JPWO2016035849A1 - グルコース脱水素酵素製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
D−グルコース + 電子受容体(酸化型) →
D−グルコノ−δ−ラクトン + 電子受容体(還元型)
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているGDHとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン(以下PQQとも記載)依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド(以下FADとも記載)依存型の3種類などが知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下NADとも記載)などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるNAD等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、PQQ依存型GDHはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型GDH(以下FAD−GDHとも記載)が浸透しつつある。
GDH製剤はその由来生物もしくは宿主生物より精製して得られるため、前記生物に固有の蛋白質を少量ながら含んでいる場合がある。そのような場合において、GDHの精製が十分でない場合には前記蛋白質がGDH製剤に持ち込まれる可能性があるが、前記蛋白質として例えばオリゴ糖加水分解酵素(マルトースなど、グルコースをその構造の一部に含む物質に働いてグルコースを生産する可能性がある酵素)がGDH製剤に一定量存在した場合、たとえばサンプル中に存在するマルトースなどのオリゴ糖が分解されてグルコースが産生し、これがFAD−GDHの酸化を受けることで、実際のサンプル中のグルコース濃度よりも高い測定値が算出される可能性があると考えられた。
また、グルコースセンサにおいて、GDH製剤には種々の目的で添加物(たとえばマルトースなどのオリゴ糖)が添加されている場合がある。そのような場合において、前記加水分解酵素がGDH製剤に微量なりとも存在すれば、長期保存中に前記オリゴ糖が分解されてグルコースが産生し、これがFAD−GDHの酸化を受けることで、グルコース測定キットやグルコースセンサのブランクアップを招く可能性があると考えられた。
項1.
以下の(1)に示す特性を有する、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物。
(1)40mmol/LのPIPES、50mMのマルトースおよび1mmol/Lのフェリシアン化カリウムを含む反応液(pH6.5)2.9mLを37℃で5分予備加温し、前記反応液に15000U/mLの前記グルコースデヒドロゲナーゼを0.1mL添加して37℃で5分間インキュベーションする間に405nmの吸光度を記録し、その初期直線部分から405nmの吸光度の1分あたりの減少度を算出した際、吸光度減少が1分あたり20mAbs未満である。
項2.
項1に記載の組成物を含む、グルコース測定用センサ。
項3.
項1に記載の組成物を用いる、グルコース測定方法。
項4.
項2に記載のグルコース測定用センサを用いる、グルコース測定方法。
(1)40mmol/LのPIPES、50mMのマルトースおよび1mmol/Lのフェリシアン化カリウムを含む反応液(pH6.5)2.9mLを37℃で5分予備加温する。
(2)前記反応液に15000U/mLの前記グルコースデヒドロゲナーゼを0.1mL添加して37℃で5分間インキュベーションする間に405nmの吸光度を記録し、その初期直線部分から405nmの吸光度の1分あたりの減少度を算出する。
大腸菌が宿主生物の場合、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリDH5α等が、酵母が宿主生物の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、クリプトコッカス・エスピー S−2株(FERM BP−10961)、クリプトコッカス・エスピー S−2 D−11株(FERM BP−11482)等が、糸状菌が宿主生物である場合は、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Mucor hiemalis、Mucor prainii、Tricoderma reesei等を、それぞれ例示できる。
(a)Aspergillus oryzae(アスペルギルス・オリゼ)、Aspergillus terreus(アスペルギルス・テレウス)、Penicillium lilacinoechinulatum(ペニシリウム・リラシノエキヌラタム)、Penicillium italicum(ペニシリウム・イタリカム)、Mucor hiemalis(ムコール・ヒマリス)、Mucor RD056860、Mucor subtilissimus NBRC6338、ムコール・プライニ(Mucor prainii)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus)、ムコール・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス(Mucor circinelloides f.circinelloides)コレトトリカム(Colletotrichum)属(その有性世代であるグロメレラ(Glomerella)属を含む)、アースリニウム(Arthrinium)属(その有性世代であるアピオスポラ(Apiospora)属を含む)、タラロマイセス(Talaromyces)属
例えば、FAD−GDHとして流通している製品の中には、製造者が、その純度を、費用対効果等の観点から、「グルコース測定に支障をきたさないと考える範囲内で多少の不純物の含有を許容する程度」に留めている場合がある。このような製品は、「FAD−GDH」として流通していても、本明細書で言う「FAD−GDHを含む組成物」に含まれる。
なお、メディエータについては、種々の官能基による修飾体を用いるなどして、酵素とともに電極上に固定化させて用いてもよい。
本明細書において、FAD−GDH活性測定は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液(0.1mol/L HEPES、200mmol/L D−グルコース、0.55mmol/L DCPIP、pH6.5)2.9mLを石英セルにいれ、37℃で5分間予備加温する。そしてGDH溶液0.1mLを加えて混和し、37℃で5分反応させ、この間700nm吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から1分間あたりの吸光度の減少度(ΔODTEST)を算出する。盲検は、GDH溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に37℃5分インキュベートして700nm吸光度を記録し、その初期直線部分から1分間あたりの吸光度の減少度(ΔODBLANK)を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値(U/mL)を算出する。なおここでは、基質存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量を1Uと定義する。
GDH活性(U/mL)=[(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.0×希釈倍率 ]/(4.5×1.0×0.1)
なお、ここで
3.0 :GDH溶液混和後の容量(mL)
4.5 :DCPIPのミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)
1.0 :光路長(cm)
0.1 :添加するGDH溶液の液量(mL)
である。
本発明に規定するマルトース加水分解活性は、特に断りのない限り以下のとおり測定される。
反応液(40mmol/L PIPES、1mmol/L フェリシアン化カリウム、50mM マルトース、pH6.5)2.9mlを石英セルにいれ、37℃で5分間予備加温する。そこに15000U/mlのFAD−GDH0.1mLを加えて混和し(最終的なGDH濃度:500U/ml)、37℃で5分反応させ、この間405nmの吸光度を測定して1分間あたりの吸光度の減少度を算出する(ΔODTEST)。盲検は、GDH溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に37℃5分インキュベートして405nmの吸光度を記録し、その初期直線部分から1分間あたりの吸光度の減少度を算出する(ΔODBLANK)。ΔODTESTよりΔODBLANKを差し引いた数値を、オリゴ糖加水分解に起因する吸光度減少度として評価する。
FAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼの組換え発現
アスペルギルス・オリゼ由来FAD依存型GDHを、特許文献7に記載のとおり麹菌宿主で組換え発現を行った。すなわち、アスペルギルス・オリゼ由来GDH遺伝子を、AmyBプロモーター、AmyBターミネーター、アスペルギルスニドランス由来sC遺伝子を含むpUSAプラスミド(非特許文献1)のSmaIサイトに平滑化の上連結し、組換えプラスミドを構築した。また、前記組換えプラスミドを用いて非特許文献5に記載の方法に従い、アスペルギルス・オリゼNS4株を形質転換して形質転換体を得た。この形質転換体を、10L容ジャーファーメンターを用いて、(1.5% 大豆ペプトン、1% マルトエキス、0.1% MgSO4 ・7H20、2% グルコース、2% マルトース(pH6.5))の組成からなる培地にて、培養温度30℃で50時間通気攪拌培養した。培養菌体をろ過した後、硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて狭雑タンパク質を沈殿させ、遠心分離でGDH粗抽出液を得た。
フェニルセファロースを用いたFAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼの精製
Phenyl sepharose 6 Fast Flow HighSub(GEヘルスケア製)を充填したカラムに、まず0.5飽和の硫酸アンモニウムを溶解させた50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)を通液して緩衝化し、ここに実施例1で得られたGDH粗抽出液を通液し、GDHを含む蛋白質を吸着させた。さらに緩衝化に用いたバッファーを通液して未吸着の蛋白質を洗浄したのち、硫酸アンモニウム濃度をゼロになるまでグラジエントをかけて吸着した蛋白質を溶出させた。溶出液をフラクション分画し、各フラクションのGDH活性とオリゴ糖分解活性を測定した。但し、ここでのオリゴ糖加水分解酵素活性測定は、GDH濃度1500U/mlの溶液を使用し、10分間の吸光度減少の積算値(ΔmAbs/10分)に希釈倍率を乗じた値とした。結果を図1に示す。GDH活性とオリゴ糖分解活性のピークは別のフラクションにあるものの、ほとんどのフラクションで両方の活性を示しており、これらを分けてプールすることは困難であった。このクロマトグラフィーでGDH活性を有する全画分をプールしたもの(GDH1)、GDHのピークの前半部分をプールしたもの(GDH2)、GDHのピークの最初の1/4のみをプールしたもの(GDH3)についてそれぞれ調製した。
精製GDH中のオリゴ糖分解活性の測定
実施例2で得られたそれぞれの精製GDHについて、上述のマルトース加水分解活性測定方法に従ってGDH500U/mlあたりのマルトース加水分解活性を測定した。結果を表1に示す。なお、精製GDH1および精製GDH2は比較例、精製GDH3および精製GDH4は実施例である。
各種精製GDHを用いたグルコース定量用組成物の作成とブランクアップ検証
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液(pH=7.5)を作製した(対照組成)。
1mM クエン酸
5mM マルチトール
50mM フェリシアン化カリウム
500U/ml FAD依存型GDH(実施例1〜2で作製したもの)
0.25% カルボキシメチルセルロース
上記溶液を作製直後のもの、25℃で1時間、6時間、16時間、24時間置いたものについて、それぞれ5μLを3電極を具備するディスポーサブルチップ(DEP−CHIP、バイオデバイステクノロジーズ社製)の作用極・対極・参照極上に滴下し、50℃10分の加温処理を行うことでセンサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ/ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に生理食塩水5μLを添加して+0.3Vの電圧を印加して電流値をモニタリングした。結果を図3に示す。
すなわち、本発明の実施例である精製GDH3および精製GDH4を用いた組成物(製剤)を提供することにより、センサ組成中やサンプル中に含まれるマルチトールの影響を低減しうることが明らかとなった。
Claims (4)
- 以下の(1)に示す特性を有する、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物。
(1)40mmol/LのPIPES、50mMのマルトースおよび1mmol/Lのフェリシアン化カリウムを含む反応液(pH6.5)2.9mLを37℃で5分予備加温し、前記反応液に15000U/mLの前記グルコースデヒドロゲナーゼを0.1mL添加して37℃で5分間インキュベーションする間に405nmの吸光度を記録し、その初期直線部分から405nmの吸光度の1分あたりの減少度を算出した際、吸光度減少が1分あたり20mAbs未満である。 - 請求項1に記載の組成物を含む、グルコース測定用センサ。
- 請求項1に記載の組成物を用いる、グルコース測定方法。
- 請求項2に記載のグルコース測定用センサを用いる、グルコース測定方法。
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