX線結晶構造解析の結果が
報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が
明らかとなった。（J.Mol.Biol., 289, 319-333(1999),
Thecrystal structure of the apo form of the soulb
le quinoprotein glucose dehydrogenase from Acineto
bacter calcoaceticus revelas a novel internal cons
erved sequence repeat; A.Oubrie et al., The EMBO J
ournal, 18(19) 5187-5194 (1999), Structure and mec
hanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogena
se, A. Oubrie et al., PNAS, 96(21), 11787-11791 (1
999), Active-site structure of the soluble quinopr
otein glucose dehydrogenase complexed with methylh
ydrazine: A covalent cofactor-inhibitor complex,
A. Oubrie et al.）。これらの論文によれば、水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨは6つのＷ−モチーフから構成されるβプロ
ペラ蛋白質であることが明かとなった。
報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が
明らかとなった。（J.Mol.Biol., 289, 319-333(1999),
Thecrystal structure of the apo form of the soulb
le quinoprotein glucose dehydrogenase from Acineto
bacter calcoaceticus revelas a novel internal cons
erved sequence repeat; A.Oubrie et al., The EMBO J
ournal, 18(19) 5187-5194 (1999), Structure and mec
hanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogena
se, A. Oubrie et al., PNAS, 96(21), 11787-11791 (1
999), Active-site structure of the soluble quinopr
otein glucose dehydrogenase complexed with methylh
ydrazine: A covalent cofactor-inhibitor complex,
A. Oubrie et al.）。これらの論文によれば、水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨは6つのＷ−モチーフから構成されるβプロ
ペラ蛋白質であることが明かとなった。
【０００５】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマ
ーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しか
し、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にとも
ない発生する過酸化水素を定量するため、カタラーゼあ
るいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要が
あった。またＧＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進
められてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存
することから高濃度のグルコース試料には適さないこ
と、あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じ
る可能性があった。一方、Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に
基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補
酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないとい
う煩雑性があった。そこで、これまでのグルコース酵素
定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素とし
てＰＱＱＧＤＨの応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨ
はグルコースに対して高い酸化活性を有していること、
およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電
子受容体として酸素を必要としないことから、グルコー
スセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野へ
の応用が期待されている。しかしながらＰＱＱＧＤＨは
グルコースに対する選択性が低いことが問題であった。
ーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しか
し、ＧＯＤを用いる方法ではグルコース酸化反応にとも
ない発生する過酸化水素を定量するため、カタラーゼあ
るいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要が
あった。またＧＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進
められてきたが、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存
することから高濃度のグルコース試料には適さないこ
と、あるいは溶存酸素濃度によって測定値に誤差が生じ
る可能性があった。一方、Ｇ６ＰＤＨは分光学的手法に
基づくグルコース定量に用いられてきたが、反応系に補
酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないとい
う煩雑性があった。そこで、これまでのグルコース酵素
定量方法に用いられてきた酵素にかわる新たな酵素とし
てＰＱＱＧＤＨの応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨ
はグルコースに対して高い酸化活性を有していること、
およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電
子受容体として酸素を必要としないことから、グルコー
スセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野へ
の応用が期待されている。しかしながらＰＱＱＧＤＨは
グルコースに対する選択性が低いことが問題であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明はグ
ルコースに対する改良された選択性を有する改変型水溶
性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。本発明は
特に、血中グルコース濃度測定の感度を増加させるため
に、グルコースに対する反応性と比較してラクトースあ
るいはマルトースに対する反応性が低い改変型水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
ルコースに対する改良された選択性を有する改変型水溶
性ＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。本発明は
特に、血中グルコース濃度測定の感度を増加させるため
に、グルコースに対する反応性と比較してラクトースあ
るいはマルトースに対する反応性が低い改変型水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は従来の水溶性
ＰＱＱＧＤＨを改良してそのグルコースに対する選択性
を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶
性ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸変異を導
入することにより、グルコースに対する選択性がきわめ
て高い酵素を得ることに成功した。
ＰＱＱＧＤＨを改良してそのグルコースに対する選択性
を高め、臨床検査や食品分析などに応用できる改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶
性ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸変異を導
入することにより、グルコースに対する選択性がきわめ
て高い酵素を得ることに成功した。
【０００８】すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノ
ンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におい
て、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の１またはそれ
以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されてお
り、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較
してグルコースに対して選択性が向上していることを特
徴とする改変型グルコース脱水素酵素を提供する。好ま
しくは本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、グルコ
ースに対する反応性と比べて、ラクトースあるいはマル
トースに対する反応性が野生型より低下している。好ま
しくは、グルコースに対する反応性を１００％とした場
合、ラクトースあるいはマルトースに対する活性が６０
％以下であり、より好ましくは５０％以下であり、さら
に好ましくは４０％以下である。
ンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におい
て、天然の水溶性グルコース脱水素酵素の１またはそれ
以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されてお
り、かつ前記天然の水溶性グルコース脱水素酵素と比較
してグルコースに対して選択性が向上していることを特
徴とする改変型グルコース脱水素酵素を提供する。好ま
しくは本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、グルコ
ースに対する反応性と比べて、ラクトースあるいはマル
トースに対する反応性が野生型より低下している。好ま
しくは、グルコースに対する反応性を１００％とした場
合、ラクトースあるいはマルトースに対する活性が６０
％以下であり、より好ましくは５０％以下であり、さら
に好ましくは４０％以下である。
【０００９】本発明はまた、ピロロキノリンキノンを補
酵素とするグルコース脱水素酵素において、βプロペラ
蛋白質構造における６番目のＷ−モチーフにおけるＢス
トランドとＣストランドをつなぐループ領域（Ｗ６Ｂ
Ｃ）中の１またはそれ以上のアミノ酸残基が、天然に存
在するＰＱＱグルコース脱水素酵素中の対応するアミノ
酸残基と異なるアミノ酸残基で置換されていることを特
徴とする、改変型グルコース脱水素酵素を提供する。
酵素とするグルコース脱水素酵素において、βプロペラ
蛋白質構造における６番目のＷ−モチーフにおけるＢス
トランドとＣストランドをつなぐループ領域（Ｗ６Ｂ
Ｃ）中の１またはそれ以上のアミノ酸残基が、天然に存
在するＰＱＱグルコース脱水素酵素中の対応するアミノ
酸残基と異なるアミノ酸残基で置換されていることを特
徴とする、改変型グルコース脱水素酵素を提供する。
【００１０】本発明の１つの態様においては、本発明の
ＰＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter
calcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基
から第４６８残基に相当する領域において１またはそれ
以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、すなわち天然
に存在するＰＱＱグルコース脱水素酵素中の対応するア
ミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換されている。
なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メ
チオニンを１として番号付けする。
ＰＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter
calcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基
から第４６８残基に相当する領域において１またはそれ
以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、すなわち天然
に存在するＰＱＱグルコース脱水素酵素中の対応するア
ミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換されている。
なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メ
チオニンを１として番号付けする。
【００１１】好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ
は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４６２番目の
アスパラギン残基、４５２番目のアスパラギン残基、４
５５番目のリジン残基、４５６番目のアスパラギン酸残
基および４５７番目のアスパラギン酸残基に相当するア
ミノ酸残基の１またはそれ以上が他のアミノ酸残基で置
換されている。
は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４６２番目の
アスパラギン残基、４５２番目のアスパラギン残基、４
５５番目のリジン残基、４５６番目のアスパラギン酸残
基および４５７番目のアスパラギン酸残基に相当するア
ミノ酸残基の１またはそれ以上が他のアミノ酸残基で置
換されている。
【００１２】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列： Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Va
l Thr Xaa5 Thr Leu GluAsn Pro Gly (式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5は任意の天然ア
ミノ酸残基である、ただし、Xaa1がAsnであり、Xaa2がL
ysであり、Xaa3がAspであり、かつXaa4がAspであると
き、Xaa5はAsnではない)を含む。
ＰＱＱＧＤＨは、配列： Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Va
l Thr Xaa5 Thr Leu GluAsn Pro Gly (式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5は任意の天然ア
ミノ酸残基である、ただし、Xaa1がAsnであり、Xaa2がL
ysであり、Xaa3がAspであり、かつXaa4がAspであると
き、Xaa5はAsnではない)を含む。
【００１３】本発明はまた、上述の改変型グルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター
および該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ットおよびグルコースセンサーを提供する。
水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター
および該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ットおよびグルコースセンサーを提供する。
【００１４】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素蛋白質
はグルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコー
スに対して高い酸化活性を有していることから、グルコ
ースの高感度かつ高選択的な測定に応用できる。
はグルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコー
スに対して高い酸化活性を有していることから、グルコ
ースの高感度かつ高選択的な測定に応用できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】改変型ＰＱＱＧＤＨの構造 本発明者は、水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の
コーディング領域中にエラープローンＰＣＲ法によりラ
ンダムに変異を導入し、アミノ酸残基の変異が導入され
た水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを構築した。これ
を大腸菌に形質転換し、グルコースに対するＰＱＱＧＤ
Ｈの活性についてスクリーニングして、これを大腸菌に
形質転換し、ＰＱＱＧＤＨの活性についてスクリーニン
グして、２０ｍＭ濃度のグルコースに対する活性が野生
型ＰＱＱＧＤＨと同等であるが、２０ｍＭのラクトース
に対する活性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下したＰＱＱ
ＧＤＨを発現する多数のクローンを得た。
コーディング領域中にエラープローンＰＣＲ法によりラ
ンダムに変異を導入し、アミノ酸残基の変異が導入され
た水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを構築した。これ
を大腸菌に形質転換し、グルコースに対するＰＱＱＧＤ
Ｈの活性についてスクリーニングして、これを大腸菌に
形質転換し、ＰＱＱＧＤＨの活性についてスクリーニン
グして、２０ｍＭ濃度のグルコースに対する活性が野生
型ＰＱＱＧＤＨと同等であるが、２０ｍＭのラクトース
に対する活性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下したＰＱＱ
ＧＤＨを発現する多数のクローンを得た。
【００１６】これらのクローンの一つについて遺伝子配
列を解析したところ、第４５２番目のＡｓｎがＡｓｐに
置換されていることが判明した。さらにこの残基をトレ
オニン、リジン、イソロイシン、ヒスチジンあるいはア
スパラギン酸残基に置換したところ、いずれの残基に置
換しても野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨよりもグルコースに
対する選択性が向上した優れた変異酵素が得られた。次
に、これらの結果に基づいて、他のアミノ酸残基の変異
によるグルコース選択性の向上の可能性について検討し
た。
列を解析したところ、第４５２番目のＡｓｎがＡｓｐに
置換されていることが判明した。さらにこの残基をトレ
オニン、リジン、イソロイシン、ヒスチジンあるいはア
スパラギン酸残基に置換したところ、いずれの残基に置
換しても野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨよりもグルコースに
対する選択性が向上した優れた変異酵素が得られた。次
に、これらの結果に基づいて、他のアミノ酸残基の変異
によるグルコース選択性の向上の可能性について検討し
た。
【００１７】水溶性ＰＱＱＧＤＨのＸ線結晶構造解析に
基づく高次構造の報告（J.Mol.Biol., 289, 319-333(19
99), The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999), PN
AS,96(21), 11787-11791 (1999)）によれば、水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨは６つのＷ−モチーフから構成されるβプロ
ペラ蛋白質であり、第４５２番目のアミノ酸残基は、第
６番目のＷ−モチーフのＢ−ストランドとＣ−ストラン
ドを結ぶループ領域に存在する。すなわち、水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨのＷ６ＢＣと予測されるループ領域が基質特異
性を支配していることが示唆される。そこで、このルー
プ領域中の他のアミノ酸残基に対しても同様に変異を導
入した。すなわち、第４５５番目のリジン残基をイソロ
イシン残基に、第４５６番目のアスパラギン酸残基をア
スパラギン残基に、第４５７番目のアスパラギン酸残基
をアスパラギン残基に、第４６２番目のアスパラギン残
基をヒスチジン残基に置換した変異酵素をそれぞれ構築
した。その結果、表３に示すように、いずれの変異酵素
においてもグルコースに対する選択性が向上したことが
わかった。
基づく高次構造の報告（J.Mol.Biol., 289, 319-333(19
99), The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999), PN
AS,96(21), 11787-11791 (1999)）によれば、水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨは６つのＷ−モチーフから構成されるβプロ
ペラ蛋白質であり、第４５２番目のアミノ酸残基は、第
６番目のＷ−モチーフのＢ−ストランドとＣ−ストラン
ドを結ぶループ領域に存在する。すなわち、水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨのＷ６ＢＣと予測されるループ領域が基質特異
性を支配していることが示唆される。そこで、このルー
プ領域中の他のアミノ酸残基に対しても同様に変異を導
入した。すなわち、第４５５番目のリジン残基をイソロ
イシン残基に、第４５６番目のアスパラギン酸残基をア
スパラギン残基に、第４５７番目のアスパラギン酸残基
をアスパラギン残基に、第４６２番目のアスパラギン残
基をヒスチジン残基に置換した変異酵素をそれぞれ構築
した。その結果、表３に示すように、いずれの変異酵素
においてもグルコースに対する選択性が向上したことが
わかった。
【００１８】このことはこれらの活性部位を構成する特
定のループ領域に変異を導入することによりグルコース
に対する選択性を向上させうることを意味する。上記で
示したAsn452残基, Lys455, Asp456, Asp457およびAsn4
62残基は単なる例であり、本発明を限定するものではな
い。すなわち本発明は水溶性グルコース脱水素酵素の第
６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランド
を結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造
遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコ
ースに対する選択性を改良しうることを当該技術分野に
おいて初めて明らかにしたものであり、ＰＱＱＧＤＨの
基質特異性を改良する方法論がここで提供される。
定のループ領域に変異を導入することによりグルコース
に対する選択性を向上させうることを意味する。上記で
示したAsn452残基, Lys455, Asp456, Asp457およびAsn4
62残基は単なる例であり、本発明を限定するものではな
い。すなわち本発明は水溶性グルコース脱水素酵素の第
６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランド
を結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造
遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコ
ースに対する選択性を改良しうることを当該技術分野に
おいて初めて明らかにしたものであり、ＰＱＱＧＤＨの
基質特異性を改良する方法論がここで提供される。
【００１９】本発明の好ましいＰＱＱグルコース脱水素
酵素においては、Acinetobacter calcoaceticus 由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基から第４６８残基に相
当する領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発
明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列の４６２番目のアスパラギン残基、４５２番目
のアスパラギン残基、４５５番目のリジン残基、４５６
番目のアスパラギン酸残基および４５７番目のアスパラ
ギン酸残基に相当するアミノ酸残基の１またはそれ以上
が他のアミノ酸残基で置換されている。
酵素においては、Acinetobacter calcoaceticus 由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基から第４６８残基に相
当する領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発
明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列の４６２番目のアスパラギン残基、４５２番目
のアスパラギン残基、４５５番目のリジン残基、４５６
番目のアスパラギン酸残基および４５７番目のアスパラ
ギン酸残基に相当するアミノ酸残基の１またはそれ以上
が他のアミノ酸残基で置換されている。
【００２０】また別の観点においては、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨは、配列： Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Va
l Thr Xaa5 Thr Leu GluAsn Pro Gly (式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5は任意の天然ア
ミノ酸残基である、ただし、Xaa1がAsnであり、Xaa2がL
ysであり、Xaa3がAspであり、かつXaa4がAspであると
き、Xaa5はAsnではない)を含む。
ＰＱＱＧＤＨは、配列： Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Va
l Thr Xaa5 Thr Leu GluAsn Pro Gly (式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5は任意の天然ア
ミノ酸残基である、ただし、Xaa1がAsnであり、Xaa2がL
ysであり、Xaa3がAspであり、かつXaa4がAspであると
き、Xaa5はAsnではない)を含む。
【００２１】本発明の改変型グルコース脱水素酵素にお
いては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限
り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換さ
れていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されてい
てもよい。
いては、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限
り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換さ
れていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されてい
てもよい。
【００２２】さらに、当業者は、他の細菌に由来する水
溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがっ
てＷ６ＢＣループ領域内でアミノ酸残基を置換すること
により、グルコースに対する選択性が向上した改変型グ
ルコース脱水素酵素を得ることができる。特に、蛋白質
の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素
の一次構造をもとに予測された二次構造を比較すること
により、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃ
ｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨのＷ６ＢＣルー
プ領域に相当する領域を容易に認識することができ、本
発明にしたがって、かかるループ領域中において１また
はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換す
ることにより、基質に対する選択性が改良された改変型
グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改
変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は配列番号２で規定される。
溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがっ
てＷ６ＢＣループ領域内でアミノ酸残基を置換すること
により、グルコースに対する選択性が向上した改変型グ
ルコース脱水素酵素を得ることができる。特に、蛋白質
の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該酵素
の一次構造をもとに予測された二次構造を比較すること
により、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃ
ｅｔｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨのＷ６ＢＣルー
プ領域に相当する領域を容易に認識することができ、本
発明にしたがって、かかるループ領域中において１また
はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換す
ることにより、基質に対する選択性が改良された改変型
グルコース脱水素酵素を得ることができる。これらの改
変型グルコース脱水素酵素も本発明の範囲内である。改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は配列番号２で規定される。
【００２３】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子において、上述のループ領域中に存在するアミノ酸残
基をコードする塩基配列を、変異すべきアミノ酸残基を
コードする塩基配列に置換することにより構築すること
ができる。このような部位特異的塩基配列置換のための
種々の方法が当該技術分野において知られており、例え
ば、Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory M
anual”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New Yorkに記載されている。
遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子において、上述のループ領域中に存在するアミノ酸残
基をコードする塩基配列を、変異すべきアミノ酸残基を
コードする塩基配列に置換することにより構築すること
ができる。このような部位特異的塩基配列置換のための
種々の方法が当該技術分野において知られており、例え
ば、Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory M
anual”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New Yorkに記載されている。
【００２４】このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発
現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを
適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋
白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該
技術分野において知られており、宿主としては例えば、
細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることが
できる。
現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを
適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋
白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該
技術分野において知られており、宿主としては例えば、
細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることが
できる。
【００２５】ランダム変異を導入する場合には、標的と
するループ領域においてエラープローンＰＣＲ法により
ランダムに変異を導入し、ループ領域に変異が導入され
た変異水溶性ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを構築す
る。
するループ領域においてエラープローンＰＣＲ法により
ランダムに変異を導入し、ループ領域に変異が導入され
た変異水溶性ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリーを構築す
る。
【００２６】これを大腸菌に形質転換し、ＰＱＱＧＤＨ
のグルコースに対する選択性について各クローンをスク
リーニングする。水溶性ＰＱＱＧＤＨは大腸菌において
発現させたときにペリプラズム空間に分泌されるため、
菌体そのものを用いて容易に酵素活性の検定を行うこと
ができる。このライブラリーを色素としてＰＭＳ−ＤＣ
ＩＰを加え、ＰＱＱＧＤＨの活性を目視により判定し
て、２０ｍＭ濃度のグルコースに対する活性が野生型Ｐ
ＱＱＧＤＨと同等であるが、２０ｍＭのラクトースに対
する活性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下したＰＱＱＧＤ
Ｈを発現するクローンを選択し、遺伝子配列を解析して
その変異を確認する。
のグルコースに対する選択性について各クローンをスク
リーニングする。水溶性ＰＱＱＧＤＨは大腸菌において
発現させたときにペリプラズム空間に分泌されるため、
菌体そのものを用いて容易に酵素活性の検定を行うこと
ができる。このライブラリーを色素としてＰＭＳ−ＤＣ
ＩＰを加え、ＰＱＱＧＤＨの活性を目視により判定し
て、２０ｍＭ濃度のグルコースに対する活性が野生型Ｐ
ＱＱＧＤＨと同等であるが、２０ｍＭのラクトースに対
する活性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下したＰＱＱＧＤ
Ｈを発現するクローンを選択し、遺伝子配列を解析して
その変異を確認する。
【００２７】上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させるこ
ともできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、Ｈ
ＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨを調製する。酵素活性の測定方法 本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。
ＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させるこ
ともできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、Ｈ
ＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型
ＰＱＱＧＤＨを調製する。酵素活性の測定方法 本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。
【００２８】酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグ
ルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸
化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈
色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ンなどを用いることができる。選択性の評価方法 本発明のＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、
基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノー
ス、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラ
クトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等
の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グ
ルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調
べることにより評価することができる。グルコースアッセイキット 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧ
ＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。グルコースセンサー 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドをブロッキングする。
ルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸
化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈
色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ンなどを用いることができる。選択性の評価方法 本発明のＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、
基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノー
ス、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラ
クトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等
の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グ
ルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調
べることにより評価することができる。グルコースアッセイキット 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧ
ＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。グルコースセンサー 本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドをブロッキングする。
【００２９】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱ
およびＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電
極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱ
およびＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電
極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。
【００３０】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリの構築およびスクリ
ーニング プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファ
ルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Acinetob
acter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構
造遺伝子を挿入したものである（図１）。このプラスミ
ドをテンプレートとして、エラープローンＰＣＲ法によ
り種々の領域中にランダムに変異を導入した。ＰＣＲ反
応は、表１に示す組成の溶液中で、９４℃３分間、次
に、９４℃３分間、５０℃２分間、および７２℃２分間
を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間の条件で行っ
た。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 変異ＰＱＱＧＤＨ遺伝子ライブラリの構築およびスクリ
ーニング プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ファ
ルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Acinetob
acter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構
造遺伝子を挿入したものである（図１）。このプラスミ
ドをテンプレートとして、エラープローンＰＣＲ法によ
り種々の領域中にランダムに変異を導入した。ＰＣＲ反
応は、表１に示す組成の溶液中で、９４℃３分間、次
に、９４℃３分間、５０℃２分間、および７２℃２分間
を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間の条件で行っ
た。
【００３１】
【表１】 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ テンプレートＤＮＡ １．０μｌ フォワードプライマーＡＢＦ ４．０μｌ リバースプライマーＡＢＲ ４．０μｌ １０× Ｔａｑポリメラーゼバッファー １０．０μｌ １Ｍ β−メルカプトエタノール １．０μｌ ＤＭＳＯ １０．０μｌ ５ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０．０μｌ １０ｍＭ ｄＧＴＰ ２．０μｌ ２ｍＭ ｄＡＴＰ ２．０μｌ １０ｍＭ ｄＣＴＰ ２．０μｌ １０ｍＭ ｄＴＴＰ ２．０μｌＨ2Ｏ ５１．５μｌ １００．０μｌ 得られた変異水溶性ＰＱＱＧＤＨのライブラリーを大腸
菌に形質転換し、形成された各コロニーをマイクロタイ
タープレートに移した。コロニーを別のプレートにレプ
リカし、片方のプレートにはグルコース濃度２０ｍＭお
よびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、他方のプレートには２０
ｍＭラクトースおよびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、双方の
ＰＱＱＧＤＨの活性を目視で判定した。２枚のプレート
でグルコースの示す活性よりもラクトースに対する活性
が大幅に低下したクローンが多数得られた。
菌に形質転換し、形成された各コロニーをマイクロタイ
タープレートに移した。コロニーを別のプレートにレプ
リカし、片方のプレートにはグルコース濃度２０ｍＭお
よびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、他方のプレートには２０
ｍＭラクトースおよびＰＭＳ−ＤＣＩＰを加え、双方の
ＰＱＱＧＤＨの活性を目視で判定した。２枚のプレート
でグルコースの示す活性よりもラクトースに対する活性
が大幅に低下したクローンが多数得られた。
【００３２】このうち１つのクローンを任意に選び、遺
伝子配列を解析したところ、４５２番目のアスパラギン
がアスパラギン酸に変異していたことがわかった。 実施例２ 改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築 配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、配列： 5'-C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT-3' のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを合成し、
４５２番目のアスパラギンをヒスチジンに置換した。部
位特異的変異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示
す方法により行った。
伝子配列を解析したところ、４５２番目のアスパラギン
がアスパラギン酸に変異していたことがわかった。 実施例２ 改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築 配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、配列： 5'-C ATC TTT TTG GAC ATG TCC GGC AGT AT-3' のオリゴヌクレオチドターゲットプライマーを合成し、
４５２番目のアスパラギンをヒスチジンに置換した。部
位特異的変異はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示
す方法により行った。
【００３３】ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造
（株））にAcinetobacter calcoaceticus 由来ＰＱＱＧ
ＤＨをコードする遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断
片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプ
レート５０ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録
商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキットに付属のセレクシ
ョンプライマー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプ
ライマー５０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量
の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、
１００℃、３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１
本鎖にした。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋの
カナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を
復帰させるためのものである。これを５分間氷上に置
き、プライマーをアニーリングさせた。これに３μｌの
同キットエクステンションバッファー、１μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼお
よび５μｌの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。
（株））にAcinetobacter calcoaceticus 由来ＰＱＱＧ
ＤＨをコードする遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断
片を組み込み、これをテンプレートとした。このテンプ
レート５０ｆｍｏｌと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録
商標）−Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキットに付属のセレクシ
ョンプライマー５ｐｍｏｌ、リン酸化したターゲットプ
ライマー５０ｐｍｏｌを全体（２０μｌ）の１／１０量
の同キットのアニーリングバッファーとともに混合し、
１００℃、３分間の熱処理でプラスミドを変性させ、１
本鎖にした。セレクションプライマーはｐＫＦ１８ｋの
カナマイシン耐性遺伝子上にある二重のアンバー変異を
復帰させるためのものである。これを５分間氷上に置
き、プライマーをアニーリングさせた。これに３μｌの
同キットエクステンションバッファー、１μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼお
よび５μｌの滅菌水を加えて相補鎖を合成した。
【００３４】これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株で
あるE.coli ＢＭＨ７１−１８mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。次に、こ
こから抽出したプラスミドをE.coli ＭＶ１１８４に形
質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そ
してこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、
目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラス
ミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子のKpn I-Hind III断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈの遺伝子を構築した。
あるE.coli ＢＭＨ７１−１８mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。次に、こ
こから抽出したプラスミドをE.coli ＭＶ１１８４に形
質転換し、そのコロニーからプラスミドを抽出した。そ
してこれらのプラスミドについてシークエンスを行い、
目的とした変異の導入を確認した。この断片を、プラス
ミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子のKpn I-Hind III断片と入れ替え、改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈの遺伝子を構築した。
【００３５】同様にして、ループ６ＢＣに相当する領域
において、Asp448Asn、Asn452Thr、Asn452Lys、Asn452I
le、Val453Asp、Val453Phe、Asp456Asn、Asp457Asn、As
n462His、Asn462Asp、Asn462Tyr、Asn462Lys、Asn462Ph
eの各変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨの遺伝子を構築
した。 実施例３ 改変型酵素の調製 野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドをE.coli ＤＨ５α株に形
質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ
含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養
し、１ｍＭＣａＣｌ2、５００μＭＰＱＱを含む７１の
Ｌ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピル
チオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加
し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離
（5000×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体
を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌
体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（10000×ｇ、
１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠
心分離（160500×ｇ（40000r.p.m.)、９０分、４℃）
し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以
下の実施例において用いた。
において、Asp448Asn、Asn452Thr、Asn452Lys、Asn452I
le、Val453Asp、Val453Phe、Asp456Asn、Asp457Asn、As
n462His、Asn462Asp、Asn462Tyr、Asn462Lys、Asn462Ph
eの各変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨの遺伝子を構築
した。 実施例３ 改変型酵素の調製 野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドをE.coli ＤＨ５α株に形
質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ
含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩振とう培養
し、１ｍＭＣａＣｌ2、５００μＭＰＱＱを含む７１の
Ｌ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピル
チオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加
し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離
（5000×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、この菌体
を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。集菌した菌
体をフレンチプレスで破砕し、遠心分離（10000×ｇ、
１５分、４℃）で未破砕の菌体を除去した。上清を超遠
心分離（160500×ｇ（40000r.p.m.)、９０分、４℃）
し、水溶性画分を得た。これを粗精製酵素標品として以
下の実施例において用いた。
【００３６】さらに、こうして得た水溶性画分を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で一晩透析した。透析したサ
ンプルを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇ
ｅｌ ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株
式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２
Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を
用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行っ
た。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。
このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ
蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例
において用いた。 実施例４ 酵素活性の測定 酵素活性の測定は、室温において、１０ｍＭ ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フ
ェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジク
ロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの
６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、
その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このと
き、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活
性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０に
おけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ-1とした。 実施例５ 基質特異性の評価 各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調
べた。実施例３で得られた野生型および各改変型ＰＱＱ
ＧＤＨの粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2存在下で１時間以上ホロ化した。これを
１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭ Ｄ
ＣＩＰ，６００ｍＭ ＰＭＳ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０を含む）および基質を加えた。基質として、そ
れぞれ終濃度２０ｍＭとなるように４００ｍＭのグルコ
ース、ラクトースおよびマルトースを１０μｌ加え、室
温で３０分間インキュベートして、実施例４と同様に酵
素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの
活性を１００とし、これれに対する相対活性で表した。
表２に示されるように、本発明の改変型酵素はいずれも
野生型酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を
示した。
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０で一晩透析した。透析したサ
ンプルを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇ
ｅｌ ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株
式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２
Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を
用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行っ
た。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。
このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ
蛋白質を得た。これを精製酵素標品として以下の実施例
において用いた。 実施例４ 酵素活性の測定 酵素活性の測定は、室温において、１０ｍＭ ＭＯＰＳ
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フ
ェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジク
ロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの
６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、
その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このと
き、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活
性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０に
おけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ-1とした。 実施例５ 基質特異性の評価 各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調
べた。実施例３で得られた野生型および各改変型ＰＱＱ
ＧＤＨの粗精製酵素標品をそれぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2存在下で１時間以上ホロ化した。これを
１８７μｌずつ分注し、３μｌの活性試薬（６ｍＭ Ｄ
ＣＩＰ，６００ｍＭ ＰＭＳ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０を含む）および基質を加えた。基質として、そ
れぞれ終濃度２０ｍＭとなるように４００ｍＭのグルコ
ース、ラクトースおよびマルトースを１０μｌ加え、室
温で３０分間インキュベートして、実施例４と同様に酵
素活性を測定した。値はグルコースを基質としたときの
活性を１００とし、これれに対する相対活性で表した。
表２に示されるように、本発明の改変型酵素はいずれも
野生型酵素と比較してグルコースに対する高い選択性を
示した。
【００３７】
【表２】 グルコース ラクトース マルトース 野生型 100% 61% 61% Asn452Asp 100% 56% 50% Asn452His 100% 39% 39% Asn452Lys 100% 55% 42% Asn452Thr 100% 42% 30% Asn452Ile 100% 36% 28% Lys455Ile 100% 49% 37% Asp456Asn 100% 59% 41% Asp457Asn 100% 43% 32% Asn462His 100% 31% 25% 実施例７ グルコースのアッセイ 改変型ＰＱＱＧＤＨを用いてグルコースをアッセイし
た。Ｎ４５２Ｄ改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ2存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグ
ルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2存
在下で酵素活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵
素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度
の変化を指標とした。図３に示されるように、Ｎ４５２
Ｄ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、０．１−２０ｍＭの範
囲でグルコースの定量を行うことができた。 実施例８ 酵素センサーの作製および評価 ５ユニットのＮ４５２Ｄ改変型酵素にカーボンペースト
２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した
後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカー
ボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨し
た。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間
処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ
緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグル
タルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以
上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
た。Ｎ４５２Ｄ改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ2存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグ
ルコースおよび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2存
在下で酵素活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵
素活性の測定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度
の変化を指標とした。図３に示されるように、Ｎ４５２
Ｄ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて、０．１−２０ｍＭの範
囲でグルコースの定量を行うことができた。 実施例８ 酵素センサーの作製および評価 ５ユニットのＮ４５２Ｄ改変型酵素にカーボンペースト
２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した
後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカー
ボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨し
た。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間
処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ
緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグル
タルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以
上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
【００３８】作製した酵素センサーを用いてグルコース
濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固
定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの
範囲でグルコースの定量を行うことができる。
濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固
定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの
範囲でグルコースの定量を行うことができる。
【００３９】
【発明の効果】改変型ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対す
る選択性が高いことから、本酵素を用いてアッセイキッ
トあるいは酵素センサーを作成すると、従来の天然型の
ＰＱＱＧＤＨを用いた場合に比べ、より高い選択性を得
ることができる。
る選択性が高いことから、本酵素を用いてアッセイキッ
トあるいは酵素センサーを作成すると、従来の天然型の
ＰＱＱＧＤＨを用いた場合に比べ、より高い選択性を得
ることができる。
【００４０】
【配列表】 Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> 990387 <160> 4 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <220> <222> 4 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 7 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 8 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 9 <223> Xaa is any amino acid residue <222> 14 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 3 Thr Ala Gly Xaa Val Gln Xaa Xaa Xaa Gly Ser Val Thr Xaa Thr Leu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 4 catctttttg gacatgtccg gcagtat 17
【図１】 図１は、本発明において用いたプラスミドｐ
ＧＢ２の構造を示す。
ＧＢ２の構造を示す。
【図２】 図２は、本発明の改変型酵素をコードする突
然変異遺伝子を作成する方法を示す。
然変異遺伝子を作成する方法を示す。
【図３】 図３は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースのアッセイを示す。
るグルコースのアッセイを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/32 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｑ 1/32 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｄ Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｊ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 HA11 4B029 AA08 BB02 CC03 FA12 4B050 CC03 DD02 FF05E FF11E LL02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ68 QR04 QR50 QR82 QX05 4B065 AA04Y AA26X AA62X AA80X AA90X AA91X AB01 AC14 BA02 CA28 CA46
Claims (15)
- 【請求項１】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの４６２番目のア
スパラギン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸
残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項２】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの４５２番目のア
スパラギン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸
残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項３】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの４５５番目のリ
ジン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で
置換されている改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項４】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの４５６番目のア
スパラギン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ
酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項５】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの４５７番目のア
スパラギン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ
酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項６】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするＰ
ＱＱグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter ca
lcoaceticus 由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第４４９残基か
ら第４６８残基に相当する領域において１またはそれ以
上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている
ことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項７】 配列 Thr Ala Gly Xaa1 Val Gln Xaa2 Xaa3 Xaa4 Gly Ser Va
l Thr Xaa5 Thr Leu GluAsn Pro Gly (式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5は任意の天然ア
ミノ酸残基である、ただし、Xaa1がAsnであり、Xaa2がL
ysであり、Xaa3がAspであり、かつXaa4がAspであると
き、Xaa5はAsnではない)を含む、ＰＱＱグルコース脱水
素酵素。 - 【請求項８】 ピロロキノリンキノンを補酵素とするグ
ルコース脱水素酵素において、βプロペラ蛋白質構造に
おける６番目のＷ−モチーフにおけるBストランドとＣ
ストランドをつなぐループ領域(Ｗ６ＢＣ)中の１または
それ以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換さ
れていることを特徴とする、改変型グルコース脱水素酵
素。 - 【請求項９】 野生型のＰＱＱＧＤＨと比較してグルコ
ースに対する高い選択性を有する、請求項１−８のいず
れかに記載の改変型グルコース脱水素酵素。 - 【請求項１０】 請求項１−８のいずれかに記載の改変
型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の遺伝子を含むベク
ター。 - 【請求項１２】 請求項１０に記載の遺伝子を含む形質
転換体。 - 【請求項１３】 請求項１０に記載の遺伝子が主染色体
に組み込まれている、請求項１２記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１−８のいずれかに記載の改変
型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキッ
ト。 - 【請求項１５】 請求項１−８のいずれかに記載の改変
型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。
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| CNB008083525A CN100410379C (zh) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | 葡萄糖脱氢酶 |
| IL14613700A IL146137A0 (en) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glucose dehydrogenase |
| US09/959,549 US7049114B1 (en) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glucose dehydrogenase |
| DE60029775T DE60029775T2 (de) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glukose-dehydrogenase |
| PCT/JP2000/002872 WO2000066744A1 (fr) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glucose-deshydrogenase |
| EP00922931A EP1176202B1 (en) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glucose dehydrogenase |
| CA002372741A CA2372741A1 (en) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | Glucose dehydrogenase |
| KR1020017013906A KR20020010624A (ko) | 1999-04-30 | 2000-05-01 | 글루코스 탈수소효소 |
| US11/184,834 US20060019328A1 (en) | 1999-04-30 | 2005-07-20 | Glucose dehydrogenase |
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| JP2000009137A JP2001197888A (ja) | 2000-01-18 | 2000-01-18 | 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素 |
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| WO2005026340A1 (ja) | 2003-09-08 | 2005-03-24 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質特異性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 |
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| WO2009069381A1 (ja) | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Amano Enzyme Inc. | フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法 |
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