CN102517304A

CN102517304A - 重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用

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Publication number: CN102517304A
Application number: CN2011104242472A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 张宇宏; 范云六; 姚斌; 刘波
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN102517304B

Abstract

本发明公开了重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用。本发明在不改变葡萄糖氧化酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行了优化，优化后的葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本发明进一步提供了含有所述葡萄糖氧化酶优化基因的表达载体以及重组宿主菌株。本发明将优化后的基因转入到毕赤酵母中进行表达，试验结果表明，相比于优化前，该优化基因在毕赤酵母中的分泌表达量有显著提高。葡萄糖氧化酶应用效果试验表明，所表达的重组葡萄糖氧化酶具有与商业化酶制剂相同的使用效果。

Description

重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及一种密码子经过优化的突变基因，尤其涉及按照巴斯德毕赤酵母偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因进行改造后的优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞，本发明进一步涉及它们在生产葡萄糖氧化酶中的应用，属于重组葡萄糖氧化酶领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)学名为β-D-葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)，它能专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢(Pluschkell S，Hellmuth K and Rinas U，Kinetics of glucose oxidase excretion by recombinant Aspergillusniger.Biotechnology and bioengineering，1996，51：215-220)。GOD广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域(Bankar SB，Bule MV，Singhal RS，et al.，Glucose oxidase-Anoverview.Biotechnol Adv，2009，27：489-501)。

葡萄糖氧化酶在食品工业中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。目前，许多国家已将葡萄糖氧化酶作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中，例如：用于酒类除氧、蛋白脱糖、食品包装、果蔬及制品的保鲜等(Malherbe D，Du Toit M，Cordero Otero R，et al.，Expression of theAspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potentialapplications in wine production，Appl Microbiol Biotechno，2003，61，(5-6)：502-511)。

葡萄糖氧化酶还可作为绿色面粉改良剂及添加剂并逐渐替代化学添加剂在面粉及制品的改良行业中发挥重要作用。溴酸钾在焙烤业中已有八十多年的应用历史，它作为氧化剂成功地赋予焙烤制品所必需的面筋强度及弹性，但是溴酸钾对人体具有很大的危害作用，所以有必要寻找一种安全的、可以替代溴酸钾功能的添加剂。葡萄糖氧化酶在氧化过程中产生的过氧化氢能够氧化面筋蛋白中的巯基形成二硫键，进而改善面团的网络结果，增强了面团弹性，从而能够起到化学添加剂(溴酸钾等)相同的效果，避免了化学添加剂对人体造成的损害。目前已经在小麦粉和玉米粉中通过添加葡萄糖氧化酶而提高了面粉的筋力，改善了面包等食品的手感和形状，提高了产品质量(中国发明专利申请公开号：CN 1748515A；黄卫宁，贾春利；发明名称：一种含有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的抗冻发酵冷冻面团及其生产方法)。

在医药方面，葡萄糖氧化酶作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；葡萄糖氧化酶制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成，防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于葡萄糖氧化酶可以催化生成H₂O₂，其还可用于对H₂O₂敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗(Vodopivec M，Berovi M，Jan ar J，etal.，Application of Convective Interaction Media disks with immobilised glucose oxidase foron-line glucose measurements.Analytica Chimica Acta，2000，407：105-110.)。

近几年，作为一种新型的酶饲料添加剂，葡萄糖氧化酶已被农业部列为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一，开始在畜牧、饲料行业上得到应用。在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够清除牲畜肠道上皮细胞大量自由基，保护肠道上皮细胞的完整。葡萄糖氧化酶通过不断的催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低胃肠道的pH值，偏酸性环境有利于益生菌的生长增殖，从而抑制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力。除此之外，由于葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖过程中会产生过氧化氢，当过氧化氢积累到一定浓度时，可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生长繁殖，并且这种抑菌作用不会产生菌体抗药性。随着葡萄糖氧化酶制备提纯工艺的不断发展完善，使用成本的不断降低，葡萄糖氧化酶将在饲料行业中发挥越来越重要的作用(李焰，葡萄糖氧化酶饲养肉鸡效果试验.龙岩师专学报，2004，22：77-78)。

葡萄糖氧化酶的应用已扩展到纺织品行业。纺织品在生产过程中需要用到大量的双氧水(即过氧化氢)，葡萄糖氧化酶在作用过程中产生的过氧化氢可以用于纺织工业的漂白处理。采用具有高回收率的固定化的葡萄糖氧化酶生产过氧化氢，过氧化氢浓度可达3.5g/L，处理时不需添加双氧水稳定剂，处理后织物手感柔软、丰满。并且处理后固定化葡萄糖氧化酶可以回收，再用到下批产品的处理中，因而可以有效降低纺织工业的生产成本，并提高纺织物的品质。中国作为纺织品生产和消费大国，葡萄糖氧化酶在此行业中的应用具有很好的前景(中国专利申请公开号：CN 1884682A；陈坚，阎贺静，堵国成，华兆哲；发明名称：一种应用葡萄糖氧化酶制剂的棉织物酶法煮炼的方法)。

葡萄糖氧化酶在生物界分布广泛，最先于1904年在黑曲霉和灰绿青霉中发现了葡萄糖氧化酶。目前研究的葡萄糖氧化酶主要来源于霉菌类微生物和昆虫体内，在细菌如弱氧化醋酸菌中也存在(Murray FR，Llewellyn DJ，Peacock WJ，et al.，Isolation of the glucoseoxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol ofVerticillium dahliae.Curr Genet，1997，32：367-375.)。工业上一般采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌，但黑曲霉和青霉菌天然菌株在发酵过程中会产生过氧化氢酶、纤维素酶和淀粉酶等其它多种副产物和大量的杂蛋白(Frederick K，Tung J，Emerick R，et al.，Glucose oxidasefrom Aspergillus niger.Cloning，gene sequence，secretion from Saccharomyces cerevisiae andkinetic analysis of a yeast-derived enzyme.Journal of Biological Chemistry，1990，265：3793-3802)，大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难，也增加了成本。此外，天然霉菌生产过程中酶蛋白的生物合成受葡萄糖的诱导和高浓度葡萄糖的分解代谢产物的阻遏，而发酵过程中产生的葡萄糖氧化酶能氧化培养基中的葡萄糖生成葡萄糖酸，葡萄糖酸对酶的合成也具有抑制作用。为了解决这一问题，近年来利用基因工程菌重组表达葡萄糖氧化酶受到研究人员的青睐。周亚凤和张先恩等人将黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中进行了重组表达，诱导后发酵液中酶活为30-40U/ml(Zhou YF，Zhang XE，Liu H，et al.，Cloning and expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene inmethylotrophic yeast.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2001，17：400-405)；Silvia Crognale也在毕赤酵母中成功表达青霉来源的葡萄糖氧化酶，产量为50U/ml(Silvia Crognale，ValentinaPulci and Brozzoli V，Expression of Penicillium variabile P16 glucose oxidase gene in Pichiapastoris and characterization of the recombinant enzyme.Enzyme and MicrobialTechnology.39，2006，1230-1235)。

从上述文献可知，虽然目前采用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达，表达量在原始菌株基础上得到了提高，特别是利用毕赤酵母异源分泌表达葡萄糖氧化酶具有高细胞密度发酵、蛋白可分泌到胞外表达且杂蛋白少；具有翻译后加工修饰系统，糖蛋白的免疫原性较低；遗传和表达稳定性好等诸多优点(Macauley-Patrick S，Fazenda M，McNeil B，et al.，Heterologous protein production using the Pichia pastorisexpression system.Yeast，2005，22：249-270.)，但其分泌表达量通常在50-100U/ml左右，不同程度的存在着分泌表达量较低的缺陷，导致酶制剂价格昂贵，限制了其广泛使用。

提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量通常有密码子优化、mRNA二级结构改造、GC含量调整等策略。所谓密码子优化即是：由于密码子的简并性，每个氨基酸对应的密码子可以有多个。研究发现不同物种对密码子的使用频率是不同的，那些不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。对于不同的表达系统如毕赤酵母和大肠杆菌，其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，尤其是连续出现的话，将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量的影响，可采用对异源基因的密码子进行优化来实现，即在不改变外源基因氨基酸序列的情况下，将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。该方法具有简单易行，重复性好的特点，得到了广泛的使用(Sharp P，TuohyT and Mosurski K，Codon usage in yeast：cluster analysis clearly differentiates highly andlowly expressed genes.Nucleic Acids Research，1986，14：5125.)。以前的密码子优化研究往往全部使用最优的密码子，这造成了蛋白质翻译系统负担过重，表达效果不理想等问题。如果能综合考虑毕赤酵母中各种tRNA的存在比例并据此均衡分布各个密码子的使用次数和位点，就能够最大限度地利用重组细胞的翻译系统，能更高效的表达外源蛋白(De Schutter K，et al.Genome sequence of the recombinant protein production hostPichiapastoris.Nat Biotech，2009，27：561-566)。

不同来源的酶蛋白外源基因经密码子优化后其在毕赤酵母中的表达量提高程度差别很大，例如：Teng等通过优化β-1，3-1，4葡聚糖酶的密码子组成，使其在毕赤酵母中的表达量提高10倍(Teng D，Fan Y，Yang YL，et al.，Codon optimization of Bacilluslicheniformis beta-1，3-1，4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris.ApplMicrobiol Biotechnol，2007，74：1074-1083)；Chang将来源于假丝酵母的脂肪酶密码子进行优化后，在毕赤酵母中的表达量提高4.6倍(Chang SW，Lee GC and Shaw JF，Codonoptimization of Candida rugosa lip1 gene for improving expression in Pichia pastoris andbiochemical characterization of the purified recombinant LIP1 lipase.J Agric Food Chem，2006，54：815-822.)。本发明人通过密码子优化方式将青霉来源的葡萄糖氧化酶的基因在毕赤酵母中的表达量由原来的130U/ml提高到614U/ml(中国发明专利申请公开号：CN101955953A；张伟，姚斌，范云六，张宇宏；发明名称：葡萄糖氧化酶突变基因及其应用)。

外源蛋白表达过程中，外源基因转录出的mRNA二级结构与蛋白的合成有很大关系，也是影响表达效率的重要因素。在转录过程中，目的基因的mRNA二级结构复杂度和自由能显著影响转录的效率。当目的基因的mRNA二级结构自由能非常低时会延缓转录进程，进而降低蛋白质的表达量，尤其是在转录起始和终止处，这种影响更为明显。在目的基因密码子优化过程中如果同时考虑目的基因的mRNA二级结构的复杂度和自由能，将能有效降低转录能量屏障，提高转录效率，进而提高蛋白表达量(Huang，H.Q.，P.L.Yang，et al.High-level expression of a truncated1，3-1，4-β-D-glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization ofcodons and fermentation.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78(1)：95-103)。

发明内容

本发明目的之一是提供一种密码子经过改造且mRNA二级结构稳定性高的重组葡萄糖氧化酶的优化基因，该优化基因在宿主细胞中的分泌表达量呈显著提高；

本发明目的之二是提供含有该重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明目的之三是将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞应用于生产重组葡萄糖氧化酶；

为实现上述目的，本发明首先提供了一种重组葡萄糖氧化酶的优化基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明将克隆获得的点青霉(Penicillium notatum)葡萄糖氧化酶基因(god-w)(SEQ ID NO.3所示的序列)在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对该序列进行改造，其中，改变了453个碱基，涉及391个氨基酸，优化后葡萄糖氧化酶基因(god-h)(SEQ ID NO.1)的GC含量由55.6％降为47.8％，此外，mRNA二级结构自由能也得到了较大幅度的提高，降低了转录能量屏障，提高了转录效率，有效提高了其在毕赤酵母中的分泌表达量。

本发明另一方面提供了含有所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重组酵母表达载体，最优选为重组毕赤酵母表达载体。

将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作的与酵母的表达调控序列相连就可得到在酵母细胞中分泌表达葡萄糖氧化酶的重组酵母表达载体，进一步的，将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作的与毕赤酵母的表达调控序列相连就可得到在毕赤酵母细胞中分泌表达重组葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母表达载体。

用于酵母表达载体的表达调控序列对于所属领域的普通技术人员是众所周知的，包括但不限于来自诸如以下基因的启动子区域：醇脱氢酶(ADH)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PYK)。其它用于酵母宿主的合适启动子序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)及其它诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶的糖解酶(Holland et al.，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess et al.，J.ADV.ENZYME REG.(1968)7：149)的启动子。具有由生长条件控制的转录的额外优点的可诱导酵母启动子可包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域等。酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。此外，合成启动子也可起到酵母启动子的作用。此外，酵母启动子可包括具有结合酵母RNA聚合酶和起始转录的能力的天然产生的非酵母来源的启动子，可包含部分酵母表达载体的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇化酶基因的终止子。用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒中的trp1基因，所述trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株的选择标记。

本发明所述的酵母包括能够表达编码葡萄糖氧化酶的优化基因的各种酵母中的任一种。选择用于表达重组葡萄糖氧化酶的合适酵母是在所属领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳固的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。所述产子囊酵母分为两科，即蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium属和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科，即掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(Candida)。优选的，本发明所述的酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明还提供了一种生产葡萄糖氧化酶的方法，包括：将SEQ ID NO.1所示的重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的重组葡萄糖氧化酶，即得。上述方法中，所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞优选为酵母，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

将重组葡萄糖氧化酶的优化基因引入到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：Hsiaoet al.，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76：3829和Van Solingen et al.，J.BACT.(1977)130：946。然而，也可如通常在SAMBROOK et al.，Molecular Cloning：A LabManual(2001)中所述，使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式，将外源DNA引入细胞。一旦建立重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞)，则在适于产生重组葡萄糖氧化酶的条件下培养重组宿主细胞菌株，培养重组宿主细胞菌株的方法依赖于所用表达载体的性质和宿主细胞的特性，这对所属领域的普通技术人员来说属于常规的技术手段，其包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、空心纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统；这些方法的每一种都可以采用分批、补料或连续模式等方法进行，同时以分批或连续型式采集细胞或采集培养物上清液。在含有碳、氮和无机盐的可吸收源和视情况含有维生素、氨基酸、生长因子及其它众所周知的蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。

用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。可在扩增阶段使用所属领域的普通技术人员众所周知的标准补料发酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在发酵罐内生长。所述发酵法可经调适以解决特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式中的差异。举例而言，酵母属酵母宿主的发酵可能需要单个葡萄糖、复合氮源(例如酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。举例而言，通常为碳的生长限制营养素可在扩增阶段加入发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵法通常应用设计为含有足够量的碳、氮、基本盐、磷及其它次要营养素(例如维生素、微量矿物质和盐等)的发酵培养基。

本发明的重组葡萄糖氧化酶蛋白于重组系统中表达之后进行纯化，可以采用多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化或浓缩重组葡萄糖氧化酶。任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组葡萄糖氧化酶，例如：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAE SEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。举例而言，可离心或过滤发酵培养液以去除细胞碎片，将上清液浓缩或稀释到所要体积或透滤入合适缓冲液中以调节制剂以用于进一步纯化。更优选的，可以将发酵后的上清液离心去除菌体沉淀，将上清酶液过滤，弃去滤过液，即得到浓缩的酶液；其中，所述的过滤可分为两次，第一次过滤采用0.1μm微滤膜进行过滤，以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质，收集滤过液；第二次过滤是将第一次的滤过液再经过截留分子量为10kDa的超滤膜进行过滤。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。特征为诸如存在编码4HB多肽的核苷酸序列的相关特性的充分类似于亲本的亲本细胞后代包括于这一定义所意指的后代中。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol et al.，(1992)；Rossolini et al.，Mol Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1葡萄糖氧化酶(god-w)原基因密码子使用频率。

图2本发明优化后的葡萄糖氧化酶基因(god-h)的密码子使用频率。

图3酵母重组表达质粒pPIC9-god-h的构建示意图。

图4酵母转化子的PCR鉴定电泳图；1：阴性对照，2-18：转god-h基因的PCR结果；M：marker。

图5平板法筛选有葡萄糖氧化酶活性的酵母转化子。

图6转god-w(53#)、转god-m(DG-16#)和转god-h(Gh168#、Gh459#)的酵母菌株3升发酵罐中葡萄糖氧化酶酶活结果。

图7发酵罐中葡萄糖氧化酶经甲醇诱导不同时间内的表达量的SDS-PAGE；M：蛋白分子量marker；1-3：转god-w的重组酵母(53#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清；4-6：转god-m的重组酵母(DG-16#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清；7-9：转god-h的重组酵母(Gh168#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清。

图8本发明重组葡萄糖氧化酶添加到面包中的应用效果试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

说明：以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1葡萄糖氧化酶基因的优化设计和合成

1.1菌株和质粒

点青霉(Penicillium notatum)由本发明人实验室保存；

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株TOP10和克隆载体pSP72购自北京全式金生物技术有限公司；god-h全基因片段由北京奥科生物技术公司合成。

1.2葡萄糖氧化酶基因的优化设计

本发明首先对从点青霉(Penicillium notatum)中克隆获得的葡萄糖氧化酶原始基因(god-w)的序列进行分析(基因的克隆请参考：李卓夫(硕士论文)，葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效表达.长春理工大学，2008)，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除、mRNA二级结构稳定性等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造。点青霉来源的葡萄糖氧化酶原基因全长1815bp，共编码604个氨基酸和一个终止密码子。其中前54个碱基编码的18个氨基酸为信号肽序列，在毕赤酵母中表达时需去除自带的信号肽序列，以表达载体pPIC9上的α因子为信号肽。因此去除自身信号肽的葡萄糖氧化酶基因(god-w)由1761个碱基组成，编码586个氨基酸和一个终止密码子(SEQ ID NO.3)。在不改变氨基酸序列的前提下对god-w基因进行优化后的葡萄糖氧化酶基因(god-h)序列为SEQ ID NO.1所示，共改变了453个碱基，涉及391个氨基酸，GC含量由55.6％降为47.8％(表1)。GOD基因优化前后的密码子使用情况如图1、2所示。而且，优化后的基因(god-h)(SEQ ID NO.1)通过软件预测(RNA structure 4.5)，其mRNA二级结构自由能相比god-w乃至god-m均得到了较大幅度的提高，这样有利于降低转录能量屏障，提高转录效率，进而提高蛋白表达量(表2)。

表1葡萄糖氧化酶基因优化前后GC含量的变化

注：god-m为中国专利申请公开号CN101955953A(发明名称：葡萄糖氧化酶突变基因及其应用)的专利申请中所公开的葡萄糖氧化酶突变基因；

表2god-w、god-m和god-h的mRNA二级结构自由能比较

注：mRNA二级结构自由能使用RNA structure 4.5软件进行计算

1.3密码子优化后的葡萄糖氧化酶基因(god-h)的合成

将god-h的全基因人工合成后连接在载体pSP72上。

实施例2葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌株的构建和筛选

1.1菌株和质粒

Top10大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；

表达载体pPIC9和毕赤酵母受体菌株GS115为Invitrogen公司产品。

带有原始葡萄糖化酶基因(god-w)的毕赤酵母重组菌株53#(酶活为130U/ml)，带有第一次改造后葡萄糖化酶基因(god-m)的毕赤酵母重组菌株DG16#(酶活为614U/ml)为本发明人实验室构建保存；带有本发明改造的葡萄糖氧化酶基因(god-h)的质粒pSP72-god-h进行人工合成。

1.2培养基及其他溶液

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5％琼脂粉)，108℃灭菌15min。

10×YNB(酵母无氨基酸氮源)：134g YNB固体溶于1L去离子水，过滤灭菌，4℃保存。

500×生物素：生物素20mg/10omL水，过滤灭菌，4℃保存。

10×葡萄糖：200gD-葡萄糖溶于1000mL水，过滤灭菌，4℃保存。

MD培养基：YNB13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4x10^-4g/L，琼脂糖20g/L。

MM培养基：YNB13.4g/L，甲醇0.5％，生物素4x10^-4g/L，琼脂糖20g/L。

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4x10^-4g/L，甘油10ml/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4x10^-4g/L，甲醇5mL/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。

1mol/L山梨醇：将182.1g D-山梨醇溶于1L水中，过滤灭菌，4℃保存。

Basal salts(发酵培养基)：KH₂PO₄ 12g/L，NH₄H₂PO₄ 80g/L，K₂SO₄ 43g/L，MgSO₄·7H₂O 26g/L，Ca₂SO₄ 2.86g/L，KOH 3.0g/L。

发酵中所用的微量盐溶液(PTM)：硫酸铜4.0g/L、碘化钠0.18g/L、硫酸锰1.8g/L、钼酸钠0.4g/L、硼酸0.02g/L、氯化钻1.5g/L、氯化锌10g/L、硫酸亚铁34g/L、生物素0.25g/L、硫酸3ml/L；过滤灭菌，4℃保存。

邻联茴香胺溶液：0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇，为储存液，4℃保存，实验前取0.1ml储存液，溶于12ml的0.1mol/L，pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。

平板筛选显色液：

溶液I：邻联茴香胺储存液(0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇，4℃保存)；

溶液II：18％葡萄糖(18g葡萄糖溶于100ml去离子水中)；

溶液III：90U/ml的辣根过氧化物酶；

将10ml的1％的琼脂糖溶化后加入2ml溶液II，200μl溶液I和400μl溶液III即为显色液(现用现配)。

1.3葡萄糖氧化酶的优化基因酵母重组表达载体的构建

分别提取pSP72-god-h和pPIC9质粒，并分别用EcoRI和NotI对这两个重组质粒进行双酶切处理，并将god-h基因片段和表达载体pPIC9酶切产物进行回收及连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此构建了酵母重组表达载体pPIC9-god-h(图3)。

1.4葡萄糖氧化酶的优化基因在毕赤酵母中的表达

用BglII酶切重组表达质粒pPIC9-god-h，使质粒线性化，按照毕赤酵母表达手册分别将其转化毕赤酵母宿主菌GS115。以每板200μl菌液量涂布于MD平板上，28℃培养至长出转化子。随机挑选17个克隆子提取基因组，利用CTAB法提取基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以改造基因god-h的3’端特异引物(5’CTAGGCACTTTTGGCATAGTC)与载体上的通用引物5’AOX(TACGTAATGAAGCTCCTCTCTGTTGCT)进行PCR扩增检测，目的条带大小约为2.1kb(图4)。由图4初步得出转化子的PCR阳性率较高，为95％以上。

1.5产葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母在摇床水平的筛选

首先采用平板筛选方法对转化子进行初筛。用无菌牙签将MD平板上长出来的转化子复制到具有编号的MM平板上，同时复制在具有相同编号的MD平板上，将MM复制平板和MD复制平板置于28℃培养箱培养，培养24h后，将MD复制平板取出置于4℃冰箱保存，取出MM平板后，将显色液倾倒于MM板上，室温10-20min即可显色，阳性菌株在平板上可显示棕色，据此确定阳性率及葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株(图5)。随后对平板初筛的转化子进行复筛。用无菌牙签将初筛具有酶活的相应克隆挑到10mL BMGY培养基中摇床培养48h(28℃，200rpm)，然后离心(6000rpm，8min)，弃去培养基上清，加入5mL BMMY，摇床培养(28℃，200rpm)，期间每隔24h补加0.5％甲醇，诱导60h后离心(6000rpm，8min，4℃)，收集上清液测定酶活力。复筛结果进行再次重复试验，确认酶活力。

筛选测定了转god-h基因的酵母转化子600个，发现转god-h的600个酵母转化子中平均约有35％的转化子(210个)具有葡萄糖氧化酶的活性，其中有60％的转化子的酶活均高于转god-m基因的产葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母(也包括其中酶活最高的DG16#转化子)；转god-h的600个酵母转化子中有95％的转化子的酶活高于转未改造的god-w基因的产葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母(也包括其中酶活最高的53#转化子)。其中，转god-h的600个酵母转化子中酶活最高的转化子Gh168#在摇床水平的酶活(67.3U/ml)是DG16#(33.6U/ml)的2倍，是53#(11.2U/ml)的6倍(表3)。

表3部分转葡萄糖氧化酶改造基因酵母的酶活测定结果

1.6葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母的发酵

分别以野生型基因(god-w)和经一次改造的基因(god-m)的葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌53#和DG16#为对照菌株，将复筛实验中比对照菌株酶活显著提高的2株转god-h基因的毕赤酵母重组菌株GH168#和GH459#进行实验室3升发酵罐水平诱导产酶发酵。

分别将上述4株酵母转化子用无菌牙签挑到40ml YPD培养基中，摇床培养(28℃，200rpm)48h后，转接到200ml YPD培养基中，摇床培养(28℃，200rpm)24h作为发酵种子菌液，接种于3升发酵罐中。

发酵罐参数设置为pH5.5，温度30℃，搅拌速率为1000rpm，通气量为200，初始接种量为200ml菌液，当溶氧下降至最低，然后又开始上升到100％时，开始补糖(300ml的40％葡萄糖+12mlPTM盐)，补糖4-5h后，开始混饲(80ml的40％葡萄糖+1mlPTM盐+7ml甲醇)，混饲2-4h后开始流加甲醇(500ml甲醇+12mlPTM盐)诱导产酶，开始诱导后，每隔12h取发酵样品测定菌体湿重和样品酶活并留样，酶活随着诱导时间的延长而增加，当酶活开始下降时，停止发酵，下罐，将发酵液离心(10000rpm，10min，4℃)，收集上清酶液。从3升小试水平发酵结果可知，转原基因god-w的酵母转化子53#在甲醇诱导132h后葡萄糖氧化酶的活性为130U/ml，转第一次改造的god-m基因的酵母转化子DG16#酶活诱导132h后为614U/ml；转化子Gh168#在3升发酵罐水平甲醇诱导132h后的酶活是1189U/ml，其酶活是53#的9.1倍，DG16#的1.9倍；转化子Gh459#在3升发酵罐水平甲醇诱导132h后的酶活是987U/ml，其酶活是53#的7.6倍，是DG16#的1.6倍(图6、图7)。

由此可见，本发明将点青霉来源的葡萄糖氧化酶经密码子优化、GC含量改变等综合改造后所得到的优化基因显著提高了该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，提高了酶活。与国内外部分研究比较，本发明葡萄糖氧化酶最终表达量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础(表4)。

表4文献报道的葡萄糖氧化酶基因与本发明葡萄糖氧化酶优化基因的产量

实施例3本发明所制备的重组葡萄糖氧化酶在面包上的应用效果试验

1.1葡萄糖氧化酶样品的浓缩

实施例2中的毕赤酵母表达的重组葡萄糖氧化酶在发酵液上清中的含量占到总蛋白的90％以上，因此将该发酵液上清通过超滤浓缩就可以用于后期试验。先将实施例2中的转god-h的重组酵母菌株Gh168#的发酵液上清10000rpm离心10min，去除菌体沉淀，上清酶液采用PALL公司切向流膜过滤系统进行浓缩，首先采用0.1μm微滤膜进行过滤，以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质，收集滤过液。然后将滤过液再经过截留分子量为10kDa的超滤膜进行过滤，弃去滤过液，得到浓缩的酶液用于下述的应用研究试验。

1.2葡萄糖氧化酶酶活测定方法

1.2.1标准曲线的制作

参照SIGMA Glucose(GO)Assay Kit，稍加改进。以sigma公司葡萄糖氧化酶标准品做标准曲线。将葡萄糖氧化酶标准品分别稀释成0.4U/ml，0.8U/ml，1.2U/ml，1.6U/ml，2.0U/ml，2.4U/ml，在试管中加入2.5ml邻联茴香胺溶液，加入0.3ml的18％D-葡萄糖，加入0.1ml 90U/ml辣根过氧化物酶溶液，35℃保温2min，加入0.1ml稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，反应3min后加入2ml的2mol/L硫酸终止反应，在540nm下测定反应液吸光值，结果见表5。

表5葡萄糖氧化酶标准曲线的绘制

根据葡萄糖氧化酶标准品实验结果，以葡萄糖氧化酶标准品酶活力为纵坐标，以OD₅₄₀的吸光值为横坐标，建立酶活力标准曲线，根据标准曲线的结果，得出葡萄糖氧化酶活单位的计算公式为：

酶活性(U/ml)＝(4.3769x-0.3034)×N

x：OD₅₄₀吸光值；

N：样品稀释倍数。

1.2.2葡萄糖氧化酶活性的测定

试管中加入2.5ml邻联茴香胺溶液，0.3ml的18％葡萄糖，0.1ml的90U/ml过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1ml(每隔10s加一个)，反应3min后，加入2M硫酸终止反应(同样是每个10s加一个)，取出试管，测OD₅₄₀的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

1.3葡萄糖氧化酶在面包烘焙上的应用

配料：面粉100％；酵母1.5％；糖20％；盐1％；面包油8％；改良剂；水52％；将上述配料混合在一起。

选取步骤1.1所浓缩的重组葡萄糖氧化酶及两个商品酶(DSM-GT(荷兰DSM公司)、Gluzyme Mono(丹麦诺维信公司))作为试验样品；按照每公斤面包原料添加15mg酶蛋白的比例分别将上述三种试验样品添加到面包原料中后，烘焙面包，并以不添加葡萄糖氧化酶的面包原料为对照烘焙面包。按照国家标准评价烘焙效果。试验结果表明，本发明所制备的重组葡萄糖氧化酶与两种商品酶制剂在面包烘焙方面的效果没有明显差别，具有很好的实际应用效果(图8)。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用

<130> DQXL-0019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1761

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1761)

<400> 1

tat tca cca gct gaa caa atc gac gtc caa tct cat ttg tta tct gac 48

Tyr Ser Pro Ala Glu Gln Ile Asp Val Gln Ser His Leu Leu Ser Asp

1 5 10 15

cca act aag gtt gaa gga aag acc tat gac tac gtt atc gcc gga gga 96

Pro Thr Lys Val Glu Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Ile Ala Gly Gly

20 25 30

ggt ctt acc gga ctg acc gtc gcc tct aag ctt tct gag aat cct aag 144

Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ser Lys Leu Ser Glu Asn Pro Lys

35 40 45

att aag gtt ctg gtc atc gaa aag ggt ttc tac gag tct aac gac ggt 192

Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Asn Asp Gly

50 55 60

cct att atc gaa gac cca aac gct tat gga gaa att ttt ggt acc tcc 240

Pro Ile Ile Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Phe Gly Thr Ser

65 70 75 80

gtc gac caa aac tac ctt act gtc cct ttg atc aac aat aga acc gga 288

Val Asp Gln Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg Thr Gly

85 90 95

gag atc aag tcc ggt ttg gga ttg gga ggt tcc act ctt att aac ggt 336

Glu Ile Lys Ser Gly Leu Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly

100 105 110

gac tct tgg act cgt cct gac aag gtt caa att gac tcc tgg gag aag 384

Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp Glu Lys

115 120 125

gtt ttc ggt atg gaa ggt tgg aac tgg gat aac gtt ttc caa tac atg 432

Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Phe Gln Tyr Met

130 135 140

caa aag gcc gag aga tct aga cct cca acc gca gct caa atc gag gct 480

Gln Lys Ala Glu Arg Ser Arg Pro Pro Thr Ala Ala Gln Ile Glu Ala

145 150 155 160

gga cat ttc tac gac cca gct tgc cac ggt acc gat ggt act gtc cac 528

Gly His Phe Tyr Asp Pro Ala Cys His Gly Thr Asp Gly Thr Val His

165 170 175

gct ggt cca cgt gac aac ggt aag cca tgg tct cct ctt atg aga gct 576

Ala Gly Pro Arg Asp Asn Gly Lys Pro Trp Ser Pro Leu Met Arg Ala

180 185 190

ctg atg aac act gtt tct gcc ttc ggt gtt cct gtt caa aaa gac ttc 624

Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Phe Gly Val Pro Val Gln Lys Asp Phe

195 200 205

cac tgt ggt cat cca aga ggt gtt tcc atg att cct aac aat ttg cac 672

His Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met Ile Pro Asn Asn Leu His

210 215 220

gaa aac caa atc aga gcc gac gct gcc cgt gag tgg ttg ttg cca aac 720

Glu Asn Gln Ile Arg Ala Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn

225 230 235 240

tac caa aga gac aac ttg caa atc ctt acc ggt caa aag gtt ggt aag 768

Tyr Gln Arg Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Gly Gln Lys Val Gly Lys

245 250 255

gtc ttg ttc aac caa act gcc tcc ggt cca aaa gcc gtc ggt gtt aac 816

Val Leu Phe Asn Gln Thr Ala Ser Gly Pro Lys Ala Val Gly Val Asn

260 265 270

ttc ggt act aac aag gcc gtc aac ttc aac gtt tac gct aag cag gag 864

Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asn Val Tyr Ala Lys Gln Glu

275 280 285

gtc ttg ttg gct gct ggt tcc gct atc tcc cca ctg att ttg gag tac 912

Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Pro Leu Ile Leu Glu Tyr

290 295 300

tct ggc atc gga att aag tcc gtt ctg gat aaa gct ggt gtc aag caa 960

Ser Gly Ile Gly Ile Lys Ser Val Leu Asp Lys Ala Gly Val Lys Gln

305 310 315 320

ctg ttg gag ttg cca gtc gga ttg aac atg cag gac caa act acc act 1008

Leu Leu Glu Leu Pro Val Gly Leu Asn Met Gln Asp Gln Thr Thr Thr

325 330 335

acc gtc aga tct aga gct aac aat gcc cca ggt cag ggt caa gct gcc 1056

Thr Val Arg Ser Arg Ala Asn Asn Ala Pro Gly Gln Gly Gln Ala Ala

340 345 350

tac ttt gct aac ttc act gaa gtc ttg ggt gat cac gct gct caa ggt 1104

Tyr Phe Ala Asn Phe Thr Glu Val Leu Gly Asp His Ala Ala Gln Gly

355 360 365

atc aac ttg ttg gac act aag ttg gac caa tgg gct gaa gag act gtc 1152

Ile Asn Leu Leu Asp Thr Lys Leu Asp Gln Trp Ala Glu Glu Thr Val

370 375 380

gct aga ggt ggt ttc cac aac gtc acc gca ttg aag atc caa tac gaa 1200

Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Ile Gln Tyr Glu

385 390 395 400

aac tac aga aac tgg ctg ttg gac gaa gac gtc gct ttt gct gaa ttg 1248

Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala Glu Leu

405 410 415

ttc ttt gac acc gag ggt aag att aac ttc gac atc tgg aac ttg att 1296

Phe Phe Asp Thr Glu Gly Lys Ile Asn Phe Asp Ile Trp Asn Leu Ile

420 425 430

cca ttc acc aga gga tct gtt cac atc ttg tct agt gac cca tac ttg 1344

Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His Ile Leu Ser Ser Asp Pro Tyr Leu

435 440 445

tgg cag tac gcc aac gac cca aag ttc ttc atg aac gag ttg gac ttg 1392

Trp Gln Tyr Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Met Asn Glu Leu Asp Leu

450 455 460

ttg ggt caa gct gcc gcc acc aag ttg ggt aga gag ttg tcc tct gct 1440

Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Lys Leu Gly Arg Glu Leu Ser Ser Ala

465 470 475 480

ggt gag atg aag aag tac tac gcc ggt gaa act att cca ggt gac aac 1488

Gly Glu Met Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn

485 490 495

ttg cca caa gac gct act gtt gag caa tgg gag gac tac gtc atg atg 1536

Leu Pro Gln Asp Ala Thr Val Glu Gln Trp Glu Asp Tyr Val Met Met

500 505 510

aac ttc aga cca aac tgg cac gcc gtc tct act tgt tcc atg atg tct 1584

Asn Phe Arg Pro Asn Trp His Ala Val Ser Thr Cys Ser Met Met Ser

515 520 525

aga gaa ttg ggt ggt gtt gtt gac gcc acc gct aag gtt tac ggt acc 1632

Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr Gly Thr

530 535 540

caa ggt ttg aga gtt atc gac ggc tcc atc cca cca act caa gtc tct 1680

Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Val Ser

545 550 555 560

tcc cac gtt atg act gtt ttc tac ggt atg gct ctt aga att gct gag 1728

Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Gly Met Ala Leu Arg Ile Ala Glu

565 570 575

tct gtt ctt gaa gat tac gcc aaa agt gct tag 1761

Ser Val Leu Glu Asp Tyr Ala Lys Ser Ala

580 585

<210> 2

<211> 586

<212> PRT

<213> Glucose Oxidase

<400> 2

Tyr Ser Pro Ala Glu Gln Ile Asp Val Gln Ser His Leu Leu Ser Asp

1 5 10 15

Pro Thr Lys Val Glu Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Ile Ala Gly Gly

20 25 30

Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ser Lys Leu Ser Glu Asn Pro Lys

35 40 45

Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Asn Asp Gly

50 55 60

Pro Ile Ile Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Phe Gly Thr Ser

65 70 75 80

Val Asp Gln Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg Thr Gly

85 90 95

Glu Ile Lys Ser Gly Leu Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly

100 105 110

Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp Glu Lys

115 120 125

Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Phe Gln Tyr Met

130 135 140

Gln Lys Ala Glu Arg Ser Arg Pro Pro Thr Ala Ala Gln Ile Glu Ala

145 150 155 160

Gly His Phe Tyr Asp Pro Ala Cys His Gly Thr Asp Gly Thr Val His

165 170 175

Ala Gly Pro Arg Asp Asn Gly Lys Pro Trp Ser Pro Leu Met Arg Ala

180 185 190

Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Phe Gly Val Pro Val Gln Lys Asp Phe

195 200 205

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210 215 220

Glu Asn Gln Ile Arg Ala Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Pro Leu Ile Leu Glu Tyr

290 295 300

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305 310 315 320

Leu Leu Glu Leu Pro Val Gly Leu Asn Met Gln Asp Gln Thr Thr Thr

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Ile Asn Leu Leu Asp Thr Lys Leu Asp Gln Trp Ala Glu Glu Thr Val

370 375 380

Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Ile Gln Tyr Glu

385 390 395 400

Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala Glu Leu

405 410 415

Phe Phe Asp Thr Glu Gly Lys Ile Asn Phe Asp Ile Trp Asn Leu Ile

420 425 430

Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His Ile Leu Ser Ser Asp Pro Tyr Leu

435 440 445

Trp Gln Tyr Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Met Asn Glu Leu Asp Leu

450 455 460

Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Lys Leu Gly Arg Glu Leu Ser Ser Ala

465 470 475 480

Gly Glu Met Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn

485 490 495

Leu Pro Gln Asp Ala Thr Val Glu Gln Trp Glu Asp Tyr Val Met Met

500 505 510

Asn Phe Arg Pro Asn Trp His Ala Val Ser Thr Cys Ser Met Met Ser

515 520 525

Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr Gly Thr

530 535 540

Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Val Ser

545 550 555 560

Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Gly Met Ala Leu Arg Ile Ala Glu

565 570 575

Ser Val Leu Glu Asp Tyr Ala Lys Ser Ala

580 585

<210> 3

<211> 1761

<212> DNA

<213> Penicillium notatum

<400> 3

tatagcccgg ccgagcagat cgacgtccag tctcacctgc tttctgaccc caccaaggtc 60

gagggaaaga cttacgacta tgtcattgct ggtggtggcc tgactggttt gactgtggct 120

tccaagctgt ccgaaaaccc gaagatcaaa gtcctcgtta ttgagaaggg attctacgaa 180

tccaacgatg gaccgatcat cgaggacccc aacgcctatg gggagatctt tggaactagt 240

gtggatcaga attatctcac agttcccctc atcaacaacc gaactgggga aattaagtct 300

ggcctcggtc ttggtggctc gaccttgatc aacggcgatt cctggacccg ccccgacaag 360

gtccagatcg actcatggga aaaggtcttc ggcatggagg gctggaactg ggacaatgtc 420

ttccagtaca tgcagaaagc tgaacgctcg cgccccccga ctgccgccca gattgaagcc 480

ggtcacttct acgaccctgc ctgtcatgga acagacggaa ccgttcatgc cggccctcgc 540

gacaacggca agccttggtc cccactgatg cgagccctca tgaacaccgt ctccgctttc 600

ggtgtccccg tccagaagga cttccactgc ggtcaccccc gtggtgtctc gatgatcccg 660

aacaacctcc atgagaacca gatccgggct gatgccgctc gcgaatggct tcttcccaac 720

taccagcgcg ataacctgca gatcctgact ggccagaagg tcggaaaggt tttgttcaac 780

cagaccgcat ctggacctaa ggctgttggt gtgaacttcg gtaccaacaa ggctgttaac 840

ttcaatgtct acgccaagca agaagttctg ctggccgccg gatctgccat ttctcctttg 900

atccttgaat actccggtat tggtatcaag tccgtccttg acaaggccgg tgttaagcag 960

ctcctcgaac tccctgttgg tctcaacatg caagaccaga ccactaccac tgttcggtcc 1020

cgcgccaaca acgcacctgg acaaggccag gccgcttact ttgccaactt caccgaggtt 1080

ctcggcgacc atgccgccca gggtattaat ttgctggaca ccaagcttga ccagtgggcc 1140

gaggagaccg ttgcccgcgg tggcttccac aacgtgactg ccctcaagat ccagtacgag 1200

aactaccgta actggctcct cgatgaggat gttgcatttg ccgagctctt ctttgacact 1260

gagggcaaga tcaacttcga tatctggaat cttatcccct tcactcgcgg ttccgtccac 1320

atcctcagca gtgaccctta cctctggcaa tacgcaaatg accccaagtt cttcatgaac 1380

gagctggatc ttctcggcca ggccgctgct actaagctgg gtcgtgagct ctctagcgcc 1440

ggtgagatga agaagtacta cgctggcgag accatccccg gcgacaacct accccaggat 1500

gccaccgtcg agcagtggga ggactacgtg atgatgaact tccgtcctaa ctggcacgct 1560

gttagcacct gctctatgat gtcccgcgag cttggtggtg tcgtcgacgc tactgccaag 1620

gtctacggta ctcagggcct ccgtgtcatt gacggatcta tccctcccac tcaggtgtcc 1680

tctcacgtta tgaccgtttt ctacggtatg gccttgcgga tcgccgaatc cgtccttgaa 1740

gactatgcca aaagtgccta g 1761

Claims

1.重组葡萄糖氧化酶的优化基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体。

3. 按照权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是重组真核表达载体。

4. 按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组真核表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。

5. 含有权利要求2-4任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。

6. 按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为酵母细胞。

7. 按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的酵母细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

8. 权利要求1所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因在生产葡萄糖氧化酶中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：将权利要求1所述的优化基因可操作的与表达载体相连接得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，获得重组宿主菌株；培养重组宿主菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的重组葡萄糖氧化酶。

10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的重组表达载体为重组真核表达载体，优选为毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。