CN112481227B - 利用维生素b2提高fad依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法。是将保藏编号为CGMCC NO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括菌株培养阶段、碳源饲喂阶段、饥饿饲喂阶段、诱导表达阶段在诱导过程加维生素B2水溶液。本发明有效解决了现有技术中生产制备的葡萄糖脱氢酶酶活较低的问题，具有同体积发酵液获得更高的葡萄糖脱氢酶产量等优点。

Description

利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵制备葡萄糖脱氢酶的方法，特别是指一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法。
背景技术
FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FAD-GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。
在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，因此GDH被认为是代替GOD的最具潜力的检测用酶。
申请号为201710949621.8的发明专利申请中公开了一种产FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的重组毕赤酵母及其构建方法和，通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化，人工合成基因片段，构建重组表达载体pMD-GDH，转化毕赤酵母X33菌株(CGMCC No.14382)后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。在10L发酵罐培养时经过136小时诱导培养，产量为257600U/L。
通常通过改进发酵工艺，来提高产量。辅因子对细胞生长和胞内物质代谢至关重要。发酵液中的溶氧水平与微生物细胞内的NADH/NAD+比率也有密切关系。同时，微生物胞外氧化还原态势能够影响微生物胞内的NADH/NAD+的比率。维生素B2是一种非常重要的辅酶，是合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体物质。FMN和FAD是黄素酶-NADH脱氢酶的重要组成部分，作为呼吸链的组成成分，与糖、脂和氨基酸的代谢密切相关。维生素B2是NADH脱氢酶的重要组成部分。理论上维生素B2可以通过调节微生物胞内NADH脱氢酶活性进而调节胞内的NADH/NAD+比率，但利用外源添加维生素B2来提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的报道尚未见到。
发明内容
本发明提出一种利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，通过外源添加维生素B2后能够提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。
本发明的整体技术构思是：
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为10％～15％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mLPTM1，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、pH＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14mL/L PTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16mL/h/L，流加时间为4～6小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含10～14mL/L PTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制pH＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.5mM～1mM，当酶活不再升高时停止发酵。
本发明的具体技术构思还有：
为便于实现工业化生产，优选的技术实现手段是，还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC NO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris制成种子液。
优选的一级种子的制备方法是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为28～30℃、震荡速率为200～250转/分钟的条件下振荡培养12～16小时制成一级种子。
优选的种子液的制备方法是，按体积比为3％～5％接种量将一级种子转接于80～120mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为200～250转/分钟的条件下培养6～10小时，至OD600≈6～8制成种子液。
优选的发酵培养液的装量为，发酵培养液在反应釜中的装量为45％～56％。
所述的步骤A、D中调整pH采用浓氨水。
为更好地控制反应的终点，提高工业化生产的经济性，优选的技术实现手段是，步骤D中每隔12小时取样一次检测OD600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法：
酶活检测：
毕赤酵母菌经8000转/分钟离心5分钟收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力，具体方法如下：DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH＝5.5，300μMDCIP和100mM葡萄糖。具体如下：
1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl；
2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；
3、计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。
酶活测定方法参见Sygmund C，Staudigl P，Klausberger M，et al.Heterologousoverexpression of Glomerella cingulata FAD-dependent glucose dehydrogenase inEscherichia coli and Pichia pastoris[J].Microbial Cell Factories，10，1(2011-12-12)，2011，10(1):1-9.
本发明所具备的实质性特点及取得的技术进步在于：
本发明采用外源添加维生素B2，培养108小时后FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量比对照组提高34.55％(最高可达40.39％)，对同体积的发酵液而言，FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量得到提高。实验结果还显示外源添加维生素B2后可以延长诱导培养时间至132小时，不外源添加维生素B2时，诱导108小时后酶活开始降低，诱导培养132小时后产量大于620000U/L(最高可达718840U/L)；实现同体积发酵液获得更高的产量。所以外源添加维生素B2后能够显著提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的产量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为15％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4.5mLPTM1，在温度为30℃、搅拌转速为700转/分钟、pH＝5.2、通风量为2.0vvm的条件下通气搅拌培养24小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含14mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为16mL/h/L，流加时间为6小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含14mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.3％左右，控制pH＝6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为1mM，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为30℃、震荡速率为250转/分钟的条件下振荡培养16小时制成一级种子。
按体积比为5％接种量将一级种子转接于120mL BMGY的摇瓶培养基中，在温度为30℃、转速为250转/分钟的条件下培养10小时，至OD600≈8制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为56％。
所述的步骤A、D中调整pH采用浓氨水。
步骤D中每隔12小时取样一次检测OD600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为10％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4mLPTM1，在温度为28℃、搅拌转速为600转/分钟、pH＝4.8、通风量为1.2vvm的条件下通气搅拌培养l8小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12mL/h/L，流加时间为4小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈160，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含10mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％左右，控制pH＝5.9，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.5mM，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mL YPD液体培养基中，在温度为28℃、震荡速率为200转/分钟的条件下振荡培养12小时制成一级种子。
按体积比为3％接种量将一级种子转接于80mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下培养6小时，至OD600≈6制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为45％。
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为13％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4.3mLPTM1，在温度为29℃、搅拌转速为650转/分钟、pH＝5.0、通风量为1.6vvm的条件下通气搅拌培养21小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含12mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为14mL/h/L，流加时间为5小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈170，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含12mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.25％左右，控制pH＝6.0，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.75mM，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为29℃、震荡速率为230转/分钟的条件下振荡培养14小时制成一级种子。
按体积比为4％接种量将一级种子转接于100mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为29℃、转速为230转/分钟的条件下培养8小时，至OD600≈7制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为50％。
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为11％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4。1mLPTM1，在温度为28、搅拌转速为620转/分钟、pH＝4.9、通风量为1.3vvm的条件下通气搅拌培养l9小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含11mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为13mL/h/L，流加时间为4.5小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈165，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含11mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.22％左右，控制pH＝5.9，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.6mM，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为28℃、震荡速率为210转/分钟的条件下振荡培养13小时制成一级种子。
按体积比为3.5％接种量将一级种子转接于90mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为28℃、转速为210转/分钟的条件下培养7小时，至OD600≈6制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为48％。
其余内容同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为14％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4.4mLPTM1，在温度为30℃、搅拌转速为690转/分钟、pH＝5.1、通风量为1.8vvm的条件下通气搅拌培养22小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含13mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为15mL/h/L，流加时间为5.5小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈175，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含13mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.28％左右，控制pH＝6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.9mM，当酶活不再升高时停止发酵。
还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为30℃、震荡速率为240转/分钟的条件下振荡培养15小时制成一级种子。
按体积比为4.5％接种量将一级种子转接于110mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为30℃、转速为240转/分钟的条件下培养9小时，至OD600≈8制成种子液。
发酵培养液在反应釜中的装量为53％。
其余内容同实施例1。
申请人对实施例1-5中获得的葡萄糖脱氢酶的酶活进行了测定，并与未加入维生素B2进行了对照，结果如下：
表一实施例1-5与对照诱导培养108小时酶活(U/L)
Figure BDA0002819099350000091
表二实施例1-5与对照诱导培养最终酶活(U/L)
Figure BDA0002819099350000092
通过以上实验不难看出，加入维生素B2诱导培养108小时，实施例1-5相比对照酶活提高34.55％-40.39％，
实验结果还显示外源添加维生素B2后可以延长诱导培养时间至132小时，对照诱导108小时后酶活开始降低，发酵终止；实施例1-5相比对照酶活提高15.81％-20％，可以看出最终产量得到明显提高，所以实现同体积发酵液获得更高的产量。

Claims (6)

1.利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，是将保藏编号为CGMCCNO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris接种至以甘油为碳源的发酵培养液中进行培养；其特征在于包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段
接种量为10％～15％，发酵培养基选用BSM培养基，每升发酵培养液中含有4～4.5mLPTM1，发酵培养液在反应釜中的装量为45％～56％，在温度为28℃～30℃、搅拌转速为600～700转/分钟、pH＝4.8～5.2、通风量为1.2～2.0vvm的条件下通气搅拌培养l8～24小时；
B、碳源饲喂阶段
当发酵过程中甘油耗尽时流加包含10～14mL/LPTM1且质量体积比为50％的甘油，流加量为12～16mL/h/L，流加时间为4～6小时；
C、饥饿饲喂阶段
至OD600≈160～180，停止流加甘油至培养基中甘油耗尽；
D、诱导表达阶段
流加包含10～14mL/LPTM1的甲醇使发酵液中甲醇终浓度维持在0.2％～0.3％左右，控制pH＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使发酵液中溶氧量≈0，在诱导过程加维生素B2水溶液至培养液中维生素B2终浓度为0.5mM～1mM，当酶活不再升高时停止发酵。
2.根据权利要求1所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于还包括扩大培养阶段，是将保藏编号为CGMCC NO.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris制成种子液。
3.根据权利要求2所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于所述的扩大培养是将保藏编号为CGMCC No.14382的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris接种到5mLYPD液体培养基中，在温度为28～30℃、震荡速率为200～250转/分钟的条件下振荡培养12～16小时制成一级种子。
4.根据权利要求3所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于按体积比为3％～5％接种量将一级种子转接于80～120mLBMGY的摇瓶培养基中，在温度为28℃～30℃、转速为200～250转/分钟的条件下培养6～10小时，至OD600≈6～8制成种子液。
5.根据权利要求1所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于所述的步骤A、D中调整pH采用浓氨水。
6.根据权利要求1所述的利用维生素B2提高FAD依赖的葡萄糖脱氢酶产量的方法，其特征在于步骤D中每隔12小时取样一次检测OD600和菌体湿重，每隔12小时测定表达的葡萄糖脱氢酶的活性。
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