CN110894219A - 毕赤酵母转录因子hac1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用 - Google Patents

毕赤酵母转录因子hac1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。是以GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC和ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为特异引物，以毕赤酵母Pichia p astoris GS115的基因组DNA为模板，采用PCR扩增方法获得毕赤酵母转录因子HAC1，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明解决了目前如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白正常分泌表达的问题，具有将高效重组微生物技术和蛋白质工程技术相结合，提高了青霉来源GOD酶活等优点。

Description

毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。
背景技术
1928年Muller等人首次于黑曲霉(A.niger)的无细胞提取液中分离出一种脱氢酶，将其命名为葡萄糖氧化酶(简称GOD)；1936年又首次于灰绿青霉(Penicilliumglaucum)中发现GOD。
葡萄糖氧化酶安全、无毒、无副作用，在食品工业、医药、饲料添加等方面应用非常广泛，且商业价值可观。作为国家允许使用的酶制剂之一，近年来市场对葡萄糖氧化酶的需求量逐年增长。但我国葡萄糖氧化酶技术水平尚处于研究发展的初级阶段，存在产量低、酶活低、提纯繁琐等问题，使国内葡萄糖氧化酶仍以进口为主。顾磊等人将黑曲霉来源的GOD通过在毕赤酵母中组合共表达SEC53、CNE1和GCN4基因所得重组菌株，发酵酶活达到1972.9U/mL。郜赵伟等人将点青霉来源的葡萄糖氧化酶基因经过密码子优化实现重组GOD在毕赤酵母中表达，高密度发酵后酶活达到615U/mL。目前在生物传感器领域GOD的应用十分广泛。黑曲霉GOD的糖基化程度高于青霉GOD，较高的糖基化程度限制了传感器中电子从电极迁移到GOD的速率，从而降低了生物传感器的灵敏度。
生产GOD的最常见微生物是曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和酵母属(Saccharomyces)。霉菌在发酵过程中，菌丝会影响搅拌效果，导致菌体与发酵液接触不良，造成GOD产量低，而且黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，淀粉酶、纤维素酶及过氧化氢酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当大的困难；同时还存在着酿酒酵母表达质粒易丢失、GOD高度糖基化、蛋白分泌表达效率低等技术缺陷。
在过去的20多年中毕赤酵母已经发展成为使用最多、最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一，该表达系统具有很多优点：其含有甲醇诱导的强启动子AOX1；操作技术简单、遗传稳定；具有将外源蛋白分泌到胞外的信号肽，方便了后期的分离纯化；作为真核生物，具有许多真核蛋白翻译后修饰的能力；发酵培养基成本低廉、设备简单、适合高密度生长。
然而在使用毕赤酵母表达系统生产重组蛋白时也会面临诸多问题，并不是每种异源蛋白质都能在酵母中高效表达和分泌。如果重组蛋白不能正确折叠成天然构象，就会影响异源蛋白的正常分泌表达。影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素，主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。
HAC1蛋白参与内质网中未折叠蛋白响应(UPR)信号通路，是毕赤酵母中的一个转录因子，能够调控分泌表达途径中的下游靶基因，这些基因包含了各种分子伴侣、折叠因子、内质网中参与糖基化控制以及其他胞内胁迫条件下调控因子的编码基因。
申请人检索的对比文件包括：
申请号为201410606913.8的专利文献中公开了一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，出发菌株为黑曲霉的GOD做的异源表达，其酶活表达水平为1634.7U/mL。黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶失去辅基FAD后无法恢复活性；且来自黑曲霉GOD比青霉属的GOD催化效率低。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种毕赤酵母转录因子HAC1。
本发明的目的之二在于提供一种毕赤酵母转录因子HAC1的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种利用毕赤酵母转录因子HAC1编码的蛋白。
本发明的目的之四在于提供一种利用毕赤酵母转录因子HAC1转化的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
本发明的目的之五在于提供一种利用毕赤酵母转录因子HAC1转化毕赤酵母基因工程菌的方法。
本发明的目的之六在于提供一种毕赤酵母基因工程菌在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
本发明的整体技术构思是：
毕赤酵母转录因子HAC1，其基因序列为SEQ ID No.1。
毕赤酵母转录因子HAC1的制备方法，是以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增获得。
利用毕赤酵母转录因子HAC1编码的蛋白，其序列为SEQ ID No.2。
利用毕赤酵母转录因子HAC1转化的巴斯德毕赤酵母，其拉丁文名称为Pichiapastoris，保藏编号为CGMCC No.18909。
本发明中的毕赤酵母基因工程菌申请人已于2019年11月6日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18909，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。
巴斯德毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：
a、毕赤酵母转录因子HAC1以GeneBank公布的Gene ID8196642设计引物，以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增，下划线字母代表设计加入的酶切位点；
b、PCR产物经纯化回收后由于在目的基因片段两端分别引入了EcoRI、NotI限制性酶切位点，将毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体分别使用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切，毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体各自的双酶切回收产物经1％琼脂糖凝胶核酸电泳检验后，用T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α，双酶切验证筛选阳性转化子，并送测序；
c、重组质粒HAC1/pPICZB采用限制性内切酶SacI线性化，取切好的质粒2微克，冰上放置20分钟后，电转毕赤酵母GS115/Pn-GOD感受态细胞构建重组菌，电转条件：1.5Kv、5ms，快速加入1毫升YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃金属浴静置培养2-6小时，在5000转/分钟的转速下离心2分钟，弃上清，用1毫升灭菌的0.9％生理盐水洗3次，将重组质粒HAC1/pPICZB电转后的菌液涂布于含有200微克/毫升博来霉素和1000微克/毫升G418的YPD平板上，30℃恒温培养3天获得阳性转化子，挑取单菌落接种于含1000μg/mLG418和200μg/mL博来霉素的5mL液体YPCS试管培养基中，14-22小时后加1％(v/v)甲醇，之后24小时和48小时后均各加1％(v/v)甲醇诱导，96小时收菌，12000转/分钟离心1分钟收集上清，测定葡萄糖氧化酶活力，筛选高酶活重组菌株，获得巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisCGMCC No.18909。
巴斯德毕赤酵母在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909在制备葡萄糖氧化酶中的应用，包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段：将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909按5％-10％接种量接种到5毫升灭菌后的YPD培养基中制备一级种子，在温度28℃-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养10-16小时后至OD600＝1-2；按照5％-10％接种量将一级种子转接到容积为500毫升、装有150毫升灭菌后的BMGY培养基的摇瓶中制备二级种子，在温度为28℃-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养8-12小时后至OD600＝6-10；容积为10L的发酵罐初始装4.5升BSM培养基，发酵培养基接种前先调整其pH＝5.0，再按每升培养基加入4-5毫升PTM1，以3％-10％的接种量将二级种子接入灭菌后的发酵培养基；在温度28℃-30℃、通气量为1-3vvm、初始搅拌转速为500转/分钟、12小时候后搅拌转速为700转/分钟的条件下发酵；
B、碳源饲喂阶段：待发酵培养基中甘油耗尽溶氧上升后，按照流加量为12-16毫升/小时/升的条件流加甘油，每升甘油中包含14-16毫升的PTM1，培养4小时，此时培养基中的溶氧量为0；
C、饥饿培养阶段：当菌体OD600＝180-220时，饥饿培养30分钟至2小时，停止流加甘油，当碳源消耗完后溶氧量将升高至不低于50％，直至稳定不变；
D、诱导表达阶段：控制pH＝6.0-6.5，维持整个诱导过程中溶氧量始终为0，按照前10小时流加速率为3-5克/小时/升、10小时后流加速率6-7克/小时/升的条件流加甲醇，每升甲醇中包含10-12毫升PTMl，按山梨醇：甲醇＝1:20的比例流加山梨醇，每升山梨醇中包含14-16毫升的PTM1；在诱导过程中每隔24小时加维生素C水溶液至其终浓度80-100微克/升，发酵至48小时一次性加入维生素B2，使发酵液中维生素B2的终浓度为1-1.5mM。
申请人需要说明的是：
甲醇既是葡萄糖氧化酶表达的诱导剂，又作为毕赤酵母生长的碳源。山梨醇作为一种非抑制性碳源，对醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOXI)转录的抑制较弱，对GOD的胞外降解能起到一定的减缓作用，同时还可以降低有毒副产物的积累。山梨醇与甲醇共同诱导外源蛋白表达，二者具有不同的代谢途径，山梨醇的加入可缓解甲醇单独诱导表达能量不足的压力和甲醇积累造成细胞毒性的问题，提高葡萄糖氧化酶的表达分泌。维生素C作为抗氧化剂，具有强还原性，易被氧化成脱氢维生素C，但其反应是可逆的。在诱导过程中每隔24小时加维生素C水溶液，可减少GOD在诱导表达过程中的损失。葡萄糖氧化酶有两个亚基，每个亚基都有FAD结合位点，连接一个FAD，FAD是葡萄糖氧化酶的辅因子。在维生素B2中含有FAD，加入维生素B2利于增强葡萄糖氧化酶表达。
步骤A中发酵培养基接种前先用浓氨水调整其pH＝5.0。氨水同时也作为菌株生长的氮源。
其中：
LB培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％NaC1；余量为水；
YPD培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；余量为水；
YPDS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；0.5％Sorbitol；余量为水；
YPCS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract，2％Peptone，0.5％Casminoacids，0.5％Sorbitol；
BMGY种子培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；1.34％YNB；400μg/L Biotin；1％Glycerol；100mmol pH＝6.0的磷酸钾缓冲液；
每升BSM发酵培养基由如下原料组成：26.7mL85％H3PO4；0.93gCaSO4；18.2gK2SO4；14.9gMgSO4·7H2O；4.13gKOH；40g甘油；4.35mLPTM1；余量为水；其中PTM1采用过滤除菌，其余原料采用高温高压灭菌；
每升PTM1由如下原料组成：6.0gCuSO4·5H2O；0.08gNaI；3.0gMnSO4·H2O；0.2gNaMoO4·2H2O；0.02gH3BO3；0.5gCoCl2；20.0gZnC12；65.0gFeSO4·7H2O；0.2gbiotin；5mLH2SO4；余量为水。
本发明中的葡萄糖氧化酶酶活测定采用邻一联(二)茴香胺分光光度法，方法参照高庆华等人的文献(高庆华、董聪、王王月等.共表达分子伴侣PDI和Ero1对葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中表达的影响.[J]生物技术通报.2018,34(7):174-179.)。
具体方法如下：
在3mL的反应体系中，包含0.5mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.1)，0.17mmol/L邻联茴香胺溶液和1.72％葡萄糖溶液及0.1mg/mL辣根过氧化物酶，35℃震荡混匀，加入0.1mL葡萄糖氧化酶溶液，用分光光度计，于A＝500nm自动记录随时间变化的吸光度值，根据公式X＝(ΔA500×3.1×df)/(7.5×0.1)，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
X：样品酶活(U/mL)；
ΔA500：活度值；
3.1：反应体积；
df：稀释倍数；
7.5：葡萄糖内酯A500消光系数；
0.1：加入酶液体积。
申请人为验证本申请的技术效果，进行了如下试验：
在10L发酵罐经过诱导培养本发明中的重组毕赤酵母工程菌得到葡萄糖氧化酶酶活力为912U/mL,而巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.11626酶活力为594U/mL。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909的葡萄糖氧化酶表达量是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.11626的1.5倍，这说明毕赤酵母转录因子HAC1的过量表达有助于无活性的未折叠蛋白折叠成其天然构象，促进葡萄糖氧化酶的分泌表达。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、经申请人试验证实，在10L发酵罐经过诱导培养，本发明中的重组毕赤酵母工程菌发酵制备的葡萄糖氧化酶酶活力为912U/mL，而巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisCGMCCNo.11626酶活力为594U/mL。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909的葡萄糖氧化酶表达量是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.11626的1.5倍，这说明毕赤酵母转录因子HAC1的过量表达有助于无活性的未折叠蛋白折叠成其天然构象，促进葡萄糖氧化酶的分泌表达。
2、本发明对GOD的优化利用了现代分子技术与生物工艺工程技术相结合，实现经济可行的酶生产系统，将高效重组微生物技术和蛋白质工程技术相结合，提高了青霉来源GOD酶活，与目前青霉来源GOD的研究相比，已经达到比较高的水平。
3、采用本发明中重组毕赤酵母工程菌制备的GOD酶活水平不如黑曲霉的GOD高，但青霉属来源的葡萄糖氧化酶具有更为优良的酶学特性。青霉属来源的葡萄糖氧化酶的稳定性高于黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶，后者失去辅基FAD后无法恢复活性，而前者重新加入FAD后可以恢复部分活性；来自青霉属的GOD比黑曲霉GOD催化效率高，其对底物亲和力是黑曲霉的6倍，催化效率(kcat/Km)比黑曲霉GOD高出10倍以上，提高了催化过程的灵敏度，尤其应用在生物传感器上具有更好的优势。
本发明中的毕赤酵母基因工程菌申请人已于2019年11月6日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18909，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。
附图说明
本发明的附图有：
图1是本发明中PCR扩增毕赤酵母转录因子HAC1电泳图。
图中M：DNA Marker；1：毕赤酵母转录因子HAC1；
HAC1的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1000bp左右处出现了明亮的特异性条带，与毕赤酵母转录因子HAC1预期大小996bp相一致。
图2是HAC1-pPICZB载体酶切电泳图。
图中M：DNA Marker；2：HAC1-pPICZB载体酶切；
毕赤酵母转录因子HAC1长度996bp，pPICZB空载体的大小为3.3kb，从琼脂糖凝胶电泳图可以看出，重组质粒经双酶切得到1kb左右的特异性条带，表明毕赤酵母转录因子HAC1成功插入到pPICZB载体中，初步判定HAC1-pPICZB重组载体构建成功。
图3是HAC1-pPICZB载体中的毕赤酵母转录因子HAC1测序序列比对结果截图。
毕赤酵母转录因子HAC1与Gen Bank公布的Gene ID 8196642的核苷酸序列比对有2处突变，第174位碱基C→T,第465位碱基A→G，凑巧的是，这两处突变使密码子变成了毕赤酵母的偏爱密码子，氨基酸序列完全一致。证明重组表达载体HAC1/pPICZB构建成功。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。
实施例1
HAC1表达载体的构建
1、基因的扩增
毕赤酵母转录因子HAC1以GenBank公布的Gene ID 8196642设计引物，引物委托安徽通用生物公司合成。设计引物序列中下划线字母代表设计加入的酶切位点。
HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC；
HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC
以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的基因组DNA为模板，以引物对HAC1-F/HAC1-R进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共32个循环；72℃再延伸10分钟。
PCR反应体系如下：
表1PCR反应体系
反应物 体积(μL)
DNA聚合酶 1
10×Buffer 5
HAC1-F 2
HAC1-R 2
2.5mM dNTP 4
模板 2
ddH<sub>2</sub>O up to 50
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的DNA片段。目的基因片段的纯化回收操作参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书步骤进行。具体见图1。
2、限制性酶切反应
所使用的限制性内切酶购自NEB公司，由于在目的基因片段两端分别引入了EcoRI、NotI限制性酶切位点，将毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体分别使用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切，限制性酶切反应体系分别如下：
表2限制性酶切体系1
反应物 体积(μL)
毕赤酵母转录因子HAC1 35
10×Buffer 5
EcoR I 2
Not I 2
ddH<sub>2</sub>O up to 50
表3限制性酶切体系2
反应物 体积(μL)
pPICZB载体 20
10×Buffer 5
EcoR I 2
Not I 2
ddH<sub>2</sub>O up to 50
将以上限制性酶切反应体系放于37℃金属浴中反应15分钟，用1％琼脂糖凝胶电泳检验，然后参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物。
3、载体与目的DNA片段的连接
T4 DNA连接酶购自NEB公司，毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体各自的双酶切回收产物经1％琼脂糖凝胶核酸电泳检验后，用T4 DNA连接酶连接，连接体系如下：
表4连接体系
Figure BDA0002337508850000101
Figure BDA0002337508850000111
将以上连接体系放于16℃恒温水浴锅中过夜连接，再进行大肠杆菌转化。
4、大肠杆菌感受态细胞DH5α的转化
具体转化步骤如下：
(1)取50μL的E.coli DH5α感受态细胞置于冰上30分钟，加入10微升重组载体，混匀，静置30分钟；
(2)然后将其放入42℃恒温水浴锅中热激60秒后，迅速置于冰上放置2分钟；
(3)最后加入800微升LB液体培养基，置于37℃恒温摇床150-180转/分钟培养1小时；
(4)培养后的菌液在8000转/分钟下离心1分钟，弃掉部分上清，利用剩余的约200微升LB培养基重悬菌体，然后将其涂布于含有博来霉素抗生素(25-50微克/毫升)的LB固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16小时。
5、阳性转化子的筛选及鉴定
待转化子长出，从LB固体平板上挑取单菌落接种到含博来霉素抗生素(25-50微克/毫升)的液体LB培养基中培养，并提取质粒，质粒提取步骤参照质粒提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书步骤进行。
将提取的质粒使用限制性内切酶EcoR I、Not I进行双酶切验证。具体如图2所示。
再将阳性转化子委托安徽通用生物公司测序鉴定,使用pPICZB载体两端引物5’AOX1、3’AOX1进行测序鉴定，利用序列比对工具Vector NTI进行序列比对，比对结果如图3所示。经Vector NTI软件比对将测序正确的转化子提取的质粒转化毕赤酵母感受态细胞。
实施例2
毕赤酵母感受态细胞的制备
葡萄糖氧化酶基因GOD的基因及蛋白序列参见申请号为201510893562.8的专利申请文件。
葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母GS115中表达，首先去掉其自身的信号肽编码序列，以毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.11626的基因组DNA为模板通过PCR方法设计引物将青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去除。引物序列如下：GodF:5′-GgaattcTATAGCCCGGCCGAGCAGATCGAC-3′；GodR:5′-ATAAGAATgcggccgcGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC-3′(下划线字母代表设计加入的酶切位点)。将GOD基因片段插入到表达载体pPIC9K中，构建pPIC9K-GOD载体。具体构建过程参照实施例1。
将线性化pPIC9K-GOD质粒电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，筛选出的阳性转化子制成毕赤酵母GS115/Pn-GOD感受态细胞(具体步骤参见申请号为200710052783.8的专利申请文件)。
实施例3
产葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母菌株的构建
重组质粒HAC1/pPICZB采用限制性内切酶SacⅠ线性化，取切好的质粒2微克，冰上放置20分钟后，电转毕赤酵母GS115/Pn-GOD感受态细胞构建重组菌，电转条件：1.5千伏、5毫秒，快速加入1毫升YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃金属浴静置培养2-6小时，在5000转/分钟的转速下离心2分钟，弃上清，用1毫升灭菌的0.9％生理盐水洗3次，将重组质粒HAC1/pPICZB电转后的菌液涂布于含有200微克/毫升博来霉素和1000微克/毫升G418的YPD平板上，30℃恒温培养3天后获得阳性转化子，挑取单菌落接种于含1000微克/毫升G418和200微克/毫升博来霉素的5毫升液体YPCS试管培养基中，14-22小时后加1％(v/v)甲醇，之后24小时和48小时后均各加1％(v/v)甲醇诱导，96小时收菌，12000转/分钟离心1分钟收集上清，测定葡萄糖氧化酶活力，筛选高酶活重组菌株，获得巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris CGMCC No.18909。
实施例4
外源蛋白在分泌表达过程中的发酵条件如温度、pH、通气量、搅拌转速、补料速度等对菌株的生长和蛋白的产率有重要影响，所以除了采用基因工程手段得到高表达的重组生产菌株外，对菌株的发酵条件进行进一步的优化工作也是非常重要的。
具体发酵方法如下：
A、菌株培养阶段：将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909按5％-10％接种量接种到5毫升灭菌后的YPD培养基中制备一级种子，在温度28℃-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养10-16小时后至OD600＝1-2；按照5％-10％接种量将一级种子转接到容积为500毫升、装有150毫升灭菌后的BMGY培养基的摇瓶中制备二级种子，在温度为28℃-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养8-12小时后至OD600＝6-10；容积为10升的发酵罐初始装4.5升BSM培养基，发酵培养基接种前先用浓氨水调整其pH＝5.0，再按每升培养基加入4-5毫升PTM1，以3％-10％的接种量将二级种子接入灭菌后的发酵培养基；在温度28℃-30℃、通气量为1-3vvm、初始搅拌转速为500转/分钟、12小时候后搅拌转速为700转/分钟的条件下发酵；
B、碳源饲喂阶段：待发酵培养基中甘油耗尽溶氧上升后，按照流加量为12-16毫升/小时/升的条件流加甘油，每升甘油中包含14-16毫升的PTM1，培养4小时，此时培养基中的溶氧量为0；
C、饥饿培养阶段：当菌体OD600＝180-220时，饥饿培养30分钟至2小时，停止流加甘油，当碳源消耗完后溶氧量将升高至不低于50％，直至稳定不变；
D、诱导表达阶段：控制pH＝6.0-6.5，维持整个诱导过程中溶氧量始终为0，按照前10小时流加速率为3-5克/小时/升、10小时后流加速率6-7克/小时/升的条件流加甲醇，每升甲醇中包含10-12毫升PTMl，按山梨醇：甲醇＝1:20的比例流加山梨醇，每升山梨醇中包含14-16毫升的PTM1；在诱导过程中每隔24小时加维生素C水溶液至其终浓度80-100微克/升，发酵至48小时一次性加入维生素B2，使发酵液中维生素B2的终浓度为1-1.5mM。
在10升发酵罐经过诱导培养，巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909得到酶活力为912U/mL,而巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.11626酶活力为594U/mL。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909的葡萄糖氧化酶表达量是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.11626的1.5倍，这说明毕赤酵母转录因子HAC1的过量表达有助于无活性的未折叠蛋白折叠成其天然构象，促进葡萄糖氧化酶的分泌表达。
其中：
LB培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％NaC1；余量为水；
YPD培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；余量为水；
YPDS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；0.5％Sorbi tol；余量为水。
YPCS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract，2％Peptone，0.5％Casminoacids，0.5％Sorbitol；
BMGY种子培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；1.34％YNB；400μg/L Biotin；1％Glycerol；100mmol pH＝6.0的磷酸钾缓冲液；
每升BSM发酵培养基由如下原料组成：26.7mL85％H3PO4；0.93gCaSO4；18.2gK2SO4；14.9gMgSO4·7H2O；4.13gKOH；40g甘油；4.35mLPTM1；余量为水；其中PTM1采用过滤除菌，其余原料采用高温高压灭菌；
每升PTM1由如下原料组成：6.0gCuSO4·5H2O；0.08gNaI；3.0gMnSO4·H2O；0.2gNaMoO4·2H2O；0.02gH3BO3；0.5gCoCl2；20.0gZnC12；65.0gFeSO4·7H2O；0.2gbiotin；5mLH2SO4；余量为水。
序列表
<110> 河北省微生物研究所
<120> 毕赤酵母转录因子HAC1、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用
<130> CN201410606913.8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
atgcccgtag attcttctca taagacagct agcccacttc cacctcgtaa aagagcaaag 60
acggaagaag aaaaggagca gcgtcgagtg gaacgtatcc tacgtaatag gagagcggcc 120
catgcttcca gagagaagaa acgaagacac gttgaatttc tggaaaacca cgttgtcgac 180
ctggaatctg cacttcaaga atcagccaaa gccactaaca agttgaaaga aatacaagat 240
atcattgttt caaggttgga agccttaggt ggtaccgtct cagatttgga tttaacagtt 300
ccggaagtcg attttcccaa atcttctgat ttggaaccca tgtctgatct ctcaacttct 360
tcgaaatcgg agaaagcatc tacatccact cgcagatctt tgactgagga tctggacgaa 420
gatgacgtcg ctgaatatga cgacgaagaa gaggacgaag agttgcccag gaaaatgaaa 480
gtcttaaacg acaaaaacaa gagcacatct atcaagcagg agaagttgaa tgaacttcca 540
tctcctttgt catccgattt ttcagacgta gatgaagaaa agtcaactct cacacattta 600
aagttgcaac agcaacaaca acaaccagta gacaattatg tttctactcc tttgagtctt 660
ccggaggatt cagttgattt tattaaccca ggtaacttaa aaatagagtc cgatgagaac 720
ttcttgttga gttcaaatac tttacaaata aaacacgaaa atgacaccga ctacattact 780
acagctccat caggttccat caatgatttt tttaattctt atgacattag cgagtcgaat 840
cggttgcatc atccagcagt gatgacggat tcatctttac acattacagc aggctccatc 900
ggctttttct ctttgattgg ggggggggaa agttctgtag cagggaggcg cagttcagtt 960
ggcacatatc agttgacatg catagcgatc aggtga 996
<210> 2
<211> 331
<212> PRT
<213> An artificial sequence
<400> 2
Met Pro Val Asp Ser Ser His Lys Thr Ala Ser Pro Leu Pro Pro Arg
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Thr Glu Glu Glu Lys Glu Gln Arg Arg Val Glu Arg
20 25 30
Ile Leu Arg Asn Arg Arg Ala Ala His Ala Ser Arg Glu Lys Lys Arg
35 40 45
Arg His Val Glu Phe Leu Glu Asn His Val Val Asp Leu Glu Ser Ala
50 55 60
Leu Gln Glu Ser Ala Lys Ala Thr Asn Lys Leu Lys Glu Ile Gln Asp
65 70 75 80
Ile Ile Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Gly Gly Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Asp Leu Thr Val Pro Glu Val Asp Phe Pro Lys Ser Ser Asp Leu Glu
100 105 110
Pro Met Ser Asp Leu Ser Thr Ser Ser Lys Ser Glu Lys Ala Ser Thr
115 120 125
Ser Thr Arg Arg Ser Leu Thr Glu Asp Leu Asp Glu Asp Asp Val Ala
130 135 140
Glu Tyr Asp Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Pro Arg Lys Met Lys
145 150 155 160
Val Leu Asn Asp Lys Asn Lys Ser Thr Ser Ile Lys Gln Glu Lys Leu
165 170 175
Asn Glu Leu Pro Ser Pro Leu Ser Ser Asp Phe Ser Asp Val Asp Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Thr Leu Thr His Leu Lys Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln
195 200 205
Pro Val Asp Asn Tyr Val Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Glu Asp Ser
210 215 220
Val Asp Phe Ile Asn Pro Gly Asn Leu Lys Ile Glu Ser Asp Glu Asn
225 230 235 240
Phe Leu Leu Ser Ser Asn Thr Leu Gln Ile Lys His Glu Asn Asp Thr
245 250 255
Asp Tyr Ile Thr Thr Ala Pro Ser Gly Ser Ile Asn Asp Phe Phe Asn
260 265 270
Ser Tyr Asp Ile Ser Glu Ser Asn Arg Leu His His Pro Ala Val Met
275 280 285
Thr Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Gly Ser Ile Gly Phe Phe Ser
290 295 300
Leu Ile Gly Gly Gly Glu Ser Ser Val Ala Gly Arg Arg Ser Ser Val
305 310 315 320
Gly Thr Tyr Gln Leu Thr Cys Ile Ala Ile Arg
325 330

Claims (10)

1.毕赤酵母转录因子HAC1，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No.1。
2.毕赤酵母转录因子HAC1的制备方法，其特征在于是以毕赤酵母Pichia pastorisGS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增获得。
3.利用毕赤酵母转录因子HAC1编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
4.利用毕赤酵母转录因子HAC1转化的巴斯德毕赤酵母，其特征在于其拉丁文名称为Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.18909。
5.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a、毕赤酵母转录因子HAC1以GeneBank公布的Gene ID8196642设计引物，以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的基因组DNA为模板，以HAC1-F：GgaattcACGATGCCCGTAGATTCTTCTC及HAC1-R：ATAAGAATgcggccgcTCACCTGATCGCTATGC为引物进行PCR扩增，下划线字母代表设计加入的酶切位点；
b、PCR产物经纯化回收后由于在目的基因片段两端分别引入了EcoRI、NotI限制性酶切位点，将毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体分别使用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切，毕赤酵母转录因子HAC1与pPICZB载体各自的双酶切回收产物经1％琼脂糖凝胶核酸电泳检验后，用T4 DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α，双酶切验证筛选阳性转化子，并送测序；
c、重组质粒HAC1/pPICZB采用限制性内切酶SacI线性化，取切好的质粒2微克，冰上放置20分钟后，电转毕赤酵母GS115/Pn-GOD感受态细胞构建重组菌，电转条件：1.5Kv、5ms，快速加入1毫升YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃金属浴静置培养2-6小时，在5000转/分钟的转速下离心2分钟，弃上清，用1毫升灭菌的0.9％生理盐水洗3次，将重组质粒HAC1/pPICZB电转后的菌液涂布于含有200微克/毫升博来霉素和1000微克/毫升G418的YPD平板上，30℃恒温培养3天后获得阳性转化子，挑取单菌落接种于含1000μg/mLG418和200μg/mLZeocin的5mL液体YPCS试管培养基中，14-22小时后加1％(v/v)甲醇，之后24小时和48小时后均各加1％(v/v)甲醇诱导，96小时收菌，12000转/分钟离心1分钟收集上清，测定葡萄糖氧化酶活力，筛选高酶活重组菌株，获得巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.18909。
6.根据权利要求5所述的巴斯德毕赤酵母的制备方法，其特征在于其中：
YPD培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；余量为水；
YPDS培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；0.5％Sorbitol；余量为水。
7.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、菌株培养阶段：将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.18909按5％-10％接种量接种到5毫升灭菌后的YPD培养基中制备一级种子，在温度28℃-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养10-16小时后至OD600＝1-2；按照5％-10％接种量将一级种子转接到容积为500毫升、装有150毫升灭菌后的BMGY培养基的摇瓶中制备二级种子，在温度为28-30℃、转速为220-250转/分钟的条件下培养8-12小时后至OD600＝6-10；容积为10L的发酵罐初始装4.5升BSM培养基，发酵培养基接种前先调整其pH＝5.0，再按每升培养基加入4-5毫升PTM1，以3％-10％的接种量将二级种子接入灭菌后的发酵培养基；在温度28℃-30℃、通气量为1-3vvm、初始搅拌转速为500转/分钟、12小时候后搅拌转速为700转/分钟的条件下发酵；
B、碳源饲喂阶段：待发酵培养基中甘油耗尽溶氧上升后，按照流加量为12-16毫升/小时/升的条件流加甘油，每升甘油中包含14-16毫升的PTM1，培养4小时，此时培养基中的溶氧量为0；
C、饥饿培养阶段：当菌体OD600＝180-220时，饥饿培养30分钟至2小时，停止流加甘油，当碳源消耗完后溶氧量将升高至不低于50％，直至稳定不变；
D、诱导表达阶段：控制pH＝6.0-6.5，维持整个诱导过程中溶氧量始终为0，按照前10小时流加速率为3-5克/小时/升、10小时后流加速率6-7克/小时/升的条件流加甲醇，每升甲醇中包含10-12毫升PTMl，按山梨醇：甲醇＝1:20的比例流加山梨醇，每升山梨醇中包含14-16毫升的PTM1；在诱导过程中每隔24小时加维生素C水溶液至其终浓度80-100微克/升，发酵至48小时一次性加入维生素B2，使发酵液中维生素B2的终浓度为1-1.5mM。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于步骤A中发酵培养基接种前先用浓氨水调整其pH＝5.0。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于其中：
YPD培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；2％Glucose；余量为水；
BMGY种子培养基由如下原料组成：1％Yeast extract；2％Peptone；1.34％YNB；400μg/L Biotin；1％Glycerol；100mmol pH＝6.0的磷酸钾缓冲液；
每升BSM发酵培养基由如下原料组成：26.7mL85％H3PO4；0.93gCaSO4；18.2gK2SO4；14.9gMgSO4·7H2O；4.13gKOH；40g甘油；4.35mLPTM1；余量为水；其中PTM1采用过滤除菌，其余原料采用高温高压灭菌；
每升PTM1由如下原料组成：6.0gCuSO4·5H2O；0.08gNaI；3.0gMnSO4·H2O；0.2gNaMoO4·2H2O；0.02gH3BO3；0.5gCoCl2；20.0gZnC12；65.0gFeSO4·7H2O；0.2gbiotin；5mLH2SO4；余量为水。
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