WO2007116710A1 - グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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Abstract

　本発明は、耐熱性及び基質特異性に優れ、また溶存酸素の影響を受けることのないグルコースデヒドロゲナーゼを提供する。具体的には、本発明は、真核生物由来であって、液状で５５°C１５分加熱処理後も加熱処理前と比して９０％以上の活性を保持していることを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼに関する。 　本発明は、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを提供する。 　本発明は、基質特異性の優れた糸状菌由来ＦＡＤ－ＧＤＨを組換え体にて高発現生産する方法、および該方法にて得られたＦＡＤ－ＧＤＨタンパク質、および該タンパク質を用いたグルコース測定試薬を提供する。 　本発明は、可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物の安定性を向上する方法に関するものである。可溶性ＧＤＨとしては、糸状菌由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨが好ましく、特に、Ａ．オリゼ由来のＦＡＤ－ＧＤＨ、あるいは、Ａ．テレウス由来のＦＡＤ－ＧＤＨにおいて、最も効果が認められている。

Description

明 細 書
グノレコースデヒドロゲナーゼ
技術分野
[0001] 本発明は、グルコース測定試薬及びグルコースセンサに利用可能な新規ダルコ一 スデヒドロゲナーゼ（以下、グルコースデヒドロゲナーゼを「GDH」とも示す）に関する
[0002] 本発明は、ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae)由来のグルコースデヒド ロゲナーゼをコードする遺伝子、ならびに、該グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子 組み換えにより製造する方法に関する。
[0003] 本発明は、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを組換え体にて高発現させる 方法に関する。
[0004] 本発明は、補酵素を必要とする可溶性グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の 安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関するものである。さらに詳 しくは、本発明は、フラビンィ匕合物などを補酵素とする可溶性グルコースデヒドロゲナ ーゼを含む組成物の安定性を向上する方法および該方法を用いた組成物に関する
背景技術
[0005] 血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすため に重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素 が利用されて 、る。そのような酵素の例としては例えばグルコースォキシダーゼ（EC 1. 1. 3. 4)が挙げられる。グルコースォキシダーゼはグルコースに対する特異性が 高く、熱安定性に優れて 、ると 、う利点を有して 、ることから血糖センサ用酵素として 古くから利用されており、その最初の発表は実に 40年ほど前に遡る。グルコースォキ シダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化して D—ダルコノー δ —ラタトンに変換する過程で生じる電子カ ディエーターを介して電極に渡されること で測定がなされる力 グルコースォキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡し やすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。 [0006] このような問題を回避するために、例えば NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナ ーゼ（EC 1. 1. 1. 47)あるいはピロ口キノリンキノン（本書ではピロ口キノリンキノンを PQQとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ (EC 1. 1. 5. 2 (旧 EC1. 1 . 99. 17) )が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を 受けな 、点で優位である力 前者の NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ 本書では NAD (P)依存型グルコースデヒドロゲナーゼを NADGDHとも記載する。 ) は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要と 、う煩雑性がある。一方後者の PQQ依 存型グルコースデヒドロゲナーゼ (本書では PQQ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ を PQQGDHとも記載する。）は、基質特異性に乏しぐマルトースゃラタトースといつ たグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点 がある。
[0007] 非特許文献 1〜4にはァスペルギルス 'オリゼ由来のダルコ一スデヒドロゲナーゼに ついて報告されている力 グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子に関しては報告されて いない。また、非特許文献 1〜4には、遺伝子組み換えによりァスペルギルス 'ォリゼ 由来のグルコースデヒドロゲナーゼを製造することについての記載はない。
[0008] また、特許文献 1にはァスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナ ーゼが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けな Vヽ点で優位である。熱安定性につ!、ては 50°C 15分処理で 89%程度の活性残存率 であり安定性 (以下、耐熱性とも表記）についても優れているとされている。特許文献 2には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。しかし、センサーチップ作 製の工程において加熱処理を要する場合があることを考えれば決して十分な安定性 とはいえない。また、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD依存性ダルコ 一スデヒドロゲナーゼともいう。）の製造は、組換え DNA技術を用いても困難を極め ている。実際、特許文献 2において開示されている FAD依存性グルコースデヒドロゲ ナーゼの組換え大腸菌 K12株において 0. 09UZmlと、極めて低いレベルであった 。大腸菌 K12株は、組換え生産において最も汎用され、組換え操作が簡便で、培養 のし易さ、安全性の面などから工業的に多用されている宿主である。したがって、大 腸菌 K12株を宿主とした組換え体により、 FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼを 効率的に生産する方法が望まれていた。
[0009] 最近になって、ァスペルギルス 'ォリゼの全ゲノム配列が決定された。しかしながら、 当該配列のどの部分がグルコースデヒドロゲナーゼをコードして 、るかの情報はな ヽ 特許文献 l :WO 2004/058958
特許文献 2 : WO 2006/101239
非特許文献 l : Biochim Biophys Acta.1967 Jul 11;139(2):265- 76
非特許文献 2 : Biochim Biophys Acta.1967 Jul l l;139(2):277-93
非特許文献 3 : Biochim Biophys Acta.l46(2):317-27
非特許文献 4 : Biochim Biophys Acta.l46(2):328- 35
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の第 1の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の有する欠点を克 服し、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を提供することである。
[0011] 本発明の第 2の目的は、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を効率的に 製造する方法を提供することである。より具体的には、ァスペルギルス 'ォリゼ由来の グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定、取得、利用し、該グルコースデヒドロゲナ ーゼを大量に安定的に製造する方法を確立することにある。
[0012] 本発明の第 3の目的は、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を提供する ことである。より具体的には、基質特異性ばかりでなぐ生産コストの優れた糸状菌由 来のグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)を大量に取得し、利用することにある。
[0013] 本発明の第 4の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関す る欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な組 成物を提供することである。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、ぺ-シリウム属糸状 菌よりグルコースデヒドロゲナーゼを取得し、該グルコースデヒドロゲナーゼの特性が 公知の血糖測定用酵素と比し優れた特性を有していることを見出した。 [0015] 本発明者らは、上記目的を達成するために、 National Center for
Biotechnology Information (NCBI)のデータベースを利用し、ァスペルギルス 'ォリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、 大腸菌よりァスペルギルス'オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できるこ とを見出した。また、ゲノム情報力もアミノ酸配列を推定し、該アミノ酸配列の N末端 領域にシグナルペプチドと思われるアミノ酸配列が存在することを見出した。
[0016] 本発明によれば、ァスペルギルス 'ォリゼより単離したグルコースデヒドロゲナーゼ 遺伝子を利用することにより、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、よ り実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になる。
[0017] シグナルペプチドは、ペリプラズム空間への移行シグナルとなり、該空間のスペース 上、発現量に制限が生じる可能性が危惧されたので、該シグナルペプチドの機能を 欠失させる検討を行ったところ、 GDHの生産性が約 10倍向上して、生産コストを 1/ 10に抑えることが可能となった。
[0018] 前述のとおり、特許文献 1に記載の FADGDHの熱安定性は 50°C、 15分処理で 8 9%程度の活性残存率であると書かれて 、る。
[0019] しかし、これは、あくまでも野生株力 培養、精製して得られた酵素標品での結果で あり、我々が検討したところ、該酵素の大腸菌組換え体においては、酵素表面に多 糖が付加されておらず、著しく熱安定性が低下することがわ力つた。
[0020] 我々がァスペルギルス ·ォリゼ株から取得した FADGDHと、ァスペルギルス ·ォリゼ の FADGDH遺伝子を大腸菌で発現して取得した FADGDH組換え体 (AOGDH) の熱安定性を比較したところ、同じ、 50°C、 15分処理において、前者は約 77%の活 性を維持していた力 後者の rFADGDHでは、約 13%の活性し力維持できていな かった。
[0021] また、我々はァスペルギルス 'テレウス株（NBRC 33026)力 取得した FADGD Hと、ァスペルギルス ·テレウスの FADGDH遺伝子を大腸菌で発現して取得した FA DGDH組換え体 (ATGDH)の熱安定性を比較したところ、同じ、 50°C、 15分処理 において、前者は約 90%の活性を維持していた力 後者の rFADGDHでは、約 2 %の活性し力維持できて 、なかった。 [0022] 血糖センサ用チップの作製工程にぉ 、ては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組 換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上 させる必要があった。
[0023] これまで PQQGDHの安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献 3が あり、その中では遺伝子レベルでの PQQGDH改変手段を用いた検討が報告されて いるが、酵素の改変を用いずに安定性を増大させる手段については、その可能性す ら触れられていなかった。
特許文献 3 :WO02Z072839 加熱乾燥可能なレベルとは、 50°C、 15分処理後の 残存活性が 20%以上存在する状態であり、好ましくは 40%以上の残存活性が存在 する状態であり、更に好ましくは、 60%以上の残存活性が存在する状態である。
[0024] 本発明は以下の第 1の実施形態力 第 4の実施形態を主として含む。
Kp mm
項 1A.
真核生物由来であって、液状で 55°C 15分加熱処理後も加熱処理前と比して 90% 以上の活性を保持していることを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0025] 項 2A.
真核生物由来であって、液状で 60°C 15分加熱処理後も活性を保持して 、ることを 特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0026] 項 3A.
真核生物由来であって、液状で 60°C 15分加熱後も加熱処理前と比して 40%以上 の活性を保持していることを特徴とする項 2Aに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0027] 項 4A.
真核生物が、糸状菌である項 1A〜3Aのいずれ力 1項に記載のグルコースデヒドロ ゲナーゼ。
[0028] 項 5A.
糸状菌が、ぺ-シリウム（Penicillium)属糸状菌である項 4Aに記載のグルコースデ ヒドロゲナーゼ。
[0029] 項 6A. ぺ-シリウム属糸状菌カ ぺ-シリウム 'リラシノエキヌラタム（Penicillium lilacinoe chinulatum)もしくはぺ-シリウム ·イタリカム（Penicillium italicum)である項 5A に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0030] 項 7A.
マルトースに対する作用性力 S、グルコースに対する作用性の 1%未満であることを特 徴とする項 1A〜6Aのいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0031] 項 8A.
さらにガラクトースに対する作用性が、ダルコースに対する作用性の 2%未満であるこ とを特徴とする項 7Aに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[0032] 項 9A.
真核生物由来であって次の（a)〜 (f)に示す理ィ匕学的性質を有するグルコースデヒド 口ゲナーゼ。
(a)至適反応温度： 50°C
(b)至適反応 pH :約 6. 5
(c)温度安定性： 55°C15分間の加温処理で GDH活性残存率が 90%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 40%以上
(d) pH安定性： 5. 0〜8. 0 (25°C16時間処理で 90%以上の活性残存率）
(e)基質特異性:グルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 14%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(f)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、モノョード酢酸、 N—ェ チルマレイミド、ヒドロキシルァミン、アジ化ナトリウムにより阻害を受ける。
[0033] 項 10A.
真核生物由来であって次の（a)〜 (f)に示す理ィ匕学的性質を有するグルコースデヒド 口ゲナーゼ。
(a)至適反応温度： 60°C (b)至適反応 pH :約 6. 5
(c)温度安定性： 55°C15分間の加温処理で GDH活性残存率が 95%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 70%以上
(d) pH安定性： 5. 0〜8. 5 (25°C16時間処理で 80%以上の活性残存率）
(e)基質特異性:グルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 17%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(f)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、鉄、亜鉛、モノョード酢 酸、 N—ェチルマレイミド、ヒドロキシルァミンにより阻害を受ける。
[0034] 項 11A.
以下の (a)〜(e)のいずれかに該当するタンパク質。
(a)配列番号 2に示すアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質
(b)配列番号 2に示すアミノ酸配列にお 、て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わ ない範囲において N末端側の連続する複数のアミノ酸残基を欠失したタンパク質
(c)配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 N末端側 15個以上 22個以下の連続す るアミノ酸を欠失したタンパク質
(d)上記 (a)〜(c)のいずれかに示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつグルコースデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質
(e)配列番号 2に示すアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつグルコースデヒド ロゲナーゼ活性を有するタンパク質
[0035] 項 12A.
以下の (a)〜(e)のいずれかに該当するタンパク質。
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質。 (b)配列番号 4に示すアミノ酸配列にお 、て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わ ない範囲において N末端側の連続する複数のアミノ酸残基を欠失したタンパク質。
(c)配列番号 4に示すアミノ酸配列にお 、て、 N末端側 15個以上 19個以下の連続す るアミノ酸を欠失したタンパク質。
(d)上記 (a)〜(c)のいずれかに示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつグルコースデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質。
(e)配列番号 4に示すアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつグルコースデヒド ロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
[0036] 項 13A.
真核微生物を培養し、項 1A〜12Aの!、ずれかに記載のグルコースデヒドロゲナー ゼを抽出'精製してなるグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
[0037] 項 14A.
項 1A〜12Aのいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。
[0038] 項 15A.
項 1A〜12Aのいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸を 宿主生物において機能的なプロモーター下に接続してなる組換えプラスミド。
[0039] 項 16A.
項 14Aに記載の核酸を含む配列を有する核酸分子を宿主微生物に形質転換してな る組換え微生物。
[0040] 項 17A.
核酸分子が項 15Aに記載の組換えプラスミドである、項 16Aに記載の組換え微生物 [0041] 項 18A.
宿主微生物が真核微生物である項 16Aもしくは 17Aに記載の組換え微生物。
[0042] 項 19A.
宿主微生物が原核微生物である項 16Aもしくは 17Aに記載の組換え微生物。
[0043] 項 20A. 原核微生物がグラム陰性菌である項 19Aに記載の組換え微生物。
[0044] 項 21A.
グラム陰性菌が大腸菌である項 20Aに記載の組換え微生物。
[0045] 項 22A.
項 16A〜21Aのいずれかに記載の微生物を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼを 抽出'精製してなるグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
[0046] 項 23A.
項 1A〜12Aのいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いてなるダルコ一 ス濃度の測定方法。
[0047] 項 24A.
項 1A〜12Aのいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアツ セィキット。
[0048] 項 25A.
項 1A〜12Aのいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセン サ。
[0049] 笫 2の ¾施形餱
項 1B.
以下の（a)、（b)、（c)または (d)の DNAからなる遺伝子。
(a)配列番号 11に記載の塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 11に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号 14に記載の 塩基配列からなる DNA
(c) (a)の DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
(d) (b)の DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする 領域を含む DNA
[0050] 項 2B. 以下の（a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号 10に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 10に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加 (挿入)されたアミノ酸配列カゝらなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質
[0051] 項 3B.
項 1Bまたは 2Bのいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
[0052] 項 4B.
項 3Bに記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
[0053] 項 5B.
宿主が大腸菌である項 4Bに記載の形質転換体。
[0054] 項 6B.
項 4Bまたは 5Bに記載の形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナ ーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質を製造する方法。
[0055] 笫 3の ¾施形餱
項 1C.
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを糸且換え生産する方法において、その N 末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵 素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする GDHの生産方法。
[0056] 項 2C.
糸状菌由来の GDHを組換え生産する方法において、その N末端領域に存在するシ グナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵 素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする項 1C記載の GDHの生産 方法
[0057] 項 3C.
配列番号 9、 10のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、その N末端に存在する MLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除 して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高め ることを特徴とする項 1C記載の GDHの生産方法。
[0058] 項 4C.
配列番号 9、 10のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、その N末端に存在する MLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列に、 1〜22個のアミノ酸置換ま たは Z及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて 発現活性を高めることを特徴とする項 1C記載の GDHの生産方法。
[0059] 項 5C.
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼの N末端に存在する MLGKLSFLSALS LAVAATLSNSTSAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させるこ とによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、 1 〜25個のアミノ酸置換または Z及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列 が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする項 1C記載の GDHの生 産方法。
[0060] 項 6C.
糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)において、その N末端に存在するシ グナルペプチドをコードする DNA配列の一部、ある 、は全てを置換または Z及び欠 損させた GDH遺伝子をコードする項 1C〜5Cのいずれかの生産方法に使用される DNA配列。
[0061] 項 7C.
項 6Cの DNA配列を含んでなる組換えベクター。
[0062] 項 8C.
項 7Cに記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
[0063] 項 9C.
項 8Cに記載の形質転換体を用いて生産した GDHタンパク質。
[0064] 項 10C.
項 9Cに記載の GDHタンパク質を含む組成物。
[0065] 項 11C. 項 IOC記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
[0066] 項 12C.
項 11C記載の組成物を含むグルコースセンサ。
[0067] 第 4の実施形餱
項 1D.
補酵素を必要とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)を含む組成物に おいて、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいず れカ 1つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比 ベて GDHの安定性を向上させる方法。
[0068] 項 2D.
溶液中で共存させる各化合物の終濃度が 0. 01重量％以上であり、かつ、各化合 物の合計の濃度が 30重量％以下である項 1Dに記載の安定性を向上させる方法。
[0069] 項 3D.
添カ卩する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、ダルコン酸ナトリウム、グ ルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチルー α— D—ダルコシド、シクロデキストリン、 a—D—メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、了ラニン、セリン、 BSA、 塩ィ匕ナトリウム、硫酸ナトリウム、クェン酸三ナトリウム、硫酸アンモ-ゥム、コハク酸、 マロン酸、グルタル酸、ァラビノース、ソルビタン、 2—デォキシ一 D—グルコース、キ シロース、フルクトース、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フエ-ルァラニン、プ 口リン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンカもなる群より選ばれるいずれ力 1つ以上 であることを特徴とする項 1Dまたは 2Dに記載の熱安定性を向上させる方法。
[0070] 項 4D.
フラビンィ匕合物を補酵素とする GDHが糸状菌由来であることを特徴とする項 1D〜 3Dmの 、ずれかに記載の熱安定性を向上する方法。
[0071] 項 5D.
項 1D〜4Dのいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性 GDHを 含む組成物。
[0072] 項 6D. フラビンィ匕合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)組換え体を含む組成 物において、 4°Cで保存した該組成物と比べて、 50°C、 15分処理した場合でも、 20 %以上の GDH活性を残存することを特徴とする項 5D記載の GDH含有組成物。
[0073] 項 7D.
フラビンィ匕合物結合型 GDHを含む組成物にぉ 、て、 4°Cで保存した該組成物と比 ベて、 50°C、 30分処理した場合でも、 10%以上の GDH活性を残存することを特徴 とする項 5D記載の GDH含有組成物。
[0074] 項 8D.
項 5D〜7Dの 、ずれかに記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
[0075] 項 9D.
項 5D〜7Dのいずれかに記載の組成物を含むグルコースセンサ。
[0076] 項 10D.
可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)を含む組成物にお いて、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれ 力 1つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べ て GDHの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
発明の効果
[0077] 本発明により、耐熱性及び基質特異性に優れ、また溶存酸素の影響を受けることの ないグルコースデヒドロゲナーゼを提供することができる。
[0078] 本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産することができるようにな つた。また、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得するために分子生物学 的な改良を行うことが容易になった。
[0079] 本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグ ルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。
[0080] 本発明によれば、ァスペルギルス属、またはぺ-シリウム属より単離したグルコース デヒドロゲナーゼ遺伝子力 アミノ酸配列を推定し、シグナルペプチド領域を予測し て、シグナルペプチドの一部または全部をコードする DNA配列を欠失させたり、シグ ナルペプチドをコードされたアミノ酸配列にアミノ酸置換やアミノ酸挿入を施すことに より、組換え体にてグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産させることができ、か つ、産業利用の観点力 より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが 可會 になった。
[0081] 本発明による GDH組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースァ ッセィキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用 量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れた GDH組成物を 用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。
図面の簡単な説明
[0082] [図 1]は、本発明の GDH反応速度の温度依存性を示す。活性が最大となる温度条 件を 100とした場合の相対活性 (%)で示した。
[図 2]は、本発明の GDH反応速度の pH依存性を示す。活性が最大となる温度条件 を 100とした場合の相対活性 (%)で示した。
[図 3]は、本発明の GDHの温度安定性を示す。各温度での加温処理後の活性値を 、加温処理前活性を 100とした場合の相対活性 (%)で示した。
[図 4]は、寄託番号 NBRC6092由来 GDHの pH安定性を示す。 pH3. 3〜6は酢酸 バッファー、 pH6〜7は PIPESバッファー、 pH7〜8. 5はトリス塩酸バッファーをそれ ぞれ用いた。
[図 5]は、寄託番号 NBRC32032由来 GDHの pH安定性を示す。 pH3. 3〜6は酢 酸バッファー、 pH6〜7は PIPESバッファー、 pH7〜8. 5はトリス塩酸バッファーをそ れぞれ用いた。
[図 6]は、本発明の GDHを用いて作製したグルコース電極におけるグルコース電極と 応答電圧値の関係を示す。検出器によって出力される応答電圧値 IVはグルコース 電極における 10 Aの電流に相当する。
[図 7]は、本発明の GDH (組換えタンパク質)を用いて作製したグルコース電極にお けるダルコース電極と応答電圧値の関係を示す。検出器によって出力される応答電 圧値 IVはグルコース電極における 10 μ Αの電流に相当する。
[図 8]ァスペルギルス ·ォリゼ由来 FAD— GDHのシグナルペプチド切断部位の予測 [図 9]A.ォリゼ野生型 GDH (シグナルペプチド有）の培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示すグラフ
[図 10]A.ォリゼ変異型 GDH-S2の培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性 値の関係を示すグラフ
[図 11]A.ォリゼ変異型 GDH-S3の培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性 値の関係を示すグラフ
[図 12]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 28°C, Kd-PO. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す グラフ
[図 13]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 28°C, Kd-PO. 75における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示 すグラフ
[図 14]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 28°C, d-Pl. 0における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示すグ ラフ
[図 15]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 28°C, Kd-Pl. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す グラフ
[図 16]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 20°C, Kd-PO. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す グラフ
[図 17]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除)の培養温度 23°C, Kd-PO. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す グラフ
[図 18]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 26°C, Kd-PO. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す グラフ
[図 19]A.テレウス野生型 GDH (予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度 29°C, d-PO. 5における培養フェーズと菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示すグ ラフ
発明を実施するための最良の形態
[0083] 本発明は、第 1の実施形態から第 4の実施形態までの 4つの主要な実施形態を有 する。
[0084] 以下、第 1の実施形態から第 4の実施形態の各々について説明するが、各実施形 態の記載は、必要に応じて他の実施形態に当てはめることができる。
Kp mm
第 1の実施形態において、本発明は、真核生物由来グルコースデヒドロゲナーゼで あり、以下の反応を触媒する。
[0085] D—グルコース + 電子伝達物質 (酸化型）
→ D—ダルコノー δ —ラタトン + 電子伝達物質 (還元型） 本発明は耐熱性の高さによって特徴付けられ、この点で公知の真核生物由来 GD Ηと区別される。公知の真核生物由来グルコースデヒドロゲナーゼにおいて安定性に 優れるとされるァスペルギルス ·テレウス由来 GDHが 55°C 15分の加温処理で残存 活性 (加温処理前の活性を 100%とした活性残存率）が 60%以下であるのに対し、 本発明の GDHは 55°C15分処理後の残存活性が 90%以上である。また、本発明の GDHは好ましくは 60°C 15分処理後も GDH活性を保持し、より好ましくは 60°C 15分 処理後の残存活性力 0%以上である。
[0086] 上記に記す耐熱性を有する力否かを判別するにあたり、本発明に示す加温処理の 条件としては、濃度 20mMの K—リン酸緩衝液 (pH6. 5)に GDHを lU/mlの活性 となるよう溶解した状態で 15分間加温する。なお、活性は後述の試験例に示す方法 に従って測定した値である。
[0087] 本発明の GDHの由来生物は真核生物であればよぐ真核生物の範疇には核膜に 覆われた細胞核を細胞中に有する生物全般が含まれるが、より好ましくは糸状菌で ある。中でも好ましい糸状菌としてはべ-シリウム（Penicillium)属、ァスペルギルス（ Aspergillus)属に属する種類を挙げることができる力 さらにこの中でぺ-シリウム属 糸状菌が由来生物としてより好まし 、。さらにぺ-シリウム属の中でぺ-シリウム ·リラ シノエキヌラタム（Penicillium lilacinoechinulatum)もしくはぺ-シリウム 'イタリカ ム（Penicillium italicum)がより本発明の GDH由来菌株として好まし!、。これら菌 株は各菌株保存機関より分譲を依頼することにより容易に入手することができる。さら にべ-シリウム .リラシノエキヌラタムとしては寄託番号 NBRC6231、ぺ-シリウム 'ィ タリカムとしては寄託番号 NBRC32032として製品評価技術基盤機構 ·生物資源部 門に登録されて 、る菌株がより好ま 、。
[0088] また、本発明はさらに基質特異性の高さによって特徴付けられ、マルトースに対す る作用性がグルコースに対する作用性の 1%未満でありかつガラクトースに対する作 用性がグルコースに対する作用性の 2%未満である。ここで 、う作用性とは基質濃度 4mMにおける GDH活性を指し、その測定方法は後述の試験例に従うが、用いる反 応液組成のうち基質濃度は終濃度 4mMに調整する。
[0089] また別の観点からは、本発明は真核生物由来であって以下の特性を有するダルコ 一スデヒドロゲナーゼである。
(a)ゲルろ過による見かけの分子量：約 270kDa
(b)至適反応温度： 50°C
(c)至適反応 pH :約 6. 5
(d)温度安定性： 55°C 15分間の加温処理で GDH活性残存率が 90%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 40%以上
(e) pH安定性： 5. 0〜8. 0 (25°C16時間処理で 90%以上の活性残存率）
(f)基質特異性：ダルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 14%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(g)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、モノョード酢酸、 N—ェ チルマレイミド、ヒドロキシルァミン、アジ化ナトリウムにより阻害を受ける。
由来する真核生物は上記の特性を有する GDHを生産しうるものであれば特に限定 しないが、好ましくは糸状菌であり、さらに好ましくはぺニシリウム属糸状菌であり、さ らに好ましくはべ-シリウム ·リラシノエキヌラタムである。さらに好ましくは寄託番号 N BRC6231として製品評価技術基盤機構 ·生物資源部門に登録されている菌株であ る。
[0090] さらに、本発明は真核生物由来であって以下の特性を有するグルコースデヒドロゲ ナーゼである。
(a)ゲルろ過による見かけの分子量： 79〜93kDa
(b)至適反応温度： 60°C
(c)至適反応 pH :約 6. 5
(d)温度安定性： 55°C 15分間の加温処理で GDH活性残存率が 95%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 70%以上
(e) pH安定性： 5. 0〜8. 5 (25°C16時間処理で 80%以上の活性残存率）
(f)基質特異性：ダルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 17%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(g)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、鉄、亜鉛、モノョード酢 酸、 N—ェチルマレイミド、ヒドロキシルァミンにより阻害を受ける。
[0091] 由来する真核生物は上記の特性を有する GDHを生産しうるものであれば特に限 定しないが、好ましくは糸状菌であり、さらに好ましくはぺニシリウム属糸状菌であり、 さらに好ましくはべ-シリゥム ·イタリカムである。さらに好ましくは寄託番号 NBRC32 032として製品評価技術基盤機構 ·生物資源部門に登録されて 、る菌株である。
[0092] 上記に記す pH安定性を有する力否かを判別するにあたり、本発明に示す加温処 理の条件としては、濃度 20mMの酢酸緩衝液 (pH4. 5〜6. 0)、 PIPES緩衝液 (p H6. 0〜7. 5)、トリス塩酸緩衝液（pH7. 0〜8. 5)に GDHをそれぞれ lU/mlの活 性となるよう溶解した状態で 15分間加温する。なお、活性は後述の試験例に示す方 法に従って測定した値である。
[0093] 上記に示すゲルろ過の処理条件は以下の通りである。使用カラムは東ソー (株)製 TSK-GEL G3000SW (7. 5mm X 300mm)、使用バッファ一は 50mM Tris — HC1、 150mM NaCl (pH7. 5)、チャージするサンプル量は 25 Lで流速 0. 5 mlZ分で分画する。あらかじめ標準タンパク質溶液で作成した検量線に基づき、資 料のピーク出現位置力 分子量を計算する。ピーク出現位置の特定方法は、紫外吸 光測定によるモニタリングを行ってもよぐまたカラムを透過する液をフラクション取りし 、 GDH活性のピークフラクションを特定することにより行ってもよい。
[0094] 上記に示すケミカルの影響の測定条件は、後述の試験例に示す反応試薬に各化 学物質を終濃度 2mMとなるよう溶解し、 0. l〜5UZmlの GDH溶液を用いて試験 例の方法に従って活性測定を行 、、該化学物質を加えな 、反応試薬により測定した 活性と比較を行う。本発明において「阻害を受ける」とは、本方法において該化学物 質を添加した場合に無添加条件と比べて 10%以上の活性低下が見られることをい い、また「強い阻害を受ける」とは、本方法において該化学物質を添加した場合に無 添加条件と比べて 50%以上の活性低下が見られることをいう。
[0095] また別の観点からは、本発明は配列番号 2に示すアミノ酸配列力 なり、かつダルコ 一スデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。また、配列番号 2のアミノ酸配 列について 1もしくは数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入または付加させてなり、かつ グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質も本発明に含まれる。さらに配列 番号 2に示すアミノ酸配列と 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上の相同性を有するタンパク質も本発明の範疇である。さらにこれら配列中のァ ミノ酸残基は、発現の過程で糖鎖の付加ゃメチルイ匕など種々の修飾を受けたもので あってもよい。
[0096] さらに本発明は配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なり、かつグルコースデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質である。また、配列番号 4のアミノ酸配列について 1も しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入または付加させてなり、かつグルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を有するタンパク質も本発明に含まれる。さらに配列番号 4に示す アミノ酸配列と 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上の相 同性を有するタンパク質も本発明の範疇である。さらにこれら配列中のアミノ酸残基 は、発現の過程で糖鎖の付加ゃメチルイ匕など種々の修飾を受けたものであってもよ い。 [0097] また本発明の GDHは、配列番号 2および配列番号 4に示すアミノ酸配列について 、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わな 、範囲にぉ 、て N末端側の複数の連続 するアミノ酸残基を欠失したタンパク質である。欠失する残基数は、該 GDHが活性を 失わない範囲であれば特に限定しないが、例示される目安としては、例えばシグナ ル配列に該当する N末端配列もしくはシグナル配列に該当すると予想される N末端 配列が欠失されたタンパク質である。遺伝子組み換えによらな 、該 GDHの生産や、 該 GDHの由来生物と同様の分泌発現機構を有する宿主を用いた組換え GDH生産 においては、得られる GDHは分泌シグナルが除去された成熟型 GDHであり、その アミノ酸配列は配列番号 2および配列番号 4に示すアミノ酸配列のうち N末端側のシ グナル配列に該当する部分が欠失していると考えられる。また、原核微生物のように 該 GDHの由来する生物と性質が異なる宿主を用いた組換え GDH生産に際しては、 シグナル配列に該当するもしくは該当すると予想される N末端アミノ酸配列をコード する部分を除いた遺伝子を発現させることができる。その際、欠失させる配列を除い た末端のアミノ酸残基カ チォニン以外である場合、開始コドン (ATG)を付加するの が好ましい。あるいは N末端欠失配列にアダプターを介してタグ遺伝子を接続し、発 現後に部位特異的ぺプチダーゼ等でアダプタ一部分を消化することで N末端欠失 G DHを作製することも可能である。このような N末端領域の予測方法としては、シグナ ルペプチドを予測する各種ツールを用いることができ、このようなツールの例としては SignalP var. 3. 0がある。このプログラムのサーバー（http：〃 www.cbs.dtu.dk/servi ces/SignalP/)にアクセスしオンラインで予測することが可能である。この方法により予 測されるシグナル配列部分は、配列番号 2については開始コドン〜 15番目 Alaまで、 もしくは開始コドン〜 22番目 Serまでのいずれかであり、一方配列番号 4については 開始コドン〜 15番目 Alaまで、もしくは開始コドン〜 19番目 Alaまでのいずれかであ る。特に原核微生物を宿主とした組換え GDH発現に際しては、上記 N末端領域を 削除することで、削除しない場合と比し培養液中の GDH活性が向上するという利点 がある。
[0098] 本発明に述べる「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズム を用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、最適なアラインメント (好ましくは 、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギヤッ プの導入を考慮しうるものである）における、オーバーラップする全アミノ酸に対する、 同一アミノ酸残基の割合 (％)を意味する。本発明に述べる相同性は、非特許文献 5 に記載のアルゴリズムが組み込まれた BLASTプログラムにより算出された値である。 非特許文献 5 : Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) Vol.90 p5873- 5877 配列番号 2に示す配列力 なる GDHと配列番号 4力 なる GDHはともに熱に対する 安定性が高 ヽと 、う特徴で一致して 、るが、この 2種類の GDH間のアミノ酸配列上 の相同性も 80%と極めて高ぐかつ NCBI— BLASTにおける検索結果によれば、こ れら GDHの配列と 55%を越える相同性を有するアミノ酸配列はこれまで知られてい ない。よって本発明による GDHを特徴づける指標のひとつとして配列番号 2もしくは 4に示すアミノ酸配列との相同性の高さを挙げることができ、 80%以上、より好ましく は 85%以上、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有しているタンパク質が産業上 有利であると推察できる。
[0099] また、本発明は真核微生物を培養し、上記の特性を有する GDHを抽出'精製して なるグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法を提供する。真核微生物には糸状菌、 酵母、真核藻類が挙げられ、この範囲において上記特性を有する GDHを産出しうる ものであれば特に限定しないが、好ましくは糸状菌であり、より好ましくはぺニシリウム 属糸状菌であり、さらに好ましくはべ-シリウム ·リラシノエキヌラタムもしくはべ-シリウ ム 'イタリカムである。これら属 ·種名に該当する菌株であれば本発明に用いることが できるが、さらに好ましくはべ-シリウム 'リラシノエキヌラタム NBRC6231もしくはぺ ニシリウム.イタリカム NBRC32032を用いるのがよ!/ヽ。
[0100] 微生物を培養する培地としては、微生物が生育しかつ本発明に示す GDHを生産 しうるものであれば特に限定しないが、より好適には微生物の生育に必要な炭素源、 無機窒素源及び Zまたは有機窒素源を含有するものがよぐさらに好ましくは通気攪 拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例えばダル コース、デキストラン、グリセロール、可溶性デンプン、蔗糖など力 窒素源としては、 例えばアンモニゥム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカ一、ペプトン、力 ゼイン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他 の栄養素（例えば塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩ィ匕マグネシウム等の無 機塩、ビタミン類等）を含んで 、てもよ 、。
[0101] 培養方法は、当分野において知られている方法に従う。例えば上記栄養素を含む 液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌 により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液の p Hは好ましくは 5〜9であり、さらに好ましくは 6〜8である。温度は通常 14〜42°C、よ り好ましくは 20°C〜40°Cで行うのがよい。通常は 14〜144時間培養を継続するが、 好ましくは各々の培養条件において GDHの発現量が最大となる時点で培養を終了 するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行つ て培養液中の GDH活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的な GDH 活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。
[0102] 上記の培養液力 GDHを抽出する方法としては、菌体内に蓄積した GDHを回収 する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌 体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法 により破砕することで菌体中の GDHを溶媒中に抽出することができる。破砕方法とし ては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素 としては、真菌細胞壁を消化する能力を有するものであれば特に限定しないが、適 用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Lyticase」等が挙げられる。また、物理的破 砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス等が挙げら れる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ過により残渣を取り除いて GDH粗 抽出溶液を得ることができる。また、菌体外に分泌された GDHを回収する場合にあ つては、遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体を除いた培養液上清を粗抽出 GDHとし、以下の工程に用いればよい。
[0103] また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度 や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明の GDH生産能を有する真 核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよぐまた培養物を攪拌 する等して混合してもよい。 GDHの抽出は、培養物に溶媒、好ましくは水もしくは緩 衝液を加えて GDHを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体ゃふすま等の固形 物を取り除くことでなされる。
[0104] 本発明の GDHは、該タンパク質をコードする核酸 (以下 GDH遺伝子とも記す)をク ローニング (もしくは化学的に合成)し、該核酸を坦持する発現ベクターを含むかもし くは該核酸をゲノム DNA中に組換え挿入してなる形質転換微生物の培養物力ゝら単 離精製することにより製造することも可能である。
[0105] 酵素遺伝子のクローユングは公知の方法に従って行うことができる。所望の酵素を 生産する組織もしくは細胞から該酵素を完全または部分精製し、その N末端のァミノ 酸配列をエドマン分析や質量分析により行う。また、該酵素を部位特異的エンドぺプ チダーゼ等を用いて部分分解して得られるペプチドについて同様にアミノ酸配列を 決定する。このように決定されたアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌク レオチドをプローブとし、 cDNAライブラリーもしくはゲノミック DNAライブラリーからコ 口-一（もしくはプラーク）ハイブリダィゼーシヨンによりクローユングする。プローブとし ては、酵素産生生物のゲノム DNAあるいは cDNAをテンプレートに上記オリゴヌタレ ォチドをプライマーとして PCR増幅した GDH遺伝子部分配列を用いてもょ 、。ある いは上記部分配列の隣接配列を、インバース PCR法や RACE法により決定すること で遺伝子配列全長の塩基配列を決定し、 GDH遺伝子に該当する部分を PCR増幅 してもょ 、。あるいは該酵素もしくはその部分分解産物に対する抗体を用いてゲノミツ ク DNAもしくは cDNAライブラリーより抗体スクリーニングを行うことでクロー-ングを 行ってもよい。
[0106] 本発明の GDHをコードする核酸は、例えば配列番号 2および配列番号 4に示すァ ミノ酸配列力 なるポリペプチドまたはそれと実質的に同一のペプチドをコードする核 酸である。このような核酸配列の例としては例えば配列番号 1および配列番号 3に示 す配列が挙げられるが、さらに該ポリペプチドのうちシグナル配列に該当する部分を コードしている配列を削除してもよい。あるいは全体に渡って同一もしくは類似のアミ ノ酸をコードする別のコドンに置換してもよぐまたは糸状菌もしくは昆虫細胞もしくは 動物細胞など真核宿主に導入する場合にあってはイントロンに該当する配列が挿入 されていてもよい。また本発明の GDHをコードする核酸としては、配列番号 1もしくは 配列番号 3に示す塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする塩基配列を含み、かつ配列番号 2もしくは配列番号 4に示すアミノ酸配 列を有するタンパク質と実質的に同等の性質を有するタンパク質をコードする核酸を 挙げることができる。当業者は、ノ、イブリダィゼーシヨン反応および洗浄時の温度や、 ノ、イブリダィゼーシヨン反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、ス トリンジェントな条件を容易に選択することができる。具体的には、 6 X SSC (0. 9M NaCl, 0. 09Mクェン酸三ナトリウム）または 6 X SSPE (3M NaCl, 0, 2M NaH P
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O , 20mM EDTA- 2Na, pH7. 4)中 42°Cでハイブリダィズさせ、さらに 42°Cで 0.
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5 X SSCにより洗浄する条件力 本発明のストリンジェントな条件の 1例として挙げら れるが、これに限定されるものではない。好ましくは 50%ホルムアミド、 6 X SSC (0. 9 M NaCl, 0. 09Mクェン酸三ナトリウム）または 6 X SSPE (3M NaCl, 0, 2M Na H PO , 20mM EDTA- 2Na, pH7. 4)中 42°Cでハイブリダィズさせ、さらに 42°C
2 4
で 0. 1 X SSCにより洗浄する条件が挙げられる。核酸としては DNAであっても RNA であってもよぐあるいは DNAZRNAキメラであってもよいが、好ましくは DNAであ る。なお該核酸が RNAの場合は、例示した塩基配列中の「t」を「u」と読み替えるもの とする。
本発明はまた、本発明の GDHをコードする核酸を含む核酸分子を提供する。この ような核酸分子としては、プラスミドベクターやウィルスベクターに GDH遺伝子を挿入 した組換えベクターを例示することができる。本発明の組換えプラスミドは宿主細胞 にお 、て複製保持または自律増殖できるものが好ま 、が、ゲノム DNA中に所望の 核酸を導入することを意図する場合にあっては必ずしも宿主細胞中で複製される必 要はな!、。用いるベクターは原核および Zまたは真核細胞の各種宿主細胞の組換 え発現系に適したものを用いることができ、好ましくは所望の核酸を挿入しょうとする 部位、さらに好ましくは宿主細胞において機能的なプロモーター下流の制御可能な 部位に制限酵素サイトを有するものが好ましい。上記の GDH遺伝子を適当な制限 酵素およびリガーゼ、ある ヽは必要に応じてリンカ一もしくはアダプター DNAを用 ヽ て連結することが可能である。あるいは Taqポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を 付加するような DNAポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、 TAク ローニングによるベクターへの接続も可能である。 [0108] また、該核酸分子中の GDH遺伝子には、培養発現における目的タンパク質の可 溶性を高めたり、あるいは培養液からの該 GDHタンパク質の精製を容易にする目的 でレポーター遺伝子やタグ配列等を接続することができ、このような配列の例としては ダルタチオン— S—トランスフェラーゼ遺伝子やマルトース結合タンパク質遺伝子、あ るいは 6 X Hisタグ等が挙げられる。またこれら遺伝子やタグ配列と該 GDH遺伝子と の間にスぺーサー配列をさらに挿入してもよい。
[0109] 本発明に用いるベクターとしては、例えば大腸菌用としては pBR322、 pUC18、 p Bluescript SK (—）など、酵母用としては pSH19、 pSH15など、枯草菌用としては pUB110、 pTP5などが挙げられるがこれらに限定されない。また宿主細胞内で機能 的なプロモーターの例としは、例えば大月募菌では trpプロモーター、 lacプロモーター 、酵母では GAPプロモーター、 AGHプロモーター、枯草菌では SPOlプロモーター 、 penPプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。またプラスミドには形 質転換体選抜のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましいが、 そのようなマーカー遺伝子の例としてはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、 クロラムフエ-コール、ハイグロマイシン等に代表されるような抗生物質に対する耐性 遺伝子や、あるいは宿主の栄養要求性変異を相補する遺伝子等が挙げられる。
[0110] 作製した核酸分子を導入する宿主としては、組換え発現系が確立している各種バ クテリア、放線菌、酵母、糸状菌などの微生物のほか、昆虫細胞、動物細胞、高等植 物なども使用できるが、好ましくは微生物である。形質転換の方法としては当該分野 において公知の方法に従うことができ特に限定されないが、エレクト口ポレーシヨンに よるほか、細胞壁溶解酵素や各種薬剤処理することによりコンビテント化した細胞を 用いることができ、それらを用いた場合の核酸の導入は核酸分子をコンビテントセル と混合 Wンキュペートするかあるいはさらにヒートショックを与えるなど適当な方法に よってなされる。
[0111] 形質転換微生物の培養方法としては、上記の微生物培養方法に準じた方法により なされるが、所望の核酸分子が導入された形質転換微生物株のみを選択的に生育 させるため、好ましくはマーカー遺伝子に対応する抗生物質を添加した培地や、相 補した栄養要求性に対応する物質を除 、た最少培地を用いて培養し純ィ匕を行う。ま た、 GDHの培養生産にあたって該 GDHの発現を強化するために各プロモーターに 対応する発現誘導物質を添加し、ある ヽは温度条件によって誘導されるプロモータ 一であればそれに適した温度条件とすることも可能である。また、培養後の培養液か らの該 GDHの抽出方法にっ 、ても、上記の真核微生物培養物からの GDH抽出方 法に従い行うことができる。
[0112] GDHの精製は、 GDH活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離 技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記 GDH抽出液から、例えば 塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性 PAGE、 SDS— PAGE、ィォ ン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マト グラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方 法を適当に選択して行うことができる。特に、該 GDHにタグを付加した場合にあって は、そのタグに対し親和性を有するカラムを用いることができる。例えば 6 X Hisタグを 付加した場合はニッケルカラムを用いることで簡便に該 GDHの純度を高めることが できる。
[0113] また、抽出した GDHもしくは精製した GDH溶液中に各種安定化剤等を添加するこ ともできる。このような物質の例としては例えばマン-トール 'トレハロース'スクロース' ソルビトール 'エリスリトール、グリセロール等に代表される糖 '糖アルコール類、ダル タミン酸 ·アルギ-ン等に代表されるアミノ酸、牛血清アルブミン '卵白アルブミンや各 種シャペロン等に代表されるタンパク質 ·ペプチド類等を挙げることができる。これら 物質は単独で添加してもよぐまた適宜 2種類以上を選択して同時に使用してもよい
[0114] また本発明の GDHは液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空乾燥あるいはス プレードライ等により粉末ィ匕することができる。このとき、 GDHは緩衝液等に溶解した ものを用いることができ、さらに賦形剤ある ヽは安定化剤として糖 ·糖アルコール類、 アミノ酸、タンパク質、ペプチド等を添加するのが好ましい。また、粉末化後さらに造 粒することちでさる。
[0115] 上記に示す GDHの抽出 '精製'粉末化に用いる緩衝液の組成は特に限定しない 力 好ましくは pH5〜8の範囲で緩衝能を有するものであればよぐ例えばホウ酸、ト リス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、 BES、 Bicine、 Bis— Tris、 CHES、 EPPS、 HEPES、 HEPPSO、 MES、 MOPS, MOPSO、 PIPES, POPSO、 TAPS, TA PSO、 TES、 Tricineといったグッド緩衝剤が挙げられる。
第 2の実施形
本発明者らは、上記目的を達成するために、 NCBIのデータベースを利用し、ダル コースデヒドロゲナーゼと推測される遺伝子 DNAを見出した。
[0116] 配列番号 7に記載の塩基配列からなる DNA (遺伝子）は、 NCBIのデータベースか ら予測される、ァスペルギルス'オリゼ RIB40株由来のグルコースデヒドロゲナーゼを コードする DNA (遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列であ る。
[0117] 配列番号 8に記載の塩基配列力 なる DNA (遺伝子）は、配列番号 7からイントロン を除去したものである。
[0118] 配列番号 9に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする遺伝子は、 NCIB のデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。
[0119] 本発明者らは、非特許文献 1〜4、 NCBIのデータベースなどから、ァスペルギルス
'ォリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DN A (遺伝子）の同定は容易になしうると予想して 、た。
[0120] そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質 転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製す ることも容易になしうると考えて 、た。
[0121] 具体的には、本発明者らは、 NCBIのデータベースではァスペルギルス 'ォリゼ由 来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするアミノ酸配列部分および 塩基配列部分は特定されて!ヽな ヽものの、非特許文献 1〜4に記載された方法や公 知技術を参考にしてァスペルギルス'オリゼを培養し、その培養上清カゝら各種クロマト グラフィーを用いて GDHを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブ を作製し、グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。
[0122] 同様に、本発明者らは、ァスペルギルス 'テレウスに属する微生物を独自に入手し てグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離することを試みた。 [0123] 本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法 では、ァスペルギルス'ォリゼ TI株培養上清から、高純度で、 SDS— PAGE上では つきりと確認できる GDH標品を得るのは困難であることが分力つた。酵素タンパク質 に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の 1つであると推察 した。したがって、遺伝子取得の常法の 1つである部分アミノ酸配列を利用したクロー ユングを断念せざるを得な!/ヽと判断した。
[0124] このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めた力 鋭 意検討の結果、ァスペルギルス ·ォリゼ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナ ーゼをコードする遺伝子を単離し、本願発明を完成するに至った。
[0125] その詳細は実施例 1B〜3Bに後述する。
[0126] 本発明の一実施形態は、以下の（a)、 (b)、 (c)、 (d)のいずれかの DNAからなる 遺伝子、もしくは、以下の（e)または (f)のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換 えベクターにより形質転換体を栄養培地にて培養し、ダルコ一スデヒドロゲナーゼ活 性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質を製造する方法である。
(a)配列番号 11に記載の塩基配列力 なる DNA (遺伝子）は、本願発明者が同定し た、後述のァスペルギルス'オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有 するタンパク質をコードする DNA (遺伝子）の全配列を示す。また、
(c)配列番号 11に記載の塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活 性を有するタンパク質をコードする DNA (遺伝子)も、本発明に含まれる。
(b)配列番号 14に記載の塩基配列力もなる DNA (遺伝子）は、後述のァスペルギル ス 'オリゼ TI株由来のダルコ一スデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコード する DNA (遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列である。ま た、
(d)配列番号 14に記載の塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活 性をコードする領域を含む DNAも、本発明に含まれる。 (e)配列番号 10に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質をコードする遺伝子とは、 後述のァスペルギルス ·ォリゼ TI株由来のダルコ一スデヒドロゲナーゼ活性を有す るタンパク質をコードする DNA (遺伝子）の全配列を示す。また、
(f)配列番号 10に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加 (挿入)されたアミノ酸配列カゝらなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質をコードする DNA (遺伝子)も、本発明に含まれる。
[0127] 本発明の DNA (遺伝子）は本 GDHの発現を向上させるように、コドンユーセージ（ Codon usage)を変更したものを含みうる。
[0128] 例えば、上記のァスペルギルス'ォリゼ由来の GDH遺伝子を発現用ベクター（ブラ スミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主 (大 腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた 形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的 方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて EDTAなどの キレート剤や界面活性剤等を添加して可溶ィ匕し、 GDHを含む水溶性画分を得ること ができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した GDHを直接培 養液中に分泌させることが出来る。
[0129] 上記のようにして得られた GDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫 酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また 、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過 剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ 二ティクロマトグラフィーを行うことにより、精製された GDHを得ることができる。該精 製酵素標品は、電気泳動（SDS— PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化され ていることが好ましい。
[0130] これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
(a)タンパク質実験プロトコール第 1卷機能解析編，第 2卷構造解析編（秀潤社） 西村善文，大野茂男監修
(b)改訂タンパク質実験ノート上抽出と分離精製（洋土社）岡田雅人，宫崎香 編集
(c)タンパク質実験の進めかた（洋土社） 岡田雅人，宫崎香編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
[0131] 作製されたタンパク質の遺伝情報を有する DNAは、ベクターと連結された状態に て宿主微生物中に移入される。
[0132] ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドか ら遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばェシ エリヒア ·コリを宿主微生物とする場合には Lambda gtlO、 Lambda gtl lなどが例 示される。また、プラスミドとしては、例えば、ェシエリヒア'コリを宿主微生物とする場 合に ίま、 pBR322、 pUC19、 pKK223— 3、 pBluescriptなど力 列示される。な力で も、 pBluescriptなど、クローユングサイト上流にェシエリヒア'コリ内で認識されうるプ 口モーターを保持するものが好まし 、。
[0133] また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可 能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシ リヒア 'コリ ではェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ C600、ェシエリヒア'コリ HB101、ェ シエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ DH5 aなどを用いることができる。
[0134] 宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がェシ エリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換え DNAの 移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクト口ポレーシヨン法を用いて も良い。更には、巿販のコンビテントセル (例えば、コンビテントハイ DH5 a；東洋紡 績製)を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロボ レーシヨン法力 また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる
[0135] 本発明において、 GDHをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が 挙げられる。ァスペルギルス 'ォリゼのゲノム配列情報を用い、予測 GDH遺伝子を見 出すことができる。ついで、ァスペルギルス'ォリゼの菌体より mRNAを調製し、 cDN Aを合成する。こうして得られた cDNAをテンペレートとして、 PCR法により GLD遺伝 子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両 DNAの平滑末端または付着末端にぉ ヽて DNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えべクタ 一を複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用して GDHを コードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
[0136] 上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることによ り、多量の GDHを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーと GD H活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに 基づく選択培地で生育し、かつ GDHを生成する微生物を選択すればょ ヽ。
[0137] GDH遺伝子の塩基配列は、 Science,第 214卷， 1205 (1981)に記載されたジ デォキシ法により解読した。また、 GDHのアミノ酸配列は上記のように決定された塩 基配列より推定した。
[0138] 上記のようにして、一度選択された GDH遺伝子を保有する組換えベクターより、他 の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、 GDH遺伝子を保持する組換 えベクター力 制限酵素や PCR法により GDH遺伝子である DNAを回収し、他のベ クタ一断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他 の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンビテントセル法やエレクト口ポレー シヨン法、プロトプラスト法などを用いることができる。
[0139] なお、本発明の GDH遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該 遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるよう な DNA配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるような DNA配列をもつものでもよ!/ヽ。
[0140] 野生型 GDHをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報 を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有する DNAの特 定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより 、改変蛋白質の遺伝情報を有する DNAが作成される。 DNA中の塩基を変換する具 体的な方法としては、例えば市販のキット（TransformerMutagenesis Kit； Clone tech製， ΕΧΟΙΠ/Mung Bean Deletion Kit ; Stratagene製， QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、或いはポリメラ ーゼ連鎖反応法 (PCR)の利用が挙げられる。 [0141] 形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して 培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌 培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使 用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
[0142] 培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよぐ例えば、グルコース、シユーク ロース、ラタトース、マルトース、ラタトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、 窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよぐ例えば、ペプトン、肉エキス、 酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他 、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛 などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
[0143] 培養温度は菌が成育し、 GDHを生産する範囲で適宜変更し得る力 好ましくは 20 〜37°C程度である。培養時間は条件によって多少異なる力 GDHが最高収量に達 する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよぐ通常は 6〜48時間程度で ある。培地の pHは菌が発育し、 GDHを生産する範囲で適宜変更し得る力 好ましく は pH6. 0〜9. 0程度の範囲である。
[0144] 培養物中の GDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することも できるが、一般には、常法に従って、 GDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心 分離などにより、 GDH含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。 GDHが 菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段に より菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方 法で破壊し、また、必要に応じて、 EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加して GDHを可溶ィ匕し、水溶液として分離採取する。
[0145] 上記のようにして得られた GDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫 酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また 、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ 過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフ ィ-ティクロマトグラフィーを行うことにより、精製された GDHを得ることができる。
[0146] 例えば、セフアデックス（Sephadex)ゲル（GEヘルスケア バイオサイエンス社製） などによるゲルろ過、 DEAEセファロース CL— 6B (GEヘルスケア バイオサイェン ス社製）、ォクチルセファロース CL— 6B (GEヘルスケア バイオサイエンス社製） 等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。 該精製酵素標品は、電気泳動（SDS— PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純 化されて!/、ることが好まし!/、。
第 3の実施形
本発明の一実施形態は、糸状菌由来の GDHを組換え生産する方法において、そ の N末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目 的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする GDHの生産方法で ある。
[0147] 本発明者らは、大収量の GDHタンパク質を取得するために鋭意努力した結果、上 記目的を達成するために、まずその改変の元になる遺伝子 DNAとして、先の発明で ァスペルギルス'ォリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼと推測さ れる遺伝子 DN Aを見出して 、る。
[0148] 本発明者らは、 NCBIのデータベースを利用し、 FAD依存性グルコースデヒドロゲ ナーゼと推測される遺伝子 DNAを見出した。
[0149] 本発明者らは、非特許文献 1〜4、 NCBIのデータベースなどから、 GDH活性を有 するタンパク質をコードする DNA (遺伝子）の同定は容易になしうると予想して 、た。 そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転 換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製するこ とも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献 1〜4に記載された方法や 公知技術を参考にしてァスペルギルス'オリゼを培養し、その培養上清から各種クロ マトグラフィーを用いて GDHを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプロ ーブを作製し、 GDHをコードする遺伝子を単離することを試みた。
[0150] 本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法 では、ァスペルギルス'ォリゼ培養上清から、高純度で、 SDS— PAGE上ではっきり と確認できる GDH標品を得るのは困難であることが分力つた。酵素タンパク質に結 合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の 1つであると推察した。 したがって、遺伝子取得の常法の 1つである部分アミノ酸配列を利用したクローニン グを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をと もない、非常な困難を極めた力 鋭意検討の結果、ァスペルギルス 'ォリゼ由来の G DHをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。
[0151] また、本発明者らは他起源の GDH遺伝子の取得についても種々検討し、ぺ -シリ ゥム属（Penicillium lilacinoechinulatum)由来の GDHをコードする遺伝子、お よびァスペルギルス 'テレウス由来の GDHをコードする遺伝子を単離した。その詳細 も実施例に後述する。
[0152] 本発明の遺伝子 DNAは本 GDHの発現をさらに向上させるように、コドンユーセー ジ（Codon usage)を変更したものを含みうる。
[0153] シグナルペプチドは、成熟型タンパク質の N末端に残基数 15〜30個に及ぶ延長 ペプチドとして存在する。該ペプチド配列中には、疎水性アミノ酸領域を持ち、新生 ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過に先導役を務め、膜通過後は切 断されるちのである。
[0154] 本発明における糸状菌由来の GDH糸且換え体は特に限定されるものではないが、 ァスペルギルス属やべ-シリウム属などを GDH遺伝子の給源とした GDH組換え体 が例示できる。好ましくはァスペルギルス属の GDHであり、さらに好ましくはァスペル ギルス 'ォリゼである。最も好ましくは配列番号 10、 18のいずれかに記載されたァミノ 酸配列を有する GDHが例示できる。
[0155] これら GDH組換え体は、該 GDHをコードする遺伝子を PCR法にて入手し、この遺 伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させた形質転換体を培養し 、培養液力 遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチ一 ムなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて EDTAなどのキレート剤や界面 活性剤等を添加して可溶ィ匕して GDHを含む水溶性画分として得ることができる。ま たは適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した GDHを直接培養液中に分 泌、させることが出来る。 [0156] 本発明においては、 GDHの N末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配 列の一部を欠損、あるいは置換することによりシグナルペプチドの機能を低下できる
[0157] 例えば、配列番号 10に記載されたアミノ酸配列を有する GDHでは、その N末端に 存在する MLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列の一部、あるいは全 てを削除することによりシグナルペプチドの機能を低下することができる。あるいは、 1 〜22個のアミノ酸置換または/及びアミノ酸挿入を行うことによつても可能である。
[0158] 具体的な置換位置は例えばシグナルペプチド切断部が例示できる。好ましくはシグ ナルペプチドの C末端に相当するァラニンを他のアミノ酸に置換することにより、機能 低下が可能である。
[0159] 該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったか どうかは、該配列への変異導入前後における培養液 lmlあたりの総活性値を比較し て確認することが出来る。また、シグナルペプチド配列の改変は、エドマン分解を用 いた N末端アミノ酸シーケンスにより確かめることができる。
[0160] N末端領域に存在するシグナルペプチドの機能を欠失することにより、 GDHタンパ ク質の発現量が向上することを見出した。
[0161] シグナルペプチドの予測ツールとしては、 PSORT、 SignalPソフトがよく利用され て ヽる。それぞれ、 webにて「psort. nibb. ac. jp/」、める ヽ 「www. cbs. dtu. d k/services/SignalP- 2. OZ」のアドレスから利用することができる。
[0162] SignalPソフトを用いて、ァスペルギルス 'ォリゼ由来の GDH遺伝子から推定され たアミノ酸配列（配列番号 9)のシグナルペプチド切断位置を予測したところ、 16番目 のァラニンと 17番目のセリンの間、あるいは 22番目のァラニンと 23番目のリジンの間 で切断される可能性が高いと予想された（図 8)。
[0163] 例えば、ァスペルギルス'ォリゼ由来の GDH遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等 多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主 (大腸菌等 多くのものが当該技術分野において知られている）に形質転換させた形質転換体を 培養し、培養液力 遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリ ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて EDTAなどのキレート剤や 界面活性剤等を添加して可溶ィ匕し、 GDHを含む水溶性画分を得ることができる。ま たは適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した GDHを直接培養液中に分 泌、させることが出来る。
[0164] 上記のようにして得られた GDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫 酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また 、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過 剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ 二ティクロマトグラフィーを行うことにより、精製された FADGDHを得ることができる。 該精製酵素標品は、電気泳動（SDS— PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純 化されて!/、ることが好まし!/、。
[0165] これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
(a)タンパク質実験プロトコール第 1卷機能解析編，第 2卷構造解析編（秀潤社） 西村善文，大野茂男監修
(b)改訂タンパク質実験ノート上抽出と分離精製（洋土社） 岡田雅人，宫崎香 編集
(c)タンパク質実験の進めかた（洋土社） 岡田雅人，宫崎香編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
[0166] 本発明はさらに、 GDHをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで 形質転換された形質転換体を含む。
[0167] 作製されたタンパク質の遺伝情報を有する DNAは、ベクターと連結された状態に て宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
[0168] ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、ェシエリヒア'コリー（Escherichia coli)を宿主微生物とする場合には pBluescript, pUC18などが使用できる。宿主微 生物としては、例えば、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ C600、ェシエリヒ ァ 'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ DH5ひなどが利用できる。宿主微生物に組換えべ クタ一を移入する方法としては、例えば宿主微生物がェシエリヒア属に属する微生物 の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換え DNAの移入を行なう方法などを採 用することができ、更にエレクト口ポレーシヨン法を用いても良い。更には、巿販のコン ピテントセル (例えば、コンビテントハイ DH5 a；東洋紡績製)を用いても良い。
[0169] このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよぐまた化学的に合成することもで きる。さら〖こ、 PCR法の利用により、 GDH遺伝子を含む DNA断片を得ることも可能 である。
[0170] 本発明において、糸状菌由来 GDHをコードする遺伝子を得る方法としては、次の ような方法が挙げられる。まず、ァスペルギルス 'ォリゼの GDH遺伝子の配列情報を 参照し、目的とする糸状菌の予測 GDH遺伝子を取得することができる。該糸状菌ょ り mRNAを調製し、 cDNAを合成する。こうして得られた cDNAをテンペレートとして 、 PCR法により GDH遺伝子を増幅させ、該遺伝子をベクターと両 DNAの平滑末端 または付着末端において DNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを 構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマ 一力一を利用して GDHをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微 生物を得る。
[0171] GDH遺伝子の塩基配列は、 Science ，第 214卷， 1205 (1981)に記載されたジ デォキシ法により解読した。また、 GDHのアミノ酸配列は上記のように決定された塩 基配列より推定した。
[0172] 上記のようにして、一度選択された GDH遺伝子を保有する組換えベクターより、他 の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、 GDH遺伝子を保持する組換 えベクター力 制限酵素や PCR法により GDH遺伝子である DNAを回収し、他のベ クタ一断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他 の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンビテントセル法やエレクト口ポレー シヨン法、プロトプラスト法などを用いることができる。
[0173] なお、本発明の GDH遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該 遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるよう な DNA配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるような DNA配列を持つものでもよ!/、。
[0174] 野生型 GDHをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報 を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有する DNAの特 定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより 、改変蛋白質の遺伝情報を有する DNAが作成される。 DNA中の塩基を変換する具 体的な方法としては、例えば市販のキット（TransformerMutagenesis Kit； Clone tech製， ΕΧΟΙΠ/Mung Bean Deletion Kit ; Stratagene製， QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、或いはポリメラ ーゼ連鎖反応法 (PCR)の利用が挙げられる。
[0175] 形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して 培養条件を選択すればよぐ多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培 養を行うのが有利である。
[0176] 培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよぐ例えば、グルコース、シユーク ロース、ラタトース、マルトース、ラタトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、 窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよぐ例えば、ペプトン、肉エキス、 酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他 、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛 などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
[0177] 培養温度は菌が成育し、 GDHを生産する範囲で適宜変更し得る力 好ましくは 20 〜37°C程度である。培養時間は条件によって多少異なる力 GDHが最高収量に達 する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよぐ通常は 6〜48時間程度で ある。糸状菌由来 GDHの組換え体の培養においては、培地の pHを制御することが 特に重要であり、 pH7. 1〜7. 3以下に制御することが望ましぐ pH6. 0〜7. 3の範 囲で制御して培養することが特に好まし 、。この様に pHを制御して培養することによ り、糸状菌 GDHタンパク質を大量に調製することが可能になる。
[0178] し力しながら、糸状菌由来の GDHは、 pH7. 0以下の酸性域では高い安定性を保 持するが、 pH7. 1〜7. 3以上では不安定となり、急速な活性低下が見られる。
[0179] したがって本発明においては、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素（GDH)を組 換え生産において、培養時の pHを 7. 3以下に制御することが好ましい。 [0180] 糸状菌由来 GDH組換え体の培養生産時においては、この活性低下割合が、 pHO . 2高くなることにより、元の活性値と比べて 10%以上低下しており、 GDHによっては 最大で 30%程度も低下していた。そこで、本特許においては、 pHO. 2上昇により、 元の活性値と比べて 10%以上が低下する現象における活性低下前の培養液の pH 以下、具体的には、 7. 3以下、好ましくは 7. 1以下で pH制御することの有効性を推 測し、実際に検討して確認した。
[0181] 組換え体の培養にお!、て、菌体の死滅や目的タンパク質の分解を懸念して、 pH制 御することは一般的に行われている力 通常は中性域の pHを保つことが一般的であ り、糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼのように中性以下の pH制御の必要性を 説いた例はない。
[0182] 培養物中の GDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することも できるが、一般には、常法に従って、 GDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心 分離などにより、 GDH含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。 GDHが 菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段に より菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方 法で破壊し、また、必要に応じて、 EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加して GDHを可溶ィ匕し、水溶液として分離採取する。
[0183] 上記のようにして得られた GDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫 酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また
、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ 過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフ ィ-ティクロマトグラフィーを行うことにより、精製された GDHを得ることができる。
[0184] 例えば、セフアデックス（Sephadex)ゲル（フアルマシアバイオテク）などによるゲル ろ過、 DEAEセファロース CL— 6B (フアルマシアバイオテク）、ォクチルセファロー ス CL— 6B (フアルマシアバイオテク)等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製 し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（SDS— PAG E)的に単一のバンドを示す程度に純化されて!ヽることが好ま 、。 第 4の実施形
GDHは、以下の反応を触媒する酵素である。
[0185] D—グルコース + 電子伝達物質 (酸化型）
→ D—ダルコノー δ —ラタトン + 電子伝達物質 (還元型） D -ダルコースを酸化して D -ダルコノ— 1, 5—ラタトンを生成すると!、う反応を触媒 する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
[0186] 本発明の方法に適用することができる GDHは、可溶性のグルコースデヒドロゲナー ゼ（GDH)であれば特に限定されな！、。
[0187] 補酵素としては、例えばフラビン化合物をとることができる。
[0188] 本発明の方法に適用することができる、補酵素として FADをとる GDH (FAD結合 型 GDH)としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属 する糸状菌のべ-シリウム（Penicillium)属、ァスペルギルス (Aspergillus)属など の微生物に由来するものが挙げられる。これら微生物菌株は各菌株保存機関より分 譲を依頼することにより容易に入手することができる。
[0189] 例えば、ぺ-シリウム属のべ-シリウム 'リラシノエキヌラタムは、寄託番号 NBRC62 31として製品評価技術基盤機構 ·生物資源部門に登録されている。また、ァスペル ギルス属のァスペルギルス'テレウスは、寄託番号 NBRC 33026として製品評価技 術基盤機構'生物資源部門に登録されて 、る。
[0190] ァスペルギルス 'ォリゼについては、実施例 1Bに従って GDH遺伝子を取得するこ とがでさる。
[0191] 本発明の方法に適用することができる GDHは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有する限り、上記に例示されたものにさらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置 換されて 、てもよく、また他のアミノ酸残基が付加されて 、てもよ!/、。
[0192] このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に 実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋 白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、 S ambrookら著、 Molecular Cloning； A Laboratory Manual 第 2|¾RA上 989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに ci載されている。 [0193] 例えば、上記の GDHを生産する天然の微生物、あるいは、天然の GDHをコードす る遺伝子をそのまま、あるいは、変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該 技術分野において知られている。例えばプラスミド。 )に挿入し、適当な宿主 (多くのも のが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質 転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法 またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて EDTAなどのキレ 一ト剤ゃ界面活性剤等を添加して可溶ィ匕し、 GDHを含む水溶性画分を得ることがで きる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した GDHを直接培養液 中に分泌させることが出来る。
[0194] 上記のようにして得られた GDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫 酸アンモ-ゥム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメ タノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また 、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過 剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ 二ティクロマトグラフィーを行うことにより、精製された GDHを得ることができる。該精 製酵素標品は、電気泳動（SDS— PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化され ていることが好ましい。
[0195] 上記工程と前後して、全 GDH酵素タンパク質に対するホロ型 GDHの割合を向上 させるために、好ましくは 25〜50°C、より好ましくは 30〜45°Cの加熱処理を行っても 良い。
[0196] 本発明における GDHの濃度は特に制約がない。用いる酵素の特性等によって適 切な範囲は異なるが、実用上、当該酵素を用いてグルコースを十分な信頼性をもつ て測定できると当業者が判断できる濃度であればよい。
[0197] 例えば、本発明における FADGDHの濃度は特に制約がないが、溶液中の場合、 好ましい下限は、 0. 01UZmL、さらに好ましくは、 0. lUZmL、さらに好ましくは 0 . 2UZmLである。好ましい上限は、 5000UZmL、さらに好ましくは、 500U/mL 、さらに好ましくは 50UZmLである。粉末あるいは凍結乾燥物中でも同程度の濃度 が望ましいが、粉末標品を調製する目的では、 5000U/mL以上の濃度にすること ができる。
[0198] 上記微生物を培養する培地としては、微生物が生育し、かつ本発明に示す GDHを 生産しうるものであれば特に限定されないが、より好適には微生物の生育に必要な 炭素源、無機窒素源及び Zまたは有機窒素源を含有するものがよぐさらに好ましく は通気攪拌に適した液体培地であるのがよい。液体培地の場合、炭素源としては例 えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、蔗糖など力 窒素源としては、例え ばアンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスティープリカ一、ペプトン、カゼィ ン、肉エキス、脱脂大豆、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄 養素（例えば塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩ィ匕マグネシウム等の無機塩 、ビタミン類等）を含んで 、てもよ 、。
[0199] 培養方法は、当分野において知られている常法に従う。例えば上記栄養素を含む 液体培地に微生物の胞子もしくは生育状態の菌体を植菌し、静置もしくは通気攪拌 により菌体を増殖させるが、好ましくは通気攪拌により培養するのがよい。培養液の p Hは好ましくは 5〜9であり、さらに好ましくは 6〜8である。温度は通常 14〜42°C、よ り好ましくは 20°C〜40°Cで行うのがよい。通常は 14〜144時間培養を継続するが、 好ましくは各々の培養条件において GDHの発現量が最大となる時点で培養を終了 するのがよい。このような時点を見極める方策としては、培養液のサンプリングを行つ て培養液中の GDH活性を測定することでその変化をモニタリングし、経時的な GDH 活性の上昇がなくなった時点をピークとみなして培養停止すればよい。
[0200] 上記の培養液力 GDHを抽出する方法としては、菌体内に蓄積した GDHを回収 する場合にあっては遠心分離もしくはろ過等の操作によって菌体のみを集め、この菌 体を溶媒、好ましくは水もしくは緩衝液に再懸濁する。再懸濁した菌体は公知の方法 により破砕することで菌体中の GDHを溶媒中に抽出することができる。破砕方法とし ては、溶菌酵素を用いることもでき、また物理的破砕方法を用いてもよい。溶菌酵素 としては特に限定されないが、適用可能な酵素の例としてはシグマ社製「Lyticase」 等が挙げられる。また、物理的破砕の方法としては例えば超音波破砕、ガラスビーズ 破砕、ホモジナイズ破砕等が挙げられる。破砕処理後の溶液は、遠心分離もしくはろ 過により残渣を取り除 、て GDH粗抽出溶液を得ることができる。 [0201] また本発明における培養方法としては固体培養によることもできる。好ましくは温度 や湿度等を適宜制御の上で小麦等のふすま上に本発明の GDH生産能を有する真 核微生物を生育させる。このとき、培養は静置により行ってもよぐまた培養物を攪拌 する等して混合してもよい。 GDHの抽出は、培養物に溶媒、このましくは水もしくは 緩衝液を加えて GDHを溶解させ、遠心分離もしくはろ過により菌体ゃふすま等の固 形物を取り除くことでなされる。
[0202] GDHの精製は、 GDH活性の存在する画分に応じて通常使用される種々の分離 技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。上記 GDH抽出液から、例えば 塩析、溶媒沈殿、透析、限外ろ過、ゲルろ過、非変性 PAGE、 SDS— PAGE、ィォ ン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マト グラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方 法を適当に選択して行うことができる。
[0203] 本発明の GDHの熱安定性を向上させる方法の一形態は、可溶性の補酵素結合 型のグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)を含む組成物において、（1)該酵素、と、（ 2)該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれ力 1つ以上 の化合物を共存させる工程を含む。
[0204] 添カ卩する化合物として好まし 、ものとして、トレハロース、マンノース、メレジトース、 ダルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチルー α— D—ダルコ シド、シクロデキストリン、 oc—D—メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、 ァラニン、セリン、 BSAからなる群より選ばれるいずれか 1つ以上を挙げることができ る。
[0205] これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の 場合、好ましい下限は、 0. 001重量％、さらに好ましくは、 0. 01 %、さらに好ましくは 0. 1 %である。夾雑物の持込の危険性から、好ましい上限は、 30重量％、さらに好ま しくは、 20%、さらに好ましくは 10%である。なお、実施例で記載されている化合物 の濃度は、溶液中の場合は、溶媒に対する重量％、粉末乾燥物に対しては、 GDH酵 素に対する重量％で表している。例えば、粉末乾燥物では、 40mgZmlの GDHに 対して 60%の安定化剤を添加したとすると、 24mg安定化剤を溶解したことになり、 その際の溶液中での濃度は約 2. 4%になる。粉末安定化の検証実験でも、溶液中 で熱安定化効果を示した濃度範囲内で粉末安定化効果が見られており、粉末安定 性に関しても溶液中の濃度と同様範囲で効果を発揮することが容易に推測できる。
[0206] これらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、溶液中の 場合、好ましい下限は、 0. 01mM、さらに好ましくは、 0. lmM、さらに好ましくは lm Mである。好ましい上限は、 10M、さらに好ましくは、 5M、さらに好ましくは 1Mである
[0207] 粉末あるいは凍結乾燥物を作製する場合には、溶液中の場合と同程度の化合物 濃度を含有する組成にて乾燥処理を施すことにより同様の効果を持った乾燥標品を 取得することができる。
[0208] なお、実施例で記載されて!、る化合物の濃度は、 GDH酵素と共存して保存する時 の終濃度である。
[0209] また本発明の GDHを含む組成物は液状で供することもできるが、凍結乾燥、真空 乾燥あるいはスプレードライ等により粉末ィ匕することができる。このとき、 GDHは緩衝 液等に溶解したものを用いることができ、さらに賦形剤あるいは安定化剤として本発 明で用いる上記化合物以外の糖'糖アルコール類、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等 を添加することができる。また、粉末ィ匕後さらに造粒することもできる。
[0210] 上記に示す GDHの抽出 '精製'粉末化、および安定性試験に用いる緩衝液の組 成は特に限定しないが、好ましくは pH5〜8の範囲で緩衝能を有するものであればよ ぐ例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、 BES、 Bicine、 Bis— Tri s、 CHES、 EPPS、 HEPES、 HEPPSO、 MESゝ MOPS, MOPSO、 PIPES, PO PSO、 TAPS, TAPSO、 TES、 Tricineといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、 フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤 ち挙げることがでさる。
[0211] これらのうち 1種のみを適用してもよいし、 2種以上を用いてもよい。さらには上記以 外を含む 1種以上の複合組成であってもよい。
[0212] また、これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されな 、が
、好ましい上限は lOOmM以下、より好ましくは 50mM以下である。好ましい下限は 5 mM以上である。
[0213] 粉末あるいは凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるもので はないが、好ましくは 0. 1% (重量比）以上、特に好ましくは 0. 1〜80% (重量比）の 範囲で使用される。
[0214] これらは、種々の市販の試薬を用いることが出来る。
[0215] 上記に示す種々の化合物は後記するグルコース測定用試薬、グルコースアツセィ キットあるいはグルコースセンサを作製する前に添加しておくことが望ましいが、測定 時に添加してもよい。また、 GDHの抽出 '精製'粉末ィ匕などの各製造工程において 工程液に添加することもできる。
[0216] 本発明でいう熱安定性の向上とは、 GDH酵素を含む組成物をある一定の温度で、 一定時間熱処理した後、維持されている GDH酵素の残存率(％)が増大することを 意味する。本願発明では、ほぼ完全に活性が維持される 4°C保存のサンプルを 100 %として、これと一定温度で一定時間熱処理した後の GDH溶液の活性値を比較し て、その酵素の残存率を算出している。この残存率が該化合物無添加のものと比べ て増大して ヽた場合、 GDHの熱安定性が向上したと判断した。
[0217] 具体的に、安定性が向上しているかどうかの判断は、次のように行った。
[0218] 後述の GDH酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、 4°C保存した溶 液の GDH活性値 (a)と、一定温度で一定時間熱処理した後の GDH活性値 (b)を測 定し、測定値 (a)を 100とした場合に対する相対値（(b) Z (a) X 100)を求めた。この 相対値を残存率（％)とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により 残存率が増大した場合、熱安定性が向上したと判断した。
[0219] 本発明の効果は、メディエーターを含む系においてより顕著なものとなる。本発明 の方法に適用できるメディエーターは特に限定されないが、フエナジンメトサルフエ一 ト（PMS)と 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール（DCPIP)との組み合わせ、 P MSと-トロブルーテトラゾリゥム（NBT)との組み合わせ、 DCPIP単独、フェリシアン 化物イオン (ィ匕合物としてはフェリシアンィ匕カリウムなど）単独、フエ口セン単独、ニトロ ソァ-リン単独などが挙げられる。中でもフェリシアン化物イオン (ィ匕合物としてはフエ リシアンィ匕カリウムなど）が好まし!/、。 [0220] これらの各メディエーターは感度に様々な違 、が存在するために、添加濃度を一 律に規定する必要性はないが、一般的には ImM以上の添カ卩が望ましい。
[0221] これらのメディエーターは測定時に添カ卩してもよいし、後記するグルコース測定用 試薬、グルコースアツセィキットあるいはグルコースセンサを作製するときに予め含有 させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問わ れず、測定時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
[0222] 本発明においてはさらに必要に応じて種々の成分を共存させることが出来る。例え ば、界面活性剤などを添加しても良い。
[0223] 本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
[0224] 本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアツセィキット、グルコースセンサは、 液状 (水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末ィ匕したもの、凍 結乾燥など種々の形態をとることができる。乾燥法としては、特に制限されるものでは なく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られ ず、乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
[0225] 本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコース沏 用試憨
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、 GDH、緩衝液、メディエーター など測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液 、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬とし て、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明 の GDHはホロ化した形態で提供される力 アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ ィ匕することちでさる。
[0226] グルコースアツセィキット
本発明はまた、本発明に従う GDHを含むグルコースアツセィキットを特徴とする。本 発明のグルコースアツセィキットは、本発明に従う GDHを少なくとも 1回のアツセィに 十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の GDHに加えて、アツセィに必要な 緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液 、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う GDHは種々の形態で、例えば、凍結乾 燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。 好ましくは本発明の GDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供 し、使用時にホロ化することもできる。
[0227] グルコースセンサ
本発明はまた、本発明に従う GDHを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極と しては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素 を固定ィ匕する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中 に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸 化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定ある!/ヽ は電極上に吸着固定してもよぐまた、これらを組み合わせて用いてもよい。好ましく は本発明の GDHはホロ化した形態で電極上に固定ィ匕する力 アポ酵素の形態で固 定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的に は、ダルタルアルデヒドを用いて本発明の GDHをカーボン電極上に固定化した後、 アミン基を有する試薬で処理してダルタルアルデヒドをブロッキングする。
[0228] グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を 入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明の GDH を固定ィ匕した電極を用い、対極 (例えば白金電極）および参照電極 (例えば AgZAg C1電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、 グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液 により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算する ことができる。
[0229] 本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアツセィキット、グルコースセンサ、 あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではな いが、好ましくは、 2, 6— dichlorophenol— indophenol (略称 DCPIP)、フエ口セン あるいはそれらの誘導体 (例えばフェリシアンィ匕カリウム、フエナジンメトサルフェート など）を用いるのがよい。これらのメディエーターは巿販のものを入手することができる
麵列 本発明にお 、て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。 <試薬 >
50mM PIPES緩衝液 pH6. 5 (0. l%TritonX— 100を含む）
14mM 2, 6—ジクロロフエノールインドフエノール（DCPIP)溶液
1M D—グルコース溶液
上記 PIPES緩衝液 15. 8ml、 DCPIP溶液 0. 2ml、 D—グルコース溶液 4mlを混合 して反応試薬とする。
<測定条件 >
反応試薬 2. 9mlを 37°Cで 5分間予備加温する。 GDH溶液 0. 1mlを添カ卩しゅるや かに混和後、水を対照に 37°Cに制御された分光光度計で、 600nmの吸光度変化を 5分記録し、直線部分から 1分間あたりの吸光度変化（ Δ OD )を測定する。盲検
TEST
は GDH溶液の代わりに GDHを溶解する溶媒を試薬混液にカ卩えて同様に 1分間あ たりの吸光度変化（ Δ OD )を測定する。これらの値から下記の式に従って GD
BLANK
H活性を求める。ここで GDH活性における 1単位（U)とは、濃度 200mMの D—グル コース存在下で 1分間に 1マイクロモルの DCPIPを還元する酵素量として定義してい る。
[0230] 活性 (UZml) ={— ( A OD - Δ Οϋ ) X 3. O X希釈倍率 }
TEST BLANK
/ (16. 3 X 0. 1 X 1. 0)
なお、式中の 3. 0は反応試薬 +酵素溶液の液量 (ml)、 16. 3は本活性測定条件に おけるミリモル分子吸光係数 (cm2Zマイクロモル）、 0. 1は酵素溶液の液量 (ml)、 1 . 0はセルの光路長（cm)を示す。
実施例
[0231] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定 されるものではない。
Kp mm
[0232] <実施例 1A>
ぺニシリウム通糸状菌由 GDHの B¾
GDH生産菌として Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231および Penicillium ital icum NBRC32032 (独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入)を用い、それぞ れの L乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Difco製）に植菌し 25°Cでインキュべ ートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルタ 一滅菌水に懸濁した。 2基の 10L容ジャーフアーメンター中に生産培地（ 1 %麦芽ェ キス、 1. 5%大豆ペプチド、 0. l%MgSO · 7水和物、 2%グルコース、 pH6. 5) 6L
4
を調製し、 120°C 15分オートクレープ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、 培養を開始した。培養条件は、温度 30°C、通気量 2LZ分、攪拌数 380rpmで行つ た。培養開始力も 64時間後に培養を停止し、ヌッチヱろ過器を用いて吸引ろ過により ろ紙上にそれぞれの菌株の菌体を集めた。菌体を 20mMの K リン酸バッファー（p H6. 5) 3Lに再懸濁し、圧力 130MPaでフレンチプレス破砕することで菌体を破砕し た。破砕液を 500ml容の遠心管に分注して日立高速冷却遠心機で 8000rpml5分 遠心し残渣を沈殿させた。上清を分子量 10, 000カットの限外ろ過用中空糸モジュ ールで 1Z10量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモ-ゥムを終濃度が 60%飽 和 (456gZL)となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で 8000rp ml 5分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清を Octyl— Sepharoseカラムに吸着させ 、硫酸アンモ-ゥム濃度 0. 6〜0. 0飽和でグラジェント溶出して GDH活性のある画 分を回収した。得られた GDH溶液を、 G— 25セファロースカラムでゲルろ過を行って タンパク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に 0. 6飽和相当の硫酸アンモ -ゥムを添加、溶解した。これを Phenyl— Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモ -ゥム濃度 0. 6〜0. 0飽和でグラジェント溶出して GDH活性のある画分を回収した 。これを 50°Cで 45分加温し、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得ら れた溶液を精製 GDHサンプルとした。
<実施例 2A>
分子量の推定
実施例 1Aで精製した NBRC6231および NBRC32032由来 GDH溶液 25 μ Lを 、 50mM Tris-HCl (pH7. 5)で緩衝ィ匕した東ソー（株）製 TSK— GEL G3000 SW (7. 5mm X 300mm)にチャージし、流速 0. 5mlZ分で分画した。 NBRC623 1の溶出に際しては、 280nmの吸光度をモニタリングしてそのピーク出現位置力も溶 出時間を決定した。 NBRC32032の溶出液はフラクションコレクタ一により採液し、各 フラクションの GDH活性を試験例 1に従って測定し、ピークフラクションを特定し、そ こ力も溶出に要した時間を割り出した。決定した溶出時間を元に、あら力じめ標準タ ンパク質溶液（オリエンタル酵母製 MW— Marker (MW12, 400〜290, 000) )を 用いて作成した検量線カゝら GDHタンパク質の分子量を算出した。結果、 NBRC623 1由来 GDHは約 270kDa、 NBRC32032由来 GDHは 79〜93kDaの範囲であると 推定された。
[0234] <実施例 3A> 実施例 1Aで得た NBRC6231および NBRC32032由来 GDH精製液について至 適反応温度を知るために、上述の試験例の測定手順のうち予備加温および反応中 の反応試薬の温度を 25、 37, 40、 45, 50、 55, 60、 65。Cとしてそれぞれの条件で の活性を算出した。最大活性となった条件の活性値を 100とした場合の相対活性を 示したグラフが図 1である。以上のことから、上記条件において、 NBRC6231由来 G DHの至適反応温度は 45°Cを越え 55°C未満の範囲にあり約 50°Cであること、 NBR C32032由来 GDHの至適反応温度は 55°Cを越え 65°C未満の範囲にあり約 60°C であることがそれぞれわかる。
[0235] <実施例 4A> 実施例 1Aで得た NBRC6231および NBRC32032由来 GDH精製液について至 適 pHを知るために、上述の試験例に示す試薬のうち PIPES緩衝液の代わりに pH5 . 5〜8. 0の範囲からなる 50mM K—リン酸緩衝液を用いて反応試薬を調製し、そ れらを用いて試験例の手順どおり活性測定を行った。最大活性を示す pH条件での 活性を 100とした場合の各 pH条件での相対活性を示したグラフが図 2である。 NBR C6231由来と NBRC32032由来いずれの GDHも pH6. 5付近で最大活性を示し た。以上のことから、上記条件において、 NBRC6231由来 GDHおよび NBRC320 32由来 GDHの至適反応 pHはいずれも、 6. 0を越え 7. 0未満の範囲にあり約 6. 5 であることがわかる。 [0236] <実施例 5A>
温度安定件
実施例 1Aで得た NBRC6231および NBRC32032由来 GDH精製液について温 度安定性を知るために、各 GDH溶液を 20mM K—リン酸緩衝液 (pH6. 5)を用い て lU/mlの活性となるよう希釈し、この希釈液をヒートバスを用い 37°C〜65°Cの範 囲の各温度で 15分間加温処理行って処理前の処理後の活性を比較した。活性測 定方法は上述の試験例に従った。加温処理前の活性に対する加温処理後の残存活 性を示したグラフが図 3である。 NBRC6231由来 GDHは、 55°C処理で 93%、 60°C 処理で 44%の活性残存率を示し、 NBRC32032由来 GDHは 55°C処理で 98%、 6 0°C処理で 73%の活性残存率を示した。
[0237] <実施例 6A>
ΌΗ安定件
実施例 1Aで得た NBRC6231および NBRC32032由来 GDH精製液について ρ Η安定性を知るために、 ρΗ3. 3〜8. 5の範囲の緩衝液 (ρΗ3〜6 :酢酸バッファー、 pH6〜7、 PIPESバッファー、 pH7〜8. 5 :トリス塩酸バッファー）を調製し、これらを 用いて各 GDHを酵素濃度 lUZmlとなるよう希釈した。希釈液を 25°Cで 16時間イン キュペートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対す るインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図 4 (NBRC6231由来）および図 5 (NBRC32032由来）に示す。 NBRC6231由来 GDHは pH5〜8の範囲で 80% 以上の活性残存率を示し良好な安定性を示した。一方の NBRC32032由来 GDH は、 pH5〜8. 5の範囲で 80%以上の活性残存率を示した力 バッファーが PIPES の場合は pH7. 4で 77%の活性残存となった。
[0238] <実施例 7A>
実施例 1Aで得た NBRC6231および NBRC32032由来 GDH精製液について基 質特異性を知るために、表 1 Aに示す物質を終濃度 4mMとなるよう溶解した反応試 薬を用いて活性測定を実施した。基質がグルコースの場合の活性を 100%とした場 合の各基質に対する活性を表 1Aに示す。グルコース以外の基質の中では、両酵素 とも 2—デォキシ D ダルコースおよびキシロースに作用することがわかった。但し 、その他の糖類に対しては実用上問題とならないレベルの反応性であった。
[表 1A]
Figure imgf000054_0001
[0240] <実施例 8A〉
実施例 1Aで得た NBRC32032および NBRC6231由来 GDH精製液について各 化学物質の影響を知るために、表 2Aに記載の物質を試験例に示す反応試薬に終 濃度 2mMとなるよう添加し、これを用いて GDHの活性測定を実施した。化学物質無 添加条件における活性値を 100とした場合の相対活性値を表 2Aに示す。共通して 強い阻害効果のある物質としては硫酸銅、酢酸カドミウム、硝酸銀が挙げられ、また 塩化亜鉛、モノョード酢酸、 N—ェチルマレイミド、ヒドロキシルァミンも共通して阻害 効果が見られた。また、 NBRC6231由来 GDHはアジ化ナトリウムに、 NBRC3203 2由来 GDHは塩ィ匕鉄 (III)にそれぞれ阻害されることがわ力つた。
[0241] [表 2A] 相対活性
添加物質 （終濃度 2 mM) NBRC6231 NBRC32032
M g C 1 2 9 9. 7 1 0 2
C a C 1 2 1 0 3 1 0 3
B a ( O A c ) 2 1 0 6 1 06
F e C 1 a 1 0 6 7 7. 5
C o C 1 2 9 4. 1 1 0 2
M n C 1 2 9 3. 4 9 9. 1
Z n C 1 2 7 6. 2 7 5. 1
C d ( O A c ) 2 4 1 . 0 4 1 . 4
N i C 1 2 9 6. 6 1 0 1
C u S O 4 2. 2 4. 5
A g N O 3 20. 9 1 5. 0 モノ ョー ド酢酸 6 8. 7 7 3. 3
N—ェチルマレイ ミ ド 8 6. 8 8 7. 8 ョードアセ トアミ ド 1 1 1 1 0 1 ヒ ドロキシルァミン 8 1 . 5 7 9. 1
E D T A 1 1 3 1 04 o—フエナント口リ ン 1 0 6 1 03
, a ' —ジピリジル 1 0 9 1 0 2
ホウ酸 1 1 1 1 0 2
N a F 1 1 1 1 0 2
N a N 3 8 9. 3 9 7. 8
[0242] <実施例 9A>
D グルコースに針する Km値
試験例に記載した反応試薬組成のうち D グルコース濃度を 200mM以下の範囲 で変化させて NBRC6231および NBRC32032由来 GDHの活性を測定した。 Line weaver— Burkプロット法に従い Km値の算出を行った。結果、 NBRC6231由来 G DHの Km値は 13mM、 NBRC32032由来 GDHの Km値は 7mMであった。
[0243] <実施例 10A>
グルコース雷極への応用
乳鉢にカーボングラファイト 0.5gをのせ、流動パラフィン 0.3mLをカ卩えて乳棒で 30 分練り、カーボンペーストを作製した。作製したカーボンペーストは白金電極上に練り こみ、さらに実施例 1Aに従って作製した精製 GDH溶液 (寄託番号 NBRC6231由 来、 500UZmL)を 10/zL添加して室温で 30分風乾した。風乾した酵素電極上に 透析用セルロース半透膜を被せ、プラスチック製の Oリングで半透膜を固定した。こう して作製したグルコース電極は、あらかじめ氷冷した 50mMのリン酸カリウムバッファ 一（pH7. 0)に 30分浸漬した後使用した。 25°Cに保温したキュベットに 20mlの反応 液を入れ、これにグルコース電極 (作用極）、対極として白金電極、及び参照電極とし て AgZAgCl電極を浸し、 +0. 35Vの電圧を印加した。電流値が一定になった後に グルコースを添加し、これに応答する電流値をモニタリングした。検出器は電流値 1 μ Αを。. IVの電圧に変換して出力し、出力された電圧値の経時変化をグラフ化し た。ノ ックグランド値力もグルコース添加後に達した定常値までの電圧上昇度を応答 値 (V)とした。添加するグルコース濃度を終濃度 5〜40mMの範囲で変動させ、それ ぞれのグルコース濃度で得られる応答値をプロットしたグラフが図 6である。この結果 から、グルコース濃度依存的な応答値の上昇が見られており、本発明による GDHが グルコースの定量に適用可能であって、グルコースセンサとして利用可能であること が確認された。
[0244] <実施例 11A>
cDNAの作製
ぺ-シリウム .リラシノエキヌラタム NBRC6231株およびべ-シリウム'イタリカム NB RC32032株についてそれぞれ実施例 1Aの方法に従い（ただしジャーフアーメンタ 一での培養時間は 24時間）培養を実施し、ヌッチェろ過器を用いてろ紙上に菌糸を 集めた。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミル を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスタ社製セパゾール RNA Iを用いて本キットのプロトコールに従ってトータル RNAを抽出した。得られたトータル RNAからは Origotex— dt30 (第一化学薬品社製）をもち 、て mRNAを精製し、こ れをテンプレートに東洋紡製 ReverTra-Plus-™を用いて RT—PCRを行った。得られ た産物はァガロース電気泳動を行い、鎖長 0. 5〜4. Okbに相当する部分を切り出し た。切り出したゲル断片から東洋紡製 MagExtractor— PCR&Gel Clean Up— を用いて cDNAを抽出 ·精製して cDNAサンプルとした。
[0245] <実施例 12A>
GDH遣伝 西 R列の決定
精製済みの NBRC6231由来 GDHを 0. 1%SDS、 10%グリセロールを含有する Tris—HClバッファー（pH6. 8)に溶解し、ここに Glu特異的 V8エンドプロテアーゼ を終濃度 10 /z gZmlとなるよう添加し 37°C16時間インキュベートすることで部分分 解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度 16%のゲルを用いて電気泳動してぺ プチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4 %グリシン、 0.3%トリス、 20%エタノール)を用いてセミドライ法により PVDF膜に転写 した。 PVDF膜上に転写したペプチドは CBB染色キット（PIERCE社製 GelCode B lue Stain Reagent)を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分 2 箇所を切り取ってペプチドシーケンサ一により内部アミノ酸配列の解析を行った。得 られたアミノ酸配列は IGGWDTSLKVYGT (配列番号 5)および WGGGTKQTV RAGKALGGTST (配列番号 6)であった。この配列を元にミックス塩基を含有する ディジェネレートプライマーを作製し、実施例 11 Aで作製した NBRC6231由来 cDN Aをテンプレートに PCRを実施したところ増幅産物が得られ、ァガロースゲル電気泳 動により確認したところ 1. 4kb程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出し て東洋紡製 MagExtractor— PCR&Gel Clean Up—を用いて抽出'精製した。 精製 DNA断片は東洋紡製 TArget Clone —Plus—により TAクローユングし、得 られたベクターを大腸菌 JM109コンビテントセル (東洋紡製コンビテント'ハイ JM109 )にヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート 挿入が確認されたコ口-一につ!ヽて東洋紡製 MagExtractor - Plasmid—を用い てプラスミドをミニプレップ抽出'精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてィ ンサートの塩基配列を決定した。決定した GDH遺伝子部分配列を元に、該部分配 列の 5 '側および 3 '側隣接領域を RACE法により決定した。決定した遺伝子領域の 開始コドン力 終止コドンまでの配列を配列番号 1に、また本配列力 推定されるアミ ノ酸配列を配列番号 2に示す。同様に 32032株由来 GDH遺伝子配列も決定し、配 列番号 3に示す塩基配列を得た。また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番 号 4に示す。これら塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に「NCBI BLASTJの ホームページ（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)からホモロジ一検索を実施し た。 NBRC6231株由来 GDH配列については Botryotinia fockeliana由来グルコース ォキシダーゼがもっともホモロジ一が高く相同性 55%、 NBRC32032株由来 GDH については Aspergillus oryzae由来 unnamed protein product (uRF力ら推定される ミノ酸配列）がもっとも相同性が高く 54%であった。そして NBRC6231由来 GDHと NBRC32032由来 GDHの間のホモロジ一は 80%であった。これら 2種類の GDH はともに熱に対する安定性が高 ヽと 、う特徴で一致して 、るが、この 2種類の GDH 間のアミノ酸配列の相同性も極めて高ぐかつこれらと 55%を越える相同性を有する 公知のアミノ酸配列は存在しないことがわ力つた。よって本発明による GDHを特徴づ ける指標のひとつとして配列番号 2もしくは 4に示すアミノ酸配列との相同性の高さを 挙げることができ、 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上の 相同性を有しているタンパク質が産業上有利であると推察できる。
<実施例 13A>
GDH遣伝早鉬橼 プラスミドおよび形皙転橼微牛物の作製
配列番号 3に示す塩基配列のうち 5'末端側および 3'末端側のそれぞれ 28塩基に さらに 5'端には Ndel、 3'端には BamHIのサイトをそれぞれ付カ卩したプライマーを作 製し、これを用いて NBRC32032株由来 cDNAをテンプレートに PCRを行った。ま た、配列番号 4に示すアミノ酸配列について SignalP var. 3. 0のサーバーで N末 配列のシグナル配列解析を行ったところ、 15残基目 Alaまでもしくは 19残基目 Alaま でが分泌シグナルである可能性が高いとの結果を得た。そこで、 N末配列の 15コドン 分 (45塩基)を削除し開始コドン (ATG)を付加した配列、および N末配列の 19コドン 分 (57塩基)を削除し開始コドン (ATG)を付加した配列が増幅するよう N末制限酵 素サイト付加プライマーを作製し PCR増幅産物を得た。得られた PCR産物はァガロ ース電気泳動、東洋紡製 MagExtractor—PCR&Gel Clean Up—によるゲルか らの抽出 '精製の後、 Ndelおよび BamHIにより制限酵素処理を行った。同様の制限 酵素処理を行った pBluescript KSN ( + )と混合し、これら混合液と等量の東洋紡 製ライゲーシヨン'ハイをカ卩えて混合後 16°C30分インキュベートすることでライゲーシ ヨンを実施した。ライゲーシヨンした産物を大腸菌 JM109株にヒートショックにより導入 し、 50 g/mlのアンピシリンナトリウムを含む LB寒天培地に塗布、 37°C—晚培養 することにより形質転換コロニーを得た。インサートを有するコロニーの液体培養産物 力もミニプレップによりプラスミドを抽出しインサートの塩基配列を確認した。このように して組換えプラスミド pPIGDHl (配列番号 3の開始コドン力 全長を導入）、 pPIGD H2 (配列番号 3のうち N末 15コドン分を削除して開始コドンを付加した配列を導入） 、 pPIGDH3 (配列番号 3のうち N末 19コドン分を削除して開始コドンを付カ卩した配列 を導入)の 3種類の組換えプラスミドを作製した。
[0247] <実施例 14A>
形皙転椽微牛.物の焙着および GDHの発現
実施例 13Aで得た組換えプラスミドおよび比較対照としてインサートを含まな ヽプラ スミドを、それぞれ大腸菌 C600株にエレクト口ポレーシヨンにより導入した。得られた 形質転換株を試験管中に入った 5mlの LB培地（50 μ gZmlのアンピシリンナトリウム を含む）に植菌し 30°C16時間振とう培養した。この培養液のうち 50 μ 1をとつて 5ml の LB培地（50 μ gZmlのアンピシリンナトリウムを含む）に添加し、 30°Cで 20時間振 とう培養した。インサートのな!ヽプラスミドによる形質転換体を培養した培養液中の G DH活性をブランクとして差し引いた、各 GDH遺伝子導入株の培養液中の GDH活 '性は表 3Aのとおりであった。
[0248] [表 3A]
Figure imgf000059_0001
[0249] このように大腸菌での GDH遺伝子の発現を確認した。さらに、 pPIGDH3で形質転 換した大腸菌 C600株を今度は富栄養培地（2. 4%酵母エキス、 2. 4%ポリペプトン 、 1. 25%リン酸 1水素 2カリウム、 0. 23%リン酸 2水素 1カリウム、 0. 4%グリセロール 、 50 gZmlアンピシリンナトリウム、 pH7. 0)を用い、温度 25°Cで 20時間振とう培 養したところ、培養液の活性は 1000UZLに達した。
[0250] <実施例 15A>
組換え発現 GDHの精製
PPIGDH3を形質転換した大腸菌 C600株を 500ml容坂口フラスコに入った 60ml の LB培地（50 μ gZmlアンピシリンナトリウムを含む）に植菌し 30°Cで 16時間振とう 培養した。これを 10L容ジャーフアーメンターに入った富栄養培地（2. 4%酵母ェキ ス、 2. 4%ポリペプトン、 1. 25%リン酸 1水素 2カリウム、 0. 23%リン酸 2水素 1力リウ ム、 0. 4%グリセロール、 50 μ gZmlアンピシリンナトリウム、 pH7. 0)に投入し、培養 温度 25°C、通気量 2LZ分、攪拌回転速度 330rpmで 24時間培養した。培養菌体 を遠心分離で集めたのち、 50mMのリン酸バッファー（pH6. 5)〖こ 660nmでの菌体 濁度が約 50となるように懸濁し、 65MPaの圧力でフレンチプレス破砕を行った。破 砕液を遠心分離して得た上清に終濃度 9%となるようポリエチレンイミンを添加するこ とで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニゥムを飽和量 溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を 50mMのリン酸バ ッファー（PH6. 5)に再溶解させた。そして G— 25セファロースカラムによるゲルろ過 、 Octyl—セファロースカラムおよび Phenyl—セファロースカラムによる疎水クロマト（ 溶出条件は共に 25%飽和〜 0%の硫酸アンモ-ゥム濃度勾配をかけてピークフラク シヨンを抽出）を実施し、さらに G— 25セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アン モ-ゥムを除去し組換え GDHサンプルとした。
[0251] <実施例 16A>
組椽ぇ発現 GDHのグルコース雷極への]^用
実施例 12Aで得た組換え GDHを用 、て実施例 1 OAの要領でダルコース電極を作 製し、グルコース濃度の定量を行った。結果を図 7に示す。グラフのとおり、組換え G DHを用いて作製したグルコース電極もグルコース濃度依存的なレスポンスを示し、 グルコース濃度定量に適用可能であることが確認された。
第 2の ¾施形餱
実施例に記載される、ァスペルギルス ·ォリゼ GDH遺伝子の取得手順の概略は以 下の通りである。
[0252] ァスペルギルス.オリゼ由来 GDH遺伝子を取得するために、ァスペルギルス.オリ ゼ、ァスペルギルス'テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いて GD Hの精製を試みたが、高純度の GDHを得るのは困難であった。 （実施例 1B[1]) よって、遺伝子取得の常法の 1つである部分アミノ酸配列を利用したクローユングは 断念せざるを得なくなった。
[0253] そこで、我々は GDHを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、 Pe nicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株が GDHを生産することを見出し 、本菌株の培養液力 高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実施例 1B[2]) 次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したァミノ 酸配列を元に、 PCR法により、 P. lilacinoechinulatum NBRC6231由来 GDH 遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（1356bp)。（実施例 IB [3]および [4]) 最終的に、この塩基配列を元に、公開されているァスペルギルス 'ォリゼのゲノムデ ータベースより、ァスペルギルス'オリゼ GDH遺伝子を推定 (実施例 1B[5])、取得し た。
[0254] <実施例 1B>
ァスペルギルス 'ォリゼ由来ダルコ一スデヒドロゲナーゼ遺伝子の推定
[ 1 ]ァスペルギルス 'オリゼ由来 GDHの取得
ァスペルギルス 'ォリゼは、土壌より入手し定法に従って L乾燥菌株とし保管してい たものを使用した。以下これをァスペルギルス ·ォリゼ TI株と呼ぶ。
[0255] ァスペルギルス .ォリゼ TI株の L乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Dif co 製）に植菌し 25°Cでインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の 菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。 2基の 10L容ジャーファーメ ンタ一中に生産培地（1%麦芽エキス、 1. 5%大豆ペプチド、 0. l%MgS04' 7水和 物、 2%グルコース、 pH6. 5) 6Lを調製し、 120°C 15分オートクレーブ滅菌して放冷 した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、 30°C、通気攪拌培養を行った。培養開始から 64時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去して GDH活性を含む濾過液を 回収した。回収した上清を限外ろ過膜 (分子量 10, 000カット）により低分子物質を除 去した。次いで、硫酸アンモ-ゥムを 60%飽和度となるように添加、溶解し、硫安分 画を行い、遠心機により GDHを含む上清画分を回収後、 Octyl—Sepharoseカラム に吸着させ、硫酸アンモ-ゥム飽和度 60%〜0%でグラジェント溶出して GDH活性 のある画分を回収した。得られた GDH溶液を、 G— 25— Sepharoseカラムを用いて 脱塩を行った後、 60%飽和度の硫酸アンモ-ゥムを添加、溶解し、これを Phenyl— Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモ-ゥム飽和度 60%〜0%でグラジェント溶 出して GDH活性のある画分を回収した。更にこれを 50°Cで 45分加温した後、遠心 分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製 GDH標品 (AOG DH)とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として 20mM リン酸カリウム緩 衝液 (PH6. 5)を使用した。さらに、 AOGDHの部分アミノ酸配列を決定するため、ィ オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を 試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはでき なかった。
[0256] また、我々はァスペルギルス 'テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記 と同様にその培養上清より、塩析、 Octyl— sepharose等による精製を試みた力 ァ スペルギルス 'ォリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得 ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、 SDS- PAGE上ではっきりと確認できる GDH標品を得ることができなかったのは、酵素タン ノ ク質に結合して 、るであろう糖鎖が原因の一つとなって 、るのではな!/、かと推察し た。したがって、遺伝子取得の常法の 1つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を 利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
[0257] [2]ぺニシリウム属糸状菌由来 GDHの取得
ぺ-シリウム属糸状菌由来の GDH生産菌として Penicillium lilacinoechinulat urn NBRC6231を用い、上記ァスペルギルス'ォリゼ TI株と同様の手順に従って、 培養および精製を行 ヽ、 SDS電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
[0258] [3]cDNAの作製
Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231について上記方法に従い（た だしジャーフアーメンターでの培養時間は 24時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌 糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（ 東洋紡社製)を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾール RNA Iけ 力ライテスタ社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータル RNAを抽出した 。得られたトータル RNAからは Origotex—dt30 (第一化学薬品社製）をもち 、て m RNAを精製し、これをテンプレートに ReverTra— Plus— TM (東洋紡社製）を用い て RT— PCRを行った。得られた産物はァガロース電気泳動を行い、鎖長 0. 5〜4. Okbに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片カゝら MagExtractor— PCR &Gel Clean Up—(東洋紡社製）を用いて cDNAを抽出'精製して cDNAサンプ ノレとした。 [0259] [4] GDH遺伝子部分配列の決定
上記で精製した NBRC6231由来 GDHを 0. 1%SDS、 10%グリセロールを含有 する Tris—HClバッファー（pH6. 8)に溶解し、ここに Glu特異的 V8エンドプロテア 一ゼを終濃度 10 gZmlとなるよう添加し 37°C16時間インキュベートすることで部分 分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度 16%のゲルを用いて電気泳動して ペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1 .4%グリシン、 0.3%トリス、 20%エタノール)を用いてセミドライ法により PVDF膜に転 写した。 PVDF膜上に転写したペプチドは CBB染色キット（PIERCE社製 GelCode
Blue Stain Reagent)を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部 分 2箇所を切り取ってペプチドシーケンサ一により内部アミノ酸配列の解析を行った。 得られたアミノ酸配列は IGGWDTSLKVYGT (配列番号 5)および WGGGTKQT VRAGKALGGTST (配列番号 6)であった。この配列を元にミックス塩基を含有す るディジェネレートプライマーを作製し、 NBRC6231由来 cDNAをテンプレートに P CRを実施したところ増幅産物が得られ、ァガロースゲル電気泳動により確認したとこ ろ 1. 4kb程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製 MagExtr actor—PCR&Gel Clean Up—を用いて抽出'精製した。精製 DNA断片は TAr get Clone Plus （東洋紡社製）
により TAクローユングし、得られたベクターで大腸菌 JM109コンビテントセル (東洋 紡社製)をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でイン サート挿入が確認されたコロニーについて MagExtractor— Plasmid （東洋紡社 製)を用いてプラスミドをミニプレップ抽出'精製し、プラスミド配列特異的プライマーを 用いてインサートの塩基配列を決定した（1356bp)。
[0260] [5]AOGDH遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「NCBI BLAST」のホームページ（http : ZZwww. nc bi. nlm. nih. govZBLASTZ)からホモロジ一検索を実施し、
複数の候補配列より、公知のグルコース酸化酵素とのホモロジ一も考慮して、 AOG DH遺伝子を推定した。検索により推定した AOGDHと P. lilacinoechinulatum N BRC6231由来 GDH部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は 49%であった。 <実施例 2B>
AOGDH遺伝子の取得、大腸菌への導入
AOGDH遺伝子を取得するために、ァスペルギルス.オリゼ TI株の菌体より mRN Aを調製し、 cDNAを合成した。配列番号 12、 13に示す 2種類のオリゴ DNAを合成 し、調製した cDNAをテンプレートとして KOD Plus DNAポリメラーゼ (東洋紡社 製）を用いて AOGDH遺伝子増幅した。 DNA断片を制限酵素 Ndel、 BamHIで処 理し、 pBluescript (LacZの翻訳開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合 わせる形で Ndelサイトを導入したもの） Ndel— BamHIサイトに挿入し、組換えプラス ミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、ェシエリヒア'コリ DH5ひ（東洋紡社製 )を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、 AOGDH遺伝子 の塩基配列の決定を行った (配列番号 11)。この結果、 cDNA配列力 推定されるァ ミノ酸残基は 593アミノ酸 (配列番号 10)からなることが明ら力となった。データベース に登録されて 、る RIB40株から予想される GDHは 588アミノ酸（配列番号 9)であり T I株 GDHとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、 TI株ゲノム DNAを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域につ！ヽても RACE法を用 いて確認を行った。データベース株である RIB40株と TI株で、 GDH遺伝子の配列 が異なることが示唆されたため、 TI株 GDH遺伝子を含む組換えプラスミドを铸型とし て、データベース RIB40株の配列から予想される GDH遺伝子配列を含む組換えプ ラスミドを QuickChange Site
Directed Mutagenesis Kit (Stratagene製）を用いて作製し、形質転換体の 取得を行った。これら形質転換体を 100 gZmlのアンピシリンを含む液体培地 (Te rrific broth) 200ml中で、 30°C、 16時間振とう培養を行った。菌体破砕液について G DH活性を確認したところ、 RIB40株由来 GDHの配列を有する形質転換体では GD H活性が確認できなカゝつた力 TI株由来 GDHの配列を有する形質転換体にっ ヽて は菌体内に培養液 lml当たり 8. 0Uの高い GDH活性が得られた。尚、実施例 1Bで 実施したァスペルギルス'オリゼ TI株の培養上清の GDH活性は、 0. 2UZmlであつ た。この結果は、 RIB40株データベース配列から予想した GDH遺伝子は GDHとし て機能して 、な 、ことが示唆するものであり、 TI株と RIB40株の遺伝子配列を比較 するかぎり、 RIB40株では GDH遺伝子の配列が一部欠失していることがその原因で あると考えられた。
[0262] ぐ実施例 3B〉
実施例 2Bで培養した TI株由来 GDHの配列を有するェシエリヒア'コリ DH5 a形質 転換体を遠心分離により菌体を回収し、 20mM リン酸カリウム緩衝液 (ρΗ6. 5)に 懸濁後、フレンチプレス破粉機を用いて GDHを抽出液した。これを実施例 1Bで精 製した AOGDHと同様の手順により、精製酵素標品 (rAOGDH)を得て、 AOGDH 精製酵素標品との特性比較を実施した。
[ 1]基質特異性
血糖センサを用いて血糖値を測定する場合、誤診を招かないために、グルコース 特異的な酵素の使用が求められる。そこで rAOGDHについて各種糖類に対する反 応性を調べた。結果を表 1Bに示す。 rAOGDHは AOGDHと同等の基質特異性を 示し、輸液使用患者がセンサを使用する際に特に問題になるマルトースには作用し ないことが確認された。
[0263] [表 1B]
Figure imgf000065_0001
[0264] [2]マルトース分解性
血糖センサに使用する GDHそのものはマルトースに作用せずとも、酵素標品等に マルトースをグルコースに分解する成分が含まれる場合にも誤診につながる可能性 力 Sある。つまり、 GDH酵素標品にマルトースを分解する成分が含まれていないことが 、きわめて重要になる。そこで、 GDH精製表品中のマルトース分解成分のコンタミネ ーシヨンについて調べた。マルトース分解酵素のコンタミネーシヨン試験は、以下の要 領で行った。 lOUZmlに調製した各種精製酵素液 50 μ 1に、 8mMマルトース 50 1 を添カ卩して 37°Cにて反応した。反応終了後、リキテックグルコース ·ΗΚ·テスト（ロッシ ュ 'ダイァグノスティックス社製)を用いて反応液に含まれるグルコース濃度を調べた。 なお、グルコース濃度を算出するための検量線は、該測定キットにて検量係数設定 用グルコース (和光純薬工業社製)を測定して作成した。結果を表 2Βに示す。 AOG DH精製標品では、 37°C, 30秒処理で、既に 90%のマルトースがグルコースに分解 されており、 10分反応処理後では、 100%に近いマルトースが分解されていた。そこ で、実施例 1Bで部分アミノ酸配列解析を目的に AOGDHを高度に精製した標品を 用いて同様に測定を行ったが、やはりマルトースから分解活性が確認された。一方、 rAOGDHでは、 37°C， 10分処理した後も、グルコースの蓄積は全く見られなかった 。ァスペルギルス 'ォリゼは古くから、醱酵産業に利用されており、アミラーゼやダルコ アミラーゼなどの糖質関連酵素を著量生産することが知られており、そのような環境 下で、 GDHのみを高純度に精製するのは極めて困難と考えられる。
[0265] これらの結果から、ァスペルギルス'ォリゼ由来 GDHを血糖センサで用いる場合に は遺伝子組換え体力 調製した GDHを用いることが必須であると考える。
[0266] [表 2B]
Figure imgf000066_0001
第 3の実施形
配列番号 8に記載の塩基配列力 なる DNA (遺伝子）は、 NCBIのデータベースか ら予測される、ァスペルギルス ·ォリゼ RIB40株由来のグルコースデヒドロゲナーゼを コードする DNA (遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列から イントロンを除去したものである。配列番号 9はその対応アミノ酸配列である。
[0268] 配列番号 9に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする遺伝子は、 NCIB のデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。
[0269] 配列番号 11に記載の塩基配列からなる DNA (遺伝子）は、本願発明者が同定した 、後述のァスペルギルス'ォリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有 するタンパク質をコードする DNA (遺伝子）の全配列を示す。配列番号 10はその対 応アミノ酸配列である。また、
配列番号 11に記載の塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質をコードする DNA (遺伝子)も、本発明の適用範囲に含まれる。
[0270] 配列番号 10に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後 述のァスペルギルス ·ォリゼ TI株由来のダルコ一スデヒドロゲナーゼ活性を有するタ ンパク質をコードする DNA (遺伝子）の全配列を示す。また、配列番号 10に記載の アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 (挿入)され たアミノ酸配列力 なり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を コードする DNA (遺伝子)も、本発明の適用範囲に含まれる。
[0271] ァスペルギルス'オリゼ GDH遺伝子は、実施例 1Bに従って取得した。
[0272] <実施例 1C >
ァスペルギルス'オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の大腸菌への導入 AOGDH遺伝子を、ァスペルギルス'ォリゼの菌体より mRNAを調製し、 cDNAを 合成した。配列番号 12, 13に示す 2種類のオリゴ DNAを合成し、調製した cDNAを テンプレートとして KOD— Plus (東洋紡績製)を用いて AOGDH遺伝子（野生型)増 幅した。 DNA断片を制限酵素 Ndel、 BamHIで処理し、 pBluescript (LacZの翻訳 開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合わせる形で Ndelサイトを導入した もの） Ndel— BamHIサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラス ミドを、コンビテントハイ DH5 a (東洋紡績製)を用いて導入した。常法に従いプラス ミドを抽出し、 AOGDH遺伝子の塩基配列の決定を行った (配列番号 11)。 cDNA 配列から推定されるアミノ酸残基は 593アミノ酸 (配列番号 10)であった。 [0273] シグナルペプチド切断後の FAD— GDHを mFAD—GDHとした場合、 mFAD— GDHの N末端に Mのみ付カ卩して mFAD— GDHの N末端が 1アミノ酸分のびた形態 となっているものを S2と表現した。また、 mFAD— GDHのN末端のKをMにァミノ酸 置換して、 mFAD— GDHとアミノ酸総数を同じにしたものを S3と表現した。 S2では、 配列番号 15のオリゴヌクレオチドを N末端側プライマーとして、配列番号 13のプライ マーとの組合せで PCRを行い、同様手順にて、 S2をコードする DNA配列をもつ組 換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。 S3では、配列番号 16のオリ ゴヌクレオチドを N末端側プライマーとして、配列番号 13のプライマーとの組合せで P CRを行い、 S3をコードする DNA配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質 転換体を取得した。なお、それぞれの改変 FAD— GDHの DNA配列を持つプラスミ ドは、 DNAシーケンシングにて配列上誤りがな!、ことを確かめた。
[0274] 配列番号 17は、上記で決定したシグナルペプチド欠質変異体 S 2の DNA配列を 示す。配列番号 18はその対応するアミノ酸配列を示す。
[0275] これら形質転換体を TB培地にて 10L—ジャーフアーメンターを用いて 1〜2日間液 体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕して GDH活性を確 認した。各種形質転換体の培養フェーズと OD, pH, GDH活性の関係を表 1C,2C, 3Cおよび図 9, 10, 11に示す。なお、ァスペルギルス'ォリゼ野生株を液体培地（1 %麦芽エキス、 1. 5%大豆ペプチド、 0. l%MgS04 · 7水和物、 2%グルコース、 0 . 05mM p—ベンゾキノン、 0. ImM EDTA、 pH6. 5)にて、 10L—ジャーファー メンターを用いて 30°C、 1日間培養し、菌体内あるいは菌体外の活性を確認したとこ ろ、いずれも約 0. 2UZml培養液 (ml broth)程度の GDH活性であった。
[0276] なお、本特許においては、 1ml培養液あたりの GDH活性量を比較することにより発 現量の比較を行っている。
[0277] 野生型 FAD— GDH (WT)では、培養 16〜18時間でピーク（6. 6 UZml— b (培 養液 lml当たりの酵素単位 (U)))が見られ、以後活性の低下が見られた。一方、改変 型 FAD— GDHの S2では 22〜25時間目（72〜73U/ml— b)、 S3では 20〜23時 間目（74〜75UZml—b)でピークが見られ、 WTと同様にその後は、 GDH活性の 低下が見られた。 [0278] それぞれのピークにおける培養力価を比較したところ、シグナルペプチドと思われ るアミノ酸配列を削除することにより、その GDH生産性が 10倍以上増大することが明 らかにされた。
[0279] また、シグナルペプチドの削除前後で FADGDH精製標品の比活性 (U/mg)を 比較したところ、野生型 FADGDH (WT) 270UZmgのところ、削除後の改変型 FA DGDHの S2では 670UZmgであり、比活性が 2. 5倍増大していた。シグナルぺプ チドを削除することにより比活性も増大することが示唆されている。
[0280] 比活性の増大を考慮しても、少なくとも 4. 4倍は活性量が増大しているものと思わ れる。
[0281] さらに我々は鋭意検討の結果、糸状菌由来の FAD— GDHは、 pH7. 1以上の pH 域において、その安定性が低下することを発見した。そして今回の検討で、糸状菌由 来 FAD— GDHの組換え体での生産培養において、 pH7. 1〜7. 3以下、好ましく は pH7. 1以下で PH制御を行うことが如何に大切であるか明らかにされた。なお、当 該 pH以下となるように培養制御を入れることにより GDH活性のピークが保てることを 確認している。
[0282] また、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを糸且換え生産する方法において、 その N末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入したものでは、培養 制御 pHを 7. 3まで上げることができる。
[0283] <実施例 2C >
ァスペルギルス 'テレウス由来ダルコ一スデヒドロゲナーゼ（以下 ATGDHと示す）遣 ί云子の大腸菌への導人
ATGDH遺伝子を、ァスペルギルス 'テレウスの菌体（寄託番号 NBRC 33026と して製品評価技術基盤機構'生物資源部門に登録されて ヽる。）より mRNAを調製 し、 cDNAを合成した。配列番号 21, 22に示す 2種類のオリゴ DNAを合成し、調製 した cDNAをテンプレートとして KOD— Plus (東洋紡績製）を用いて ATGDH遺伝 子 (予想シグナルペプチド配列を除去した遺伝子配列）を増幅した。 DNA断片を制 限酵素 Ndel、 BamHIで処理し、 pBluescript (LacZの翻訳開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合わせる形で Ndelサイトを導入したもの） Ndel— BamHIサ イトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンビテントハイ DH5ひ（東洋紡績製)を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、 ATGDH 遺伝子の塩基配列の決定を行った (配列番号 19)。 cDNA配列から推定されるァミノ 酸残基は 568アミノ酸 (配列番号 20)であった。
[0284] これら形質転換体を 100 μ gZmlのアンピシリンを含む 50mlの LB培地にて 30°C, 1晚培養した後、再度、 100 gZmlのアンピシリンを含む 50mlの LB培地にて 30°C , 8時間培養して種菌を調製した。
[0285] 調製した種菌を、 100 μ g/mlのアンピシリンを含む ΤΒ培地にて、 Kd'P 0. 5〜1 . 5の範囲で 10L—ジャーフアーメンターにて 6日間液体培養した。各培養フェーズ の菌体を集菌した後、超音波破砕して GDH活性を確認した。培養フェーズと OD, p
H, 0011活性の関係を表4じ,5じ,6じ,7じぉょび図12,13, 14,15に示す。なお、ァス ペルギルス 'テレウス野生株を液体培地（1%麦芽エキス、 1. 5%大豆ペプチド、 0. 1 %MgSO · 7水和物、 2%グルコース、 0. 05mM p—べンゾキノン、 0. ImM ED
4
TA、 pH6. 5)にて、 10L—ジャーフアーメンターを用いて 30°C、 1日間培養し、菌体 内の GDH活性を確認したところ、約 0. lU/ml培養液がピークであった。
[0286] 一方、 FAD— GDH組換え体では、ピークで約 9〜21UZml— bの活性が見られ、 100〜200倍程度の培養力価の増大が認められた。また、培養条件を検討したとこ ろ、 Kd'Pを 0. 5と低く設定することにより、 Kd'P 0. 75の時の約 1. 5倍、 Kd'P 1〜
I. 5の時の約 2倍の培養力価が認められた。なお、 Kd'Pを 2以上に設定した場合に は、培養力価が約 5UZml— b)となることを確認している。
[0287] 培養温度に関しては、培養フェーズと OD, pH, GDH活性の関係を表 8C,9C,10 C,11Cおよび図 16, 17,18,19に示す。培養温度は 26〜28°Cが最適であり、少なく とも 23〜28°Cで培養する必要があり、 29°Cよりも高い温度にて培養した場合、培養 力価が半減する傾向が認められた。
[0288] ATGDH遺伝子組換え体の培養においても、培養液の pHを 7. 3以下に保つこと が酵素活性を安定に保っために非常に重要であり、 ATGDHにおいては、 AOGD Hよりも、むしろ低い PHで培養を終了することが必要になるようであった。
[0289] なお、 ATGDH遺伝子は、ァスペルギルス 'テレウス由来 FAD— GDHをコードす る DNA配列力も予想されるシグナルペプチド（MLGKLSFLSALSLAVAATLS NSTSA) (配列番号 23)配列部分の DNAを切除したものである。シグナルペプチド 配列を含むものは、 A.ォリゼ由来 FAD— GDHと同様、 FAD— GDHの発現量が 乏しかったため、当初力もシグナルペプチドを含まなレ、ものを用いて培養の検討を行 なっている。
[表 1C] サンプリング時間 野生型
0D P H A c t
h r (U/ml)
16 11. 9 6 8 6. 5
18 14. 2 7 1 6. 6
20 15. 2 7 3 4. 9
22 15. 7 7 5 1. 7
23 16. 2 7 6 1. 1
24 16. 8 7 7 0. 9
25 16. 8 7 7 0. 6
26 16. 7 7 8 0. 4
28 17. 8 8 0 0. 3
30 18. 1 8 1 0. 2
[0291] [表 2C] サンプリ ング時間 S2
0D P H A c t
h r A c t (U/ml)
16 5. 8 6. 7 14.1
18 9. 3 6. 6 47.0
20 11. 4 6. 7 63.5
22 14. 0 7. 0 72.2
23 14. 5 7. 1 72.8
24 15. 1 7. 2 73.3
25 15. 8 7. 3 71.6
26 16. 5 7. 5 49.9
28 17. 3 7. 7 36.2
30 17. 5 7. 9 24.4
[0292] [表 3C] S3
サンプリング時間 A c t h r 0D P H A c t (U/ml)
16 9. 8 6.5 53.4
18 11. 8 6.8 70.0
20 1 . 4 7.0 74.6
22 15. 3 7.2 74.6
23 15. 6 7.3 74.0
24 15. 9 7.5 63.5
25 16. 0 7.6 46.7
26 16. 2 7.7 29.8
28 17. 6 7.9 24.5
30 16. 9 8.3 1.4
[0293] [表 4C]
Figure imgf000072_0001
[0294] [表 5C] FAD-GLD 0D660 U/OD P H
T ime U/ml
16 0.4 2.2 0.19 6.8
20 2.0 6.1 0.34 6.51
24 3.2 9.1 0.35 6.47
28 4.7 13.7 0.35 6.37
32 7.3 15.7 0.46 6.34
36 12.4 17.1 0.72 6.46
40 11.3 18.1 0.63 6.63
44 11.6 20.8 0.56 6.76
48 11.7 20.7 0.56 6.87
52 10.2 20.1 0.51 6.96
56 9.8 21.0 0.47 7.11
60 8.9 21.9 0.41 7.23
64 7.8 23.6 0.33 7.34
68 6.6 24.5 0.27 7.47
72 5.5 24.5 0.22 7.51
76 4.3 26.0 0.16 7.63
80 3.1 27.1 0.11 7.71
84 2.2 27.1 0.08 7.86
88 1.2 23.9 0.05 7.97
[0295] [表 6C]
Figure imgf000073_0001
[0296] [表 7C] FAD-GLD 0D660 U/OD P H
T ime U/ml
16 0.2 2.1 0.10 6.83
20 3.2 8.4 0.38 6.54
24 4.5 14.5 0.31 6.44
28 9.4 17.7 0.53 6.66
32 8.3 19.3 0.43 6.94
36 4.5 20.5 0.22 7.3
40 3.0 19.3 0.16 7.6
44 1.8 19.2 0.09 7.74
48 1.0 19.4 0.05 7.8
52 0.4 18.6 0.02 8.01
56 0.1 19.1 0.01 8.09
60 0.0 20.2 0.00 8.11
64 0.0 19.6 0.00 8.22
68 0.0 18.9 0.00 8.42
[0297] [表 8C]
Figure imgf000074_0001
[0298] [表 9C] FAD-GLD 0D660 U/OD P H
T i me U/ml
18 0.0 0.4 0.01 6.81
24 0.0 1.3 0.01 6.79
28.5 0.7 2.9 0.24 6.7
39 4.4 7.1 0.61 6.37
46 7.1 9.3 0.76 6.22
50 8.9 11.2 0.80 6.19
56 10.0 12.7 0.79 6.36
62 10.0 13.7 0.73 6.53
70 12.7 13.7 0.93 6.72
76 13.1 14.4 0.91 6.85
82 14.4 16.1 0.89 6.97
88 14.2 17.1 0.83 7.1
94 14.3 17.4 0.82 7.25
100 13.1 17.6 0.74 7.4
106 10.8 17.5 0.62 7.45
112 8.8 19.1 0.46 7.57
130 5.2 17.4 0.30 7.96
136 2.2 17.4 0.13 8.03 ]
FAD-GLD 0D660 U/OD P H
T ime U/ml
18 0.8 2.3 0.37 6.69
24 0.6 4.9 0.12 6.43
28.5 4.5 6.2 0.72 6.35
39 6.3 8.7 0.72 6.18
46 9.5 10.6 0.89 6.28
50 11.0 11.8 0.93 6.41
56 6.7 15.4 0.44 6.52
62 11.5 12.8 0.90 6.63
70 16.9 12.3 1.37 6.77
76 19.4 13.3 1.46 6.89
82 21.3 15.6 1.37 7.02
88 19.8 15.6 1.27 7.1
94 19.8 16.2 1.22 7.22
100 17.6 17.4 1.01 7.28
106 16.8 16.3 1.03 7.28
112 13.8 17.1 0.81 7.34
130 4.1 17.2 0.24 7.77
136 1.3 17.2 0.08 7.94 [0300] [表 11C]
Figure imgf000076_0001
[0301] 表 1C〜表 3Cは、各種変異体の 10Lジャーフアーメンター培養における培養フエ一 ズと培養液の菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係を示す。表 1Cは図 9に、表 2 Cは図 10に、表 3Cは図 11にそれぞれ対応する。
[0302] 表 4C〜表 7Cは、 10Lジャーフアーメンター培養における夫々 Kd'P 0. 5、 0. 75、 1、 1. 5における培養フェーズと培養液の菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の関係 を示す。表 4Cは図 12に、表 5Cは図 13に、表 6Cは図 14に、表 7Cは図 15にそれぞ れ対応する。
[0303] 表 8C〜表 11Cは、 10Lジャーフアーメンター培養における夫々培養温度 20、 23 、 26、 30°Cにおける培養フェーズと培養液の菌体濁度 (OD)、 pH、 GDH活性値の 関係を示す。表 8Cは図 16に、表 9Cは図 17に、表 10Cは図 18に、表 11Cは図 19に それぞれ対応する。
[0304] 第 4の実施形餱
試験例 1D： FAD依存型 GDH活性の測定方法
本発明にお 、て、 FAD依存型 GDHの活性測定は以下の条件で行う。 <試薬 >
50mM PIPES緩衝液 pH6. 5 (0. l%TritonX— 100を含む）
163mM PMS溶液
6. 8mM 2, 6—ジクロロフエノールインドフエノール（DCPIP)溶液
1M D—グルコース溶液
上記 PIPES緩衝液 15. 6ml、 DCPIP溶液 0. 2ml、 D—グルコース溶液 4mlを混合 して反応試薬とする。
<測定条件 >
反応試薬 3mlを 37°Cで 5分間予備加温する。 GDH溶液 0. 1mlを添カ卩しゅるやか に混和後、水を対照に 37°Cに制御された分光光度計で、 600nmの吸光度変化を 5 分記録し、直線部分から 1分間あたりの吸光度変化（ Δ OD )を測定する。盲検は
TEST
GDH溶液の代わりに GDHを溶解する溶媒を試薬混液にカ卩えて同様に 1分間あたり の吸光度変化（ Δ OD )を測定する。これらの値力も次の式に従って GDH活性
BLANK
を求める。ここで GDH活性における 1単位（U)とは、濃度 200mMの D—グルコース 存在下で 1分間に 1マイクロモルの DCPIPを還元する酵素量として定義している。 活性 (UZml) =
{ - ( Δ Οϋ - Δ Οϋ ) Χ 3. O X希釈倍率 }Ζ{ 16. 3 X 0. 1 X 1. 0}
TEST BLANK
なお、式中の 3. 0は反応試薬 +酵素溶液の液量 (ml)、 16. 3は本活性測定条件 におけるミリモル分子吸光係数 (cm2Zマイクロモル）、 0. 1は酵素溶液の液量 (ml) 、 1. 0はセルの光路長（cm)を示す。
実施例 1D :糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組椽ぇ体標品の調製
ァスペルギルス.ォリゼ TI株（土壌より入手し定法に従って L乾燥菌株とし保管して いたものを使用した。以下これをァスペルギルス 'ォリゼ TI株と呼ぶ。）、および、ァス ペルギルス'テレウス NBRC33026株の菌体より mRNAを調製し、 cDNAを合成し た。配列番号 12, 13、および、配列番号 21, 22に示す 4種類のオリゴ DNAを合成 し、夫々の mRNAから調製した夫々の cDNAをテンプレートとして KOD— Plus (東 洋紡績製）を用いてァスペルギルス'ォリゼ、および、ァスペルギルス'テレウスの GD H (AOGDH)遺伝子を増幅した。 DNA断片を制限酵素 Ndel、 BamHIで処理し、 p Bluescript (LacZの翻訳開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合わせる形 で Ndelサイトを導入したもの） Ndel— BamHIサイトに挿入し、 2種類の組換えプラス ミド (pAOGDH, pATGDH)を構築した。これらの組換えプラスミドを、コンビテント ノ、ィ DH5ひ（東洋紡績製)を用いて夫々導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、 AOGDH遺伝子、および、 ATGDHの塩基配列の決定を行った（配列番号 11、 19) 。 cDNA配列力も推定されるアミノ酸配列は、ァスペルギルス *ォリゼで 593アミノ酸（ 配列番号 10)、および、ァスペルギルス 'テレウスで 568アミノ酸（配列番号 20)であ つた。また、同様の手法により、ぺ-シリウム 'イタリカムの GDH (PIGDH)遺伝子を 含有する組換えプラスミド (pPIGDH)を導入した形質転換体も取得した。
[0306] これら形質転換体を TB培地（2. 4%酵母エキス、 1. 2%ポリペプトン、 1. 25%リン 酸 1水素 2カリウム、 0. 23%リン酸 2水素 1カリウム、 0. 4%グリセロール、 50 μ g/ml アンピシリンナトリウム、 pH7. 0)にて 10L—ジャーフアーメンターを用いて培養温度 25°C、通気量 2LZ分、攪拌回転速度 170rpmで 48時間培養した。
[0307] 培養菌体を遠心分離で集めた後、 50mMのリン酸バッファー（pH5. 5)〖こ 660nm での菌体濁度が約 50となるように懸濁し、 65MPaの圧力でホモジナイザー破砕を行 つた。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度 9%となるようポリエチレンイミンを添 加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニゥム を飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を 50mMの リン酸バッファー（PH5. 5)に再溶解させた。そして G— 25セファロースカラムによる ゲルろ過、 Octyl—セファロースカラムおよび Phenyl—セファロースカラムによる疎水 クロマト (溶出条件は共に 25%飽和〜 0%の硫酸アンモニゥム濃度勾配をかけてピ 一クフラクシヨンを抽出）を実施し、さらに G— 25セファロースカラムによるゲルろ過で 硫酸アンモ-ゥムを除去し GDH組換え体標品を調製した。
[0308] 実施例 2D：糸状菌野牛.株由来 FADGDH標品の調製
糸状菌野生株由来 FAD依存型 GDH生産菌としてァスペルギルス'テレウス NBR C33026株とァスペルギルス.オリゼ TI株を用い、それぞれの L乾標本をポテトデキス トロース寒天培地 (Difco製）に植菌し 25°Cでインキュベートすることにより復元した。 復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。 2基 の 10L容ジャーフアーメンター中に生産培地（1%麦芽エキス、 1. 5%大豆ペプチド 、 0. l%MgSO .7水和物、 2%グルコース、 pH6. 5) 6Lを調製し、 120。C15分ォ
4
一トクレーブ滅菌後に上記の菌糸懸濁液をそれぞれ投入、培養を開始した。培養条 件は、温度 30°C、通気量 2LZ分、攪拌数 380rpmで行った。培養開始から 64時間 後に培養を停止し、ヌッチェろ過器を用いて吸引ろ過によりろ紙上にそれぞれの菌 株の菌体を集めた。培養液 5Lを分子量 10, 000カットの限外ろ過用中空糸モジユー ルで 1Z10量に濃縮し、濃縮液にそれぞれ硫酸アンモ-ゥムを終濃度が 60%飽和（ 456g/L)となるように添加、溶解した。続いて日立高速冷却遠心機で 8000rpml5 分遠心し残渣を沈殿させたのち、上清を Octyl— Sepharoseカラムに吸着させ、硫 酸アンモ-ゥム濃度 0. 6〜0. 0飽和でグラジェント溶出して GDH活性のある画分を 回収した。得られた GDH溶液を、 G— 25セファロースカラムでゲルろ過を行ってタン パク質画分を回収することで脱塩を行い、脱塩液に 0. 6飽和相当の硫酸アンモ-ゥ ムを添カロして溶解した。これを Phenyl— Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモ -ゥム濃度 0. 6〜0. 0飽和でグラジェント溶出して GDH活性のある画分を回収した 。さらに、得られた GDH溶液を、 G— 25セファロースカラムでゲルろ過を行ってタン パク質画分を回収し、取得した精製酵素を FAD依存型 GLD評価標品として使用し た。
[0309] 本発明のグルコース測定用組成物、グルコースアツセィキット、グルコースセンサ、 あるいはグルコース測定方法に用いるメディエーターは、特に制限されるものではな いが、好ましくは、 2, 6— dichlorophenol— indophenol (略称 DCPIP)、フエ口セン あるいはそれらの誘導体 (例えばフェリシアンィ匕カリウム、フエナジンメトサルフェート など）を用いるのがよい。これらのメディエーターは巿販のものを入手することができる
[0310] 実施例 3D：グルコース沏 I定系を用いた各糠安定化剤の FADGDH熱安定化効 の 鐘
検討は、先述の試験例 1の FADGDH活性の測定方法に準じて行った。
[0311] まず、実施例 1Dで所得したァスペルギルス'ォリゼ由来 FADGLD組換え体標品（ rAOFADGDH)を約 2UZmlになるように酵素希釈液（50mM リン酸カリウム緩衝 液 (pH5. 5)、 0. 1% TritonX— 100)にて溶解したものを 50ml用意した。この酵素 溶液 0. 9mlに、表 1D記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、 合計容量を 1. 0mlとしたものを 2本用意した。また、コントロールには、各種化合物の 代わりに蒸留水 0. 1mlを添加したものを 2本用意した。
[0312] 2本のうち、 1本は 4°Cで保存し、もう 1本は、 50°C、 15分間処理を施した。処理後、 夫々のサンプルの FADGDH活性を測定した。各々、 4°Cで保存したものの酵素活 性を 100として、 50°C、 15分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％)として算 出した。
[0313] これらの検討の結果、 FADGDHの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添 加することにより、 FADGDHの熱安定性が増大することが明ら力となった (表 1D)。
[0314] アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定ィ匕効果が見られ、その中でも、トレハロース 、マンノース、ダルコン酸ナトリウム、ガラクトース、メチルー α— D—ダルコシド、 a - D—メリビオースで高い効果が見られた。
[0315] [表 1D]
終濃度 安定化剤 50°C X 15分処理後 活性残存率（％)
1% Control (無添加) 19.3 糖類 1% D— （一） 一ァラビノース 23.0
1% 1 , 4-ソルビタン 26.7
1% 2 -デォキシー D-グルコース 69.6
1% D - ( + ) ーキシ口一ス 68.5
1% D - ( + ) — トレハロースニ水和物 64.7
1% D— ( + ) 一マンノ一ス 65.3
1% D— ( + ) —メ レジトース 44.7
1% D - (一） 一フルク ト一ス 25.9
1% グルコン酸ナ トリウム 33.5
1% D—グルク口ン酸ナ トリゥム 56.2
1% D— α—ガラクッロン酸 0.0
1% ィヌリン 24.7
1% ガラク ト一ス 60.6
1% グルコノ -1， 5-ラク トン 0.0
1% メチル - 0；- D-グルコシド 53.6
1% α—シクロデキス トリン 44.1
1% -D - ( + ) ーメ リ ビオ一ス 59.0
1% スクロース 44.1 ァミノ酸類 1% L—ァスパラギン酸ナトリゥム 23.0
1% L—ァスパラギン酸 12.2
0.20% L—ァスパラギン 22.8
1% グリシン 26.4
0.10% D _グルタミン酸 23.2
0.10% D—フエ二ルァラニン 23.6
1% D—プロリン 24.8
1% D— a—ァラニン 27.1
0.25% D L—イソロイシン 23.4
0.25% L一'グルタミン 22.6
1% L一 （一） 一プロリン 25.2
1% L一アルギニン 1.1
1% Lーセリン 27.0
0.10% L— トリブトファン 24.3
0.50% L一バリン 25.5
0.25% L一ヒスチジン 11.4
0.20% L—フエ二ルァラニン 22.3
1% L—リジン一塩酸塩 23.4
0.10% L一口イシン 22.2
1% サルコシン 25.2
1% タウリン 23.8 実施例 4D:FADGDH熱安定化効果に及ぼすトレハロース有効濃度の検討
次に、高い熱安定化効果の見られたトレハロースについて、その効果を発揮する有 効濃度について検討した。方法は、先の実施例 3Dに準じて行った。その結果、添カロ 濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られ、たとえ終濃度 0.01%トレ ハロースの添カ卩においても、安定化効果を発揮することが明ら力となった (表 2D)。 [0317] [表 2D]
Figure imgf000082_0001
[0318] ¾施例 5D：その他相 効¾の檢討
基本的な方法は、先の実施例 3Dに準じて、その他の安定ィ匕剤においても、各々組 み合わせることにより、相乗効果が見られないか検討した。その結果、セリン xBSAの 組合せ（表 3D)やトレハロースとマンノース、トレハロースとグリシン、マンノースとグリ シンの組合せ (表 4D)においても単独で使用した場合と比べて明らかな熱安定ィ匕効 果が確認できた。
[0319] [表 3D]
Figure imgf000082_0002
[0320] [表 4D」
Figure imgf000082_0003
[0321] 実施例 6D :トレハロース グリシン、マンノース グリシンの有効濃度の検討
実施例 5Dの検討で高い熱安定ィ匕効果の見られたトレハロースとグリシン、マンノー スとグリシンの組み合わせについて、その効果を発揮する有効濃度について検討し た。方法は、先の実施例 3Dに準じて行った。その結果、これら混合物においても添 加濃度の増加にしたがって、効果が増大する傾向が見られた。終濃度 0. 01%で各 化合物を添加した場合でも、 50°C, 30分間処理において、 20%前後の残存活性が 見られ、先の 0. 01%トレハロースを単独で使用した場合と比べて 2倍近い安定ィ匕効 果が認められた (表 5D)。
[表 5D]
Figure imgf000083_0001
[0323] 実窗列 7D :各糠 FADGDHにおける安定化剤の熱安定化効 の枪討
基本的な方法は、先の実施例 3Dに準じて、各種 FADGDHにおける安定化剤の 熱安定ィ匕効果について検討した。安定化剤として 4%D—グルクロン酸ナトリウムと 4 %グリシンの混合糸且成を利用した。その結果、野生株由来 GDH、糸且換え体 GDHを 問わず、安定化剤の効果が見られることが明らかとなった (表 6D)。
[0324] [表 6D]
Figure imgf000083_0002
[0325] msn：グルコース沏 系 用いた保存安定件の檢討
検討は、実施例 1Dで所得したァスペルギルス ·ォリゼ由来 FADGLD組換え体標 品（rAOFADGDH)を用い、先述の試験例 1の FADGDH活性の測定方法に準じ て行った。 FADGDH酵素溶液中に占める FADGDHタンパク質量を測定し、これに 対して 60%あるいは 30%に相当する安定化剤を溶解したものを lml用意した。例え ば、 10mgの FADGDHを含有する酵素液に対して、 60%相当の BSAを添カ卩する 場合には、 6mgの BSAを溶解した。
[0326] 各種安定化剤を添加した酵素溶液力も正確に 0. 2mlずつバイアルに分取したもの を数本用意した。また、コントロールには、安定ィ匕剤を添加しないものを用意した。用 意したパイアルを凍結真空乾燥 (FDR)して、水分を完全に蒸発させた後、同じ安定 ィ匕剤を添加したサンプルの内 2本のみ、直ちに、活性測定を行った。一方、検体バイ アルでは、 25°C、湿度 70%で数時間処理した後、 37°Cで保存して、 1週間後の残 存活性を測定した。活性残存率は、 FDR直後の活性平均値を 100%として、 37°C 処理後の各サンプルの活性平均値を測定して活性残存率(％)を算出した。そして、 活性残存率が高くなつているほど、保存安定性が向上していると判断した。
[0327] その結果、 BSA,セリン， トレハロース単独でも粉末酵素の保存安定性の向上が見 られたが、 BSAとセリンを組み合わせることにより、更なる、保存安定ィ匕効果が認めら れた。酵素標品の量の関係から、 2， 3の組合せのみで検討を行ったが、熱安定化効 果のあった化合物では、いずれにおいても同様の保存安定ィ匕効果があるものと思わ れる。 （表 7Dゝ表 8D)
[0328] [表 7D]
Figure imgf000084_0001
[0329] [表 8D]
Figure imgf000084_0002
[0330] ¾施例 9D :グルコース測定系を用いた各糠安定化剤の FADGDH熱安定化効 の 腿 検討は、先述の試験例 1の FADGDH活性の測定方法に準じて行った。
[0331] まず、実施例 1Dで所得したァスペルギルス'テレウス由来 FADGLD組換え体標品
(rATFADGDH)を約 2UZmlになるように酵素希釈液（50mM リン酸カリウム緩 衝液 (pH5. 5)、 0. 1% TritonX— 100)にて溶解したものを 50ml用意した。この酵 素溶液 0. 9mlに、表 1D記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して 、合計容量を 1. 0mlとしたものを 2本用意した。また、コントロールには、各種化合物 の代わりに蒸留水 0. 1mlを添加したものを 2本用意した。
[0332] 2本のうち、 1本は 4°Cで保存し、もう 1本は、 50°C、 15分間処理を施した。処理後、 夫々のサンプルの FADGDH活性を測定した。各々、 4°Cで保存したものの酵素活 性を 100として、 50°C、 15分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％)として算 出した。
[0333] これらの検討の結果、 FADGDHの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添 加することにより、 FADGDHの熱安定性が増大することが明ら力となった（表 9D、表 10D)。
[0334] アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定ィ匕効果が見られ、その中でも、トレハロース 、マンノース、メレジトース、ダルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース 、メチルー α—D—ダルコシド、 a—D—メリビオース、スクロース、グリシン、了ラニン 、セリン、塩ィ匕ナトリウム、硫酸ナトリウム、クェン酸三ナトリウム、硫酸アンモ-ゥム、コ ハク酸、マロン酸、グルタル酸、ァラビノース、ソルビタン、 2—デォキシ一 D—ダルコ ース、キシロース、フルクトース、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フエ-ルァラ ニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンで高い効果が見られた。
[0335] [表 9D]
Figure imgf000085_0001
[0336] [表 10D] GDH活性 （U/v i a l ) GDH活性 粉末化 粉末化 37。C , 残存率 安定化剤 直前 直後 1 週間後 (% )
Cont r o l (無添加） 403 352 6 1 . 6
60%トレハロ一ス 397 401 1 95 48. 6
30%トレハロースと 30%セリシン 405 385 288 74. 7
*湿度 70 こて 25°C , 7時間処理後、 37 °C , 1 週間放置 産業上の利用可能性
[0337] 本発明によれば、グルコース測定用組成物もしくはグルコース測定方法を得ること ができる。このグルコース測定用組成物もしくはグルコース測定方法は、グルコースァ ッセィキット、グルコースセンサに利用できる。
[0338] 本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、ァスペルギルス 'ォリゼ由来のダルコ 一スデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。また、本発明 により広 、意味でマルトースに作用しな 、、ダルコースセンサ等に適したダルコース デヒドロゲナーゼを生産することを可能にする。
[0339] 本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、ァスペルギルス 'ォリゼ由来のダルコ 一スデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。また、本発明 により広 、意味でマルトースに作用しな 、、ダルコースセンサ等に適したダルコース デヒドロゲナーゼを生産することが可能になる。
[0340] 本発明による GDH組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースァ ッセィキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用 量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れた GDH組成物を 用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。

Claims

請求の範囲
[1] ぺニシリウム（Penicillium)属糸状菌由来であって次の（a)〜（f)に示す理化学的性 質を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
(a)至適反応温度： 50°C
(b)至適反応 pH :約 6. 5
(c)温度安定性： 55°C15分間の加温処理で GDH活性残存率が 90%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 40%以上
(d) pH安定性： 5. 0〜8. 0 (25°C16時間処理で 90%以上の活性残存率）
(e)基質特異性:グルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 14%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(f)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、モノョード酢酸、 N—ェ チルマレイミド、ヒドロキシルァミン、アジ化ナトリウムにより阻害を受ける。
[2] ぺニシリウム（Penicillium)属糸状菌由来であって次の（a)〜（f)に示す理化学的性 質を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
(a)至適反応温度： 60°C
(b)至適反応 pH :約 6. 5
(c)温度安定性： 55°C15分間の加温処理で GDH活性残存率が 95%以上、 60°C1 5分間の加温処理で GDH活性残存率が 70%以上
(d) pH安定性： 5. 0〜8. 5 (25°C16時間処理で 80%以上の活性残存率）
(e)基質特異性:グルコースに対する作用性を 100%とした場合、キシロースに対し 約 10%、 2—デォキシ—D—グルコースに対し約 17%の作用性を有し、マルトース、 フルクトース、ァラビノース、スクロース、ガラクトース、マンノース、メレジトース、ソルボ ース、リボース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロースに対する反応性は 2%未満。
(f)ケミカルの影響:銅、銀、カドミウムにより強い阻害を受け、鉄、亜鉛、モノョード酢 酸、 N—ェチルマレイミド、ヒドロキシルァミンにより阻害を受ける。
[3] ぺ-シリウム属糸状菌力 ぺ-シリウム 'リラシノエキヌラタム（Penicillium lilacinoe chinulatum)もしくはぺ-シリウム ·イタリカム（Penicillium italicum)である請求 項 1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[4] 以下の (a)〜(e)のいずれかに該当するタンパク質。
(a)配列番号 2に示すアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質
(b)配列番号 2に示すアミノ酸配列にお 、て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わ ない範囲において N末端側の連続する複数のアミノ酸残基を欠失したタンパク質
(c)配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 N末端側 15個以上 22個以下の連続す るアミノ酸を欠失したタンパク質
(d)上記 (a)〜(c)のいずれかに示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつグルコースデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質
(e)配列番号 2に示すアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつグルコースデヒド ロゲナーゼ活性を有するタンパク質
[5] 以下の (a)〜(e)のいずれかに該当するタンパク質。
(a)配列番号 4に示すアミノ酸配列力 なり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を 有するタンパク質。
(b)配列番号 4に示すアミノ酸配列にお 、て、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わ ない範囲において N末端側の連続する複数のアミノ酸残基を欠失したタンパク質。
(c)配列番号 4に示すアミノ酸配列にお 、て、 N末端側 15個以上 19個以下の連続す るアミノ酸を欠失したタンパク質。
(d)上記 (a)〜(c)のいずれかに示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつグルコースデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質。
(e)配列番号 4に示すアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつグルコースデヒド ロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
[6] 請求項 4または 5に記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。
[7] 請求項 6に記載の核酸を宿主生物において機能的なプロモーター下に接続してなる 組換えプラスミド。
[8] 請求項 7に記載の組換えプラスミドを宿主微生物に形質転換してなる組換え微生物
[9] 宿主微生物が大腸菌である請求項 8に記載の組換え微生物。
[10] 請求項 9に記載の微生物を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼを抽出'精製してな るグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
[11] 請求項 1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いてなるグルコース濃度の測定方 法。
[12] 請求項 1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアツセィキット。
[13] 請求項 1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ。
[14] 以下の（a)、（b)、（c)または (d)の DNAからなる遺伝子。
(a)配列番号 11に記載の塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 11に記載の塩基配列およびイントロンを含む、配列番号 14に記載の 塩基配列からなる DNA
(c) (a)の DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
(d) (b)の DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする 領域を含む DNA
[15] 以下の（a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号 10に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 10に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加 (挿入)されたアミノ酸配列カゝらなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質
[16] 請求項 14に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
[17] 請求項 16に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
[18] 宿主が大腸菌である請求項 17に記載の形質転換体。
[19] 請求項 17に記載の形質転換体を栄養培地にて培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性 を有するタンパク質を製造する方法。
[20] 糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを糸且換え生産する方法において、その N 末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵 素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする GDHの生産方法。
[21] 糸状菌由来の GDHを組換え生産する方法において、その N末端領域に存在するシ グナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵 素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする請求項 20に記載の GDH の生産方法
[22] 配列番号 9、 10のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、その N末端に存在する MLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除 して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高め ることを特徴とする請求項 20に記載の GDHの生産方法。
[23] 配列番号 9、 10のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、その N末端に存在する MLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列に、 1〜22個のアミノ酸置換ま たは Z及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて 発現活性を高めることを特徴とする請求項 20に記載の GDHの生産方法。
[24] 糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼの N末端に存在する MLGKLSFLSALS LAVAATLSNSTSAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させるこ とによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、 1 〜25個のアミノ酸置換または Z及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列 が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項 20に記載の GD Hの生産方法。
[25] 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)において、その N末端に存在するシ グナルペプチドをコードする DNA配列の一部、ある 、は全てを置換または Z及び欠 損させた GDH遺伝子をコードする請求項 20に記載の生産方法に使用される DNA 配列。
[26] 請求項 25の DNA配列を含んでなる組換えベクター。
[27] 請求項 26に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
[28] 請求項 27に記載の形質転換体を用いて生産した GDHタンパク質。
[29] 請求項 28に記載の GDHタンパク質を含む組成物。
[30] 請求項 29記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
[31] 請求項 30記載の組成物を含むダルコースセンサ。
[32] フラビン化合物を補酵素とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)を含む 組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選 ばれるいずれか 1つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させな V、場合と比べて GDHの安定性を向上させる方法。
[33] 溶液中で共存させる各化合物の終濃度が 0. 01重量％以上であり、かつ、各化合物 の合計の濃度が 30重量％以下である請求項 32に記載の安定性を向上させる方法。
[34] 添カ卩する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、ダルコン酸ナトリウム、グル クロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチルー α— D—ダルコシド、シクロデキストリン、 at —D—メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、ァラニン、セリン、 BSA、塩 化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クェン酸三ナトリウム、硫酸アンモ-ゥム、コハク酸、マロ ン酸、グルタル酸、ァラビノース、ソルビタン、 2—デォキシ一 D—グルコース、キシロ ース、フルクトース、ァスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フエ-ルァラニン、プロリ ン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンカもなる群より選ばれるいずれか 1つ以上であ ることを特徴とする請求項 32に記載の熱安定性を向上させる方法。
[35] フラビン化合物を補酵素とする GDHが糸状菌由来であることを特徴とする請求項 32 に記載の熱安定性を向上する方法。
[36] 請求項 32に記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性 GDHを含む組成物。
[37] フラビン化合物結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)組換え体を含む組成 物において、 4°Cで保存した該組成物と比べて、 50°C、 15分処理した場合でも、 20 %以上の GDH活性を残存することを特徴とする請求項 36記載の GDH含有組成物
[38] フラビン化合物結合型 GDHを含む組成物にお ヽて、 4°Cで保存した該組成物と比 ベて、 50°C、 30分処理した場合でも、 10%以上の GDH活性を残存することを特徴 とする請求項 36記載の GDH含有組成物。
[39] 請求項 36に記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
[40] 請求項 36に記載の組成物を含むグルコースセンサ。
[41] 可溶性の補酵素結合型のグルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)を含む組成物にお!ヽ て、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか 1つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べて GDHの熱安定性が向上した組成物の製造方法。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2022850A1 (en) * 2006-05-29 2009-02-11 Amano Enzyme Inc. Flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase
WO2009069381A1 (ja) * 2007-11-28 2009-06-04 Amano Enzyme Inc. フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法
WO2009084616A1 (ja) 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
WO2010053161A1 (ja) * 2008-11-06 2010-05-14 ユニチカ株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2011083251A (ja) * 2009-10-16 2011-04-28 Kagawa Univ キノプロテイングルコース脱水素酵素およびその製造方法
JP5889800B2 (ja) * 2010-12-01 2016-03-22 キッコーマン株式会社 大腸菌形質転換体、それを用いたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、および、変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2016075553A (ja) * 2014-10-06 2016-05-12 東洋紡株式会社 グルコースセンサによるグルコース測定方法
WO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2016-10-13 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JPWO2016035849A1 (ja) * 2014-09-04 2017-07-27 東洋紡株式会社 グルコース脱水素酵素製剤
US10077432B2 (en) 2014-03-21 2018-09-18 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP2018154579A (ja) * 2017-03-16 2018-10-04 栄研化学株式会社 抗体フラグメントとグルコース脱水素酵素との融合タンパク質
WO2019230614A1 (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 天野エンザイム株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼの改良
US10961514B2 (en) 2016-01-14 2021-03-30 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60331477D1 (de) 2002-12-24 2010-04-08 Ikeda Food Res Co Ltd Coenzymbindende glukosedehydrogenase
EP2365073A1 (en) 2005-03-25 2011-09-14 Ikeda Food Research Co. Ltd. Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same
CN104046604A (zh) * 2014-04-24 2014-09-17 天津科技大学 采用喷雾干燥法破碎乳酸菌细胞壁制备胞内乳糖酶粉剂的方法
WO2018181980A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Kikkoman Corporation Continuous glucose monitoring using an fad-dependent glucose dehydrogenase
CN108486027A (zh) * 2018-04-04 2018-09-04 江南大学 一种fad为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法
CN110438098B (zh) * 2019-08-29 2020-12-29 遵义医科大学珠海校区 一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082595A1 (en) * 2001-08-03 2003-05-01 Bo Jiang Nucleic acids of aspergillus fumigatus encoding industrial enzymes and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058958A1 (ja) 2002-12-24 2004-07-15 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素
WO2006101239A1 (ja) 2005-03-25 2006-09-28 Ikeda Food Research Co., Ltd. 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Structural Analysis", article "Tanpakushitsu Jikken Protocol Vol. 1, Functional Analysis Vol. 2"
BAK T.G. ET AL.: "Studies on glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. 3. General enzymatic properties", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 146, no. 2, 1967, pages 317 - 327, XP002373580 *
BAK T.G. ET AL.: "Studies on glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 139, no. 2, 11 July 1967 (1967-07-11), pages 277 - 293, XP009067679 *
BAK T.G. ET AL.: "Studies on glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site", BIOCIM BIOPHYS ACTA, vol. 146, no. 2, 1967, pages 328 - 335, XP003018176 *
BAK T.G. ET AL.: "Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by rho-benzoquinone and hydroquinone", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 139, no. 2, 11 July 1967 (1967-07-11), pages 265 - 276, XP003018175 *
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 139, no. 2, 11 July 1967 (1967-07-11), pages 265 - 76
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 139, no. 2, 11 July 1967 (1967-07-11), pages 277 - 93
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 146, no. 2, pages 317 - 27
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 146, no. 2, pages 328 - 35
KARLIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SCIENCE, vol. 214, 1981, pages 1205

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2022850A4 (en) * 2006-05-29 2009-11-18 Amano Enzyme Inc FLAVIN-ADENIN-DINUCLEOTIDE BINDING GLUCOSE-DEHYDROGENASE
EP2022850A1 (en) * 2006-05-29 2009-02-11 Amano Enzyme Inc. Flavin adenine dinucleotide-binding glucose dehydrogenase
WO2009069381A1 (ja) * 2007-11-28 2009-06-04 Amano Enzyme Inc. フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法
JPWO2009069381A1 (ja) * 2007-11-28 2011-04-07 天野エンザイム株式会社 フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素遺伝子が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素の製造法
WO2009084616A1 (ja) 2007-12-28 2009-07-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子
US8445221B2 (en) 2007-12-28 2013-05-21 Ikeda Food Research Co., Ltd. Modified glucose dehydrogenase gene
WO2010053161A1 (ja) * 2008-11-06 2010-05-14 ユニチカ株式会社 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2011083251A (ja) * 2009-10-16 2011-04-28 Kagawa Univ キノプロテイングルコース脱水素酵素およびその製造方法
JP5889800B2 (ja) * 2010-12-01 2016-03-22 キッコーマン株式会社 大腸菌形質転換体、それを用いたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、および、変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
US10077432B2 (en) 2014-03-21 2018-09-18 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JPWO2016035849A1 (ja) * 2014-09-04 2017-07-27 東洋紡株式会社 グルコース脱水素酵素製剤
JP2016075553A (ja) * 2014-10-06 2016-05-12 東洋紡株式会社 グルコースセンサによるグルコース測定方法
WO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2016-10-13 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JPWO2016163448A1 (ja) * 2015-04-09 2018-02-08 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
US10913971B2 (en) 2015-04-09 2021-02-09 Toyobo Co., Ltd. Enzyme preparation for use in measurement of glucose
JP2021118744A (ja) * 2015-04-09 2021-08-12 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP2022062148A (ja) * 2015-04-09 2022-04-19 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP7156437B2 (ja) 2015-04-09 2022-10-19 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
JP7276530B2 (ja) 2015-04-09 2023-05-18 東洋紡株式会社 グルコース測定用酵素製剤
US10961514B2 (en) 2016-01-14 2021-03-30 Ikeda Food Research Co., Ltd. Flavin-conjugated glucose dehydrogenase
JP2018154579A (ja) * 2017-03-16 2018-10-04 栄研化学株式会社 抗体フラグメントとグルコース脱水素酵素との融合タンパク質
WO2019230614A1 (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 天野エンザイム株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼの改良

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