WO2007139013A1 - フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 Download PDF

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WO2007139013A1
WO2007139013A1 PCT/JP2007/060694 JP2007060694W WO2007139013A1 WO 2007139013 A1 WO2007139013 A1 WO 2007139013A1 JP 2007060694 W JP2007060694 W JP 2007060694W WO 2007139013 A1 WO2007139013 A1 WO 2007139013A1
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enzyme
flavin
gdh
fad
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PCT/JP2007/060694
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Noriaki Tanaka
Kensuke Yuuki
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Amano Enzyme Inc.
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    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae

Definitions

  • the present invention relates to a coenzyme-linked glucose dehydrogenase and use thereof. Specifically, the present invention relates to a glucose dehydrogenase using flavin adenyl dinucleotide as a coenzyme, a microorganism producing the enzyme, a method for producing the enzyme, a glucose measuring method using the enzyme, and the like.
  • a biosensor is obtained by forming an electrode and an enzyme reaction layer on an insulating substrate.
  • the enzyme used here include glucose dehydrogenase (GDH) and glucose oxidase (GO). It has been pointed out that the method using GO is affected by the dissolved oxygen in the measurement sample and that the dissolved oxygen immediately affects the measurement results.
  • GDH which uses pyroguchi quinoline (PQQ) as a coenzyme
  • PQQ pyroguchi quinoline
  • PQQ-GHH pyroguchi quinoline
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-350588
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-197888
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-346587
  • Patent Document 4 International Publication No. 2004Z058958 Pamphlet
  • Non-patent document 1 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Inducti on of its synthesis by p—benzoquinone and hydroquinone, TC Bak, and R. Sato, Bioch. Biophys. Acta, 139, 265—276 (1967 ).
  • Non-Patent Document 2 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II.Purification and physical and chemical properties, T.C.Bak, Biocnim.Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967).
  • Non-patent literature 3 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. Gene ral functional properties, TC Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967).
  • Non-patent literature 4 Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histi dyl residue as an active site, TC Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 3 28-335 (1967).
  • an object of the present invention is to provide a novel enzyme capable of more accurately measuring the amount of glucose, its producing bacterium, and its use.
  • FAD-GDH glucose dehydrogenase
  • the FAD-GDH has excellent selectivity for glucose and enables more accurate measurement of the amount of dalcose in a sample that is less susceptible to the effects of dissolved oxygen present in the reaction system. It was done. On the other hand, it was confirmed that another strain (Aspergillus oryzae) produces an enzyme equivalent to the FAD-GDH.
  • the present invention is based on the above findings or results, and provides the following flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase and the like.
  • Flavin adene dinucleotide-binding glucose dehydrogenase having the following properties:
  • Substrate specificity Low reactivity with maltose, D-fructose, D-mannose and D-galactose.
  • pH stability stable in the range of pH 3.0 to 7.0
  • Temperature stability Stable at 40 ° C or less.
  • Km value: D-glucose! / Km value is about 8 mM.
  • Aspergillus oryzae BB-56 which has the ability to produce flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase and the accession number is NITE BP-236.
  • a flavin adene dinucleotide-binding glucose dehydrogenase gene comprising any of the DNAs selected from the following groups (A) to (C):
  • (C) has a nucleotide sequence homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, and Furabin'ade carrot nucleotide-linked DNA 0 that encodes a protein having a glucose dehydrogenase activity
  • a method for producing a flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase comprising the following steps (1) and (2) or steps (i) and (ii):
  • a reagent for measuring glucose comprising the flavin adenyl dinucleotide-binding dalcose dehydrogenase according to any one of [1] to [8].
  • a glucose measurement kit comprising the glucose measurement reagent according to [15].
  • FIG. 1 SDS-PAGE of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • the lanes at both ends are molecular weight markers, and the upper forces are also phosphorylase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), trypsin inhibitor (20. lkDa), ⁇ -lacto Albumin (14.4 kDa).
  • FIG. 2 Measurement of molecular weight of purified FAD- GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56 by HPLC.
  • A Molecular weight marker. Glutamate dehydrogenase (290 kDa, 11. 508 min), lactate dehydrogenase (142 kDa, 13. 012 min), enolase (67 kDa, 14. 6 43 min), myokinase (32 kDa, 15. 321 min), cytochrome C (12.4 kDa, 20. 3 03min)
  • B Purified FAD—GDH.
  • FIG. 3 Comparison of molecular weight of FAD- GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • A Molecular weight marker. Glutamate dehydrogenase (GLDH, 290 kDa), lactate dehydrogenase (LDH, 142 kDa), myokinase (32 kDa) in order of elution.
  • B (C), (D), (), (F), (G), ( ⁇ ) are derived from A. oryzae ⁇ -56, ⁇ 2603, ⁇ 2628, ⁇ 26 83, ⁇ 2736, ⁇ 2706 and NBRC30113, respectively The culture filtrate was used as a sample.
  • FIG.4 Purified FAD— GDH derived from Aspergillus oryzae BB—56 at 400–800 nm Absorption spectrum.
  • FIG. 5 Optimal pH of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 6 Optimum temperature of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 7 pH stability of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 8 Temperature stability of purified FAD- GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 9 Measurement of isoelectric point of purified FAD- GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56 by glycerol density gradient isoelectric focusing.
  • FIG. 10 Line we aver- Burk plot for purified FAD — GDH glucose from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 11 Measurement of sugar content of purified FAD GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • FIG. 12 Measurement of the concentration of gnolecose by purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56.
  • DNA encoding a protein refers to DNA obtained by expressing the protein, that is, DNA having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein. Therefore, codon degeneracy is also considered.
  • isolated is used interchangeably with “purified”. “Isolated” when used in relation to the enzyme of the present invention (FAD-GDH) means that when the enzyme of the present invention is derived from a natural material, components other than the enzyme are substantially contained in the natural material. (In particular, substantially free of contaminating proteins). Specifically, for example, in the isolated enzyme of the present invention, the content of contaminating protein is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, even more preferably in terms of weight. Is less than about 1%.
  • the term “isolated” in the case where the enzyme of the present invention is prepared by a genetic engineering technique substantially includes other components derived from the used host cell, culture medium, and the like. It means no state. Specifically, for example, in the isolated enzyme of the present invention, the content of contaminating components is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, and still more preferably in terms of weight. Less than about 1%. It is different from that Unless it is clear to express the meaning, the term “flavin adenyl dinucleotide-binding glucose dehydrogenase” in the present specification simply means “isolated flavin adenyl dinucleotide-binding glucose dehydrogenase”. "Means. The same applies to the terms “FA D GDH” and “enzyme” used in place of flavinadenine dinucleotide-linked glucose dehydrogenase.
  • isolated when used in the context of naturally occurring DNA is typically separated from other nucleic acids that coexist in the natural state. It means that. However, some other nucleic acid components such as a nucleic acid sequence adjacent in the natural state (for example, a sequence of a promoter region or a sequence of terminator) may be included.
  • an “isolated” state in the case of genomic DNA is preferably substantially free of other DNA components that coexist in the natural state.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by genetic engineering techniques such as cDNA molecules is preferably substantially free of cell components and culture medium.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by chemical synthesis is preferably substantially free of precursors (raw materials) such as dNTPs, chemicals used in the synthesis process, and the like.
  • precursors raw materials
  • dNTPs chemical synthesis process
  • DNA DNA in an isolated state.
  • the first aspect of the present invention provides glucose dehydrogenase (FAD-GDH) having flavin adene dinucleotide as a coenzyme and its producing bacteria.
  • the FAD-GDH of the present invention (hereinafter also referred to as “the present enzyme”) is characterized by having the following properties. First, this enzyme catalyzes the following reaction, that is, a reaction in which glucose hydroxyl group is oxidized in the presence of an electron acceptor to produce dalcone ⁇ -latathone.
  • the molecular weight of the enzyme by SDS-polyacrylamide electrophoresis is about lOOkDa
  • the molecular weight of the enzyme by gel filtration is about 400kDa.
  • the FAD-GDH of the present invention consists of a tetramer.
  • this enzyme has excellent substrate specificity and acts selectively on D-glucose.
  • the FAD-GDH of the present invention has extremely low reactivity with maltose, and D-fructose, D-mannose, D-galactose, etc. have very low reactivity.
  • the reactivity to these substrates is less than 5% when the reactivity to D-glucose is 100%.
  • reactivity to maltose is 1% or less or substantially not observed.
  • 1% or less or substantially none of the reactivity to D-fructose and the reactivity to D-galactose are observed.
  • the present enzyme having excellent substrate specificity as described above is preferable as an enzyme for accurately measuring the amount of glucose in a sample. That is, according to the present enzyme, the target glucose level can be measured more accurately even when contaminants such as maltose and galatatose are present in the sample. Therefore, it can be said that this enzyme is suitable for applications in which the presence of such contaminants is expected or concerned (typically, measurement of the amount of dalcose in blood). It can be said that it can be applied to various purposes including high versatility.
  • the reactivity and substrate specificity of this enzyme were measured and evaluated by the methods shown in the examples below (columns (12), columns (7-1), columns (2-2-2)). can do.
  • the enzyme is preferably FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • FAD—GDH derived from Aspergillus oryzae refers to FAD—GDH produced by a microorganism (either wild or mutant) classified as Aspergillus oryzae, or Aspergillus oryzae ( It means FAD-GDH obtained by genetic engineering techniques using wild-type or mutant strain FAD-GDH genes.
  • a recombinant produced by a host microorganism into which a FAD-GDH gene obtained from Aspergillus oryzae (or a gene modified from the gene) has been introduced also falls under “FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae”.
  • Aspergillus oryzae from which the enzyme is derived is referred to as a producer of the enzyme for convenience of explanation.
  • bacteria producing this enzyme include Aspergillus oryzae BB-o6, Aspergillus oryzae IAM2603, Aspergillus oryzae IAM2628, Aspergillus oryzae IAM2683, Aspergillus oryzae IAM2736, Aspergillus oryzae IAM2706, and Aspergillus oryzae as described in the examples below.
  • the BB-56 strain is excellent in productivity of FAD-GDH and is a particularly preferable producing bacterium.
  • BB-56 shares are deposited with the designated depository as follows: It is readily available.
  • Aspergillus oryzae IAM2603, Aspergillus oryzae IAM2628, Aspergillus oryzae IAM2683, Aspergillus oryzae IAM2736, and Aspergillus oryzae IAM2706 are strains stored in the IAM Culture Collection (Center for Cell Function Information, University of Tokyo). It can be sold by going through the prescribed procedure.
  • Aspergillus oryzae NBRC3011 3 is a strain stored in NBRC (Biotechnology Division, Biotechnology Headquarters, Biotechnology Headquarters, National Institute of Product Evaluation and Technology), and can be sold through a predetermined procedure.
  • the present inventors succeeded in preparing FAD-GDH having the above properties (action, molecular weight, substrate specificity) from Aspergillus oryzae BB-56, as shown in Examples described later. As a result of detailed examination of the obtained FAD-GDH, it was revealed that the following properties were further provided.
  • Km value D-glucose! /, Km value is about 8mM
  • the optimum pH is a value measured in, for example, a Mcllvaine buffer as shown in the examples below, and the optimum temperature is also measured in a PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) in the same manner. It is the value.
  • it can be said to be “stable” in the pH condition when the activity is maintained at 80% or more when treated at 37 ° C for 30 minutes under a specific pH condition.
  • an appropriate buffer eg PIPES— If no substantial decrease in activity is observed after 20 minutes of treatment with NaOH buffer, pH 6.5) (that is, about 100% activity is maintained), the temperature conditions are met! It can be said that it is “stable”.
  • the Km value and isoelectric point can be measured and evaluated by the methods shown in the examples below (columns 8 and 6).
  • Aspergillus oryzae BB- 56 also produces other strains exemplified above, namely Aspergillus oryzae IAM2603, Aspergillus oryzae IAM2o28, Aspergillus oryzae IAM2683, Aspergillus oryzae IAM2736, Aspergillus oryzae IAM2706, and Aspergillus oryzae NBR C 30113. It was confirmed that FAD-GDH with the same properties as GDH was produced.
  • the amino acid sequence of FAD-GDH possessed by Aspergillus oryzae BB-56 was determined.
  • the enzyme can be further characterized by the feature that it also has a protein power having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. here
  • the modified protein when a part of the amino acid sequence of a protein is modified, the modified protein may have a function equivalent to that of the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the protein function, and the protein function may be maintained before and after the modification. Therefore, the present invention provides, as another embodiment, a protein having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 and having FAD-GDH activity (hereinafter also referred to as “homologous protein”).
  • the “homologous amino acid sequence” here is partly different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, but this difference has a substantial effect on the function of the protein (here, FAD—GDH activity). This refers to the amino acid sequence.
  • “Partial differences in amino acid sequence” typically means deletion of one to several amino acids constituting the amino acid sequence, substitution, addition, insertion of one to several amino acids, or a combination thereof.
  • the combination means that the amino acid sequence has been altered.
  • the difference in the amino acid sequence here is allowed as long as the FAD-GDH activity is maintained (there may be some variation in activity).
  • the positions where the amino acid sequences are different are not particularly limited, and differences may occur at a plurality of positions.
  • the term “plurality” as used herein refers to, for example, a number corresponding to less than about 30% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 20%, more preferably a number corresponding to less than about 10%.
  • the homologous protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 of, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more, and most preferably about 99% or more. Have identity.
  • homologous proteins are obtained by causing conservative amino acid substitutions at amino acid residues that are not essential for FAD-GDH activity.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties.
  • basic side chains for example, lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains for example, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine
  • non-polar side chains eg alanine, norine, leucine, isoleucine, proline, ferulalanin, methionine, tributophan
  • ⁇ -branched side chains eg threonine, parin, isoleucine
  • aromatic side It is classified into several families, such as chains (eg tyrosine, ferulanine, tryptophan, histidine).
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues in the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined by the following procedure, for example.
  • the two sequences are aligned for optimal comparison (for example, a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence).
  • a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • Gapped BLAST described in Altsc hul et al. (1997) Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402 can be used.
  • the enzyme having the amino acid sequence can be easily prepared by a genetic engineering technique. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (for example, E. coli) with DNA encoding this enzyme and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately purified according to the purpose. Thus, if this enzyme is obtained as a recombinant protein, various modifications are possible. For example, if a DNA encoding this enzyme and another appropriate DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, any peptide! / This enzyme can also be obtained that also has a reversible protein power.
  • a suitable host cell for example, E. coli
  • modification may be performed so that addition of sugar chain and Z or fat, or processing of N-terminal or C-terminal may occur.
  • modification as described above, extraction of recombinant protein, simplification of purification, addition of biological function, etc. are possible.
  • the second aspect of the present invention provides a gene encoding this enzyme, that is, a novel FAD-GDH gene.
  • the gene of the present invention consists of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • a specific example of this embodiment is DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • the present invention provides, as another embodiment, a DNA having a base sequence homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 and encoding a protein having FAD-GDH activity (hereinafter also referred to as “homologous DNA”). .
  • the “homologous nucleotide sequence” here is partially different from the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 19, but due to the difference, the function of the protein it encodes (here, FAD-GDH activity) is substantially reduced. A base sequence that is not affected.
  • a specific example of the homologous DNA is a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • it is DNA that hybridizes under stringent conditions.
  • stringent conditions are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Such stringent conditions are well known to those skilled in the art, and should be known in the art as Molecular loning (Third Edition, old bpnng Harbor Laboratory Press, New York) or Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al , 1987).
  • hybridization solution 50% formamide, 10 X SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium cirate, pH 7.0), 5 X Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 / zg / ml of modified salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) and incubated at about 42 ° C to about 50 ° C, then about 0.1 X SSC, 0.1% SDS The conditions for washing at 65 ° C to about 70 ° C can be mentioned.
  • More preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 X SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), IX Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 g / ml Of denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).
  • the base sequence ability includes substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or more bases based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, FAD— Examples include DNA encoding a protein having GDH activity. If the base is replaced, deletions may occur at multiple sites.
  • plural refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases depending on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the DNA. It is a base.
  • Homologous DNA such as those described above can be treated with restriction enzymes, exonuclease DNA ligase, etc., site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) And random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), etc., to introduce substitutions, deletions, insertions, additions, and Z or It can be obtained by modifying the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 so as to contain an inversion.
  • homologous DNA can be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • DNA in which a base difference as described above is recognized due to a polymorphism represented by SNP (-base polymorphism).
  • the gene of the present invention can be obtained by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. It can be prepared in a separated state. Specifically, it is possible to specifically hybridize to the gene of the present invention from an appropriate filamentous fungus, genomic DNA library or cDNA library of yeast, or an intracellular extract of filamentous fungi or yeast.
  • the oligonucleotide probe can be prepared by appropriately using a primer. Oligonucleotide probe 'primers can be easily synthesized using commercially available automated DNA synthesizers.
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 it is isolated by using the hybridization method using the whole or part of the base sequence or its complementary sequence as a probe. be able to. Further, it can be amplified and isolated using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence.
  • a nucleic acid amplification reaction for example, PCR
  • a further aspect of the present invention relates to a vector containing the gene of the present invention.
  • the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid molecule inserted thereinto into a target such as a cell, and the type and form thereof are not particularly limited.
  • the vector of the present invention can take the form of a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a viral vector (an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.).
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and taking into account the type of host cell.
  • specific examples of vectors include vectors having E. coli as a host (such as M13 phage or a variant thereof, ⁇ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.)), and yeast as a host.
  • Vector pYepSe Examples include cl, pMFa, pYES2, etc., vectors using insect cells as hosts (pAc, pVL, etc.), vectors using mammalian cells as hosts (pCDM8, pMT2PC, etc.).
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enzyme sequence that promotes the expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence of the expression vector (and the degree thereof) can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the gene of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (eg, Molecular loning, Third Edition, 1.84). , Cold bpnng Harbor Laboratory Press, New Yor, known methods using restriction enzymes and DNA ligase).
  • the present invention further relates to a transformant into which the gene of the present invention has been introduced.
  • the gene of the present invention exists as an exogenous molecule.
  • the transformant of the present invention is preferably prepared by transformation using the above-described vector of the present invention. Transformation and transformation are carried out by calcium phosphate coprecipitation method, electoral poration (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984), Lipofexion (Feigner, PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413-7417 (1984), microinjection (Graessmann, M.
  • Host cells include bacterial cells such as E. coli and yeast cells (eg, Saccharomyces cere visiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), filamentous mycelium (for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger), etc.
  • E. coli and yeast cells eg, Saccharomyces cere visiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris
  • filamentous mycelium for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
  • a further aspect of the present invention provides a method for producing FAD-GDH.
  • a flavin adenylate is obtained from the step of culturing a microorganism capable of producing the enzyme (FAD-GDH) (step (1)), the culture solution after culturing and Z or cells.
  • a step (step (2)) of recovering the nucleotide-bound glucose dehydrogenase is performed.
  • the above Aspergillus oryzae BB-56 or the like can be used.
  • the culture method and culture conditions are not particularly limited as long as the target enzyme is produced. That is, on the condition that the present enzyme is produced, a method and culture conditions suitable for culturing microorganisms to be used can be appropriately set.
  • examples of culture conditions include medium, culture temperature, and culture time.
  • any medium can be used as long as the microorganism to be used can grow.
  • carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate Or nitrogen sources such as peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, bran, meat extract, and potassium, magnesium, sodium, phosphate, manganese, iron, zinc, etc.
  • vitamins, amino acids, etc. may be added to the medium.
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3-8, preferably about 5-7, and the culture temperature is usually about 10-50 ° C, preferably about 25-35 ° C, for 1-15 days, preferably Incubate under aerobic conditions for 3-7 days.
  • the culture method for example, a shaking culture method or an aerobic deep culture method using a jar fermenter can be used.
  • FAD-GDH is recovered from the culture solution or cells (step
  • the culture supernatant is filtered and centrifuged to remove insoluble matter, followed by concentration with an ultrafiltration membrane, salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various chromatography.
  • the enzyme can be obtained by separating and purifying in an appropriate combination.
  • the enzyme when recovering from bacterial cells, can be obtained, for example, by crushing the bacterial cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separating and purifying in the same manner as described above. It should be noted that the above-described series of steps (crushing, separating, and purifying the cells) may be performed after the culture fluid cells are collected in advance by filtration, centrifugation, or the like.
  • fractionation is performed using FAD-GDH activity as an indicator, and the process proceeds to the next step.
  • FAD-GDH activity as an indicator
  • FAD-GDH is produced using the above transformant.
  • the above-mentioned transformant is cultured under the condition that a protein encoded by the gene introduced therein is produced (step (i)).
  • Culture conditions for transformants are known for various vector host systems, and those skilled in the art can easily set appropriate culture conditions.
  • the produced protein that is,? 0—0011) is recovered (step ⁇ )). Recovery and subsequent purification may be performed in the same manner as in the above embodiment.
  • the degree of purification of this enzyme is not particularly limited, but it can be purified to a specific activity of 50 to 160 (UZmg), preferably 100 to 160 (UZmg), for example.
  • the final form may be liquid or solid (including powder).
  • a further aspect of the invention relates to the use of the enzyme.
  • a glucose measurement method using this enzyme is provided.
  • the amount of glucose in a sample is measured using an oxidation-reduction reaction by this enzyme.
  • the present invention is used, for example, for measurement of blood glucose level, measurement of glucose concentration in foods (such as seasonings and beverages), and the like. Further, the present invention may be used for examining the degree of fermentation in the production process of fermented food (eg vinegar) or fermented beverage (eg beer or liquor).
  • FAD which is a coenzyme
  • GDH so it is not necessary to add a coenzyme for measurement, and a simple measurement system can be constructed.
  • the present invention also provides a reagent for measuring glucose containing the present enzyme.
  • the reagent is used in the glucose measurement method of the present invention described above.
  • the present invention further provides a kit (glucose measurement kit) for carrying out the glucose measurement method of the present invention.
  • the kit of the present invention contains, in addition to a glucose measurement reagent containing the present enzyme, a reaction reagent, a buffer solution, a glucose standard solution, and the like as optional elements.
  • an instruction manual is usually attached to the glucose measurement kit of the present invention.
  • Yeast extract (Becton, Dickinson Company) 0.2% (w / v), soybean peptone (D MV company) 1.0% (w / v), glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2.0% (w / v), KH P
  • FAD GDH oxidizes dulcose's hydroxyl group in the presence of an electron acceptor. ⁇ Catalyze the reaction that produces ratatones. Detection of FAD-GDH activity was carried out by the following reaction system.
  • PMS represents Phenazine methosulfate
  • NTB represents Nitrotetrazorium blue
  • reaction (1) reduced PMS is produced with the oxidation of glucose, and further, Diformazan formed by reduction of NTB by reduced PMS in reaction (2) is measured at a wavelength of 570 nm.
  • the enzyme activity (unit) is calculated by the following formula.
  • Vt is the total liquid volume
  • Vs is the sample volume
  • 20.1 is the extinction coefficient (cm 2 /0.5 mole) of diformazan per 0.5 ⁇ mole.
  • 1.0 represents the optical path length (cm)
  • df represents the dilution factor.
  • Aspergillus oryzae BB-56 was cultured to produce FAD-GDH.
  • Yeast Ex 0.2% (w / v), Soybean Peptone 0.5% (w / v), Glucose 2.0% (w / v), KH PO
  • a medium was prepared. Dispense 50 mL of this liquid medium into a 300 mL Erlenmeyer flask, sterilize at 121 ° C, 0.12 MPa for 20 minutes, and then inoculate Aspergillus oryzae BB-56. C, cultured at 200 rpm for 3 days.
  • FAD-GDH Production of FAD-GDH was carried out in a main culture medium having the following composition. Glucose 10.0% (w / v), Meast PIG 2.0% (w / v), Soybean peptone 4.0% (w / v), KH PO
  • the desalted solution 'concentrate was applied to CM—Sepharose Fast Flow (1000 mL, Amersham Biosciences) equilibrated with 10 mmol / L Mcllvaine buffer pH 5.5, and FAD-GDH was adsorbed onto the column. After washing the column with 10 mmol / L Mcllvaine buffer pH 5.5, FAD-GDH was eluted with 10 mmol / L Mcllvaine buffer pH 5.5 containing 0.1 mol / L NaCl to collect the FAD-GDH active fraction. The collected active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane, and the concentrated solution was equilibrated with 10 mmol / LK HPO—NaOH buffer pH 6.5 containing 2.5 mol / L ammonium sulfate.
  • FAD—GDH was eluted by changing the ammonium sulfate concentration in the same stepwise to 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 mol / L. It was. Collect the active fraction of FAD— GDH and desalinate with ultrafiltration membrane (20 mmol / L K HPO—NaOH buffer p
  • the molecular weight of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56 was measured by SDS-PAGE.
  • the gel was Homogeneously. 5 (GE Healthcare Bio-Sciences), the molecular weight marker was Protein Molecular Markers 14.4-97 kDa (GE Healthcare Bio-Sciences), and was performed by PhastSystem (GE Healthcare Biosciences). Protein bands were detected by staining protein bands on the gel with PhastGel Blue R (Kumashi R350 staining). As a result, it was detected as a single band near the molecular weight lOOkDa (Fig. 1).
  • FAD-GDH is a protein having a molecular weight of about 400,000 (FIG. 2).
  • FAD-GDH activity was detected at a molecular weight of about 400,000 in any culture filtrate (Fig. 3). This indicates that FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56, IAM2603, IAM2628, IAM2683, IAM2736, IAM2706, and NBRC30113 is a protein having a molecular weight of 400,000 in common.
  • Diformazan produced by the enzyme reaction was measured at an absorbance of 57 Onm, and the enzyme activity was measured by measuring the amount of Diformazan produced per minute.
  • the optimum pH of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56 was 7.0 (Fig. 5).
  • Triton X- 50 mM PIPES-NaOH buffer containing 100 pH 6. 5 2. Mix 55 mL, 1 M D-glucose solution 0.1 mL, 3 mM PMS solution 0.2 mL, and 6.6 mM NTB solution 0. ImL, 30, 37, 45, 55, 60, or 65. After incubating for 5 minutes at C, add 0.1 mL of purified 80-0011 solution derived from Aspergillus oryzae 88-56 and start the reaction at 30, 37, 45, 50, 55, 60 or 65 ° C. .
  • Di formazan produced by the enzyme reaction was measured at an absorbance of 570 nm, and the enzyme activity was measured by measuring the amount of Diformazan produced per minute.
  • the optimum temperature of purified FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae BB-56 was about 60 ° C (Fig. 6).
  • Purified FAD— GDH solution is 0.1M acetate buffer (pH3, pH4), 0.1M Mcllvain e buffer (pH4.5, pH5.0, pH6.0, pH7.0, pH8.0), or 0.1M Na CO
  • the FAD-GDH activity was measured by the method described in 1. above.
  • As a control the activity of purified FAD—GDH stored in ice-cold dilution with 0.1M K H PO—NaOH buffer pH 6.5
  • Diformazan produced by the enzyme reaction was measured at an absorbance of 570 nm, and the enzyme activity was measured by measuring the amount of Diformazan produced per minute. The relative activity for each substrate was calculated with a reaction rate for D-glucose of 100% (Table 3).
  • Aspergillus oryzae BB— 56, IAM2603, IAM2628, IAM2683, IAM2736, IAM2706, or NBRC30113-derived culture filtrates lOmL were placed in Dialysis Membrane 36, dialyzed in 10 mM KH PO—NaOH at 4 ° C, dialyzed Went.
  • Substrate BB-56 IAM2603 IA 2628 IAM2683 IA 2736 IAM2706 NBRC301
  • the sugar content per enzyme protein was measured by the phenol sulfate method.
  • Purified FAD-GDH solution 1. OmL, 5% (w / v) phenol solution 1. OmL, 98% sulfuric acid 5. OmL was mixed and left at room temperature for 20 minutes. After cooling with running water, the absorbance at 490 nm was measured. A calibration curve was prepared with a 0-0.03 mg / mL D-glucose standard solution (Fig. 11), and the sugar content per mg of enzyme was calculated. As a result, the sugar content of FAD-GDH was 0.43 mg (43%) per mg of enzyme.
  • the glucose oxidase activity is measured by the following reaction principle.
  • Reaction 2 ⁇ 2 0 2 + 4-Aminoantipyrine + phenol ⁇ quinoneimine dye + 4 ⁇ 2 0 HO produced by GO in Reaction 1 becomes peroxidase in Reaction 2
  • GO activity was measured by measuring the quinone imine dye at an absorbance of 500 nm.
  • One unit of GO activity is defined as the amount of enzyme that can oxidize 1 ⁇ mol of D-glucose per minute under the reaction conditions at 37 ° C. To do. The actual measurement method is shown below.
  • Phenonor solution (0.1M Phosphate with 0.152% Triton X-100, 0.1M Phosphate Knife pH7.0) 2.
  • OmL 0.5555mol / LD-Glucose solution 0.5mL, 25 U / mL peroxidase (Amano Enzyme Co., Ltd.) solution 0.5mL and 4mg / mL
  • FAD-GDH FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae according to the present invention
  • D glucose solution (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 mg / dL) 0.1 mL
  • 3 mM Mix 0.20 mL of PMS solution and 0.1 mL of 6.6 mM NTB solution and leave at 37 ° C for 5 minutes, then add 0.1 mL of FAD-GDH enzyme solution (0.3 U / mL) derived from Aspergillus oryzae BB-56 The reaction was started.
  • Dif or mazan produced by the enzyme reaction was measured at an absorbance of 570 nm, and the relationship between the increase in absorbance at 570 nm per 3 minutes and the glucose concentration is shown in FIG.
  • FAD-GDH derived from Aspergillus oryzae it was shown that the glucose concentration in the sample specimen can be accurately measured if the glucose concentration is 800 mg / dL or less.
  • the inhibitory effect of 1,10-phenantoracin on purified FAD- GDH was measured by measuring the enzyme activities of the control group and test group (1,10-phenantorin-added group) and comparing the two as follows. Examined.
  • the enzyme activity was determined when 1,10-phenantorin was prepared so that the final concentrations were lmM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, and 50 mM, respectively. (Test results)
  • CYA medium K HPO lg, Czapek Concentrate 10mL, Yeast extract (Difco) 5g, Sucr
  • CZ medium K HPO lg, Czapek Concentrate lOmL, Sucrose 30g, Agar (Wako) 17.5g
  • CY20S medium K HPO lg, Czapek Concentrate lOmL, Yeast extract. (Difco) 5g, Su
  • MEA medium Malt extract (Difco) 20g, Glucose 20g, Bacto-peptone (Difco) lg, Agar (Wako) 15g, purified water lOOOmL
  • PDA medium Potato dextrose agar (Eiken) was used.
  • the degree of growth was cultured at 25 ° C or 37 ° C for 7 days, and the diameter of the colony was measured.
  • the growth state was observed in CYA medium, CZ medium, CY20S medium, and MEA medium (25 ° C, 7 days).
  • the conidial surface was observed with a scanning electron microscope after culturing at 25 ° C for 15 days in a CYA medium, followed by treatment with osmium acid vapor fixation.
  • the growth degree (7-day culture) in various media is shown in the following table.
  • the growth conditions (25 ° C, 7 days culture) in various media are shown in the table below.
  • the color was in accordance with the Japan Horticultural Plant Standard Color Chart (published by the Japan Color Research Institute) (numbers in parentheses are color chart numbers).
  • Table 10 Table 10. Growth conditions in various media (cultured at 25 ° C for 7 days)
  • Aspergillus oryzae BB-56 cultured and purified fermentation obtained The isoelectric point was fractionated by the method shown in 6.
  • the obtained purified enzyme was subjected to SDS-PAGE using gel PAG Mini DAIIC HI 7.5 (Daiichi Chemical Co., Ltd.).
  • Transcription buffer 1 0.3M Tris (pH 10.4), 20% methanol
  • Transcription buffer 2 (30 mM Tris (pH 10.4), 20% methanol)
  • Transcription buffer 3 40 mM 6-aminohexanoic acid (pH 7. 6), 20% methanol
  • the transfer operation uses transfer buffer 1 on the anode side, transfer buffer 2 on the center including the membrane, and transfer buffer 3 on the cathode side, using a semi-dry transfer device under conditions of constant current 0.8mAZPVDF membrane cm 2 for 90 min. I went there.
  • CBB Concentrassie Brilliant Blue R-250 staining was performed, and a band corresponding to the enzyme was excised and used as a sample for N-terminal amino acid sequence analysis.
  • the gel after electrophoresis was stained with CBB to cut out the band corresponding to the enzyme and used as it was as a sample for internal amino acid sequence analysis.
  • the N-terminal amino acid sequence and the internal amino acid sequence became clear.
  • Aspergillus oryzae BB-56 was incubated at 30 ° C using a Sakaguchi flask containing 100 ml of YPD medium (Yeast Extract 1%, Peptone 2%, Glueose 2%), and then the Buchner funnel and Nuts Using this, the culture solution was filtered to obtain bacterial cells.
  • YPD medium Yeast Extract 1%, Peptone 2%, Glueose 2%
  • Chromosomal DNA was precipitated by adding 1/10 volume of 3M NaO Ac (pH 4.8) and 2 volumes of ethanol to the resulting supernatant and cooling at -80 ° C.
  • the precipitated chromosomal DNA was recovered by centrifugation (20,000 g, 20 minutes, 4 ° C).
  • the collected chromosomal DNA was washed with 70% ethanol, vacuum-dried, and finally dissolved in 400 1 TE solution to obtain a chromosomal DNA solution having a concentration of about 1 mg / ml.
  • a PCR reaction was carried out using the chromosomal DNA prepared in (3) as a cage.
  • TAKARA LA-Taq TM (Takara Bio Inc.) was used for the reaction, and the composition of the reaction solution was in accordance with the attached standard method.
  • Primers (FG-F, FG-R) were each added to 0.4 M, and the vertical genome was added to a concentration of 10 ng / 1, and a PCR reaction was performed.
  • the reaction cycle was as follows. That is, after a reaction at 94 ° C for 2 minutes, a cycle with a reaction at 94 ° C for 30 seconds, a reaction at 60 ° C for 30 seconds, and a reaction force at 72 ° C for 10 minutes was repeated 35 times. The reaction was carried out at 72 ° C for 10 minutes. After completion of the reaction, the sample was stored at 4 ° C.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis to separate amplified fragments and primers, and extracted from agarose gel using GENE CLEAN TM (BIO 101).
  • the extracted amplified fragment was subcloned into the vector PUC19 (Takara Bio) Smal site. Thereafter, the nucleotide sequence of the region corresponding to the enzyme gene of the subcloned plasmid PFG2 was analyzed.
  • the sequence reaction was performed using the BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) according to the instruction manual of the product.
  • ABI PRISM 310 sequencer (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) was used for the analysis.
  • the FAD-GDH of the present invention is excellent in substrate specificity and makes it possible to measure the amount of glucose more accurately. Therefore, the FAD-GDH of the present invention is suitable for measurement of blood glucose level and glucose concentration in foods (condiments, beverages, etc.).

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Abstract

　グルコース量のより正確な測定を可能とする新規な酵素及びその生産菌、並びにその用途を提供する。(1)電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する作用を有し、(2)ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１００ｋＤａ、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が約４００ｋＤａであり、(3)マルトース、Ｄ-フルクトース、Ｄ-マンノース及びＤ-ガラクトースに対する反応性が低いフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素が提供される。また、当該酵素を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅが提供される。さらに、当該酵素を用いたグルコース測定法、グルコース測定用試薬、及びグルコース測定用キットが提供される。

Description

フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 技術分野
[0001] 本発明は補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びその用途に関する。詳しくは、 本発明はフラビンアデ-ンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素、及 び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造法、当該酵素を使用したグルコース測定法 などに関する。
背景技術
[0002] 近年、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられ ている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである 。ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（GDH)、グルコースォキシ ダーゼ (GO)などが挙げられる。 GOを用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素 の影響を受けやすぐ溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘さ れている。
[0003] 一方、溶存酸素の影響を受けず且つ NAD (P)非存在下でグルコースに作用する 酵素としてピロ口キノリン（PQQ)を補酵素とする GDH (PQQ— GDH)が知られてい る（例えば特許文献 1〜3を参照)。し力しながら PQQ— GDHには、（l) PQQが酵素 から解離しやすいこと、（2)グルコースに対する選択性が低いこと、及び (3)—般に 膜画分に存在していることからその抽出'単離操作に困難を伴うことなどの問題があ る。
[0004] ところで近年、病院で簡易血糖自己測定器を使用した患者において低血糖等を発 症した例が報告された。その後の調査'分析の結果、 PQQ— GDHが輸液成分とし て含まれるマルトースに反応し、実際の血糖値より高値を示したことが、このような発 症例の原因であることが判明した (医薬品 ·医療用具等安全性情報 206号 (Pharmace uticals and Medical Devices Safety Information No.206)、平成 16年（2004年） 10月、 厚生労働省医薬食品局)。このような事情もあって、グルコースに特異的に作用し、 特にマルトースへの作用性が低い血糖測定用酵素の開発が切望されている。 尚、 PQQ— GDHの他、溶存酸素の影響を受けず且つ NAD (P)非存在下でダル コースに作用する酵素としてフラビンアデ-ンジヌクレオチドを補酵素とするダルコ一 ス脱水素酵素（本明細書にぉ 、て「FAD— GDH」とも!/、う）が知られて!/、る。これまで に、 Aspergillus oryzae ( 特許文献 1〜4)及び Aspergillus terreus (特許文献 4)力 それぞれ FAD— GDHが取得されて!、る。
特許文献 1：特開 2000 - 350588号公報
特許文献 2：特開 2001— 197888号公報
特許文献 3：特開 2001— 346587号公報
特許文献 4 :国際公開第 2004Z058958号パンフレット
非特干文献 1： Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Inducti on of its synthesis by p— benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Bi ochim. Biophys. Acta, 139, 265—276 (1967).
非特許文献 2 : Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purifi cation and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biocnim. Biophys. Acta, 139 , 277-293 (1967).
非特許文献 3 : Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. Gene ral enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967). 非特許文献 4 : Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histi dyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 3 28-335 (1967).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記背景の下で本発明は、グルコース量のより正確な測定を可能とする新規な酵 素及びその生産菌、並びにその用途を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 以上の課題を解決するために本発明者らはまず、フラビンアデ-ンジヌクレオチド を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FAD— GDH)に注目した。そして、広く微生 物を対象としてスクリーニングした結果、 FAD— GDHの生産性に優れた菌株を見出 した。同定の結果、 Aspergillus oryzae (ァスペルギルス'ォリゼ）と判明した。また、 当該菌株が生産する FAD— GDHを精製することに成功し、その諸性状を決定する ことにも成功した。決定された諸性状より、当該 FAD— GDHが新規な酵素であること が判明した。また、当該 FAD— GDHがグルコースに対する選択性に優れ、し力も反 応系に存在する溶存酸素の影響を受けにくぐ試料中のダルコース量のより正確な 測定を可能にするものであることが示された。一方、当該 FAD— GDHと同等の酵素 を他の菌株 (Aspergillus oryzae)が生産することが確認された。
更に検討を進めた結果、上記菌株が保有する FAD— GDHのアミノ酸配列及びそ れをコードする遺伝子の配列を決定することに成功した。
本発明は以上の知見ないし成果に基づくものであり、以下に示すフラビンアデニン ジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素などを提供する。
[1]以下の性状を備えるフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵 素、
(1)作用： 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸ィ匕してダルコノー δ—ラタ トンを生成する反応を触媒する、
(2)分子量： SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約 100kDa、ゲルろ 過クロマトグラフィーによる分子量が約 400kDa、
(3)基質特異性： マルトース、 D-フルクトース、 D-マンノース及び D-ガラクトースに 対する反応性が低い。
[2] D-グルコースに対する反応性を 100%としたときのマルトースに対する反応性が 5%以下である、 [1]に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水 素酵素。
[3]D-グルコースに対する反応性を 100%としたときの D-ガラクトースに対する反応 性が 5%以下である、 [1]又は [2]に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グ ルコース脱水素酵素。
[4]D-グルコースに対する反応性を 100%としたときの D-フルクトース及び D-マンノ ースに対する反応性カ^、ずれも 5%以下である、 [1]〜 [3]の 、ずれか一項に記載 のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。 [5]以下の性状を更に備える、 [1]〜 [4]の 、ずれか一項に記載のフラビンアデニン ジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(4)至適 pH : 7付近、
(5)至適温度： 60°C付近、
(6) pH安定性： pH3. 0〜7. 0の範囲で安定、
(7)温度安定性： 40°C以下で安定。
[6]以下の性状を更に備える、 [1]〜 [5]の 、ずれか一項に記載のフラビンアデニン ジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(8) Km値： D-グルコースにつ!/、ての Km値が約 8mM。
[7] Aspergillus oryzaeに由来する酵素である、 [1]〜[6]のいずれか一項に記載 のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
[8]配列番号 20で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列 を有することを特徴とする、 [1]〜 [7]の 、ずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌ クレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
[9]フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する 、受託番号が NITE BP— 236の Aspergillus oryzae BB— 56。
[10]以下の (A)〜（C)力もなる群より選択される 、ずれかの DNAからなるフラビン アデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子：
(A)配列番号 20で示されるアミノ酸配列をコードする DNA；
(B)配列番号 19で示される塩基配列力 なる DNA；
(C)配列番号 19で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデ ニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードする DNA0
[11] [10]に記載の遺伝子を含有するベクター。
[12] [10]に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
[13]以下のステップ（1)及び（2)、又はステップ (i)及び (ii)を含んでなる、フラビン アデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
(1) [7]に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の 生産能を有する Aspergillus oryzaeを培養するステップ；
(2)培養後の培養液及び Z又は菌体より、フラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型 グルコース脱水素酵素を回収するステップ；
(i) [12]に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される 条件下で培養するステップ；
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
[14] [1]〜 [8]の 、ずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型ダル コース脱水素酵素を用 、て試料中のダルコースを測定することを特徴とする、ダルコ ース測定法。
[15] [1]〜[8]の 、ずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型ダル コース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
[16] [15]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
図面の簡単な説明
[図 1] Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの SDS— PAGE。 両端のレーンは、分子量マーカーで、上力も順にホスホリラーゼ b (97kDa)、アルブ ミン（66kDa)、オボアルブミン（45kDa)、カルボニックアンヒドラーゼ（30kDa)、トリ プシンインヒビター（20. lkDa)、 α—ラクトアルブミン（14. 4kDa)。
[図 2] Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの HPLCによる分子 量の測定。（A)分子量マーカー。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（290kDa、 11. 508 min)、乳酸デヒドロゲナーゼ（142kDa、 13. 012min)、エノラーゼ（67kDa、 14. 6 43min)、ミオキナーゼ（32kDa、 15. 321min)、シトクローム C (12. 4kDa、 20. 3 03min) (B)精製 FAD— GDH。
[図 3] Aspergillus oryzae由来の FAD— GDHの分子量の比較。（A)分子量マー カー。溶出が早い順にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GLDH、 290kDa)、乳酸デヒ ドロゲナーゼ（LDH、 142kDa)、ミオキナーゼ（32kDa)。 (B) , (C) , (D) , (Ε) , (F ) , (G) , (Η)は、それぞれ A. oryzae ΒΒ— 56、 ΙΑΜ2603、 ΙΑΜ2628、 ΙΑΜ26 83、 ΙΑΜ2736, ΙΑΜ2706及び NBRC30113由来の培養ろ液を試料とした。
[図 4]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの 400— 800nmに おける吸収スペクトル。
[図 5]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの至適 pH。
[図 6]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの至適温度。
[図 7]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの pH安定性。
[図 8] Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの温度安定性。
[図 9]グリセロール密度勾配等電点電気泳動による Aspergillus oryzae BB— 56 由来の精製 FAD— GDHの等電点の測定。
[図 10]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD — GDHのグルコースに対 する Line we aver— Burk plot。
[図 11] Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD GDHの糖含量の測定。
[図 12]Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD - GDHによるグノレコース濃 度の測定。
発明を実施するための最良の形態
(用語）
本発明において「タンパク質をコードする DNA」とは、それを発現させた場合に当 該タンパク質が得られる DNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基 配列を有する DNAのことを 、う。従ってコドンの縮重も考慮される。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本 発明の酵素 (FAD— GDH)に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の 酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実 質的に含まない (特に夾雑タンパク質を実質的に含まない)状態をいう。具体的には 例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体 の約 20%未満、好ましくは約 10%未満、更に好ましくは約 5%未満、より一層好ましく は約 1%未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製された ものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分 や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離され た酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約 20%未満、好ましくは約 10% 未満、更に好ましくは約 5%未満、より一層好ましくは約 1%未満である。尚、それと異 なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「フラビンアデ-ンジ ヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」と記載した場合は「単離された状態のフ ラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素」を意味する。フラビンァ デニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の代わりに使用される用語「FA D GDH」及び「酵素」につ!/、ても同様である。
DNAにつ 、て使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在して 、る DN Aの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状 態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモータ 一領域の配列やターミネータ一配列など）など一部の他の核酸成分を含んで ヽても よい。例えばゲノム DNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態に おいて共存する他の DNA成分を実質的に含まない。一方、 cDNA分子など遺伝子 工学的手法によって調製される DNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、 細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製される DNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、 dNTPなどの前駆体 (原材料)や 合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表 すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離 された状態の DNAを意味する。
(FAD— GDH及びその生産菌）
本発明の第 1の局面はフラビンアデ-ンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱 水素酵素 (FAD— GDH)及びその生産菌を提供する。本発明の FAD— GDH (以 下、「本酵素」ともいう）は以下の性状を備えることを特徴とする。まず、本酵素は次の 反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してダルコノー δーラ タトンを生成する反応を触媒する。また、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による本酵 素の分子量は約 lOOkDaであり、ゲルろ過による本酵素の分子量は約 400kDaであ る。尚、本発明の FAD— GDHは 4量体からなる。
一方、本酵素は基質特異性に優れ、 D-グルコースに対して選択的に作用する。詳 しくは、本発明の FAD— GDHはマルトースに対する反応性が極めて低ぐ D-フルク トースゃ D-マンノース、 D-ガラクトースなどに対する反応性も非常に低い。具体的に は D-グルコースに対する反応性を 100%としたときの、これらの基質に対する反応性 は 、ずれも 5%以下である。本発明の好ま 、態様ではマルトースに対する反応性 は 1%以下又は実質的に認められない。更に好ましい態様では、 D-フルクトースに 対する反応性及び D-ガラクトースに対する反応性のいずれについても 1%以下又は 実質的に認められない。以上のような優れた基質特異性を有する本酵素は、試料中 のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本酵素によれば 試料中にマルトースゃガラタトースなどの夾雑物が存在していた場合であっても目的 のグルコース量をより正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中に このような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途 (典型的には血液中のダルコ一 ス量の測定）に適したものであるといえ、しかも当該用途も含め様々な用途に適用可 能であること、即ち汎用性が高いともいえる。尚、本酵素の反応性及び基質特異性は 、後述の実施例に示す方法（（1 2)の欄、（7— 1)の欄、（7— 2— 2)の欄)で測定- 評価することができる。
[0010] 本酵素は好ましくは Aspergillus oryzaeに由来する FAD— GDHである。ここで の「Aspergillus oryzaeに由来する FAD— GDH」とは、 Aspergillus oryzaeに分 類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産する FAD— GDH 、或いは Aspergillus oryzae (野生株であっても変異株であってもよい）の FAD— GDH遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られた FAD— GDHであるこ とを意味する。従って、 Aspergillus oryzaeより取得した FAD— GDH遺伝子（又は 当該遺伝子を改変した遺伝子)を導入した宿主微生物によって生産された組み換え 体も、「 Aspergillus oryzaeに由来する FAD— GDH」に該当する。
[0011] 本酵素がそれに由来することとなる Aspergillus oryzaeのことを、説明の便宜上、 本酵素の生産菌という。本酵素の生産菌の例として、後述の実施例に示す Aspergil lus oryzae BB— o6、 Aspergillus oryzae IAM2603、 Aspergillus oryzae IAM2628, Aspergillus oryzae IAM2683、 Aspergillus oryzae IAM273 6、 Aspergillus oryzae IAM2706、及び Aspergillus oryzae NBRC30113 を挙げることができる。この中でも BB— 56株は FAD— GDHの生産性に優れ、特に 好ましい生産菌である。 BB— 56株は以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、 容易に入手可能である。
寄託機関： NITEバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター (〒 292-0818 日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5 -8)
寄託日（受領日）： 2006年 5月 17日
受託番号： NITE BP— 236
尚、 Aspergillus oryzae IAM2603、 Aspergillus oryzae IAM2628、 Aspe rgillus oryzae IAM2683、 Aspergillus oryzae IAM2736、及び Aspergillu s oryzae IAM2706は IAMカルチャーコレクション（東京大学分子細胞生物学研 究所 細胞機能情報研究センター）に保管された菌株であり、所定の手続を経ること によってその分譲を受けることができる。同様に Aspergillus oryzae NBRC3011 3は NBRC (独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物 遺伝資源部門）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を 受けることができる。
本発明者らは、後述の実施例に示す通り、 Aspergillus oryzae BB— 56より、上 記性状 (作用、分子量、基質特異性)を備える FAD— GDHを調製することに成功し た。得られた FAD— GDHを詳細に検討した結果、以下の性状を更に備えることが 明らかとなった。
(4)至適 pH : 7付近
(5)至適温度： 60°C付近
(6) pH安定性： pH3. 0〜7. 0の範囲で安定
(7)温度安定性： 40°C以下で安定
(8) Km値： D-グルコースにつ!/、ての Km値が約 8mM
(9)等電点： 6. 4付近
ここで、至適 pHについては後述の実施例に示すように例えば Mcllvaineバッファ 一中で測定した値であり、至適温度についても同様に例えば PIPES— NaOHバッフ ァー（pH6. 5)中で測定した値である。また、特定の pH条件の下、 37°Cで 30分間処 理したときに 80%以上の活性を維持したとき、当該 pH条件において「安定」であると いうことができる。同様に、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば PIPES— NaOHバッファー、 pH6. 5)で 20分間処理した後に活性の実質的な低下が認めら れな 、 (つまり約 100%の活性を維持する）とき、当該温度条件にお！、て「安定」であ るということができる。 Km値及び等電点に関しては、後述の実施例に示す方法 (8. の欄、 6.の欄)で測定'評価することができる。
[0013] 以上のように、取得に成功した本酵素の性状の詳細が明ら力となった。その結果、 本酵素がグルコースに対して選択的且つ高親和性であり、しかも安定性に優れ、グ ルコースセンサなどへの応用.実用化に適したものであることが判明した。
一方、本酵素の性状の詳細が明らかになった結果、過去に報告された補酵素結合 型酵素と全く異なる酵素であることが確認された。
尚、上で例示した他の菌株、即ち Aspergillus oryzae IAM2603、 Aspergillus oryzae IAM2o28、 Aspergillus oryzae IAM2683、 Aspergillus oryzae IAM2736, Aspergillus oryzae IAM2706、及び Aspergillus oryzae NBR C 30113についても、 Aspergillus oryzae BB— 56が生産する FAD— GDHと同 等の性状を備えた FAD— GDHを生産することが確認された。
[0014] 本発明者らの更なる検討の結果、 Aspergillus oryzae BB— 56が保有する FA D— GDHのアミノ酸配列が決定された。そこで、配列番号 20のアミノ酸配列を有す るタンパク質力もなるという特徴によって本酵素を更に特徴づけることができる。ここで
、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後 のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配 列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が 改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号 20で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有し FAD— GDH活性をもつタン パク質 (以下、「相同タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「相同なアミノ酸配列」 とは、配列番号 20で示されるアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク 質の機能 (ここでは FAD— GDH活性）に実質的な影響を与えて 、な 、アミノ酸配列 のことをいう。
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する 1〜数個 のアミノ酸の欠失、置換、若しくは 1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組 合せによりアミノ酸配列に変異 (変ィ匕）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列 の相違は FAD— GDH活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があつ てもよい)。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、ま た複数の位置で相違が生じて 、てもよ 、。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約 30 %未満に相当する数であり、好ましくは約 20%未満に相当する数であり、さらに好ま しくは約 10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約 5%未満に相当する数 であり、最も好ましくは約 1%未満に相当する数である。即ち相同タンパク質は、配列 番号 20のアミノ酸配列と例えば約 70%以上、好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは 約 90%以上、より一層好ましくは約 95%以上、最も好ましくは約 99%以上の同一性を有 する。
[0015] 好ましくは、 FAD— GDH活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸 置換を生じさせることによって相同タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」 とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを いう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖 (例えばリシン、アルギニン、ヒスチ ジン）、酸性側鎖 (例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖 (例えばグ リシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性 側鎖（例えばァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ-ルァラニン、メ チォニン、トリブトファン）、 β分岐側鎖 (例えばスレオニン、パリン、イソロイシン）、芳 香族側鎖（例えばチロシン、フエ-ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、い くつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のフアミ リー内のアミノ酸残基間の置換である。
[0016] ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸 (以下、これらを含む用語として「二 つの配列」を使用する）の同一性（％)は例えば以下の手順で決定することができる。 まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップ を導入して第二の配列とのァライメントを最適化してもよ 、)。第一の配列の特定位置 の分子 (アミノ酸残基又はヌクレオチド)が、第二の配列における対応する位置の分 子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は 、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％) = 同一位置の数 Z位置の総数 X 100)、好ましくは、ァライメントの最適化に要したギヤ ップの数およびサイズも考慮に入れる。
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能で ある。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、 Karlinおよび Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264- 68に記載され、 Karlinおよび Alt schul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873- 77において改変されたァルゴリズ ムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、 Altschulら（1990 ) J. Mol. Biol. 215:403- 10に記載の NBLASTプログラムおよび XBLASTプログラム（バ 一ジョン 2.0)に組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を 得るには例えば、 NBLASTプログラムで score = 100、 wordlength = 12として BLASTヌ クレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に相同的なアミノ酸配列を 得るには例えば、 XBLASTプログラムで score = 50、 wordlength = 3として BLASTポリ ペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップァライメントを得るためには、 Altsc hulら（1997) Amino Acids Research 25(17):3389- 3402に記載の Gapped BLASTが利 用可能である。 BLASTおよび Gapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム (例えば XBLASTおよび NBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳 しくは http：〃 www.ncbi.nlm.nih.govを参照された!ヽ。配列の比較に利用可能な他の 数学的アルゴリズムの例としては、 Myersおよび Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4: 11- 17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えば GENESTREAM ネットワークサーバー（IGH Montpellier,フランス）または ISRECサーバーで利用可能 な ALIGNプログラムに組み込まれて!/、る。アミノ酸配列の比較に ALIGNプログラムを 利用する場合は例えば、 PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ = 12、 ギャップペナルティ =4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、 GCGソフトウェアパッケージの GAPプログラムを用 いて、 Blossom 62マトリックスまたは PAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重 = 12、 10、 8、 6、又は 4、ギャップ長加重 =2、 3、又は 4として決定することができる。また、二 つの核酸配列の相同度を、 GCGソフトウェアパッケージ（http：〃 www. gcg.comで利用 可能）の GAPプログラムを用いて、ギャップ加重 = 50、ギャップ長加重 =3として決定 することができる。
[0017] 上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製する ことができる。例えば、本酵素をコードする DNAで適当な宿主細胞 (例えば大腸菌） を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製する ことができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換 えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本 酵素をコードする DNAと他の適当な DNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクター を用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドな!/、しタンパク質が連結 された組換えタンパク質力もなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び Z又は脂 質の付加や、あるいは N末端若しくは C末端のプロセッシングが生ずるような修飾を 施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又 は生物学的機能の付加等が可能である。
[0018] (FAD— GDHをコードする DNA)
本発明の第 2の局面は本酵素をコードする遺伝子、即ち新規な FAD— GDH遺伝 子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号 20のアミノ酸配列をコ ードする DNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号 19で示される塩基配列か らなる DNAである。
ところで、一般に、あるタンパク質をコードする DNAの一部に改変を施した場合に おいて、改変後の DNAがコードするタンパク質力 改変前の DNAがコードするタン ノ ク質と同等の機能を有することがある。即ち DNA配列の改変が、コードするタンパ ク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後にお いて維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号 19で示される 塩基配列と相同な塩基配列を有し、 FAD— GDH活性をもつタンパク質をコードする DNA (以下、「相同 DNA」ともいう）を提供する。ここでの「相同な塩基配列」とは、配 列番号 19で示される核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードする タンパク質の機能 (ここでは FAD— GDH活性)が実質的な影響を受けていない塩基 配列のことをいう。
[0019] 相同 DNAの具体例は、配列番号 19で示される塩基配列に相補的な塩基配列に 対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAである。ここでの「ストリンジ ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリツ ドが形成されない条件をいう。このようなストリンジヱントな条件は当業者に公知であつ て ί列 ば Molecularし loning (Third Edition,し old bpnng Harbor Laboratory Press, N ew York)や Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al, 1987)を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、 ハイブリダィゼーシヨン液（50%ホルムアミド、 10 X SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium ci trate, pH 7.0)、 5 X Denhardt溶液、 1% SDS、 10%デキストラン硫酸、 10 /z g/mlの変 性サケ精子 DNA、 50mMリン酸バッファー (pH7.5))を用いて約 42°C〜約 50°Cでイン キュベーシヨンし、その後 0.1 X SSC、 0.1% SDSを用いて約 65°C〜約 70°Cで洗浄する 条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイプリ ダイゼーシヨン液として 50%ホルムアミド、 5 X SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate , pH 7.0)、 I X Denhardt溶液、 1%SDS、 10%デキストラン硫酸、 10 g/mlの変性サケ 精子 DNA、 50mMリン酸バッファー (pH7.5))を用いる条件を挙げることができる。 相同 DNAの他の具体例として、配列番号 19で示される塩基配列を基準として 1若 しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列力 なり、 F AD— GDH活性をもつタンパク質をコードする DNAを挙げることができる。塩基の置 換ゃ欠失などは複数の部位に生じて 、てもよ 、。ここでの「複数」とは、当該 DNAが コードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異な るが例えば 2〜40塩基、好ましくは 2〜20塩基、より好ましくは 2〜 10塩基である。以 上のような相同 DNAは例えば、制限酵素処理、ェキソヌクレアーゼゃ DNAリガーゼ 等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapte r 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やランダム突然変異導入法（ Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press , New York)による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及 び Z又は逆位を含むように配列番号 19で示される塩基配列を有する DNAを改変す ることによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同 DNA を得ることができる。 相同 DNAの更に他の例として、 SNP (—塩基多型）に代表される多型に起因して 上記のごとき塩基の相違が認められる DNAを挙げることができる。
[0021] 本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし 、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いること によって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当な糸状菌類、酵 母菌類のゲノム DNAライブラリー又は cDNAライブラリー、或は糸状菌類、酵母菌類 の菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダィズ可能なオリ ゴヌクレオチドプローブ 'プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌク レオチドプローブ 'プライマーは、市販の自動化 DNA合成装置などを用いて容易に 合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの 作製方法については、例えば Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。
例えば、配列番号 19で示される塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配 列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたノ、イブリダィゼーシヨン法を利 用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダィズ するようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（ 例えば PCR)を利用して増幅及び単離することができる。
[0022] (ベクター）
本発明のさらなる局面は本発明の遺伝子を含有するベクターに関する。本明細書 において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へ と輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるもので はない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージ ベクター、ウィルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レ トロウィルスベクター、ヘルぺスウィルスベクター等）の形態をとり得る。
使用目的 (クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮 して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とす るベクター（M13ファージ又はその改変体、 λファージ又はその改変体、 pBR322又は その改変体 (pB325、 pAT153、 pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSe cl、 pMFa、 pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、 pVLなど）、哺乳類細胞 を宿主とするベクター（pCDM8、 pMT2PCなど)等である。
[0023] 本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿 入された核酸を目的の細胞 (宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内に おいて発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核 酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるェンノヽンサ一配列等を含 む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクター を用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無 (及びその程 度）を確認することができる。
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入 (必要な場合） 、プロモーターの挿入 (必要な場合)等は標準的な組換え DNA技術 (例えば、 Molec ularし loning, Third Edition, 1.84, Cold bpnng Harbor Laboratory Press, New Yor を参照することができる、制限酵素及び DNAリガーゼを用いた周知の方法)を用い て行うことができる。
[0024] (形質転換体）
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された形質転換体に関する。本発明の形 質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明 の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフエクシヨン乃 至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフエクシヨン、トランスフォー メーシヨンはリン酸カルシウム共沈降法、エレクト口ポーレーシヨン (Potter, H. et al.， P roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161—7165(1984》、リポフエクシヨン (Feigner, P.L. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413—7417(1984》、マイクロインジェクション (Gr aessmann, M. & Graessmann.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976》、 Hanahanの方法 (Hanahan, D.， J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983》、酢酸リチウム法 (Sc hiestl, R.H. et al.， Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト ポリエチレング リコール法 (Yelton, M.M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470- 1474(1984》等によ つて実施することができる。
宿主細胞としては大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞（例えば、 Saccharomyces cere visiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris)、糸状菌糸田胞 (例えば、 Aspergil lus oryzae, Aspergillus niger)等を f列 すること でさ 。
[0025] (FAD— GDHの製造法）
本発明の更なる局面は FAD— GDHの製造法を提供する。本発明の製造法の一 態様では、本酵素 (FAD— GDH)の生産能を有する微生物を培養するステップ (ス テツプ（1) )及び培養後の培養液及び Z又は菌体より、フラビンアデ-ンジヌクレオチ ド結合型グルコース脱水素酵素を回収するステップ (ステップ（2) )が行われる。
ステップ（1)に使用される微生物として例えば上記の Aspergillus oryzae BB— 56等を使用することができる。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるも のである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用す る微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件とし て、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
[0026] 培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良!、 。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、 デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモ-ゥム、炭酸アンモ-ゥム、 リン酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンステ ィープリカ一、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、 マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添 カロしたものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、 アミノ酸などを培地に添カ卩してもよい。培地の pHは例えば約 3〜8、好ましくは約 5〜 7程度に調整し、培養温度は通常約 10〜50°C、好ましくは約 25〜35°C程度で、 1 〜15日間、好ましくは 3〜7日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例 えば振盪培養法、ジャー'フアーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
[0027] 以上の条件で培養した後、培養液又は菌体より FAD— GDHを回収する (ステップ
(2) )。培養液力 回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等すること によって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、 各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を 得ることができる。 他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などに よって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができ る。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液力 菌体を回収した後、上記一連の 工程 (菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。
尚、各精製工程では原則として FAD— GDH活性を指標として分画を行い、次のス テツプへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合に はこの限りでない。
[0028] 本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いて FAD— GDHを製造する。こ の態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質 が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する (ステップ (i) )。様々なベクター 宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養 条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質 (即 ち、？八0— 0011)を回収する（ステップ^) )。回収及びその後の精製については、 上記態様の場合と同様に行えばよい。
[0029] 本酵素の精製度は特に限定されないが、例えば比活性が 50〜160(UZmg)、好 ましくは比活性が 100〜160(UZmg)の状態に精製することができる。また、最終的 な形態は液体状であっても固体状 (粉体状を含む)であってもよ ヽ。
[0030] (FAD— GDHの用途）
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を用い たグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸 化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。本発明は例えば血糖値 の測定、食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに利用される。ま た、発酵食品（例えば食酢)又は発酵飲料 (例えばビールや酒）の製造工程にお 、て 発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。本酵素では補酵素である FADが常 に GDHに結合していることから測定に際して補酵素の添加が不要であり、簡便な測 定系を構築できる。
本発明はまた、本酵素を含むグルコース測定用試薬を提供する。当該試薬は上記 の本発明のグルコース測定法に使用される。 [0031] 本発明は更に、本発明のグルコース測定法を実施するためのキット（グルコース測 定用キット）を提供する。本発明のキットは、本酵素を含むグルコース測定用試薬の 他、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液などを任意の要素として含む。また、本 発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。
実施例
[0032] 1. FAD— GDH生産菌のスクリーニング
(,1— 1) Aspergillus oryzaeの; ¾·
Aspergillus oryzaeの 7菌株（BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2683、 I AM2736、 IAM2706, NBRC30113)を以下の方法によって培養した。
[0033] (1 1 1)前培養
酵母エキス（Becton, Dickinson Company) 0. 2% (w/v)、大豆ペプトン（D MV社） 1. 0% (w/v)、グルコース（和光純薬工業株式会社） 2. 0% (w/v)、 KH P
2
O (和光純薬工業株式会社) 0. 1% (w/v)、及び MgSO · 7Η O (シグマ'アルドリツ
4 4 2
チ'ジャパン株式会社） 0. 05% (w/v) (pH5. 7)の組成からなる培地 50mLを 300m L容の三角フラスコに分注し、 121°C、 0. 12MPaで 20分間殺菌した。冷却後、 Asp ergillus oryzaeの各種菌株をスラント 5 X 5mm角で接種し、 30°C、 200rpmで 3日 間前培養を行った。
[0034] (1 1 2)本培養
グルコース 15. 0% (w/v)、 Meast PIG (アサヒフードアンドへルスケア株式会社） 3. 0% (w/v)、大豆ペプトン 6. 0% (w/v)、 KH PO 0. 3% (w/v)、 K HPO (和光
2 4 2 4 純薬工業株式会社) 0. 2% (w/v)、及び 4mM Hydroquinone (和光純薬工業株 式会社）（ρΗ6. 0)の組成からなる培地 50mLを 300mL容の三角フラスコに分注し、 121°C、 0. 12MPaで 20分間殺菌した。冷却後、上記前培養の培養液 lmLを接種 し、 30°C、 200rpmで 4日間本培養を行った。培養終了後、培養液を No. 2のろ紙（ アドバンテック株式会社)でろ過し、各菌株の培養ろ液の FAD— GDH活性の有無を 確認した。
[0035] (1 2) ?八0— 0011活性の検出
FAD GDHは、電子受容体存在下でダルコースの水酸基を酸化してダルコノー δ ラタトンを生成する反応を触媒する。 FAD— GDH活性の検出は、下記の反応 系で行った。
[数 1]
(1) D グノレコース + PMS → D グルコノー（3—ラタ トン + 還元型 PMS
(2) 2還元型 PMS + ΝΤΒ → 2 PMS + D i f o rma z a n
[0036] 尚、式中の PMSは Phenazine methosulfateを表し、 NTBは Nitrotetrazoriu m blueを表す。
反応（1)において、グルコースの酸ィ匕に伴って還元型 PMSが生成し、更に反応（2 )において還元型 PMSによる NTBの還元により生成した Diformazanを 570nmの 波長で測定する。
酵素活性 (ユニット）は以下の計算式によって算出される。
[数 2]
Δ O D/min( Δ ODtest- Δ ODblank) XVtXdf
酵素活性 =
(U/mL) 20. 1 X I . 0 XVs 尚、式中の Vtは総液量を、 Vsはサンプル量を、 20.1は diformazanの 0.5 ^ mol eあたりの吸光係数 (cm2/0.5 mole)を、 1.0は光路長（cm)を、 dfは希釈倍数を それぞれ表す。
[0037] 0.22%(w/v)トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOH緩衝液 pH6.5 2 .55mL、 1M D—グルコース溶液 0.09mL、 3mM PMS溶液 0.2mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. ImLを混合し、 37°Cで 5分間保温後、上記培養ろ液 0. ImLを 添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に 570nmに吸収を持つ Diformazan が生成される。 1分間あたりの 570nmにおける吸光度の増加を測定することにより、 F AD - GDH活性を測定した。
その結果、 Aspergillus oryzae BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2683 、 IAM2736, IAM2706、 NBRC30113由来の培養ろ液中に FAD— GDH活性が 検出された（表 1)。特に、 Aspergillus oryzae BB— 56及び NBRC30113の生産 性が優れていた
[表 1]
表 1 . FAD一 GDH生産菌のスクリーニング
菌名 活性
(u/mL)
Aspergilk JS oryzae BB— 56 1.97
Aspergilk JS oryzae IAM2063 0.1 1
Aspergilk JS oryzae IAM2628 0.87
Aspergilk JS oryzae IAM2683 0.41
Aspergilk JS oryzae IAM2736 0.20
Aspergilk JS oryzae IAM2706 0.75
Aspergilk JS oryzae NBRC301 1 3 2.12
[0038] 2. FAD— GDHの生産、及び酵素の精製
(2— 1)菌株の培養
Aspergillus oryzae BB— 56を培養して FAD— GDHを生産させた。酵母ェキ ス 0. 2% (w/v)、大豆ペプトン 0. 5% (w/v)、グルコース 2. 0% (w/v)、 KH PO
2 4
0. 1% (w/v)、 MgSO · 7Η O 0. 05% (w/v) (pH5. 7)の組成からなる前培養の
4 2
培地を調製した。この液体培地 50mLを 300mL三角フラスコに分注し、 121°C、 0. 12MPaで 20分間殺菌後、 Aspergillus oryzae BB— 56を接種し、 30。C、 200rp mで 3日間培養した。
FAD— GDHの生産は、以下の組成からなる本培養の培地で行った。グルコース 1 0. 0% (w/v)、 Meast PIG 2. 0% (w/v)、大豆ペプトン 4. 0% (w/v)、 KH PO
2 4
0. 3% (w/v)、 K HPO 0. 2% (w/v)、及び 4mM Hydroquinone (pH6. 0)
2 4
。この本培養の培地 20Lを 30Lジャ一'フアーメンター中で 121°C、 0. 12MPa、 200 rpmで 20分間殺菌後、 30°Cに冷却した。上記前培養の培養液 200mLを本培養の 培地に接種し、 30。C、 350rpm、 0. 05MPa、通気量 0. 75wmで 4日間培養するこ とにより、 FAD— GDHの生産を行った。
[0039] (2— 2) FAD— GDHの精製
上記のようにして得られた 30Lジャ一'フアーメンターの培養液 15. 0Lをシリカ # 60 OS (中央シリカ株式会社)を用いた珪藻土ろ過により培養液中の菌体及びその他の 固形成分を除去した。該操作によって得られた清澄液 16. 4Lを限外ろ過膜 (ACP — 3013、 13, 000カット、旭化成株式会社、以下同様)で 3. 0Lに脱塩 '濃縮した。 該濃縮液を 90%飽和硫安で塩析処理し、遠心上清を限外ろ過膜により脱塩（10mm ol/L Mcllvaineバッファー pH5. 5) ·濃縮を行い、 pH5. 5、電導度 1. lOmS/cm に調整した。該脱塩'濃縮液を 10mmol/L Mcllvaineバッファー pH5. 5で平衡化し た CM— Sepharose Fast Flow 刀フム谷積 1, 000mL、 Amersham Bioscien ces)にアプライし、 FAD— GDHをカラムに吸着させた。 10mmol/L Mcllvaineバッ ファー pH5. 5でカラムを洗浄後、 0. lmol/L NaClを含む 10mmol/L Mcllvaine バッファー pH5. 5で FAD— GDHを溶出させ、 FAD— GDH活性画分を回収した。 回収した活性画分を限外ろ過膜で濃縮し、該濃縮液を 2. 5mol/L硫酸アンモ-ゥム を含む 10mmol/L K HPO—NaOHバッファー pH6. 5で平衡化した Octvl— Sep
2 4
harose (カラム容積 200mL)にアプライし、 FAD— GDHをカラムに吸着させた。 2. 5mol/L硫酸アンモ-ゥムを含む 10mmol/L K HPO—NaOHバッファー pH6. 5で
2 4
カラムを洗浄後、同ノ ッファー中の硫酸アンモ-ゥムの濃度を段階的に 2. 0、 1. 5、 1. 0、 0. 5mol/Lに変更することにより、 FAD— GDHを溶出させた。 FAD— GDHの 活性画分を回収し、限外ろ過膜で脱塩（20mmol/L K HPO—NaOHバッファー p
2 4
H6. 5) '濃縮した。該脱塩'濃縮液を 20mmol/L KH PO -NaOH pH6. 5バッ
2 4
ファーで平衡化した DEAE— Sepharose CL— 6B (カラム容積 50mL、 Amersha m Biosciences)にアプライし、 20mmol/L KH PO -NaOH pH6. 5バッファー
2 4
により FAD— GDHを溶出させた。この画分を限外ろ過膜により脱塩（lOmmol/L K H PO -NaOH pH6. 5) '濃縮することにより、 FAD— GDHの精製酵素標品を
2 4
得た。表 2に示すように、精製酵素の収率は、珪藻土ろ液に対して 14%の収率であり 、比活性は約 41, 000倍に上昇した。
[表 2]
Figure imgf000024_0001
[0040] 3.分子量の測定
(3- 1)ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)によ る FAD— GDHの分子量の測定
Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの分子量を SDS— PA GEにより測定した。ゲルは Homogeneously. 5 (GE Healthcare Bio— Scienc es)、分子量マーカーは Protein Molecular Markers 14. 4— 97kDa (GE H ealthcare Bio— Sciences)を使用し、 PhastSystem (GE Healthcare Biosci ences)により行った。 PhastGel Blue R (クマシ一 R350染色）でゲル上の蛋白質 のバンドを染色し、蛋白質を検出した。その結果、分子量 lOOkDaの付近に単一バ ンドとして検出された (図 1)。
[0041] (3- 2)ゲルろ過クロマトグラフィーによる FAD— GDHの分子量の測定
Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製？八0— 0011の分子量を11?1^ (1^ - 10 AD VP、株式会社島津製作所）によるゲルろ過クロマトグラフィーにより測定 した。 0. 3M NaClを含んだ 50mMリン酸バッファー pH6. 9で平衡化した TSK— g el G3000SW(7. 5mml. D. X 30cm、東ソ一株式会社）に精製 FAD— GDH溶 液 25 μ Lをアプライし、カラム温度 25°C、流速 0. 7mL/minで同バッファ一により溶 出させ、 280nmの吸光度を測定した。分子量マーカー（MW— Marker proteins, オリエンタル酵母工業株式会社）により検量線を作成した結果、精製 FAD— GDHは 分子量が約 400, 000の蛋白であることが示された（図 2)。
[0042] Aspergillus oryzae BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2683, IAM273 6、 IAM2706、 NBRC30113の各菌株が生産する FAD— GDHの分子量を比較し た。 0. 1M KH PO—NaOHバッファー pH6. 5で平衡化した Sephadex G— 10 0 (直径 2. 2cm X 高さ 105cm、カラム容積 360mLゝ GE Healthcare Bio— Sc iences)に Aspergillus oryzae BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2683、 I AM2736、 IAM2706, NBRC30113の培養ろ液3mLをァプラィし、 FAD— GDH をカラムにチャージさせた。チャージした FAD— GDHを上記バッファーで溶出し、溶 出画分を回収し、各画分の FAD— GDH活性を上記 1.の方法で測定した。分子量 マーカーにより検量線を作成した結果、何れの培養ろ液も分子量約 400, 000の位 置で FAD— GDH活性が検出された（図 3)。このことから、 Aspergillus oryzae B B— 56、 IAM2603、 IAM2628, IAM2683、 IAM2736, IAM2706, NBRC30 113由来の FAD— GDHは、共通して分子量 400, 000の蛋白質であることが示さ れた。
[0043] 4.吸収スペクトル
A. oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHを 10mMリン酸バッファー pH6. 5 で希釈し、 400— 800nmにおける吸収スペクトルを吸光度計 (株式会社島津製作所 )によりスキャンした。その結果、フラビン酵素に特有の 460nm付近に極大吸収があ ることが示されたことから、この酵素は、フラビン結合蛋白質であることが確認された（ 図 4)。
[0044] 5. FAD— GDHの至適 ρΗ·温度、及び ρΗ·温度安定性
(5— 1)至適 ρΗの検討
0. 22% (w/v)トリトン X— 100を含む lOOmM Mcllvaineバッファー（pH4. 5、 pH 5. 0、 pH6. 0、 pH7. 0、又は pH8. 0に調整） 2. 55mL、 1M D—グルコース溶液 0. lmL、 3mM PMS溶液 0. 2mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. ImLを混合し、 3 7°Cで 5分間保温後、 Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDH溶 液 0. ImLを添カ卩し、反応を開始した。酵素反応によって生成する Diformazanを 57 Onmの吸光度で測定し、 1分間当たりの Diformazanの生成量を測定することにより 酵素活性を測定した。 Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHの 至適 pHは、 7. 0であった（図 5)。
[0045] (5— 2)至適温度の検討
0. 220/0 (w/v)トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5 2. 55mL、 1M D—グルコース溶液 0. lmL、 3mM PMS溶液 0. 2mL、及び 6. 6 mM NTB溶液 0. ImLを混合し、 30、 37、 45、 55、 60又は 65。Cで 5分間保温後、 Aspergillus oryzae 88— 56由来の精製 八0— 0011溶液0. ImLを添カ卩し、 3 0、 37、 45、 50、 55、 60又は 65°Cで反応を開始した。酵素反応によって生成する Di formazanを 570nmの吸光度で測定し、 1分間当たりの Diformazanの生成量を測 定することにより酵素活性を測定した。 Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 F AD— GDHの至適温度は約 60°Cであった（図 6)。
[0046] (5— 3) pH安定性の検討
精製 FAD— GDH溶液を 0. 1M酢酸バッファー（pH3、 pH4)、 0. 1M Mcllvain eノ ッファー（pH4. 5、 pH5. 0、 pH6. 0、 pH7. 0、 pH8. 0)、又は 0. 1M Na CO
2
-NaHCOバッファー（pH9. 5)で希釈し（50U/mL)、各 pHにおいて 37°Cで 30
3 3
分間処理した。各処理液を 0. 2M KH PO—NaOHバッファー pH6. 5で適宜希
2 4
釈し、上記 1.の方法で FAD— GDH活性を測定した。コントロールとして 0. 1M K H PO—NaOHバッファー pH6. 5で希釈した氷冷保存した精製 FAD— GDHの活
2 4
性も測定した。その結果、 FAD— GDHは、少なくとも pH3. 0— 7. 0の範囲で 80% 以上の活性を維持しており、 pH3. 0〜7. 0の範囲で安定であることが示された（図 7
) o
[0047] (5— 4)温度安定性の検討
精製 FAD— GDHを ImM塩化カルシウム、 0. 1% (w/v)トリトン X— 100、及び 0. l% (w/v)ゥシ血清アルブミンを含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5で lUZmLに希釈し、各指定温度（5、 30、 40、 50、又は 60°C)で 20分間処理した。 氷中で冷却後、各処理液を ImM塩化カルシウム、 0. 1% (w/v)トリトン X— 100、 0 . 1% (w/v)ゥシ血清アルブミンを含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5 で希釈し、上記 1.に記載の方法で FAD— GDH活性を測定した。コントロールとして 、熱処理していない酵素の FAD— GDHも測定した。その結果、 FAD— GDHは 40 °C以下でほぼ 100%の活性を維持して 、たことから、 40°C以下で安定であることが 示された（図 8)。
[0048] 6.等電点の測定 Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDH溶液 3mLをダイァライシ スメンプレン 36 (和光純薬工業株式会社）に入れ、精製水に浸漬し、 4°Cで一晩、透 析を行った。この透析サンプルをグリセロール密度勾配電気泳動に供した。カラム容 直 l lOmL、両性担体 (Pharmalyte '3— 10 for IEF (Amersham Biosciences
AB)、平均終濃度 1%)、を使用し、 5°Cで 400Vの定電圧で 48時間、通電を行つ た。通電後、約 2mL/minの流速でサンプルの回収を行った（1フラクションを 1. 5m とした）。各フラクションの pH及び FAD— GDH活性を測定した結果、 Aspergillus oryzae BB— 56由来の FAD— GDHの piは、 6. 4であった（図 9)。
[0049] 7.基質特異性
(7— 1)基質特異性の検討 1 (精製 FAD— GDHの基質特異性）
0. 220/0 (w/v)トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5 2. 55mL、 1M 基質（D—グルコース、マルトース、ガラクトース、キシロース、マルト トリオース、マルトへキサオース、又はマルトペンタオース）溶液 0. 09mL、 3mM P MS溶液 0. 2mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. ImLを混合し、 37°Cで 5分間保温後 、精製 FAD— GDH溶液 0. ImLを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成 する Diformazanを 570nmの吸光度で測定し、 1分間当たりの Diformazanの生成 量を測定することにより酵素活性を測定した。 D—グルコースに対する反応速度を 10 0%とした各基質に対する相対活性を算出した (表 3)。
[表 3]
性
Figure imgf000027_0001
マル! ス 0.582
ガラクト一ス 0.349
キシ口一ス 22.7
マルトトリオ一ス 0.239
マルトへキサォ一ス 0.479
マルトペンタォ一ス 4.55
[0050] (7- 2)基質特異性の検討 2 (各菌株が生産する FAD— GDHの基質特異性の比較 ) (7— 2— 1)酵素サンプルの調製
Aspergillus oryzae BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2683、 IAM2736 、 IAM2706,又は NBRC30113由来の各培養ろ液 lOmLをダイァライシスメンブレ ン 36に入れ、 10mM KH PO— NaOH中、 4°Cでー晚、透析を行った。
2 4
[0051] (7— 2— 2)相対活性の測定
2mM塩化カルシウムを含む 20mM MOPSバッファー pH7. 0 2. 5mL、 0. 4M 基質溶液（D—グルコース、 2—デォキシグルコース、キシロース、フルクトース、マン ノース、又はマルトース） 0. 3mLを混合し、 25°Cで 5分間保温後、 20mM PMS溶 液 0. 05mL、 4mM DCIP (2, 6— dichloroindophenol)溶液 0. 05mL、各透析 サンプル 0. ImLを添カ卩して酵素反応を開始した。本還元反応による DCIP減少を 6 OOnmの吸光度で測定することによって、 FAD— GDH活性を測定した。 D—ダルコ 一スを基質としたときの活性を 100%とし、各基質に対する相対活性を算出した (表 4 )。この結果より、 Aspergillus oryzae BB— 56、 IAM2603、 IAM2628、 IAM2 683、 IAM2736, IAM2706,又は NBRC30113由来の FAD— GDHの基質特異 性は同じであることが示された。
[表 4] 表 4.各基質に対する相対活性の比較
相対活性 (％)
基質 BB-56 IAM2603 IA 2628 IAM2683 IA 2736 IAM2706 NBRC301
1 3 グルコース 100 100 100 100 100 100 100
2-デォキジグルコース 35.1 29.0 34.2 32.7 31.3 33.9 35.3 キシロース 17.6 16.1 16.4 17.3 14.6 16.1 17.6 フルク! ス 0 0 1.40 0 0 0 0 マンノース 1.40 0 2.70 1.90 2.10 0 1.20 マル! ス 0 0 0 0 0 0 0
[0052] 8.ミカエリス-メンテン (Michaelis- Menten、 Km)定数の測定
0. 220/0 (w/v)トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5 2. 55mL、 (6. 1— 610mM D—グルコース溶液 0. lmL、 3mM PMS溶液 0. 2 mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. ImLを混合し、 37°Cで 5分間保温後、精製 FAD — GDH溶液 0. ImLを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成する Dif or mazanを 570nmの吸光度で測定し、 1分間当たりの Diformazanの生成量を測定 することにより酵素反応速度を測定した。 Lineweaver-burk plotにより Km値を算 出（図 10)した結果、精製 FAD— GDHの D—グルコースに対する Km値は 8. 2mM であった。
[0053] 9.糖含量
フエノール硫酸法で酵素蛋白あたりの糖含量を測定した。精製 FAD—GDH溶液 1 . OmL、 5% (w/v)フエノール溶液 1. OmL、 98%硫酸 5. OmLを混合し、室温で 20 分間放置した。流水で冷却後、 490nmの吸光度を測定した。 0— 0. 03mg/mLの D -グルコース標準液で検量線を作成（図 11)し、酵素 lmgあたりの糖含量を算出した 。その結果、 FAD— GDHの糖含量は、酵素 lmg当たり 0. 43mg (43%)であった。
[0054] 10.グルコースォキシダーゼ（GO)との比較
(10— 1) FAD— GDH活性の測定
0. 220/0 (w/v)トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOHバッファー pH6. 5
2. 55mL、 1M D—グルコース溶液 0. lmL、 3mM PMS溶液 0. 2mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. lmLを混合し、 37°Cで 5分間保温後、適宜希釈した酵素溶液（ Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDH、又は GO (天野ェンザィ ム株式会社)） 0. lmLを添加し、 37°Cで反応を開始した。酵素反応によって生成す る Diformazanを 570nmの吸光度で測定し、 1分間当たりの Diformazanの生成量 を測定することによって酵素活性を測定した。
[0055] (10— 2) GO活性の測定
グルコースォキシダーゼ活性は、以下の反応原理で測定される。
[数 3] 反応 1 : D—グルコース + 0 2 → D—ダルコノー όーラク トン + Η 2 0 2
反応 2 : Η 2 0 2 + 4ーァミノアンチピリン + フエノール → キノンィミン染料 + 4 Η 2 0 反応 1において GOによって生成した H Oは、反応 2においてペルォキシダーゼに
2 2
よるキノンィミン染料の生成反応に使用される。キノンィミン染料を 500nmの吸光度 で測定することにより、 GO活性を測定した。 GO活性 1ユニットは、 37°Cにおけるこの 反応条件下において、 1分間に 1 μ moleの D—グルコースを酸ィ匕する酵素量と定義 する。以下に実際の測定方法を示す。
フエノーノレ溶液（0. 152%のフエノーノレと 0. 152%のトリトン X— 100を含む 0. 1M リン酸ノ ッファー pH7. 0) 2. OmL、 0. 555mol/L D—グルコース溶液 0. 5mL、 2 5U/mLペルォキシダーゼ（天野ェンザィム株式会社)溶液 0. 5mL、及び 4mg/mL
4—ァミノアンチピリン溶液 0. lmLを混合し、 37°Cで 5分間保温後、適宜希釈した 酵素溶液 (Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDH、又は GO) 0. lmLを添加し、 37°Cで反応を開始した。反応開始 2分後及び 5分後の 500nmにお ける吸光度を測定した。また、酵素ブランクとして、酵素溶液の代わりに 0. 1Mリン酸 バッファー pH7. 0を添加し、同様に吸光度を測定した。以下の計算式で GO活性を 算出し 7こ。
[数 4]
( A 5 - A 2 ) 一 (A b 5 - A b 2 )
G O活性 g ) =
3 1 D m
X 3 . 2 X
2 . 8 8 X 1 / 2 0 . 1 上記式中の「3」は反応時間を、「12. 88」はキノンィミン染料の分子吸光定数 (mM )を、「1/2」は 2moleの H O力 lmoleのキノンィミン染料が生成することに基づく
2 2
係数を、「3. 2」は反応液の最終液量を、「0. 1」はサンプル量 (mL)を、「Dm」は希 釈倍数をそれぞれ表す。
この結果から、 Aspergillus oryzae BB— 56由来の精製 FAD— GDHは、専ら GDH活性を有し、 GO活性を実質的に有さないことが示された。一方、 GOは主とし て GO活性を有する力 GDH活性も併せ持つことが判明した (表 5)。即ち、 Aspergil lus oryzae BB— 56由来の FAD— GDHは、電子伝達系の物質を用いて D—グ ルコースを測定する際、 GOと比べて反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示 された。
[表 5] 表 5. FAD— GDHと GOの比較
GDH活性 GO活性
Aspergillus oryzae BB— 56 FAD— GDH 1 1 9U/mL 0. 0025UZmし
GO 8. 86U/mL 67. 8U mし
[0057] 11.グルコース濃度の測定
本願発明に係る Aspergillus oryzae由来の FAD— GDHの利用例を以下に示 す。 0. 22%トリトン X— 100を含む 50mM PIPES— NaOHノ ッファー pH6. 5 2. 55mL、 D—グルコース溶液（0、 100、 200、 400、 600、 800、 1000mg/dL) 0. 10 mL、 3mM PMS溶液 0. 20mL、及び 6. 6mM NTB溶液 0. lOmLを混合し、 37 °Cで 5分間放置後、 Aspergillus oryzae BB— 56由来の FAD— GDH酵素液（0 . 3U/mL) 0. 10mLを添カ卩し、反応を開始した。酵素反応によって生成する Dif or mazanを 570nmの吸光度で測定し、 3分間当たりの 570nmにおける吸光度の増加 とグルコース濃度の関係を図 12に示した。 Aspergillus oryzae由来の FAD— GD Hは、 800mg/dL以下のグルコース濃度であれば、試料検体中のグルコース濃度を 精度よく測定できることが示された。
[0058] 12.阻害試験
以下の方法で対照群及び試験群（1, 10—フエナント口リン添加群)の酵素活性を 測定して両者を比較することにより、精製 FAD— GDHに対する 1, 10—フエナント口 リンの阻害効果を調べた。
(対照群の酵素活性の測定 (表 6を参照) )
[表 6]
対照群の測定法
0. 1M KH2P04-NaOH ρΗ7· 0 1. 0mL
1M グルコース溶液 w) 1. 0mL
3mM DCI P溶液 0. ImL
3mM 1-メ卜キシ PMS溶液 0. 2mL
精製水 0. 65mL
37°C, 5m i n予熱
サンプル 0. 05mL
37°C, 600nm (A1-A3)
*1)希釈バッファー： 0.1M KH PO -NaOH pH7.0
2 4
[0059] まず、 O. 1Mのリン酸カリウム緩衝液（pH7. O) 1. OmL、 1Mの D—グルコース溶液 1. OmL、 3mMのDCIP (2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール） O. lmL、 3mM の 1ーメトキシ PMS (5—メチルフエナジゥムメチルサルフェイト）溶液 O. 2mL、精製 水 0. 65mLを石英セルに入れ、 37°Cで 5分間保温した。続いて、酵素溶液 0. 05m Lを添カ卩し、 DCIPの 600nmにおける吸光度変化（AABSZmin)を測定し、次式に よって酵素活性を算出した。
[数 5]
-AABS 3.0
酵素活性（unit/ml) = X X 酵素の希釈率
16.3 0.05
[0060] (試験群の酵素活性の測定 (表 7を参照) )
[表 7] 試験群 （阻害剤添加群） の測定法
0.1M KH2P04-NaOH pH7.0 1.0mL
1M グルコース溶液 I.OmL
3mM DCIP溶液 0.1mL
3mM トメトキシ PMS溶液 0.2mL
精製水 0.35mL
各濃度 1.10~フ1ナント卩リン溶液 0.3mL
37°C, 5m in予熱
サンプル 0.05mL
37°C, 600nm (A1-A3)
上記の測定法において、それぞれ終濃度が lmM、 5mM、 10mM、 25mM、及び 50mMとなるように 1, 10—フエナント口リンをカ卩えた場合の酵素活性を求めた。 (試験結果）
表 8に示すように、精製 FAD— GDHに対する 1, 10—フエナント口リンの阻害効果 は低く、 ImMの 1, 10—フエナント口リンでは 2%程度の阻害効果が認められるに過 ぎなかった。
[表 8]
Figure imgf000033_0001
13. Aspergillus oryzae BB— 56株の同定 (1)方法
(1 1)菌株
Aspergillus oryzae BB— 56
(1 2)培地組成
Klich, M. A. (2002). Iaentincation of し ommon Aspergillus species. Utrecht： Centr aalbureau voor Schimmelcultures, 116 pp.の報告を参考にし、以下の培地を調製した
CYA培地： K HPO lg, Czapek Concentrate 10mL, Yeast extract (Difco) 5g, Sucr
2 4
ose 30g,寒天（和光） 15g,精製水 lOOOmL
CZ培地： K HPO lg, Czapek Concentrate lOmL, Sucrose 30g,寒天（和光） 17.5g
2 4
,精製水 lOOOmL
CY20S培地： K HPO lg, Czapek Concentrate lOmL, Yeast extract. (Difco) 5g, Su
2 4
crose 200g,寒天（和光） 15g,精製水 lOOOmL
MEA培地： Malt extract (Difco) 20g, Glucose 20g, Bacto- peptone (Difco) lg, Agar (和光） 15g,精製水 lOOOmL
PDA培地： Potato dextrose agar (栄研）を用いた。
Czapek Concentrate： NaNO 30g, KC1 5g, MgSO - 7H O 5g, FeSO - 7H O O.lg, Z
3 4 2 4 2 nSO - 7H O O.lg, CuSO - 5H O 0.05g,精製水 lOOmL
4 2 4 2
(1 3)表現形質
生育度は、 25°C若しくは 37°Cで 7日間培養し、コロニーの直径を測定した。
生育状態は、 CYA培地、 CZ培地、 CY20S培地、 MEA培地で観察した (25°C、 7日間 )。
形態観察は、 CYA培地、 25°C培養で行った (6〜21日間培養)。
走査型電顕による分生子表面の観察は、 CYA培地で 25°C、 15日培養し、オスミウム 酸蒸気固定による処理を行い、観察した。
コロニーの色調は、日本園芸植物標準色票 (財団法人日本色彩研究所発行）に つ 7こ。
(2)結果 (2 - 1)生育度 (コロニーの直径）
各種培地における生育度（7日培養）を以下の表に示す。
[表 9] 各種培地における生育度 (7ョ培養)
Figure imgf000035_0001
[0064] (2— 2)生育状態
各種培地における生育状態 (25°C、 7日培養）を以下の表に示す。尚、色は、日本 園芸植物標準色票 (財団法人 日本色彩研究所発行）に従った (括弧内の数字は色 票番号)。
[表 10] 表 1 0 . 各種培地における生育状態 （25°C、 7日培養)
Figure imgf000035_0002
[0065] (2— 3)形態
Raper, K. B. & Fennell, D. I. (1965). The genus Aspergillus. Williams & Wilkins C o., Baltimore, 686 pp.、 Kozakiewicz, Z. (1989). Aspergillus species on stored produc ts. Mycological Papers. No.161: 1— 188.、 Klich, M. A. (2002). Identification of Comm on Aspergillus species. Utrecht ： Centraalbureau voor Schimmelcultures , 116 pp.、 S amson, R. A. Hoekstra, E. S. Frisvad, J. C. & Filtenborg, O. (2002). Introduction to food- and airborne lungi, 6th edn, pp.64— 97. Utrecht ： Centraalbureau voor Schim melcultures, 389 pp.を参考にすると、 Aspergillus oryzae BB— 56は、コロニーの 色が濃緑黄色または暗緑黄色であること（表 7)、生育度が CYA培地 (25°C、 7日培養 )で 59〜62mm、 MEA培地（25°C、 7日培養）で 52〜64mmであること（表 6)、分生子頭 が放射状とゆるいカラム状であること、分生子柄が頂のうの下でくびれないこと、単列 と 2列のァスペルジラが混在すること、頂のうが亜球形な 、しフラスコ形でその直径が 10〜42 μ mであること、分生子が亜球形なぃし球形でその大きさカ .6〜8.8 5.2〜8 .8 μ m、表面が滑面な!/、しわずかに粗面であること（表 8)から Aspergillus oryzae であることが確認された。
[表 11] 表 1 1 . CYA培地での形態
Figure imgf000036_0001
14. Aspergillus oryzae BB— 56由来 FAD— GDHの同定
(1)アミノ酸配列の解析
ァスペルギルス ·ォリゼ (Aspergillus oryzae) BB - 56を培養し、得られた精製酵 素を 6.に示した方法で等電点分画した。得られた精製酵素をゲル PAG Mini DAIIC HI 7.5 (第一化学薬品株式会社)を用いた SDS-PAGEに供した。転写緩衝液 1 (0.3M Tris (pH10.4)、 20% methanol)、転写緩衝液 2 (30mM Tris (pH10.4)、 20% methanol)、 転写緩衝液 3 (40mM 6-aminohexanoic acid(pH7.6)、 20% methanol)を転写緩衝液とし て用い、泳動後のゲルを PVDF膜に転写した。転写操作は転写緩衝液 1を陽極側、 転写緩衝液 2をメンブレンを含む中央部、転写緩衝液 3を陰極側で用い、セミドライ 転写装置を用いて定電流 0.8mAZPVDF膜 cm2、 90minの条件下で行った。転写後に CBB (Coomassie Brilliant Blue R-250)染色を行い当該酵素にあたるバンドを切り出 し N末端アミノ酸配列解析用サンプルとした。同様に泳動後のゲルを CBB染色し当該 酵素にあたるバンドを切り出し、そのまま内部アミノ酸配列解析用サンプルとした。解 祈の結果、 N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列が明ら力となった。
[0067] (2) N末端アミノ酸配列〖こよる相同性検索
特開 2005— 176602により公開されたァスペルギルス'ォリゼ RIB40の遺伝子情 報のうち全 CDS配列を特開 2005— 176602の出願人より入手し、明らかになった N 末端アミノ酸配列による相同性検索をデータベースソフトウェア Kiroku Ver.3 (株式 会社ワールドフュージョン）を用いて実施した。その結果、 Glucose Oxidase Precurs orとホモロジ一のあるアミノ酸配列（特開 2005— 176602の配列表における配列番 号 20494)との間に高い相同性が認められた。同配列には内部アミノ酸配列解析に より明らかになったアミノ酸配列と一致する領域も存在していた。これらの事実より、同 配列 (配列番号 1)が当該酵素のアミノ酸配列に対応することが明らかになった。
[0068] (3)ァスペルギルス 'ォリゼ BB— 56からのゲノム抽出
ァスペルギルス'ォリゼ BB— 56を YPD培地（Yeast Extract 1%、 Peptone 2%、 Glue ose 2%) 100mlを入れた坂口フラスコを用いて 30°C—晚培養した後、ブフナー漏斗及 びヌッチ 吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。 -80°Cで凍結後、凍結乾燥 して得られた重量約 0.3gの菌体を薬匙 1杯の海砂とともに乳鉢、乳棒を用いて破砕し 、 Extraction buffer (1% hexadecyltnmetnyiammonium bromide ^ 0.7M Naし 1、 50mM Tri s- HCl(pH8.0)、 lOmM EDTA、 1%メルカプトエタノール） 12mlに懸濁した。室温で 30分 回転撹拌を続けた後、等量のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール（25:24: 1 )溶液を加えて攪拌、遠心分離 (l,500g、 5分、室温)して上清を得た。得られた上清 に等量のクロ口ホルム：イソアミルアルコール（24:1)溶液を加えて攪拌し、その後遠心 分離（l,500g、 5分、室温)を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノー ルを穏や力にカ卩えた。この処理によって析出した染色体 DNAを遠心分離 (20,000g、 1 0分、 4°C)して得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。このようにして 得られた染色体 DNAを再び TE 4mlに溶解し、 10mg/ml RNase A (シグマアルドリッチ ジャパン株式会社) 200 1をカ卩えた後、 37°C、 30分間インキュベートした。次いで、 20 mg/ml Proteinase K,recombinant,PCR Grade (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会社 )溶液 40 1を加えて 37°C、 30分間インキュベートした後、等量のフエノール：クロロホ ルム:イソアミルアルコール (25 :24:1)溶液をカ卩えた。攪拌後、遠心分離（l,500g、 5分 、室温)し、上清を得た。この洗浄操作を 2回繰り返した後、得られた上清に等量のク ロロホルム：イソアミルアルコール (24: 1)溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（1 ,50 0g、 5分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その 1/10容量の 3M NaO Ac(pH4.8)と 2倍容量のエタノールを加えて- 80°Cで冷却することにより染色体 DNAを 析出させた。析出した染色体 DNAを遠心処理 (20,000g、 20分、 4°C)により回収した。 回収された染色体 DNAを 70%エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に 400 1 の TE溶液に溶解して濃度約 lmg/mlの染色体 DNA溶液を得た。
[0069] (4)合成プライマーの設計
配列番号 1のアミノ酸配列（特開 2005— 176602の配列表において配列番号 204 94で示される配列）をコードする全鎖長 3226bpの RIB40株由来遺伝子配列（配列番 号 2)の 5'、 3'両末端の配列に相当する合成プライマー FG-F、 FG- R (配列番号 3、 4 )を合成した。
[0070] (5) PCR法による FAD— GDH遺伝子の増幅
(3)で調製した染色体 DNAを铸型とした PCR反応を実施した。反応は TAKARA LA -Taq™ (タカラバイオ社)を用い、反応液組成は添付の定法に従った。プライマー (F G- F、 FG-R)をそれぞれ 0.4 M、铸型ゲノムを 10ng/ 1の濃度になるように加え PCR 反応を実施した。反応サイクルは次の通りとした。即ち、 94°C2分の反応後、 94°C30秒 の反応、 60°C30秒の反応、 72°C10分の反応力もなるサイクルを 35回繰り返し、最後 に 72°C10分の反応を行った。反応終了後、サンプルを 4°Cで保存した。
[0071] (6) FAD— GDH遺伝子の塩基配列解析
PCR反応液をァガロース電気泳動に供して増幅断片とプライマーを分離し、 GENE CLEAN™ ΠΙを (BIO 101社)用いてァガロースゲルカゝら抽出した。抽出した増幅断片 はベクター PUC19 (タカラバイオ社) Smalサイトにサブクローンした。その後サブクロー ンしたプラスミド PFG2の当該酵素遺伝子に相当する領域の塩基配列解析を実施した 。シークェンス反応は BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバ ィォシステムズジャパン株式会社)を用い、製品の使用説明書に従ってシークェンス 反応を行った。解析には ABI PRISM 310シークェンサ一（アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社)を使用した。当該酵素遺伝子の塩基配列解析を実施するために 合成プライマー FG-1 (配列番号 5)、 FG-2 (配列番号 6)、 FG-3 (配列番号 7)、 FG-4 (配列番号 8)、 FG-5 (配列番号 9)、 FG-6 (配列番号 10)、 FG-7 (配列番号 11)、 FG -8 (配列番号 12)、 FG-9 (配列番号 13)、 FG-10 (配列番号 14)、 FG-11 (配列番号 1 5)、 FG-12 (配列番号 16)、 M13-M5 (配列番号 17)、 M13-RV2 (配列番号 18)を合 成した。塩基配列解析の結果、配列番号 19に示す全鎖長 3241bpのァスペルギルス -ォリゼ BB— 56由来当該酵素遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列より 予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号 20に示した。
産業上の利用可能性
[0072] 本発明の FAD— GDHは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定する ことを可能にする。従って本発明の FAD— GDHは血糖値の測定や食品（調味料や 飲料など）中のグルコース濃度の測定などに好適と!/、える。
[0073] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲 [1] 以下の性状を備えるフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素
(1)作用： 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸ィ匕してダルコノー δ—ラタ トンを生成する反応を触媒する、
(2)分子量： SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約 100kDa、ゲルろ 過クロマトグラフィーによる分子量が約 400kDa、
(3)基質特異性： マルトース、 D-フルクトース、 D-マンノース及び D-ガラクトースに 対する反応性が低い。
[2] D-ダルコースに対する反応性を 100%としたときのマルトースに対する反応性が 5
%以下である、請求項 1に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース 脱水素酵素。
[3] D-グルコースに対する反応性を 100%としたときの D-ガラクトースに対する反応性 力 ％以下である、請求項 1又は 2に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グ ルコース脱水素酵素。
[4] D-グルコースに対する反応性を 100%としたときの D-フルクトース及び D-マンノー スに対する反応性がいずれも 5%以下である、請求項 1〜3のいずれか一項に記載 のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
[5] 以下の性状を更に備える、請求項 1〜4のいずれか一項に記載のフラビンアデニン ジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(4)至適 pH : 7付近、
(5)至適温度： 60°C付近、
(6) pH安定性： pH3. 0〜7. 0の範囲で安定、
(7)温度安定性： 40°C以下で安定。
[6] 以下の性状を更に備える、請求項 1〜5のいずれか一項に記載のフラビンアデニン ジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素、
(8) Km値： D-グルコースにつ!/、ての Km値が約 8mM。
[7] Aspergillus oryzaeに由来する酵素である、請求項 1〜6のいずれか一項に記載 のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
[8] 配列番号 20で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を 有することを特徴とする、請求項 1〜7のいずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌ クレオチド結合型グルコース脱水素酵素。
[9] フラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の生産能を有する、 受託番号が NITE BP— 236の Aspergillus oryzae BB— 56。
[10] 以下の (A)〜（C)力もなる群より選択される 、ずれかの DNAからなるフラビンアデ ニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子：
(A)配列番号 20で示されるアミノ酸配列をコードする DNA；
(B)配列番号 19で示される塩基配列力 なる DNA；
(C)配列番号 19で示される塩基配列と相同な塩基配列を有し、且つフラビンアデ ニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素活性をもつタンパク質をコードする DNA0
[11] 請求項 10に記載の遺伝子を含有するベクター。
[12] 請求項 10に記載の遺伝子が導入されている形質転換体。
[13] 以下のステップ（1)及び（2)、又はステップ (i)及び (ii)を含んでなる、フラビンアデ ニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法：
(1)請求項 7に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵 素の生産能を有する Aspergillus oryzaeを培養するステップ；
(2)培養後の培養液及び Z又は菌体より、フラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型 グルコース脱水素酵素を回収するステップ；
(i)請求項 12に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生さ れる条件下で培養するステップ；
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
[14] 請求項 1〜8の 、ずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型ダル コース脱水素酵素を用 、て試料中のダルコースを測定することを特徴とする、ダルコ ース測定法。
[15] 請求項 1〜8の 、ずれか一項に記載のフラビンアデ-ンジヌクレオチド結合型ダル コース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコース測定用試薬。
[16] 請求項 15に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
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